（分析化学专业论文）新型细胞ca2荧光探针的合成及在生命科学研究中的应用.pdf

新型细胞c a 2 + 荧光探针的合成及在生命科学研究中的应用 摘要 细胞内游离c a ! + 作为细胞重要的生理应答反应信使，具有重要的生物学功能。因 此，细胞游离钙含量及其动态分布变化的测定已成为化学、生物学和基础及临床医学 研究中的一个非常重要的研究领域，亦是现代分析化学重要的前沿研究热点。目前胞 内游离钙的测定方法主要是应用t s i e n 等人合成的q u i n 一2 、i n d o 一1 、f u r a 一2 及f l u o 一3 等钙荧光探针而建立的钙荧光指示剂法。然而，该类荧光探针或需要在紫外区激发， 导致细胞自身荧光干扰及光损伤；或与c a ”结合后无荧光峰的位移，难以采用双波长 比率法进行测定：或对于细胞内胞浆、胞核钙无特异性。迄今为止，尚未见既可长波 激发、又与c a 2 + 结合后荧光峰位移、且对胞内c a “测定具特异性、可在亚细胞水平进 行c f + 测定的整体性能优良的钙荧光探针及其在生命科学中的应用研究报道。 本论文的研究主要开展了以下几个方面：1 首次研究设计并成功合成了国内外文 献迄今未见报道的两种新型钙荧光探针( 简称s t d i n 和s t d b t ，已申请国家发明专 利) ，系统研究了所合成钙荧光探针的结构、光谱特性及细胞荧光标记特性。2 以所合 成s t d i n - - a m 为细胞钙荧光探针，采用共聚焦技术，研究了5 一羟色胺诱导培养胃 底平滑肌细胞胞内游离钙动员的机制，并与f l u o ，3 进行比较。表明所合成试剂s t d i n a m 是目前国内外唯一的可以a m 酯型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞 浆特异性c a ：+ 荧光探针。3 首次发现了5 一羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞产生的钙 火花现象，探讨了其形成机制。4 采用了四种不同的活性氧产生体系，对自行合成 c a 荧光探针s t d i n 的耐氧化能力进行了考察。并进而以h ，0 。为外源性活性氧， s t d i n a m 为探针标记h l - - 6 0 细胞，激光共聚焦技术探讨了不同浓度h z o ，对胞内c a 2 + 的影响，从膜结构和生物信号转导的角度研究了氧自由基对培养细胞的生物学效应。 5 采用量子化学方法对新荧光试剂及其c a 2 + 络合物进行了研究，首次从理论上确定 了新荧光试剂及其络合物的几何构型、金属离子在试剂分子中的络合位置，并研究了 试剂结构参数与性能之间的关系。 本文靶向性细胞c a 2 + 荧光探针的设计合成及其在生命科学研究中的应用研究，使 细胞钙的测定由单细胞水平拓展到了亚细胞水平，为更深入的细胞信号转导研究提供 了可行、有效的手段。这一研究结果，对于新型细胞探针试剂的设计合成，揭示生命 科学中的重要生理应答反应信使一胞内游离c a 2 + 的作用机制具有十分重要的理论意 1 1 1 义和应用参考价值。 本研究论文包括以下四个部分： 一细胞c a 2 + 测定方法研究进展( 综述) 对目前常用的几种细胞c a 2 + 测定方法，特别是钙荧光指示剂法中细胞钙荧光探针 的合成研究及测定方法进行了较为详尽的综述，引用截至2 0 0 2 年的文献1 0 3 篇。在 此基础上提出了自己拟进行的研究方向。 二新型细胞c a 2 + 荧光探针的合成及性能研究 1 新型钙荧光探针的合成 设计合成了两种新型钙荧光探针- - s t d i n 和s t d b t ( 其中s t d i n 已制成相应a m 酯型可导入细胞) 。 2 新型钙荧光探针的性能研究 研究了试剂的结构、吸收及荧光光谱特性和细胞荧光标记特性。结果表明，所合 成试剂既具备双波长钙荧光探针f u r a 2 与c d + 结合前后吸收和荧光峰位移，又保持了 长波长钙荧光探针f l u o 。3 荧光激发波长位于可见光区的特性。同时细胞荧光图像分析 显示，s t d i n - - a m 进入细胞后只标记胞浆c e + 而不标记胞核c a 2 + ，是目前唯一的可 以a m 酯型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞浆特异性c a 2 + 荧光探针。并且 其水溶性好，在胞浆内较f l u o 3 等更易于负载。试剂整体性能优于目前国内外广泛采 用的c a 2 + 荧光探针。 三新型c a 2 + 荧光探针在生命科学研究中的应用 1 胞浆特异性c a 2 + 荧光探针s t d i n 用于5 一羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞内游 离钙动员机制的共聚焦研究 首次采用激光共聚焦技术分别进行了新型c a + 荧光探针s t d i n 与f l u o - 3 对胃底平 滑肌细胞的标记，及其对胞内游离c 一+ 浓度变化的响应等特性的比较研究。结果表明， 与f l u o 一3 不同，新型c a ”荧光探针s t d i n 对胞浆c a ”具有靶向性，只标记胞浆而不进 入胞核，是一种真正的胞浆c a 2 + 荧光探针，对5 羟色胺( 5 - h t ) 诱导的胞内游离c a ” 浓度变化的响应更灵敏迅速。应用于5 一h t 诱导胃底平滑肌细胞胞内游离c a ”动员的机 制研究，发现5 一h t 通过促进外钙内流和内钙释放使 c a ” 。升高：在胃底平滑肌5 一h t 升高 c a 2 + 。系通过5 一h t ：受体介导的i p 。c a 2 + 和d g p k c 双信使途径；5 一h t 通过l 型钙 通道促进外钙内流。 2 5 - - h t 诱导胃底平滑肌细胞钙火花的研究 以合成的胞浆特异性c a 2 + 荧光探针s t d i n - - a m 标记细胞，采用激光共聚焦线扫 描技术，首次观察到5 一h t 诱导胃底平滑肌细胞胞内钙释放的最基本单位 i v ( e l e m e n t a r ye v e n t s ) ， “钙火花( c a l c i u ms p a r k s ) ”现象。