（生物医学工程专业论文）甲状腺激素受体新亚型TRβΔ的组织分布研究.pdf

天津医科大学博士学位论文 重组大鼠t r 3 1 蛋白发生交叉反应。 2 在正常成年大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织均检测到刀砌m r n a 的表 达。经对职团、t r i l l 及r y s z + r y $ 1 三种m r n a 的定量研究发现，乃黝与 豫洒j 在成年大鼠的肝，肾，脾组织高表达，脑组织中低表达；不同发育期大 鼠肝组织的表达强度均高于其它三种组织，脑组织并未表现出类似于成年大 鼠的显著低水平表达。就表达的阶段特性而言，各组织的表达峰值均处于发 育期，成年后表达水平降低。在不同组织中及不同发育时段，掣的表达 量均显著高于t r i l l ，并在刀妒j + 掣的和值中占相当大的比例。 3 在成年大鼠肝、肾组织的核提取物中可检测到t r f j a 蛋白的表达，但未能在 脑、脾组织中检测到其表达。 结论： 1 成功制备了抗t r l 3 a 多克隆抗体。所制备的抗体具有较高的效价及特异性。 2 t r f l am r n a 在正常大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织中普遍存在，并非 是来源于个体基因突变的偶然现象。掣与刀妒j 均与原来认为的t r i l l ( 实 际上是郦j + 刀黝) 有着非常相似的组织分布特征，硼蚴表达具有与其它 刀够亚型类似的在发育阶段高表达，成年后趋于较低水平稳定表达的特征。 在大鼠组织中t r f l a 新亚型可能作为一种主要的剪接形式而存在。 3 t r g a 作为一个新的受体蛋白而存在于正常成年大鼠肝、肾组织中。 关键词：甲状腺激素受体新亚型组织分布荧光定量p c r i l 天津医科大学博士学位论文 a b s t r a c t t h y r o i dh o r m o n eh a sv e r yi m p o r t a n tm e t a b o l i ca n dd e v e l o p m e n t a lr e g u l a t i o n e f f e c t si na l m o s ta l lo r g a n so ft h eb o d y i te x e r t sm o s to fm e i rf u n c t i o n sa tt h e g e m o m i cl e v e l ，t h r o u g hb i n d i n gt ot h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r s ( t r s ) ，w h i c ha r e h i g h l yc o n s e r v e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r so f t h en u c l e a rr e c e p t o rs u p e r f a m i l y b e c a u s eo f d i f f e r e n tt r a n s c r i p ts t a r tp o s i t i o na n da l t e r n a t i v es p l i c i n g , e a c hs u b t y p eh a ss e v e r a l i s o f o r m s ，i n c l u d i n gt r a l ，t r a 2 ，t r a 3 ，t r a a l ，t r a a 2 ，t r 3 1 ，t r i b 2 ，t r p 3 ，t r a p 3 t r p i san o v e lt r pi s o f o r mw h i c hh a v ei s o l a t e da n di d e n t i f i e di nr a tl i v e r i t s m r n a c d n ai so n l y1 0 8 b p sl o n g e rt h a nt h a to f t r 3 1 t h eo n l yd i f f e r e n c eb e t w e e n t r p aa n dt r p li sa na d d i t i o n a l3 6a m i n o a c i dr e s i d u e so ft r l 3 n os p e c i f i c a n t i b o d ya g a i n s tt h et r p i s o f o r mi sa v a i l a b l ea tp r e s e n tt i m e ，a n dt h ea n t i b o d yt o t r i b1m a yr e c o g n i s e dt r p a sw e l l t h er e p o r t e dt i s s u ed i s t r i b u t i o nr e s u l t so ft h e t r y 1i s o f o r md on o ta c c o u n tf o rt h i s i nt h i sp a p e r , as t u d yo ft h et i s s u ed i s t r i b u t i o n o ft h en o v e lt h y r o i dh o r m o n er e c e p t o ri s o f o r m - t r f l ai sr e p o r t e d o m e c t i v e s ： t od e t e c tt h e 掣m r n ai nn o r m a la d u l tr a tt i s s u e s t o i n v e s t i g a t et h e t i s s u e - s p e