（生物医学工程专业论文）紫花苜蓿液泡膜NaltgtHltgt逆向转运蛋白基因的克隆、表达分析及转化.pdf

重庆大学硕士学位论文 英文摘要 。“。1一 v a c u o l a rc o m p a r t m c n t a t i o no f n a + t h r o u g hn a + h + a n t i p o r t e r si nt h el a r g ev a c u o l e m e m b r a n ei sa l le s s e n t i a lm e c h a n i s mf o r s a l i n i t yt o l e r a n c eo fp l a n t s f i r s t s e q u e s t r a t i o j l o fn a + i n t ov a c u o l ec o u l dl o w e rc y t o s o l i cn a + l e v e l w h i c hk e e p sr e d u n d a n tn a + f r o m t h es i t e so fm e t a b o l i s ma n da l l e v i a t e st h et o x i ce f f e c t st o e n z y m e sa n dm e m b r a n e s y s t e m ；s e c o n d ，p l a n tc o u l d t a k ea d v a n t a g eo f e n o u g h n a + i nv a c u o l et ol o w e rt h ew a t e r p o t e n t i a lo f c e l la n dt or e s i s tt h eo s m o t i cs t r e s so f s a l t m o r e o v e r , e f f i c i e n tn a + u p t a k e i n t ov a c u o l ec o u l dm a i u t a i nt h e h i g hc y t o s o l i ck + n a + r a t e b y t h em u l t i p l ya l i g n m e n to fa m i n oa c i ds e q u e n c e sa n dn u c l e o t i d ea c i d s e q u e n c e s o fs e v e r a lp l a n t sv a c u o l em e m b r a n e n a + h + a n t i p o r t e r si ng e n b a n k , ap a i ro fd e g e n e r a t e p r i m e r sw a sd e s i g n e da g a i n s tt h ec o n s e r v e dr e g i o n st h a tw a su s e df o rr t - p c rt o a m p l i f ya2 8 8 b pe d n as e g m e n t f r o mt h e m e d i c a g o s a t i v al b a s e do nt h es e q u e n c eo f t h ec d n a s e g m e n t ，p r i m e rw a sd e s i g n e df o r3 r a c ea n da1 5 3 6 b pe d n as e g m e n t w a sa c q u i r e d ；f r o mt h e s e q u e n c eo f3 e n do ft h eg e n e ，p r i m e rw a sd e s i g n e df o r 5 r a c ea n da 1 0 8 2 b p e d n a s e g m e n t w a s a c q u i r e d t h ef u l l l e n g t he d n a w a s g a i n e d b yo v e r l a p p i n gs e q u e n c e s ，a n dt h ea n a l y s i so ft h es e q u e n c ei n d i c a t e st h a ti tc o n t a i n e s a n o p e nr e a d i n gf r a m e ，c o m p r i s i n g5 4 1a m i n oa c i dr e s i d u e s t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e c o m p a r e db y b l a s tr e v e a l e dh i g hh o m o l o g yw i t ht h o s eo fo t h e r p l a n t v a c u o l em e m b r a n e n 矿，h + a n t i