提出其成因于 肌质网上的单个和若干钙释放通道( 亦称r y a n o d i n e 受体) 的开启的机理。 3 钙荧光探针s t d i n 对活性氧的耐受性和在h 2 0 2 对h l 一6 0 细胞胞浆钙影响研 究中的应用 采用了四种不同的活性氧产生体系：( 1 ) h ，0 。：( 2 ) 黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶( 产生 h 2 0 ，和超氧阴离子自由基0 。一) ；( 3 ) h ：o ，f e 。或h 2 0 ：f e 混合物体系( 产生 o h 自由基) ；( 4 ) h ，0 ，和辣根过氧化酶( h r p ) 体系等，首先对自行合成c a ”荧光探针 s t d i n 的耐氧化能力进行了考察。进而以h ，o ，为外源性活性氧，s t d i n a m 为探针标记 h l - - 6 0 细胞，激光共聚焦技术检测单细胞内c a - - s t d i n 荧光强度变化，探讨了不同 浓度h ，o 。对胞内c a - + 浓度的影响，从膜结构和生物信号转导的角度研究氧自由基对培 养细胞的生物效应。 四新型钙荧光试剂及其络合物的量子化学研究 本文运用m o p a c 6 0 和g a u s s i a n9 8 程序中的全优化的a m l 和p m 3 两种半经验 方法，对新型钙荧光试剂及其c d + 络合物进行了研究，理论上首次确定了新荧光试剂 及其c a 2 + 络合物的几何构型和金属离子在试剂分子中的络合位置。分别利用计算所得 的分子几何构型及h o m o 和l u m o 能级差对试剂与c a 2 + 配位后吸收和激发峰紫移、 利用试剂及络合物分子几何构型的差异对试剂与c a 2 十配位后荧光强度和荧光光谱的 变化、以及分子总能量和试剂分子中可键合原子的静电荷密度对不同取代基试剂与 c a ”配位后离解常数各异等现象进行了探讨。结果，理论计算预测与实验事实基本吻 合，表明利用量子化学计算可为新试剂的合成设计提供理论指导。 关键词：靶向性细胞c a ”荧光探针，激光共聚焦显微镜，细胞c a 2 + 测定，5 - - 羟色胺， 胃底平滑肌细胞，钙火花，活性氧，h l - - 6 0 细胞，量子化学计算 v s t u d y a n d s y n t h e s i s o fn o v e lf l u o r e s c e n c ec a 2 + p r o b ei n b i o s c i e n c e a b s t r a c t c a l c i u ms e r v e sa sai n t r a c e l l u l a rs e c o n dm e s s e n g e ra n dm e d i a t o r p l a yav e r yi m p o r t a n t r o l ei nb i o l o g i c a ls y s t e m s c o n s e q u e n t l y , t h em e a s u r e m e n to f c y t o s o l i cc a 2 + h a s b e c o m ea n i m p o r t a n t a r e ao fi n v e s t i g a t i o ni n b i o l o g i c a l a n dm e d i c a lr e s e a r c h a t p r e s e n t ，m o s t m e a s u r e m e n to fi n t r a c e l l u l a rc a 2 + a r ea c c o m p l i s h e d u s i n g f l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r s d e v e l o p e db yt s i e n ，s u c ha sq u i n 2 ，i n d o 一1 ，f u r a - 2 a n df l u o - 3 。t h ei n d i c a t o r s q u i n 一2 ， i n d o l a n df u r a - 2h a v et h ea d v a n t a g eo f w a v e l e n g t h - s h i f tu p o nb i n d i n gc 一+ b u ts h a r ea c o m m o nd r a w b a c ki nt h a tt 1 1 ee x c i t a t i o nb a n d sf o rt h e s ei n d i c a t o r so c c u ra tu v w a v e l e n g t h ( 3 4 0 3 6 0 n m ) ，w h e r e a u t o f l u o r e s c e n c ef r o mc e l l si sh i g h ，r a d i a t i o n d a m a g eo f c e l l u l a rs t r u c t u r e si s s e r i o u s ，t h et r a n s m i s s i o no fm i c r o s c o p eo p t i c s i s p o o r , a n dt h e a v a i l a b i l i t yo fa b e r r a t i o n c o r r e c t e do p t i c sf o rc o n f o c a lm i c r o s c o p yi sl i m i t e d f l u o - 3 ，a v i s i b l e l i g