（细胞生物学专业论文）ssb蛋白的克隆、表达和功能研究.pdf

摘要 单链结合蛋白( s i n g l e - s t r a n d e dd n a - b i n d i n gp r o t e i n ，s s b ) 在d n a 复制、重组 和修复中起着重要作用。为阐明单链结合蛋白s s b 的体外生物功能，本研究构建了融合 蛋白s s b 的表达载体并使其高效表达并易于纯化。础基因片段是以c o l ik - 1 2 基因 组为模板经p c r 扩增获得，通过基因的体外拼接，成功构建了表达载体p q e 3 0 一s s b 。重 组菌株t 4 1 5 曲e 3 0 - s s b 经过i p t g 的诱导表达了s s b 蛋白；收集菌体细胞，经超声波破 碎后离心，取上清进行s d s p a g e 分析，得到了一条与预期分子量( 1 9 51 0 ) 相应的诱 导表达条带，其表达量约占全细胞蛋白的3 0 且以可溶形式存在。 利用固定化金属离子( n i 2 + ) 配体亲和层析柱和凝胶过滤层析等方法纯化融合蛋白 s s b ，其纯度达到9 0 。利用表面等离子共振( s u r f a c e p l a s m o nr e s o n a q p e ，s p r ) 技术对 s s b 蛋白的生物功能进行了系统研究。结果表明：s s b 蛋白以四聚体形式与单链d n a 分 子结合；在有无镁离子的情况下，两者的平衡解离常数( e q u i l i b r i u md i s s o c i a t i o nc o n m a n t ， k m ) 分别为4 7 9 x 1 0 。7m 和9 6 7 1 0 4m ：阐明了镁离子对于两者作用形式的影响。利用 原子力显微镜( a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y ，a f m ) 技术在单分子水平分别观察s s b 蛋白、 s s d n a 和s s b s s d n a 复合物的成像，s s b 蛋白分子通过协同作用于底物s s d n a 并能非 特异性结合在s s d n a 上，此发现为下一步研究s s b 在d n a 代谢中作用模式的单分子 可视化研究奠定了基础。 关键词：s s e 蛋白，阅e 3 0 - s s b ，s s d n a ，表面等离子菇振，原子力显微镜 a b s t r a c t s i n g l e - s i r e dd n a - b i n d i n gp r o t e i n ( s s b lp l a y sni m p o r t a n tr o l ei nr e p l i c a t i o n , r e c o m b i n a t i o n d r e p a i ro fd n aa n di st h u sc r u c i a lf o rt h es u r v i v a lo ft h eb a c t e r i a i nt h i sr e p o r t , w ed e s c r i b e dah 讪 e x p r e s s i o na n de f f i e i e n 【tp u r i f i c a t i o ns c h e m e ，k i n e t i ca s s a ya n dv i s u a l i z a t i o no i li n t e r a c l i o nw i t hi t s b s t r a t e ，s i n g l e - s u a n d e dd n a ( s s d n a ) as s bg e n e ( 5 3 7b p ) f o re n c o d i n gs s bw o b t a i n e db yp c r a m p l i f i c a t i o n 劬me e o l ik - 1 2g e r l o m e t h ee x p r e s s i o nv e c t o ro ft h e f u s i o np r o t e i ni - i i s 6 - s s b e o n s t r a c t e db y 砷瑚h i i l gs s bg e n et op q e 3 0 s s bf u s i o np r o t e i n 郸e x p r e s s e di nm 1 5b yi n d u c i n gw i t h l p - r g s d s - p a g l 3r e v e a l e dt h a tf l a e “删p t o t o i nw i t ham o l e c u l a rw e i g h t1 95 k dw a ss o l u b l ea n d a m o u n t e d t oa b o u t3 0 o f t l l e t o t a l b a c t e r i a l p t o t o i n $ s bp r o t e i nw a sp 嘶n e db yi m m o b i l i z e dm e t a l ( n nc h e l a t i o na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y dg e l f i l t r a t i o na n dt h ep u r i t yw a so v e r9 0 * * i nt h i sr e p o r t , i n t e r a c t i o no fs s bw i t hs s d n aw a sm o n i t o r e db y s u r f a