p o r t e r s a n dt h es i m i l a r i t yt ol n n h x l w a st h eh i g h e s tw i t h7 8 ，t h er e s u l t i n d i c a t e st h eg e n ec l o n e df r o ma l f m f ai sav a c u o l em e m b r a n en a + h + a n t i p o r t e rg e n e n a m e d 如酲y z a n di t sg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ri sa y 4 5 6 0 9 6 s e m i q u a n t i t i v er t p c rw a sp e r f o r m e dt or e v e a lt r a n s c r i p tl e v e lo fm s n h x l i n d i f f e r e n tt i s s u e sa n du n d e rd i f f e r e n ta b i o t i cs t r e s s e s t h er e s u l t si n d i c a t e dj 】l f 订吁7w a s a b u n d a n ti nl e a fa n ds t e m ，r a t h e rt h a ni nr o o t ；f u r t h e r m o r e ，u n d e rt h e2 0 0 m mn a c l s t r e s s t h et r a n s c r i p tl e v e lo fm s n h x lw a su p - r e g u l a t e da n dr e a c h e di t sp e a ka f t e r6 h o u r s ，w h e nd r o u g h ta n d c o l dt r e a t m e n tc o u l dn o t 1 1 1 cc o d i n g r e g i o no f m s n h x lw a si n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp b l l 2 1a n d t h er e c o m b i n e dv e c t o rw a sn a m e da sp b i n h x t h e np b 】n h xw a sj n t r o d u c e di n t o a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4 a l f a l f aw a s t r a n s f e r r e db yl e a f d i s k e x p e c t i n g t o g a i nm s n h x lo v e r e x p r e s s i o np l a n t a f t e rs e l e c t i o nb ya n t i b i o t i c s ，t h er e g e n e r a t e d p l a n t sw e r eo b t a i n e da n dp c ra n a l y s i so ft h e ms h o w e dt h e yw e r ea l l p c r p o s i t i v e l i n e s k y e w o r d s ：m e d i c a g o s a t i v a l ，v a c u o l em e m b r a n e ，n a + h + a n t i p o r t e r ，r t - p c r ， o v e r e x p m s s i o n u 重庆大学硕士学位论文 缩略词 缩略词 英文缩英文名称 a b aa b s c i s i ca c i d a c r a c r y l a m i d e a m pa m p i c i l l i n a t pa d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e a m p a m p i c i l l i nr e s i s t a n c e b i s n ，n - m e t h y l e n e b i sa c r y l a m i d e b s ab o y i ns e r l l ma l b u m i n c a m p c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e e d n a c o m p l e m e n t a r y d n a d d h 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，一d e o x y n u c l e o t i d e t r i p h o s p h a t e s ( u s u a l l y a d