h t e x c i t a b l ec a ”i n d i c a t o r , o v e r c o m e sm el i m i t a t i o n o fq u i n 一2 i n d o - 1a n d f u r a - 2b u tn ol o n g e rd i s p l a ya n ys p e c t r a ls h i f t s u p o nc a 2 + b i n d i n ga n dt h u sr a t i o m e t r i c m e a s u r e m e m sa r en o tp o s s i b l e i na d d i t i o n ，a l lo ft h e s ei n d i c a t o r sd e s c r i b e da b o v ea r e d i f f i c u l tt ot a r g e tp r e c i s e l yt os p e c i f i ci n t r a c e l l u l a rl o c a t i o n s w h e n t h e y a r et r a n s f e c t e di n t o c e l l s ，t h e yn o to n l yd i s t r i b u t e di nc y t o s o l i cc o m p a r t m e n tb u ta l s oi nt h en u c l e u sa n dt h i s m a y c a u s es o m e d i s a c c u r a c yf o r r e a lc y t o s o l i cc a 2 + m e a s u r e m e n t i nv i e wo ft h ea b o v e d i s c u s s e d t e c h n o l o g i c a lb a c k d r o p ，i ti sa p p a r e n tt h a tt h ef i e l dh a s u r g e n t l y a w a i t e dt h ei n n o v a t i v e d e v e l o p m e n t o f l o n g - w a v e l e n g t h a n dr a t i o m e t r i c f l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r sw h i c ha r e c o n c o m i t a n t l ya b l et ot a r g e tp r e c i s e l yt os p e c i f i c i n t r a c e l l u l a rl o c a t i o n s i nt h i s t h e s i s ，t h ei n v e s t i g a t i o n si n c l u d et h ef o l l o w i n gs e v e r a la s p e c t s ：1 t w on e w f l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r ss t d i na n ds t d b th a v eb e e n d e s i g n e da n ds y r l m e s i z e d t h e s t r u c t u r e sa n da b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s er e a g e n t sh a v e b e e n t h o r o u g h l y s t u d i e d 2 c o n f o c a l m i c r o f l u o r o s c o p ea n dt h en e wf l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o rs t d i n a m w e r eu s e dt o i n v e s t i g a t e 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n o ( 5 一h t ) o ni n t r a c e l l u l a rc a l c i u md y n a m i c s v i t h em e c h a n i s mo f i nc u l t u r e dr a ts t o m a c h f u n d u ss m o o t hm u s c l ec e l l sc o m p a r i n gw i t h 也a to ff l u o 3 t h er e s u l t ss h o w n 也a tt h en e w f l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r , s t d i n ，d e v e l o p e di no u rl a b o r a t o r y n o to n l yc a ni tb ee x c i t e d b yv i s i b l el i g h tb u ta l s od i s p l a y sas p e c t r u m s h i f tu p o nb i n d i n gw i t hc a ”m o r e o v e r , i t t a r g e t sp r e c i s e l yi n t oc y t o s o lo n l y , a n dt h e r e b ye x h i b i t sg r e a ta d v a n t a g