c ep l a s m o nm n 卸( s p r ) a n dd i r e c t l yo b s e r v e d 噼吨a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，w h i c h p r e s e n t e d a na t t e m p t1 0i n v e s t i g a t et h eb i n d i n gm o d eo fs s bb yas i n g l e - m o l e c u l ev i s u a l i z a t i o n t h er e s u l t i n gs s bo r o t e i nw i l 5ac o r r e c t l yf o l d e dt e l x a l n e rw i t h1 1 1a p p a r e n tb i n d i n gt o ， 4 3 - m 盯s s d n aw i t ht h ec q l l j l i b u md i s s o c i a t i o nc o n s l a m 征曲o f9 6 7 x 1 0 7ma n d4 7 9 x 1 0 - rm r e 删w l yw h 蜘m g c l 2bp 陀s e n to rn o t 鼬d e t e r m i n e db ys p r i n1 l l ea f mi m a g e s m d i v k l t 】a l i ；s d n a ts s bp r o t e i na n ds s b 一嚣d n ac 唧】就w e r cv i s u a l i z e d t h eu s e ds s d n aw 衄l o n ge u 曲f o r 叩盯砒i v e s s bb i n d i n ga r d w e o b s e r w d t h 越s s bp r o t e i n d i s t r i b u t e d s s d n a n 。s p e c i 行c a l l y k 口w o r d s = s s b ，p q e 3 0 - s s b ，s s d n a ，s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a l l c e ，a t l n i e f o r c e m i c r o s c o p y n 缩写词表 英文全称 s i n g l es m m db m d m gp r o t e i n s i n g l es t r a n dd n a m i s m a t c hr e p a i r s u r f a c ep l a s m o n 职：s o n 锄l c e a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e i s o p r o p h y l t h i o b d - g a l a c t o s i d e 5 - b r o m o - 4 c m o r o - 3 - - m d o l y l 睁d - g a l a c t o s i d e a m p i c i l l i n b a s ep a i r k i l o b a s e d i o t h y lp y r o c a r b o n a t e c o m p l e m e n t a r yd n a d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e m i n u t o r e v o l u t i o np e rm i n u t e p o l y m e r ec h a i n 埋删o n t r i s a c e t a t e e d t ab u f f e r t h e r m o sa q u a t i c u sd n a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e v i 中文全称 单链结合蛋白 单链d n a 错配修复 表面等离子共振 原子力显微镜 十六烷基三甲基溴化胺 异丙基硫代一b 廿半乳糖苷 5 - 溴4 氢一3 吲哚一b 一1 3 - 半乳糖苷 氨苄青霉素 碱基对 千碱基 焦磷酸二乙酯 互补d n a 脱氧核糖核苷三磷酸 分钟 转每分钟 聚合酶链式反应 t n s 乙酸e d r a 电泳缓冲液 栖热水生菌d n a 聚合酶 乙二胺四乙酸 十二烷基磺酸钠 四甲基乙烯基二胺 黼娜一一害| 删 一l圣砌脚印曲 一一 一口 呻嗽 眦一芎；一 独创声明和论文使用授权说明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 签名： 丕整自日期：塑乒l 一 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：蚕煎画导师签名：弛i l 一日期：2 生啦l 第一部分综述 第一部分综述 1s s b 蛋白的研究进展 引言 单链结合蛋白( s i n g l es t r a n d b i n d i n g p r o t e i n , s s b ) 通过参与i n a 的复制、修复和重 组三个代谢过程而发挥其重要作用。此外，由于s s b 与d n a 紧密、协同结合的特性，多年 来已经被作为核酸和蛋白相互作用研究中的原型( p r o t o t y p i c ) 蛋白，同时也作为一个重 要蛋白被应用于p c r 和d n a 测序等生物技术领域。s s b 已有多年的研究历史，早期的研 究主要是集中在对s s b 的纯化和对s s b 一般特征的描述。