m m i xo f d a t i d t r p d c t p d g t p ) d t td i t h l o t h r e i t o l e be t h i d i u mb r o m i d e e c o l ie s c b e r i c h i ac o l j e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d g u s b - g l u c u r o n i d a s e i p t g i s o p r o p y l t h i o b - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n k a n a m y c i n k di r a l o d a l l o n l bl u r i a - b e r t a n im e d i a m a p km i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m i nm i n u t e 1 1 1 中文名称 脱落酸 丙烯酰胺 氨苄青霉素 三磷酸腺苷 氨苄青霉素抗性 亚甲基双丙烯酰胺 牛血清白蛋白 环腺苷酸 互补d n a 双蒸水 焦碳酸二乙脂 脱氧核糖核酸 脱氧腺苷三磷酸 ( 山 t p d r r p ，d c t p d g t p 的混合物) 二硫苏糖醇 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 6 一葡萄糖苷酸酶 异丙基b d 硫代半乳糖苷 卡那霉素 千道尔顿 l b 培养基 有丝分裂原激发的蛋白激酶 分钟 重庆大学硕士学位论文缩略阋 s e c m s 0 d p c r p m r n a r i f r m p s d s t r i s x g a i s e c o n d m u r a s h i g e s k o o g m e d i a o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p l a s m am e m b r a n e r i b o n u l e i ca c i d r i f a m p i c i n r o u n d s p e r m i n u t e s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 5 一b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 i n d o l y l - b d g a l a c t o s i d e 秒 m s 培养基 光密度 聚合酶链式反应 质膜 核糖核酸 利福平 每分钟转速 十二烷基磺酸钠 三羟甲基氨基甲烷 5 溴4 氯3 吲哚b d 半乳 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 1 绪论 1 1 植物液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的研究进展 当环境中盐分浓度过高时，植物在吸收水分的同时，n a + 随着蒸腾流进入 植物细胞，由于植物不断地进行蒸腾作用，细胞内的n a + 就会产生定的积累， 而过多的n a + 就会破坏细胞内的离子平衡，列细胞内的酶类和膜系统造成伤害； 同时，外界环境中过多的盐分也会影响其它营养离子的吸收，从而造成离子毒 害【1 2 l 。植物为了应付盐胁迫造成的伤害，可以通过三种方式降低n a + 在胞内累 积量。其一是通过选择性地离子吸收，如对k + n a + 亲和性高的a k t l 和h k t l 可以有效地阻止n a + 进入细胞质内1 3 “】；二是通过n a + 的外排作用将进入胞质内 的n a + 重新运回到胞外介质中【5 1 ：三是内膜转运系统将进入胞质内的n a + 转运到 特定的细胞器中，从而将n a + 区隔化【6 】。其中后两者都涉及到一类名为n a + h + 逆向转运蛋白的蛋白家族，它们是植物膜系统上普遍存在的一类离子转运蛋自， 参与n a + 的外排或者n a + 在胞质中的区隔化作用，是植物降低胞质n a + 累积、抵 御盐分胁迫的一种重要机制。近年来，随着植物分子生物学研究的不断进展， 编码植物液泡膜n a + 皿+ 逆向转运蛋白的基因已经在多种植物中被克隆出来，它 们在植物耐盐性中的功能得到普遍的关注1 6 。 1 1 1n a + 在液泡膜中区隔化效应 液泡是植物成熟细胞中最大的细胞器，能贮存营养和代谢产物，避免有毒 物质对细胞质的伤害，大大提高细胞表面积与体积之比，有利于细胞与环境问 的物质交换，在细胞化学能利用、信号转导、膨压和耐盐性中起到重要作用。 在正常生理条件下，植物细胞质维持着较高的k + n a + ，而盐分胁追必然导致 n a + 过量的流入细胞内。虽然所有植物都有大量n a + 流入细胞，但是盐生植物和 较为耐盐的甜土植物都要把胞质内的n a + 保持在非毒性水平，大多数植物把n a + 区隔化入液泡，从而有效地降低了胞质中的n a + 浓度，为消除n a + 在细胞质中 的不利影响提供了一个有效机制。