eb e y o n df l o u 一3a n d f u r o 一2 t h u si ti sp o s s i b l et ou s es t d i n - a mt om e a s u r er e a l t i m ev a r i a t i o no f 【c a 2 + 】i n c y t o s 0 1 3 5 - h ti n d u c e dl o c a lc rt r a n s i e n t s ( c a 2 + s p a r k s ) i nc u l t u r e dr a ts t o m a c hf u n d u s s m o o t hm u s c l ec e l l s ( s f s m c ) w a sf i r s to b s e r v e db y u s i n gt h e n e wf l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o rs t d i na n dl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e t h em e c h a n i s m so fi n i t i a t i o no f c a 2 + s p a r k sa n dp r o p a g a t i n gc a 2 + w a v e sa n dt h e i rr e l a t i o nt oe - cc o u p l i n gw e r ea l s o d i s c u s s e d 4 t h ee f f e c t so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e so nt h es p e c t r a lp r o p e r t i e so ft h en e w f u o r e s c e n tc 一+ i n d i c a t o rs t d i nw e r ee v a l u a t e du s i n gf o u rd i f f e r e n to x i d a n t - g e n e r a t i n g s y s t e m s t h ee f f e c to fh y d r o g e np e r o x i d eo nt h ei n t r a c e l l u l a rc a z + l e v e l so fh l 6 0c e l l s l a b e l e d 、i t l ls t d i nw a ss t u d i e da l s o 5 t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t r u c t u r ea n dt h e p r o p e r t i e so ft h en e wf l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r sw e r es t u d i e du s i n gq u a n t u m - c h e m i c a l c a l c u l a t i o n s t h et h e s i si n c l u d e sf o u r p a r t s ： 1 m e a s u r e m e n to f c e l lc a l c i u m ( r e v i e w ) m e t h o d sf o rt h ei n t r a c e l l u l a rc a 2 + m e a s u r e m e n ts u c ha sa e q u o r i n ，m e t a l l o c h r o m i c i n d i c a t o r s ，i o n s e l e c t i v ee l e c t r o d e sa n df l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r s ，p a r t i c u l a r l yt h e f l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r sw e r er e v i e w e di nd e t a i l 2 s y n t h e s i so f n e wf l u o r e s c e n c ec a 2 + i n d i c a t o r sa n d s t u d yo nt h e i rp r o p e r t i e s t o wn e wf l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o r ss t d i na n ds t d b th a v eb e e n d e s i g n e da n d s y n t h e s i z e da n dt h e i rs t r u c t u r e s ，s p e c t r a la n db i o l o g i c a l p r o p e r t i e s h a v eb e e ns t u d i e d t h o r o u g h l y t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ev i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo fs t d i n a n ds t d b td i s p l a yad r a m a t i cs h i f t i nt h el o n gw a v e l e n g t hm a x i