近来随着编码s s b 的基因和枷 表卜1 丈肠杆菌s s b 的一般特性 4 l h o p e r t y v a l u e m o l w t o f m o n o m e rb ys d s - p o l y a e y l a m i d e g e l f r o m d n as e q l l e n c e a m i n oa c i d r e s i d u e s s u b u n i ts t r a e t u r e s t o k e sr a d l u s ( a m ) f d c t i o r l a ! c , o e f f i c i m r t s e d i m e m l a t i o a v a l t m ( s ，w ) d i f f u s i o ne o e 伍e i e n t ( d ”w ) ( e r a s ) p i f “2 8 0 n m ) a 2 ，a 2 c o p i o s o e r 州l a ：l i t c v a m 忧v a l u e s v a r y f r o m l 8 ，0 0 0 t 0 2 2 ，0 0 0 b ：l i m a m t o v a l u e s v a 口f r o m 44 s t 0 4 9 s c ：v a 如c e o 删i s f w t h e f o o 啪o t h e r r c p o r m d v a l u 黯r a n g e f r o m2 3 。7 0 0 m3 3 , 0 6 0 嚣m=誉一种一捕一嚣m=警一种一捕一 第一部分综述 突变体的鉴定d - 3 】，s s b 的研究有了突破性的进展，使其在结构和功能许多方面的研究也 取得了很大的成果。 1 1s s b 的一般特征 s s b 的一些物理特征见表1 - 1 。s s b 在溶液中是稳定的同源四聚体，当蛋白浓度高于 1 l n g 1 1 5 ，q 和低离子强度时1 7 , s 就会聚集沉淀，这些沉淀是无生物学活性的。而太肠杆 菌的s s b 蛋白是一种相对比较稳定的蛋白，可以耐受熟变性井可以在4 保存较长时间。 但是在4 c 保存时即使蛋白浓度很低，保存时问过长也同样会产生沉淀，但这种沉淀仍 具有大部分生物活性。 1 2s s b 的结构与功能 1 2 1s s b 的结构及其作用机制 s s b 分子有一个结构保守的寡核苷酸结合( o 】i g o n u c l 。0 d d e b i n g d i n g ，o b ) m 构蚓慨埘。 大多细菌的s s b 是咀同源四聚体的形式存在，其中的亚基是由个约1 2 0 个氨基酸残基， 包含较多的n 螺旋和b 折叠的n 端0 b 结构域和一个约5 0 - 6 0 个氨基酸残基，无规则结构 的c 端结构域组成。其中a 螺旋占2 2 ，b 折叠占1 9 9 6 ，无规则眷曲占5 9 。真核生物线 粒体中的s s b 也是相似的。其中t h e r m o p h i l i ed e i n o c o c c u s 和t h e r m u sg e n e r a s s b 的特 征排列与上边的稍有不同删，它们的s s b 包含有两个由一小段序列连接的连续的0 b 结构域，也有个典型的c 末端尾巴。它们形成的同源二聚体与前面s s b 形成的同源四 聚体类似，都包含有四个0 b 结构域。 预测的s s b 的二级结构如图i - i 。大多数高度有序的结构位于氨基端1 0 0 个氨基酸残 基之前，这个区域包含大多数极性氨基酸，尤其是带正电荷的氮基酸。紧接着是一段无 规则卷曲序列，这段序列中极性氨基酸很少，8 0 的氨基酸残基是甘氨酸，脯氨酸，谷 氨酸和天冬氨酸。羧基端的特征是有- 4 , 段。螺旋和一些酸性氨基酸。 到目前为止，多种物种中的s s b 的蛋白晶体结构已经被确定，如大肠杆菌、人线粒 体、m y e o b a c t e r i u mt u b e r c e l o s f z ，肛s m e g m a f i w d e i n o e o c b u sr a d i o d u r a n s 和t h e r m u 8t h e r m o p h i l u s a 其中大肠杆菌中s s b 蛋白同源四聚体的晶体结构如图卜2 。 第一部分综述 图1 - 1s 靼蛋白预测的二级结构 t h eb - s t r u c t u r e t u r n s m i n d i c a t e d 耐c h a i l lr e v e r s a l s , a n d ( + ) a n d ) s i g n sd e n o t ec h a r g e d a m i n o a c i d s t h en u m b e r s i n c a r er e s i d u e s a tc o n f o r m a t i o n a l b o u n d a r l e s t h e k n o w ns s b m u t a t i o n a ls i ( e sa r ei n d i c a t e db ya r r o w s 1 4 】 凰1 _ 2 大肠杆菌s s b 蛋白单体和同源四聚体的晶体结构 1 5 】 第一部分综述 在s s b 的研究过程中，研究者构建了很多s s b 的突变蛋白进行其功能研究。根据目前 的研究结果已知h i s 一5 5 参与s s b 亚基的相互作用，是否存在其他相关的氨基酸残基还有 待进一步证实。在s s b 的单链d n a ( s i n g l e - s t r a n dd n a ，s s d n a ) 结合结构域中，实验表 明t r p - 5 4 和p h e - 6 0 闻的区域在此发挥作用。