另外，将n a + ( 和c l + ) 贮存于液泡中可以作 为渗透调节剂1 7 8 期，保持渗透势以驱动水分进入细胞。从能耗角度看，将积累 于液泡中的无机盐离子作为渗透调节剂与在胞质中累积有机溶质相比，后者需 要多消耗几十倍的能量 1 0 1 。同时赫分积累于液泡中也是维持细胞质中高k + 小a 十 比的最有效机制之一。鉴于盐分区隔化机制在植物盐适应过程中的重要作用， 其中最为关键的运输蛋白n a + h + 逆向转运蛋白研究日益受到重视。 1 1 2 植物液泡膜n a + i - i + 逆向转运蛋白基因的分离 液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的研究始于酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 。 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 9 9 7 年，n a s s 等f 1 1 1 通过对酵母质膜扩- a t p a s e 功能缺失突变体( p m a l ) 的研究， 发现该突变体具有较高的耐盐性和低的胞质n a + 浓度，表明酵母除了通过质膜 h + - a t p a s e 提供的能量将n a + 外排这一机制外，还存在细胞内的n a + 区隔化机制。 随后他们分离出一个基因s c n h x l ，对其功能的分析发现其编码n a + h + 逆向转运 蛋白，而s c n h x 2 基因的突变体对盐非常敏感，s c n h x l 与g f p 的融合表达显示 s c n h x l 蛋白定位于前液泡膜上，而液泡膜上h + 移位酶即h * - a t p a s e 和h + p p i a s e 产生跨液泡膜的h + 电化学势梯度，为n a + m + 逆同转运蛋白提供驱动力i l l , j 2 l 。 自1 9 8 5 年b l u m w a l d 和p o o l e 首先在甜菜根部贮藏组织的液泡膜上发现n a + h + 逆向转运活性以来1 1 3 l ，人们相继发现在盐生植物如滨藜( a t r i p l e xg m e l i n i ) 1 1 4 i 、冰 叶日中花( m e s s e m b r a n t h m u mc r y s t a l l i n u m ) ”】等和较耐盐的甜土植物如大麦 ( b a r l e y ) ”i 、海滨车前( p l a n t t a g om a r i t i m a ) 1 1 7 j 、长春花( c a t h a r a n t h e u sr o s e u s ) 1 1 8 l 、 向日葵( g e l i a n t h g i g a n t e u s ) | ”i 等的液泡膜上普遍存在着n a + h + 逆向转运活性，而酵 母的液泡膜n a + 舻逆向转运蛋白基因n h x l 的分离鉴定以及拟南芥功能基因组研 究的进展无疑加速了对植物液泡n a + h + 逆向转运蛋基因的分离进程。 1 9 9 9 年，g a x i o l a 等 2 0 l 用与s c n h x l 基因高度同源e s t ( e x p r e s s i o ns e q u e n c e t a g ) 序列从拟南芥噬菌体c d n a 文库中克隆出第一个高等植物的n a + h + 逆向转运 蛋白的基因m t n b x l 。a t n h x i 基因产物是一含有5 3 8 个氨基酸残基的多肽，具有 多个跨膜结构。序列同源性比较显示a t n h x l 与酵母的s c n h x l 以及人n a 机r 逆 向转运蛋白h s n h e 6 在一些跨膜部位具有高度的同源性。y a m a g u c h i 等对 a t n h x l 的拓扑学分析发现其含有1 2 疏水区域，其中9 4 是跨膜结构，另外三个 只是和膜有关系，但并不跨膜；另外a t n l 1 含有一个长的c 末端亲水区域，位 于液泡内，去掉该区域将导致n a + i - i + 转运相对速率的急剧增加，说明其对a t n h x l 的活性调节具有重要作用【2 1 1 。 随后，f u k u d a 等用类似的方法从水稻c d n a 文库中分离出水稻液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基i 天i o s n h x l 2 2 】。其编码的蛋白与拟南芥的a t n h x l 具有7 3 的同 源性，在预测的跨膜区域与s c n h x l 和h s n h x 6 也具有高度的同源性。系统发育 分析显示，o s n h x l 与同样来自内膜的a t n h x l 、s c n h x l 和h s n h e 6 亲缘关系较 近，可能具有同一起源，而与质膜系统的逆向转运蛋白( 如细菌的n h a 等) 相距较 远。 紧接着，h a m a d a 等【2 3 l 、a p s e 等t 2 4 通过同源序列法在一些极为耐盐的植物中 分离出液泡膜n a + 逆向转运蛋白基因，如滨藜f f t i a g n h x l 、甜菜的b v n h x l 等。 