m a lf r o m5 4 0 u r nt o 4 2 4 n ma n d5 0 7 n mt o4 0 4 u mr e s p e c t i v e l yu p o nc a 2 + b i n d i n g t h ee m i s s i o nm a x i m u m c e n t e r e da t6 1 0 n ma n d6 0 0 u mi sw e l ls h i f t e df r o m t h ea b s o r p t i o n t h e s ef e a t u r e sm a d et h e s t d i na n ds t d b tn o to n l yc a nb eu s e di nv i s i b l e l i g h tr e g i o n st ot h e r e b ya v o i dt h e a u t o f l u o r e s c e n c ea n do t h e r p r o b l e m sa s s o c i a t e dw i t ht h eu s eo f u ve x c i t a t i o nw a v e l e n g t h s b u ta l s oc a nb eu s e da sar a t i o m e u i ci n d i c a t o r s f u r t h e r , t h er e s u l t sa l s os h o w e d t h a t ，i n c o n t r a s tw i t hf l u o - 3 ，w h e ns t d i nw a st r a n s f e c t e di n t oc e l l s ，i tw a s u n i f o r m l yd i s t r i b u t e di n t h ec y t o s o l i c c o m p a r t m e n t b u te x c l u d e df r o mt h en u c l e u s ，t h i sf e a t u r ei ss i g n i f i c a n tb e c a u s e i tm a d et h es t d i nar e a l l y c y t o p l a s m i c c a ri n d i c a t o ra n dc a nr e f l e c t c h a n g e s o f c y t o p l a s m i c c a 2 + m o r ea c c u r a t e l yt h a nt h a to f f l u o 一3 i na d d i t i o n ，s t d i nr e s p o n s et h e c a 2 + 】i t r a n s i e n t sm o r es e n s i t i v ea n df a s t e rt h a nf l u o 一3 3 b i o l o g i c a la p p l i c a t i o n so f t h en e wf l u o r e s c e n c ec a 2 + i n d i c a t o rs t d i n - a m 3 1 ac o n f o c a l s t u d yo ft h em e c h a n i s mo f5 - h y d r o x y t r y p t a m i n o o ni n t r a c e t l u l a r c a l c i u md y n a m i c si nc u l t u r e dr a ts t o m a c hf u n d u ss m o o t hm u s c l ec e i l sw i t han e wc a 2 + i n d i c a t o rs t d i n a m t h eu s eo ft h en e wv i s i b l ew a v e l e n g t hf l u o r e s c e n tc a 2 + i n d i c a t o rs t d i n a mi n d e t e c t i n g 【c a 2 + i t r a n s i e n t si nc u l t u r e ds m o o t hm u s c l ec e l l sc o m p a r i n gw i t ht h a to ff l u o 一3 w a sd e m o n s t r a t e d ，a n dt h em e c h a n i s mo f5 - b y d r o x y t r y p t a m i n o ( 5 - h t ) o ni n t r a c e l l u l a r c a l c i u md y n a m i c si ns t o m a c hf o n d u ss m o o t hm u s c l ec e l l s ( s f s m c ) o fr a t sb yu s i n gt h i s n e wc a 2 + i n d i c a t o rw a s i n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e d t h a ti nc o n t r a s tw i t h f l u o - 3 ，s t d i nt a r g e t sp r e c i s e l yi n t oc y t o s o lo n l ya n dt h e r e b ye x h i b i t sg r e a ta d v a n t a g e b e y o n df l o u 3 a n df u r o - 2 t h u si ti s p o s