c i f i ca n dt e m p o r a l - s p e c i f i ce x p r e s s i o nf e a t u r e so f 掣a n d 刀妒jm r n a a n dt oa n a l y z et h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h et w ot r a n s c r i p t s t op r e p a r et r p s p e c i f i c p o l y c l o n a la n t i b o d yf o ri n v e s t i g a t i n gt h et i s s u e d i s t r i b u t i o no ft r 3 ap r o t e i n si n n o r m a la d u l tr a t s m e t h o d s ： 1 b i o i n f o r m a t i c sm e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n et h ei m m u n o g e n i c i t yo ft h es p e c i f i c p e p t i d e , e n c o d i n gf o ra m i n oa c i d s12 9 16 4o ft h et r p p r o t e i n i n d i r e c te l i s a w a se s t a b l i s h e dt od e t e r m i n et h et i t e ro ft h ea n t i s e r u m t h es p e c i f i c i t yo ft h e a n t i b o d yw a sd e t e r m i n e db yw e s t e r nb l o to ft h er e c o m b i n a n tr a tt r b a n dt r l 31 p r o t e i nw i t ht h ep r e p a r e dp o l y c l o n a la n t i b o d y 2 r t - p c rw a su s e dt od e t e c tt h et r f l am r n ai nt h el i v e r , b r a i n ，k i d n e y , s p l e e n ， s m a l li n t e s t i n ea n db o n eo fn o r m a la d u l tr a t s t h et i s s u ed i s t r i b u t i o nf e a t u r e so f t h et r 归a 、t r f l l a n dt r f l a + t r f l l m r n ai nt h el i v e r 、b r a i n 、k i d n e y 、s p l e e nt i s s u e s o fa d u l tr a t sw e r ea n a l y z e dw i t hr t - q p c r t h et e m p o r a l s p e c i f i cf e a t u r e sw e r e a l s oi n v e s t i g a t e di nt i s s u e so f r a t si nd i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s 3 n u c l e a re x t r a c t sf r o mt h el i v e r , b r a i n ，k i d n e y , s p l e e nt i s s u e so fa d u l tr a t sw e r e i i i 天津医科大学博士学位论文 i n v e s t i g a t e db yw e s t e r nb l o tw i t ht h ea n t i - t r p ap o l y c l o n a la n t i b o d ya n d a n t i - t r 31m o n o d o n a la n t i b o d yt od e t e c tt h ep r o t e i ne x p r e s s i o n r e s u l t s 1 t h et r l 3 as p e c i f i cp e p t i d eh a so n ee p i t o p e a f t e rp u r i f i c a t i o n ，t h ea n t i - s a 2 1 mh a s g a i n e ds u f f i c i e n tp u r i t ya n ds e n s i t i v i t y t h ea n t i t r i b aa n t i b o d yc o u l dd e t e c t r e c o m b i n a n tt r p p r o t e i nb u tn oc r o s s r e a c t i v i t yw a ss e e nw i t hr e c o m b i n a n t t r l 31p r o t e i n 2 n et r p am r n ac o u l db ed e t e c t e dn o to n l yi nl i v e r , b u ta l s oi nb r a i n ，k i d n e y , s p l e e n , s m a l li n t e s t i n ea n db o n eo fn o r m a la d u l tr a t s i na d u l tt