这些基因编码的蛋白之间都具有极高的同源性，且都含有多个跨膜区域，都有利 尿药物氨氯毗嗪脒( a m i l o r i d e ) 作用位点( l f f l y l l p p i ) 。早期有关哺乳动物 n a + f h + 交换器研究已经显示，氨氯毗嗪脒对其活性具有抑制作用口i ，因此可以用 重庆大学硕士学位论文1 绪论 来研究液泡膜n a + h + 逆转运蛋白的活性。 1 1 3 植物液泡膜n a + 】r 逆向转运蛋白基因的功能与作用机制 既然植物液泡膜n a + m + 逆向转运蛋白与酵母的s c n h x i 具有极高的同源性+ 因此酵母s c n h x i 基因突变体( a n h x l ) 成为研究植物液泡膜n a + 小+ 逆向转运蛋 白基因功能的极好材料。g a x i o l a 等 2 0 l 将拟南芥t n h x l 基因在酵母中进行异源表 达，菌落平板分析表吼4 t n h x l 的表达能抑制突变体a n h x l 对n a c i 以及潮霉素b ( h y g r o m y c i nb ) 的敏感性，但对n a c l 敏感表型的抑制不是很明显，并且需要培 养基低浓度的k + 水平，对此他们认为可能是由酵母和植物的逆转运蛋白之问调节 差异或者对阳离子转运选择性不同所造成的；另外，用2 5 0 m mn a c l 和2 5 0 m mk c l 分别处理植物6 小时，n o r h t e m 杂交显示4 t n h x l 的转录水平分别提高4 2 倍和2 8 倍。q u i n t e r o 等【冽也将4 悯基因转移到酵母突变体an h x l 进行表达，结果显示 转基因酵母细胞增加了对n a c i 的摄入量，并且进入胞质的n a c l 大部分被区隔到 液泡中，而突变体对n a + 的抗性也得到了恢复，但不能恢复质膜n a + h + 逆向转运 蛋白基因n h a l 突变体的耐盐性。说明拟南芥，哇t n h x i 基因与酵母内源的s c n h x l 基 因的功能相似，但与质膜n a + h + 逆向转运蛋白并不相关。随后，在滨藜和甜菜中 也都证实，植物液泡膜n a + a i + 逆向转运蛋白基因可以弥补酵母& 删基因缺失 的功能1 2 3 , 2 4 】。 但为了更好的说明忉t n h x i 基因的功能，必须要分析其在植物体内的功能。 a s p e 等在拟南芥体内过表j 盘_ a t n h x l 基因，从转化植株分离完整的液泡，发现转 基因植株液泡n a + ，旷交换率比野生型高得多，而液泡中n a + 含量也较高。用含 2 0 0 r n mn a c i 的盐水浇灌，转基因植株能够完成熬个生命周期，并且没有表现出 明显的生长缺陷f2 7 1 。同时，他们用a t n h x l 的c 末端产生的多抗免疫印迹液泡膜 和质膜片段证实a t n h x l 是定位于液泡膜上【2 7 】。最近，有关，4 基因突变体 研究迸一步证实了a t n h x l 基因在n a + 平衡中的重要作用。从，哇洲麟z 基因突变体 分离出液泡，分析发现其n a + m + 和k + h + 交换速率明显低于野生型，并且突变株 大的表皮细胞含量减少，植株叶片也有所缩小；而在突变体中过表j 盘_ a t n h x l 基 因又能使其回复到野生型表型四j 。 就整个植物体而言，目前普遍认为，a t n h x l 和s o s l ( 拟南芥质膜n a + h + 逆 向转运蛋白【2 9 , 3 0 】) 协同调节植物的耐盐性。s o s l 基因表达主要集中在维管四周 的细胞，调节n a + 经茎运输到叶中，而这些被运输到叶中的n a + 随即通过液泡膜 上的a t n h x l 被区隔到液泡 3 1 3 2 , 3 3 j 。 a t n h x l 介导的n a + 区隔化可能机制是通过与液泡膜上h + 移位酶相偶联实 现，即液泡膜上矿a t p a s c 和h 4 - p p i a s e 产生跨液泡膜的h + 电化学势梯度，为n a + ，| + 逆向转运蛋白提供驱动力( 如图1 1 ) 1 3 4 3 豇。最近，在拟南芥中过表达液泡膜上 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 h + - p p i a s c 基因b 泞j 可以提高植物对n a c l 的抗性，并且转基因植株叶中的n a + 和 k + 的浓度比野生型要高得多【3 6 j ，在方面也说明了这一点。 前面的研究提到液泡膜n a + ，h + 逆向转运蛋白在盐胁迫下具有n a + 区隔化功 能。但另外一个有趣的问题是，a t n h x l 基因在非胁迫条件下相对较高水平的表 达说明孙慨搬在正常条件下也具有重要的生理功能。另外植物体中加霹基因是 呈家族形式存在，在拟南芥中目前已经克隆出6 个m 基凼( a t n h x l - a t n h x 6 ) m 3 刚，这些家族的其它成员具有什么样的功能也值得研究。目前这方面有了一 定的进展，a t n h x l 基因的启动子与g u s 基因的融合基因在保卫细胞中表达说 明其可能参与气孔的调节| 3 9 l ；v e n e m a 等【删报j 萱_ a t n h x l 基因在人工脂质体重组表 达可以调节低亲和性的k + 运输，说明a t n i - x 1 在没有n a + 胁迫的情况下，可能参 与k + 的平衡。