s i b l et o u s es t d l n a mt om e a s u r er e a l t i m e v a r i a t i o no f c a z * 】i ne y t o s o t 1 1 1 er e s u l t sa l s os h o w e dt h a t ，5 - h ta c t sv i a5 - h t 2 r e c e p t o r s o ns f s m c t h e n t h r o u g h5 - h t 2r e c e p t o r sm e d i a t e di p s c 一+ a n dg c p k cd o u b l es i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y st oc a u s ec a 2 + r e l e a s ef r o mi n t r a c e l l u l a rc a 2 - s t o r e sa n df o l l o w e d c a 2 + i n f l u xp o s s i b l yt h r o u 曲l - t y p ec a l c i u mc h a n n e l s 3 2 ac o n f o c a ls t u d yo ft h e5 - h y d r o x y t r y p t a m i n o i n d u c e dc a l c i u ms p a r k si nc u l t u r e d r a ts t o m a c hf u n d u ss m o o t hm u s c l ee e l i sw i t han e wc 矿i n d i c a t o rs t d i n - a m c o n f o c a lm i e r o f l u o r o m e t r ya n dt h en e wc a 2 + i n d i c a t o rs t d i n a mw a su s e dt os t u d y t h ee f f e c t so f5 - h y d r o x y t r y p t a m i n oo nl o c a l i z e di n t r a c e l l u l a rc a l c i u ms i g n a l i n g ，t e r m e d “c a 2 + s p a r k ，i nc u l t u r e dr a ts t o m a c hf u n d u ss m o o t hm u s c l ec e l l s n 伦r e s u l t ss h o w e dt h a t u n d e rc d + o v e r l o a dc o n d i t i o n s a d d i t i o no f5 - h y d r o x y t r y p t a m i n or e s u l t s i nag r a d u a l p o t e n t i a t i o no fs p a r k sd u et oo p e n i n go fas m a l lc l u s t e r ( o rp e r h a p se v e nas i n g l eo n e ) o f r y a n o d i n e - s e n s i t i v ec a 2 + r e l e a s ec h a n n e l sl o c a t e di nt h em e m b r a n eo ft h es a r c o p l a s m i c r e t i e u l u m ( s i n 3 3 s t u d y o ft h ee f f e c to fr e a c t i v e o x y g e n o nt h e p r o p e r t i e s o fs t d i na n d i n t r a c e l l u l a rc a 2 + l e v e l so f h l 6 0c e l l s t h ee f f e c t so f r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e so n t h e s p e c t r a lp r o p e r t i e so f t h en e w f u o r e s c e n t c a 2 + i n d i c a t o rs t d i nw e r ee v a l u a t e d u s i n gf o u rd i f f e r e n to x i d a n t g e n e r a t i n gs y s t e m s t h e e f f e c to f h y d r o g e np e r o x i d eo nt h ei n t r a c e l l u l a rc a 2 + l e v e l so fh l 6 0c e l l sl a b e l e dw i t h v i i i s t d i nw a ss t u d i e da l s oa n ds h o w i n g t h a t ，t h ei n t r a c e u u l a rc a 2 + l e v e l so f h l 6 0c e l l sw e r e r e l i e dt ot h ed o s a g eo f h y d r o g e np e r o x i d e 4 q u a n t u m - c h e m i c a ls t u d yo fn e wf l u o r e s c e n c ec a 2 + i n d i c a t o r sa n dt h e i