i s s u e s ，t r f l a ， t r f l l a n dt r f l d + t r b l m r n al e v e l sw e r em u c hh i g h e ri nl i v e r , k i d n e y , s p l e e n t h a nt h a ti nb r a i n i na l ld e v e l o p m e n t a lp e r i o d s ，l i v e rs h o w e dah i g h e re x p r e s s i o n l e v e lt h a nt h eo t h e rt h r e et i s s u e s f o ra l lk i n d so fm r n a , t h ee x p r e s s i o np e a k s w e r ei nt h ed e v e l o p m e n t a lp e r i o da n dd e c l i n e da f t e rs e x u a lm a t u r a t i o n i na l l t i s s u e sa n dt i m ep e r i o d s ，t h em r n al e v e lo ft r f l ai sm u c hh i g h e rt h a nn l a to f t p , 罗ia n di si nd o m i n a n tp r o p o r t i o no f t h et r f l a + t 郾jl e v e l s 3 t r p ap r o t e i nw a sd e t e c t e di nt h el i v e ra n dk i d l l 盯b u tn o ti nt h eb r a i na n ds p l e e n t i s s u e s c o n c l u s i o n s 1 w eh a v es u c c e s s f u l l yp r e p a r e da n t i - t r p ap o l y d o n a la n t i b o d y 、i ls u f f i c i e n t s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yt op e r f o r mw e s t e r nb l o t 2 m 掣i sw i d e l ye x p r e s s e da tt h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e li na d u l tr a tt i s s u e s t h e t i s s u e s p e c i f i c f e a t u r e so ft h e t r f l a 。t 邓la n ds o - c a l l e dt r i l l ( a c t u a l l y 删+ 刀妒j ) w e r eq u i t es i m i l a r 1 1 l et e m p o r a l - s p e c i f i ce x p r e s s i o nf e a t u r e so f 掣i s i na c c o r d a n c ew i t ho t h e r 职矽i s o f o r m si nt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l sa r e r e l a t i v e l yh i g hd u r i n gd e v e l o p m e n t a lp e r i o d sb u tt e n dt od e c l i n ea f t e rs e x u a l m a t u r a t i o n 髓e 删s p l i c i n gp a t t e r nm a yb ed o m i n a n ti nr a tt i s s u e s 3 ，n l et r p p r o t e i ne x i s t si nt h el i v e ra n d k i d n e yt i s s u e so fn o r m a la d u l tr a t s k e y w o r d s ：t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r i s o f o r mt i s s u ed i s t r i b u t i o n f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r i v 天津医科大学博士学位论文 缩写 a e r 姆 a r b c a b i s b l a s t b m e i b b s a d b d d d h 2 0 d e p c d n a d n t p e b e c o l i e d t a e r g r g s t h i s h i 心 d t g k d l b d m r o r p b s 符号说明 英文全称中文全称 a c r y l a m i d e 丙烯酰胺 a m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵 a n d r o g e nr e c e p t o r 雄激素受体 b i c i n c h o n i m i ca c i d二辛可酸 n , n - m e t h y l e n eb i s a e r y l a m i d e n ，n 二甲基酰胺 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l基本局部比对搜索工具 