另外，y a m a 斜c h i 的研究显示| 4 1 】，裂叶牵牛( i p o m o e m an i l ) 正在发 育的花蕾随着花瓣的开放从紫色向蓝色的转变的过程，可能依赖于n h x l 的同源 物的活性。因此，除了n a + 转运的功能以外，朋嘲瑾因也许还与植物其它的重要 生理功能有关。要迸一步阐明m t n h x s 基因在俸内的功能，还有待我们进行更多 关于遗传、生理生化方面的研究。 图1 1 植物细胞n a + 小+ 逆向转运蛋白作用机制 f i g u r e1 1t h ef u n c t i o nm e c h a n i s mo fn a * h + a n t i p o a e r o fp l a n tc e l l 1 1 4 植物液泡膜n a + 逆向转运蛋白基因的表达特点 许多研究显示植物液泡膜n a + 王+ 逆向转运蛋白基因在植物体内表达具有一 定的组织差异性和胁迫诱导性。在拟南芥中，a t n h x l 基因在植物叶和茎中表达 量较高而在根部( 除根毛) 弱表达，并且其在茎叶中表达量在n a c l 胁迫下明显 上调f 2 0 , 3 9 1 ；在滨藜中，爿艘理援基因在根和叶中都有一定的表达，在l o o m mn a c i 和4 0 0 m mn a c l 胁迫下，叶e g a g n h x l 的转录水平分别增加了6 倍和8 倍，蛋白水 平增加了1 7 倍和2 2 倍。而根中的4 9 碱因转录水平和蛋白水平虽也有一定水 平的上调，但不是很明显【2 2 j ；水稻经1 0 r a mn a c l 胁迫后，地上部分与地下部分 4 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 o s n h x l 基因的表达量都有所h - y b ，分别为对照组的2 3 倍和1 8 倍【2 l j ；冰叶同中 花经高浓度的n a c i 处理，n h x 样蛋白的转录水平也受到强烈诱导【4 2 1 。这些都说明 植物液泡膜n a 协+ 逆向转运蛋白基因主要在植物的地上部分表达，特别是叶中 表达量较高，这与n a + 主要在叶中累积是一致的。同时，其表达水平在盐胁迫下 都获得上调，也说明这些基因与植物耐盐性是相关的。 另外，a t n h x l 基因启动子与g l s 基因的融台表达显示，a t n h x i 在根毛细胞 的表达也受到盐胁迫的诱导1 3 ”。根毛细胞含有嘭大的液泡，而n a + 在根毛细胞液 泡中区隔化势必降低细胞的水势，使植物根毛细胞在n a c i 胁迫下易于吸收水分， 减少n a + 进入皮层以及木质部，从而有效降低n a + 从根部向茎转运的速率【3 9 l 。 1 1 5 调控植物液泡膜n a 垤+ 逆向转运蛋白基因表达的信号路径 目前有关植物耐盐性的信号通路主要有两条，目p a b a ( a b s c i s i ca c i d ) 一依赖 信号通路和a b a 不依赖的信号通路【4 3 】。x 拟小船z 基因序列研究发现其启动子区 域存在一个a b a 响应元件a b r e ( a b a - r e s p o n s i v ed e m e n t ) ，说明其可能受a b a 自靛 赖的信号路径调节。进一步研究发现，a b a 可以上调，4 t n h x l 基因的表达，而在 a b a 缺陷或a b a 不敏感的突变体a b i l 1 , a b a 2 1 和a b a 3 j 中，盐胁迫诱导4 t n h x l 表达的能力明显降低；另外，a t n h x l 基因的启动子与g u s 基因的重组表达受到 n a c i 和a b a 的胁迫上调进一步说明a t n h x l 表达可能部分受a b a 依赖的信号路 径调节【3 9 删。除此以外，在s o s 突变的植株中，a t n l f x l 基因的表达反而上调说 明调控质膜n a + i + 逆向转运蛋白基因s o s l 表达的信号路径对爿州h 艘表达具有 抑制作用1 3 9 脚4 5 y 如图1 2 ) 。 闰1 2a t n h x l 基因表达的信号路径 f i g u r e1 2t h es i g n a l h a gp a t h w a yo f a t n h x ie x p r e s s i o n 1 1 6 液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因在植物耐盐基因工程中的应 用 土壤中高浓度的n a * 离子对植物的伤害是多方面的。其主要的症状表现吸收 重庆大学硕士学位论文 1 绪沦 过多的n a + 离子，n a + 可以替代k + 结合到k 十的结合部位，这种竞争最终破坏k + 的吸收，造成胞内较低的k + 浓度。而k + 是植物所必需的大量元素，许多酶活性 发挥都需要k + 。如果质膜上不存在排9 1 n a + 机制、液泡膜上不存在n a + 区隔化机 制，细胞质中的代谢酶必定受至- u n a + 毒害1 4 6 , 4 7 。