rc a 2 + c o m p l e x e s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t r u c t u r ea n dt h ep r o p e r t i e so ft h en e wf l u o r e s c e n tc a 2 i n d i c a t o r sw e r es t u d i e d u s i n gq u a n t u m - c h e m i c a l c a l c u l a t i o n s t h e f u l l yo p t i m i z e d g e o m e t r i e s ，e n e r g i e s ，n e tc h a r g e sf o rt h e s er e a g e n t sa r eo b t a i n e df r o ms e m i e m p i r i c a lm o ( a m la n dp m 3 ) c a l c u l a t i o n s s o m er e g u l a r i t i e so ft h ee l e c t r o n p r o p e r t yr e l a t i o n s h i po f t h e s e r e a g e n t sa r ef o u n d k e y w o r d s ：t a r g e t a b l e i n t r a c e l l u l a rf l u o r e s c e n t c a 2 + i n d i c a t o r ；c o n f o c a l m i c r o f l u o r o m e t r y ；i n t r a c e l l u l a rc a 2 + m e a s u r e m e n t ；5 - h y d r o x y t r y p t a m i n o ；s t o m a c hf u n d u s s m o o t hm u s c l e c e l l s ；c a 2 + s p a r k ；r e a c t i v eo x y g e n ；h l 6 0c e l l s ；q u a n t u m c h e m i c a l c a l c u l a t i o n s i x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的成果，也不包含为获得西北大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示 谢意。 学位论文作者签字： 签字日期：年月日 第一章绪论 1 1 引言 钙是人体内极其重要的金属元素( 日必需量为1 0 m g k g 左右) ， 广泛分布于人 体的细胞和体液之中。c a 2 + 除了作为组成骨骼、牙齿的主要原材料外，还参与、调 控众多的生命过程。它不仅直接激活具有重要生理意义的胞内机械活动，如肌肉 收缩等，而且也作为胞内第二信使介导胞外信号( 如激素) 对胞内的反应。c a 2 + 对细胞的代谢与功能的调节作用几乎涉及到细胞的所有生理和生化过程，如细胞 的胞吞、胞饮、神经递质释放、d n a 合成、细胞分裂、乃至细胞死亡等。随着人 们对于钙代谢、钙通道、钙受体及其调控，钙的转运和利用及其与某些疾病发生 和发展关系的认识越来越深入，胞内c a 2 的研究已成为化学、生物学、基础和临 床医学等学科重要的前沿热点研究课题。 1 2 胞内c a 2 + 的分布及其信使作用 c a 2 + 行使其胞内信使的作用，对细胞代谢和功能进行调节是通过胞内自由c a ：+ 含量及分布的变化，以及由此而引发的与蛋白质或酶的特异性结合而实现的。 钙在体内是以结合钙和游离c a 2 + 两种形式存在。自由离子状态的游离c a 2 + 具 有生理活性。游离c a 2 + 又分为细胞外c a 2 + 和细胞内c a 2 + 。通常情况下，细胞外液 中的 f i 9 1 1 细胞钙分布示意图 钙约5 0 6 0 是结合钙，游离c a 2 + 浓度仅为0 1 1 0 m m o l l 。细胞内钙则9 9 9 以结合钙的形式存在，且其分布极不均匀。细胞内总钙浓度约在m m o l l 水平， 5 0 存在于细胞核；被称之为“钙库”的细胞器，如线粒体和内质网中各占3 0 和1 4 ，浓度分别约为o 6 m m o l l 和0 2 8 m m o l l ；质膜( 外层) 约0 1 m m o l l ， 占5 ；而细胞溶质中钙仅占总钙的0 5 ( 结合钙) 或0 0 0 5 ( 游离c a ”) 。细胞在 静息态( 非激活) 时，胞质c a 2 + 浓度约为1 0 - 7 1 0 - s m m o l l ，其代表性取值约为 0 1u m o l l 。如图1 + 1 所示。 由图1 1 可见，细胞c a ”的分布极不均匀，在胞质与胞内钙库、胞质与胞外 c a 2 + 之间均存在有大的浓度梯度，相差约3 4 个数量级。由于胞内c a 2 + 浓度很低， 而胞外和胞内钙库中c a 2 + 浓度要高几个数量级，因此，一旦受到刺激，即使胞外 有少量的c a 2 + 进入胞内溶质或钙库释放略有增大，均可导致胞浆内c a 2 + 浓度大幅 度增加，继而发生与一些能够与c a 2 + 高度亲和的蛋白质或酶的结合，使其激活， 引发细胞一系列生理、生化反应，从而起到传递胞外信号的作用。由此可见，胞 内游离c a 2 + 浓度的变化是细胞生理功能的重要物质基础，胞内游离c a ”浓度的调 节也就成为信息传递过程中的关键环节。 1 3 胞内游离c a 2 + 的测定研究进展 如上所述，胞内游离钙具有重要的生理功能。细胞内游离钙浓度及其分布的变 化代表着某种细胞功能的启动、加强和抑制，是形成c a 2 + 信号的基础。通过观察 细胞内c a 2 + 水平提高或抑制时相应生理应答反应的变化，有助