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l巯基乙醇 b o v i n e 绷a l b u m i n牛血清白蛋白 d n a - b i n d i n gd o m a i n d n a 结合域 d i s t i l l e dt w i c ew a t e r双蒸水 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e焦碳酸二乙酯 d e o x y r i b o n u e l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 2 - d e o x y n u c l e o s i d e - 5 - t r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 e s c h e r i c h i ac o l i大肠杆菌 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e s t r o g e nr e c e p t o r雌激素受体 g l u e o e o r t i e o i dr e c e p t o r糖皮质激素受体 g l u t a t h i o n e - s t r a n s f e r a s e 谷胱甘肽巯基转移酶 h i s t i d i n e组氨酸 h o r s e r a d i s hp e o x i d a s e 辣根过氧化物酶 i s o p r o p y lp d1t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基- p d 一硫代 半乳糖苷 k i l od a l t o n千道尔顿 l i g a n d b i n d i n gd o m a i n配体结合域 m i n e r a l o e o r t i c o i dr e c e p t o r盐皮质激素受体 o r p h a nr e c e p t o r孤儿受体 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n磷酸盐缓冲液 v i 丕望墨型奎堂坚主堂笪笙奎一 - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - i _ - l _ _ _ _ - _ - _ _ - 一一 p c rp o l y m e r a s oc h a i nr e a c t i o n p e g 8 0 0 0 p o l y e t h y l e n eg l y c o l8 0 0 0 p r p r o g e s t e r o n er e c e p t o r r a r r e t i n o i ca c i dr e c e p t o r r n a r i b o n u c l e i ca c i d r x r r e t i n o i dxr e c e p t o r s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p a g es d s p o l y a c r y l a m i d e9 9 le l e c t r o p h o r e s i s t e m e dn ，n ，n n - t e t r am e t h y le t h y - l c n ed i a m i n e t h s t 黜 t r e s y d r x - 鲥 聚合酶链反应 聚乙二醇8 0 0 0 孕激素受体 视黄酸受体 核糖核酸 视黄醇类x 受体 十二烷基硫酸钠 s d s 聚丙烯酰胺凝胶泳 n ，n ，n n 四甲基乙二胺 t h y r o i dh o r m o n e 甲状腺激素 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r s 甲状腺激素受体 t h y r o i dr e s p o n s ed e m e n t s 甲状腺反应元件 v i t a m i nd r e c e p t o r 维生素d 受体 5 - b r o m o - 4 c h l o r o 3 i n d o l y l p d g a l a c t o s i d e5 - 溴4 - 氯一3 一吲哚一b d 半乳糖苷 v i i 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行 研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致 谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：窆l 趣 日期：0 9 生1 z5 肘日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论 文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以 供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入 有关数据库。 保密 li ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密团。 ( 请在以上方框内打“4 ) 作者签名：篁：i 至塾日期：0 95 月猸 导师签名：；段鱼生孕 日期：0 9 钲r - 5 肘日 天津医科大学博士学位论文 j j l - 刖吾 研究现状、成果 甲状腺激素( t h y r o i dh o r m o n e s ，t h s ) 几乎对机体的所有器官、组织都具有 广泛的作用。