既然耐盐植物能够通过n a + h + 逆 向转运将大部分n a + 区隔化到液泡中，从而既能避免离子胁迫，又能进行渗透调 节，那么将编码液泡膜上n a v h + 逆向转运蛋自的基因转化到盐敏感植物中，并 使其在液泡膜上过量表达可以提高植物耐盐性。 目前关于液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白在植物耐盐转基因工程研究中的应用 已受到重视，并且表现出良好的应用前景。z h a n g 署d b l u m w a l d 4 s i 将a t n h x l 基因 在西红柿中过量表达，获得了耐盐的转基因西红柿。转基因植株在含有2 0 0 r a m 的n a c i 的土壤中能够正常生长，开花和结实。对转基因植株分析表明虽然其叶 片n a + 累积量明显增加，但果实中n a + 含量并没上升。同样 , 俦- a t n i i x l 基因转移到 油菜( b r a s s i c a n a p u s ) 中过表达i “，尽管转基因植株体内含盐量占到其干重的6 ， 但高盐对植株生长的影响轻微，而且转基因油菜收获的种予油的质量和产量与野 生型并没有什么差别。这些结果证实了通过基因工程手段将d 删基因转移到 盐敏感的作物中，从而培育耐盐作物品种的方法是可行的。 1 2 本研究的目的、内容和意义 紫花苜蓿是一种重要的优质高产牧草，对畜牧业的发展起着重要的作用。 但是由于苜蓿有限的耐盐能力却限制着其栽种范围，因此急需对其耐盐性状进 行研究，从而更好地利用基因工程的手段对其进行改造。目前，在苜蓿中已经 克隆出一些与耐盐性有关的基因，并且进行了相关的转基因研究，但是效果都 不是很明显，对其耐盐性贡献率有限 5 0 , 5 1 5 烈。因此，鉴定出与之耐盐性相关的 主效基因就显得非常重要。既然n a + 在液泡中的区隔化是植物的一种重要的耐 盐机制，也是很多耐盐性较强的甜土植物在逆境下存活并完成生命周期的重要 保证，而参与n a + 在液泡内区隔化的关键因子液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因 在植物耐盐基因工程的应用中已经显示出良好前景。那么从紫花苜蓿中克隆液 泡膜n a + i - i + 逆向转运蛋白基因并对其功能进行分析也具有一定的意义，首先可 以加深我们对苜蓿耐盐机理迸一步了解，其次我们可以通过基因工程的手段对 该基因进行改造，使其在体内超表达，从而实现对苜蓿耐盐性状的改良。 重庆大学硕士论文2 紫花苜蓿液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因部分e d n a 序列的克隆 2 紫花苜蓿液泡膜n a + 1 4 + 逆向转运蛋白 基因部分c d n a 的克隆 2 1 材料 2 1 1 植物材料和ec d 矗菌株 紫花苜蓿耐盐品种中苜一号( m e d i c a g o s a t i v al “z h o n g m un o 1 ”) ，由 中国农业科学院畜牧研究所牧草研究室提供。 大肠杆菌d h 5 a 菌株( 博大泰克公司) 。 2 1 2 生化试剂 质粒载体 克隆载体：p m d 1 8 t ( t a k a r a 公司) 。 工具酶及分子量标准 各种限制性内切酶、r n a s ea 、w a qd n a 聚合酶、t 4d n a 连接酶购自 p r o m e g a 、t a k a r a 、上海生工、华美、鼎国、原平皓等生物工程公司。d l 2 0 0 0 核酸分子量标准购自t a k a r a 公司，麸有六条带，分别为2 0 0 0 b p 、1 0 0 0 b p 、7 5 0 b p 、 5 0 0 b p 、2 5 0 b p 和1 0 0 b p 。 试剂盒 玻璃奶d n a 片段回收试剂盒为博大泰克公司产品，反转录试剂盒为 p r o m e g a 公司产品。 主要化学试剂 d e p c 、m o p s 为a m r e s c o 公司产品，s d s 、t d s 为s i g m a 公司产品，硫 氰酸胍购自p r o m e g a 公司，i p t g 、x g m 为t a k a r a 公司产品，d n t p 购自联星 生物工程公司。其余常规药品均为进口或国产分析纯级。 培养基配制 l b 培养基( 1 升) ：蛋白胨l o g ，酵母提取物5 9 ，n a a1 0 9 ，p h 7 0 ( 固体 培养基每升加1 5 9 琼脂粉) ，高压灭菌。 溶液的配制 e b 储各液( 1 0 m g m 1 ) ：l g e b 溶于1 0 0 m l 水中。4 。c 避光保存。 氨苄青霉素( a 肌p ) 贮液( 1 0 0 m g m 1 ) ：1 0 0 m ga m p 溶于l m l 蒸馏水中，- 2 0 。c 保存。 x g a l ：用二甲基甲酰胺溶解配成2 0 m g d m l 的贮存液，于一2 0 c 避光保存。 i p t g ：8 m l 的无菌去离子水中溶解2 9 l p t g 后用蒸馏水定容至1 0 m l ，过滤除 菌，分装小份于2 0 保存。 