甲状腺激素的活性形式3 ，5 ，3 三碘甲腺原氨酸( t 3 ) ，在组织中广泛 分布，在哺乳动物神经系统、内耳、肌肉、心脏和骨骼的发育中都发挥重要作 用，亦是出生后发育过程及成年后基础代谢率的重要调节因子，还参与胆固醇 稳态，心肌收缩力和骨量的维持。 t h s 通过与广泛分布在各种组织中的甲状腺激素受体( t h y r o i dh o r m o n e r e c e p t o r s ，t r s ) 结合，作用于转录过程实现其对靶基因的正性负性调节。目前认 为，t r 与雌激素受体( e r ) 、孕激素受体( p r ) 、糖皮质激素受体( g r ) 、盐皮质激 素受体( m r ) 、雄激素受体o 姣) 、维生素d 受体( v d r ) 、视黄酸受体( r a r ) 和孤 儿受体( o r ) 同属类固醇核受体的超家族，有类似的结构和功能。它们都能够识 别某段特异的d n a 序列，即激素反应元件( h o r m o n er e s p o n s i v ee l e m e n t ，h r e ) ， 并可与之结合而调控其靶基因的转录。 t r 由位于 i r a 基因( 又称c - e r b a l 和c - e r b a a ，位于人染色体1 7 q 1 1 2 ；鼠1 1 号染色体) 和t r p 基因( 又称c - e r b a 2 和c - e r b a p ，位于人染色体3 p 2 4 3 ；鼠1 4 号 染色体) 编码。t r 基因在脊椎动物中高度保守，不同种属间同源性很高【啦】。目 前总共报道了9 种亚型( i s o f o r m s ) ：t r a l ，t r a a l ，t r a y ，t r a o 2 ，t r a 3 ，t r y l ， t r l 3 2 ，t r i b 3 ，t p , 邳3 ( 见图1 ) 【3 巧】。均由在转录过程中的选择性剪接作用( a l t e r n a t i v e s p l i c i n g ) 产生。其中仅有t r a l ，t a n ，t r y 2 ，t r y 3 是功能型受体，既具有d n a 结合能力又具有配体结合能力。而t r a 2 ，t r a 3 虽有d n a 结合能力，却无配体 结合能力，t r a d 3 虽有配体结合能力，却无d n a 结合能力。t r a c t l 和t r a a 2 ， 既两者均不具备。各非功能性受体的功能目前还不十分清楚，有可能作为类似 物拮抗相关受体功能【鹪】。 这些t r s 同功体几乎在所有组织中都有表达，只是各同功体在不同组织的相 对表达量不同，各自具有其特征性的分布和调节功能： i r a l m r n a 在骨骼肌和 棕色脂肪中最为丰富；t r a 2 在脑区具有优势表达；t r ，i 的分布较为平均，但也 以脑区、肝脏和肾脏为主，并且在肝脏中有昼夜节律性变化，主要作用于维持 天津医科大学博上学位论文 a 墨墨 百 t 心 皿 皿 口 面墨阳 圃 图1t r s 的各亚型 肝脏胆固醇水平的稳态p i i ；t r b 2 m r n a 集中分布在垂体前叶和下丘脑，介导垂 体- 下丘脑一甲状腺轴的负反馈调节1 1 2 1 同时在脑和内耳发育过程中也有表达， t r b 2 的表达还畸脂肪细胞i i 等的发育分化及鸡的视网膜发育有关：大鼠中发现 t r 3 3 存在于肝、肾、肺中，t r l 0 3 存在于骨髂肌、心脏、脾脏和大脑中【i ”。 t r s 同功体基冈呈现与分化发育有关的阶段特异性表达，很可能是其介导 t h s 调节分化发育的重要机制之一。如t r s 在脑区的分布具有明显的阶段特异 性【l ”。在神经系统的发育早期以t r c t l 为t 随后渐以t r y l 为主，而t r a 2 始 终高表达。这说明t r a l 在早期神经前体细胞增殖过程中起主要作_ | | j ，而t r b l 则在以后的前体细胞分化及分化细胞成熟过程中起主要作用l t 6 1 。t r a 2 和t r 0 3 被认为是t h s 作用的抑制剂，总是与t r n l 并列表达，但表达水平并不相j i 司 也许它们基同参，整个调节过程”】。在啮齿类动物，t r a l 对于动物在生后到 断奶前的时间里是非常必要的，这一阶段是循环中t h 水，r 最高的时期。在这个 发育期，t h s 促进许多 | 官的成熟如：肠，脑，和骨 1 9 ”1 以及脾中的短暂红细 胞生成，t r a ! 还通过调控许多因素如心率，适应性产热m ”i ，和应激 2 4 i 来 维持稳态。但在出生后的脊椎动物，对于介导脑功能，特别是听觉和视觉感官 系统功能十分重要的是t r i b 。 t r s 基因表达主要受到转录水平和转录后水平的训控，使得各t r s 可功体表 现山阶段特异性、组织特异性和受激素调节的特征，值得注意的是，m r n a 和蛋 白质的量并不总是一致口“。提示可能还有其它机制影响组织中t r s 的水平。 我们在研究甲状腺激素受体的过程中发现一个新的甲状腺激素受体同功体 t r t b z x 。它4 i 同于人们熟知的 r r l 3 1 和b 2 ，也不同于w i l l i a m s 2 0 0 0 年报告的 r r l 3 天津医科大学博士学位论文 和a 1 3 3 t 8 1 。在t i l l 基因的第3 ，4 外显子( e x o n ) 之间多出了一个1 0 8 b p 的片段 ( 图2 ) ，已于2 0 0 5 年获准于g e n b a n k 登记注册，编号为d q l 9 1 1 6 5 。经过对 t r f l a m r n a j c d n a 的序列分析发现，较刀妒j 多出来的这一段序列( 1 0 8 b p ) 的 位置并不影响其前后序列的读码框。t r f l a 可翻译出比原t r b l 多3 6 个氨基酸残 基的新的受体蛋白( 图3 ，黑体字示加长的3 6 a a ) 。该氨基酸序列同样经g e n b a n k 登记注册，获编号为a b a 3 9 2 9 4 。这3 6 个氨基酸残基是t r l 3 a 与t r f i i 的唯一 区别。它是t r 家族中唯一的加长型受体亚型。它的产生很可能是可变剪接的结 果，更可能是本来存在又一个1 0 8 b p 的外显子。而且此新受体具有d n a 结合区 ( d b d ) 和配体结合区( l b d ) ，只是在原t r l 3 1 的d b d 中间部分多出3 6 个氨 基酸( 图4 ) 。t r l 3 a 当属甲状腺受体家族的第l o 个成员，是本实验室在世界范 围内最新发现的，迄今由国内作者在国内发现和鉴定的唯一的新受体。 本研究拟从转录水平和蛋白水平来探讨t r j 3 a 新亚型在大鼠组织中的分布 特点，并与t r l 3 1 进行比较，为进一步分析新受体的功能奠定基础。 i5 - t g a a g a g g a c c c a g c a t g a c t a c t a a 一c c t t c t c a c a c c a g a g a c gl ia g a a g a c a g g g a t t t g g t t c c a t a c a g a c a c c a g t t c t a c c t c t ci it g c a t t c g g t c t g g a t g t t g t c c t c a a g g c a g t g g g a c c c t g a g - i 图2 本实验室克隆的t r l 3 a c d n a 全序列 注：下划线部分为上、下游引物；黑体字部分为多出的1 0 8 b p 序列， 其余序列与t r i m c d n a 完全相同，编码序列共1 4 9 4 b p n h ，, - m t p n s m t e k c l p a w d k q k p h p d r c 的d w k l 、，g m s e a c l h r k s h v e r r g a l k n e q t s s h l i q a t w a s s i f h l d p d d v n d q s v s s a q t f q t e e k k c k g y i p s y l d k d e l c v v c g d ka r i 娜y r c l t c e g c k p s h t r d e k t g i w f h t d t s s t s l h s v w m l s s r q w d p e g f f r r t i q k s l h p s y s c k y e g k c i i d k v t r n o c q e c r f k k c i y v g m a t d l v l d d s k r l a k r k l i e e n r e k r r r e e l q k s i g h k p e 】邢e e w r e u k t v t e a h v a t n a q g s h w k q k r k f l p e d l g q a p i v n a p e g g k v d l e a f s h f i x i i 删1 1 w v d f a k k i 。p m f c e l p c e d q i i l l k o c c m e l m s l r a a v 啪p d s e l r i 肌n g e m a v t r g q u 喇 g g l g v v s d a i f d l g m s l s s f n l d d t e v a l l q a v l l m s s d r p g l a c v e r i e k y q d s f l l a f e h y i n y r k h h v t h f w p k l u k v t d l r m i g a c h a s r f l h m k v e c p t e l f p p l f l e v f e d - ( ：0 0 h 图3t r i b a 的氨基酸序列 3 天津医科大学博士学位论文 ll 捣j4 6 1 0 l ?、4970 图4t r b i 蛋白与t i 邙蛋白的比较 研究目的、方法 由于目前尚无市售的针对t r l 3 a 蛋白的特异性抗体，为了在蛋白水平分析 t r p 在大鼠组织中分布，我们首先制备了针对t r l 3 a 的特异性抗体。我们分别 用重组融合蛋白的方法及合成小肽偶联载体蛋白的方法制备免疫原，用常规福 氏佐剂方法进行家兔免疫，饱和硫酸铵法及p r o t e i n a 亲和层析法进行多抗纯化。 建立了间接e l i s a 用以检测抗血清效价。为了进一步验证抗体的特异性，我们 在同一表达系统中克隆、表达了重组r t r f l a 、r t r l 3 1 蛋白用于多抗的w e s t e r nb l o t 鉴定。为了了解删在大鼠体内转录水平表达的时间特异性和空间特异性，我 们运用r t p c r 方法，分析了t r f l am r n a 在大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组 织中的表达状况。运用r e a l - t i m e 实时定量p c r 的方法分析了乃砌m r n a 在大 鼠肝、脑、肾、脾组织中的表达水平。并与t r 筘l m r n a 及t r f l a + f l l m r n a 表达 水平进行比较。为了在蛋白质水平研究t r b 在大鼠体内表达的组织特异性，我 们进行了大鼠不同组织的核蛋白提取，应用w e s t e r nb l o t 方法检测t r 3 a 在不同 组织中的表达，用t r l 3 1 分布情况作对照研究。 4 天津医科大学博士学位论文 一、甲状腺激素受体新亚型t r pa 特异性抗体的制备与鉴定 哺乳动物的t r p 基因( 又称c - e r b a 2 和c 响a d ) 都十分庞大，超过3 0 0 k b ， 这是因为t r d 基因不同于t r a 基因，它的5 端有多个外显子通过不同的启动子 和选择性剪接产生不同的亚型【2 6 1 。