重庆大学硕士论文 2 紫花苜蓿液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因部分c d n a 序列的克隆 d e p c 水：在1 0 0 0 m l 的去离予水中加入l m ld e p c ，密封混匀，3 7 。c 放置 过夜，高压灭菌4 5 m i n 。 t e ：含1 0 m mt r i s h c l ( p h 8 0 1 l m me d t a ( p n 8 o ) ，高压灭菌。 1 0 x t a e ：t r i s 4 8 4 9 ，冰醋酸1 1 4 2 m l ，0 5 me d t a ( p h 8 o ) 2 0 m l ，加水定容 至1 升。 6 x d n a l o a d i n g b u f f e r ：0 2 5 溟酚蓝，4 0 甘油水溶液，4 c 保存。 质粒d n a 提取试剂配制 溶液h5 0 r a mt r i s h c i ( p h 7 5 ) ，1 0 m me d t a ( p h 8 o ) ，高压灭菌。 溶液i i ：0 2 mn a o h ，1 s d s ，分别配制0 4 mn a o h 和2 s d s 的贮液， 使用时以1 ：1 比例混合。 溶液：1 3 2 mk a c ( p h 4 8 ) ，高压灭菌。 2 2 方法 2 2 1 材料的获取 将苜蓿种子用蒸馏水洗涤多次后，浸种1 d ，催芽。播种于直径为2 0c m 、 深3c n l 的托盘中，置于光照培养箱。培养条件：2 4 、1 6 h 光照8 h 黑暗培养。 1 0 d 后用2 0 0 m mn a c i 溶液处理6 h 后收获整株植物用于r n a 的提取。 2 2 2 总r n a 提取( 硫氢酸胍法) r n a 的提取 1 ) 取o 2 克材科在液氮中充分研磨，转入1 5 m l 离心管中，加入o 5m i 变性液( 4 m o l l 硫氰酸胍；2 5 m m o l l 柠檬酸钠，p h 7 ；o 5 十二烷基肌氨 酸钠；0 1 m o l l 巯基乙醇) ，振荡1 5 s 。 2 ) 加入3 0 皿2 m o l l n a a c ( p n 4 9 5 2 ) ，摇匀：加入3 0 0 p i 酸酚( 水饱和酚 p h 3 n e s t e du n i v e r s a lp r i m e ra ：5 a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t _ _ 3 逆转录 1 ) 在冰上按下列组成在5 0 u lp c r 管中调制逆转录反应液 r n a 2u l 5 一c d sp r i m e r 1u 1 s m a r t a “o l i g o n u c l e o f i d e 1u l b h 垒s 2 女h 艘 一l 且 t o t a l 5u l 2 ) 混匀、瞬时离心。将p c r 管放在p c r 仪7 0 * c 保温2 m i n 后冰浴2 r a i n 。 3 ) 瞬时离心，继续在p c r 管中添加下列试剂； 5 xf i r s t s t r a n db u f f e r 2u l d t t ( 2 0m m ) 1 u l d n t pm i x ( 1 0r a m ) l u i 壁里! ! 墨! ! ! p ! 墨! ! ! ! ! ! ! ! ! 望! ! ! i p ! ! ! ! j ! i t o t a l 1 0u l 4 ) p c r 管放在p c r 仪4 2 保温1 5 h 。 5 ) 加入4 0 u l t r i c i n e e d t a b u f f e r 稀释逆转录产物，7 2 c 保温7 m i n 。 6 ) 逆转录产物用于扩增或者在一2 0 * c 保存。 p c r 扩增 于冰上在5 0 u l 的p c r 管中依次添加下列组分： p c r g r a d ew a t e r 1 7 2 5 u l f o xa d v a n t a g e2p c rb u f f e r d n t pm i x ( 1 0 m m ) 2 5u 1 0 5u l 5 0 xa d v a n t a g e2p o l y m e r a s em i x 0 5u l t o t a l 2 0 7 5u j 混合、瞬时离心后继续添加下列组分： 5 - r a c e r e a d yc d n a 1 2 5u l u p mo o x ) 2 5u l gsp2(10mm)05 u l t o t a 】 2 5u l 2 1 重庆大学硕士论文 3 紫花苜蓿液泡膜n a h + 逆向转运蛋白基因e d n a 全序列的克隆 按下面的程序进行扩增反应： 竺5 。、5 c y c l c s 7 2 3 m i n 9 4 5 $ e c、 7 0 1 0s e ck 5 c y c l e s 7 2 3r a i n j 9 4 5s e e、 6 8 1 0s e el 2 5 c y c l e s 7 2 2 m i nj 扩增片段的回收、连接、转化、测序以及序列分析方法同第2 章。 3 1 3 结果与分析 3 3 1m s n h x i 基因3 端序列的克隆 总r n a 用d t - 3 s i t e sa d a p t o r 引物