我们新发现的甲状腺激素受体亚型t r p 是 继t r y l 、t r y 2 、t r p 3 和t r a p 3 之后的第五种t r l 3 基因产物，也是唯一的一 种加长型产物。t r p 由4 9 7 个氨基酸残基组成，与由4 6 1 个氨基酸残基组成 t r i b i 同源性很高。t r l 3 a 与t r j 3 1 的差别仅在于其第1 2 9 个氨基酸残基之后的 一段3 6 个氨基酸残基的片段。目前尚无针对t r p 蛋白的特异性抗体，为了正 确分析此新受体蛋白的表达特点，进而了解其在介导甲状腺激素功能方面所起 的作用。在本部分工作中我们制备了针对此3 6 个氨基酸特异片段的抗t r b 多 克隆抗体。 1 1 对象和方法 1 1 1 对象 1 1 1 1 动物材料：所用健康雄性新西兰大耳朵白兔，体质量2 - 2 5k g ( 3 月龄) ， 购于北京维通利华实验动物有限公司。s c x k ( 京2 0 0 5 - - 0 0 0 2 ) 1 1 1 2 菌种、细胞和载体：大肠杆菌e c o l i j m l 0 9 ，d h 5 a ，b l 2 1 ( d e 3 ) 菌株为本 室保存，重组融合蛋白表达载体p g e x 3 x 1 3 a 3 6 ，p e t d u c t 1 t r p a ( 如图5 ，图6 所示) ，为本所构建及保存。p g e m te a s y 载体购自p r o m e g a 公司。 图5p g e x 一3 x 表达载体 5 天津医科大学博士学位论文 图6p e t d u e t - 1 表达载体 1 1 1 3 试剂：t r l 3 a 特有的3 6 肽的合成由上海波泰生物技术有限公司完成，兔 抗大鼠谷胱甘肽巯基转移酶( g l u t a t h i o n es - t r a a s f e r a s e ，g s t ) i g g 购自g eh e a l t h 公司。抗t r y l 多克隆抗体购自美国a b e a m 公司。辣根过氧化物酶( h r p ) 标记 的山羊抗兔i g g 购自中杉金桥公司。g s t 亲和层析蛋白纯化试剂盒购自g e h e a l t h 公司。b s a ( h 5 0 7 5 ) 、匙孔槭血蓝蛋i 刍( k l h ) 、碳二亚胺、福氏完全佐剂 及福氏不完全佐剂均为美国s i g m a 公司产品。b c a 法蛋白浓度测定试剂盒为美 国p i r e e e 公司产品。预染的中分子量蛋白标志物购自晶美生物工程公司。化学 发光试剂盒为美国p i r e e e 公司产品，胶片为柯达公司产品。透析袋购自b i o s h a r p 公司，酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 、胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 、琼脂( a g a r ) 均为 g i b c ob r l 公司产品。d n am a r k e r 、限制性内切酶购自精美生物工程公司。 t a q d n a 聚合酶、d n t p s 、t 4 d n a 连接酶、r n a s e 抑制剂为i n v i t r o g e n 公司产品。 d n a 凝胶回收试剂盒、氨苄青霉素为北京鼎国生物技术公司产品，超纯质粒提 取试剂盒为北京博大泰克公司产品。异丙基硫代一d 一半乳糖苷( i p t g ) 、溴化 乙锭( e b ) 为m r c 公司生产，其它试剂均为进口或国产分析纯。 1 1 1 4 仪器： d n at h e r m a lc y c l e r4 8 0 扩增仪为美国p e r k i ne l m e rc e t u s 公司产品； d h 2 0 0 0 凝胶图像采集分析系统、s o r v a l ll e g e n dr t 台式高速冷冻离心 机及s o r v a l l p i e o 台式高速离心机为德国h e r a e u s 公司产品；s o n i c a t o r t m 超声 6 天津医科大学博士学位论文 细胞粉碎仪为美国h e a ts y s t e m s u l t r a s o m c s ，i n c 公司产品；亚室温恒温水浴、 紫外透射仪为瑞典l k b 公司产品；u v - 2 5 0 i p c 紫外分光光度计为日本岛津公司 产品；b i o p h o t o m e t e r 分光光度计为德国e p p e n d o r f 公司产品；m u l t i s k a nm s 酶 标仪购自芬兰l a b s y s t e m s 公司；超滤离心管为美国m i l l i p o r e 公司产品。 1 1 2 方法 1 1 2 1t r l 3 a 特异性3 6 a a 肽段的免疫原性分析 对准备用做免疫原的t r b 特异片段进行生物信息学分析，以确定其含有抗 原决定簇，适合作为人工抗原用于免疫过程。连接i n t e m e t ，使用b i o i n f o r m a f i e s t o o l b o x 软件对特异3 6 肽的氨基酸序列进行免疫原性分析。 1 1 2 2 人工抗原( 免疫原) 的制备 1 ) 特异性3 6 肽的合成与鉴定 。 3 6 肽由上海波泰生物公司合成，合成抗原的性质如下所示： 氨基酸序列：p s h t r d e k t g i w f h t d t s s t s l h s v w m l s s r q w d p e 序列来源：大鼠t r p a 蛋白 序列位置：1 2 9 1 6 4 氨基酸数量：3 6 多肽纯度：经h p l c 及质谱分析证实 9 5 2 ) 碳二亚胺( e d c ) 偶联法制各免疫原 a ) 化学合成的1 3 a 3 6 肽与k l h 及b s a 的偶联 称取合成的小肽2 m g 溶于5 0 0 t dm e sb u f f e r