这段区域时疏水的a 螺旋结构，被两个螺旋 转角隔开，空间填充模型表明在这这两个氨基酸之间有一个狭缝，能容纳一个或两个嘧 啶环【1 词l 。然而，并不是所有人都认同这种解释。h e l e n e 等1 1 n 认为d n a 结合结构域应该是 b 折叠构象。通过芳香族氨基酸和核酸碱基之间的疏水相互作用的作用模型已经被提 出，并认为是s s b 和s s d n a 结合的一个重要机制，这样看来，应该是赖氢酸而不是精氨酸 参与该相互作用。尽管s s b 的四分之三赖氨酸残基位于这一区域，但最重要的氨基酸残 基仍未确定。在s s b 与其它蛋白的相互作用中，直接的实验证据很少，然而基于很多突 变体的实验结果，推测s s b 的羧基末端有此功能1 1 8 - 2 0 。近来对曲。突变体的研究提供 了一些有趣的信息。由于这个突变位点位于n 末端第1 5 个氨基酸残基处，该突变结果对 d n a 的修复产生了很大的影响，而对d n a 的复制影响很小【2 l 】。表明n 末端结构域可能通过 与r e c a 蛋白的相互作用在重组修复中起重要作用。此外，这个残基还位于疏水结构域 和亲水结构域的第一个连接处。表明疏水相互作用可能对基因重组很重要。图卜3 是s s b 同源四聚体表面的电荷分布和一些在相互作用中的关键氨基酸。 圉卜3s 册的表面参与s s d n a 结合的氩基酸 1 5 】 t h em o l e c u l a rs l l r f a c eo ft h et c l x a n l e i nt b eo r i e n t a t i o no ff i g u m l - 2 t h es u r f a c ei s c o , r e dd e e pb l u ei nt h em o s tp o s i t i v er e g i o n sa n dd e e pr e di nt h em o s tn e g a t i v e ，w i t h l i n e a ri n t e r p o l a t i o nf o rv a l v e si nb e t w e e n r e s i d u e sk n o w nt ob ei n v o l v e di nb i n d i n ga s h o w n 第一部分综述 1 2 2s s b 的功能 1 2 2 1s s b 在d n a 复制中的作用 s s b 又称为双螺旋去稳定蛋白( h e l i xd e s t a b i l i z i n g p r o l e i n ) 。当解旋酶将双链打开以 后，单链d n a 具有一种潜在的恢复原来双链的能力，重新形成氢键。而且单链本身若有 反向重复也会形成发夹结构或被核酸酶降解，这几种情况都会影响复制，然而，在细胞 内有大量单链d n a 结合蛋白( s i n g l es t r a n dd n ab i n d i n 8 p r o t e i n , s s b ) 能很快地和单链d n a 结合，防止其重新配对形成双链d n a 或被核酸酶降解。s s b 与螺旋酶不一样，它不具备酶 的活性，不和a t p 结合。在大肠杆菌细胞中s s b 是由1 7 8 个氨基酸所组成的四聚体，可以 和单链d n a 上相邻的3 2 个核苷酸结合，使d n a 受到保护，不被酶水解，也不恢复成双链， 因此可以降低d n a 的t h 值。一个5 s b 四聚体结合于单链d n a 上可以促进其他s s b 四聚体与 相邻的单链d n a 结合，这个过程称为协同结合( c o o p e r a t i v eb i n d i n g ) ，s s b 结合到单链d n a 上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链i ) n a 作为模板。s s b 可以重复使用， 当新生的d n a 链合成到某一位置时，该处的s s b 便会脱落，并被重复 q 用。s s b 对于细菌 复制叉结构的作用和解旋酶是同等的。在体外 的实验研究中，有时没有s s b 的参与并不影响 复制的进行，然而一些d n a 聚合酶，如：d n a 聚合酶i 和d n a 聚合酶1 是依赖s s b 的。 v n a 复制过程大致可以分为复制的引发 ( 如图1 - 4 ) ，d n a 链的延伸( 如图1 - 5 ) 和d n a 复制 的终止三个阶段。复制的引发( p r i m i n g ) 阶段包 括d n a 复制起点双链解开，通过转录激活步骤 合成r n a 分子，r n a 引物的合成，d n a 聚合酶将 第一个脱氧核苷酸加到引物r n a 的3 0 h 末端。 复制引发的关键步骤就是前导链州a 的合成， 一旦前导链d n a 的聚合作用开始，滞后链上的 d n a 合成也随着开始，在所有前导链开始聚合 之前有一必需的步骤就是由r n a 聚合酶( 不是 图1 - 4o 复制引发过程 第一部分综述 引物酶) 沿滞后链模板转录一短的r n a 分子。在有些d n a 复制中，如质粒c o l e ，该r n a 分子 经过加工成为d n a 复制的引物。但是，在大部分d n a 复制中，该刖a 分子没有引物作用。 它的作用似乎只是分开两条d n a 链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导 链模板d n a 上开始合成刚a 引物，这个过程称为转录激活( t r a m e r i p t i o n a la c t i v a t i o n ) ，在前 导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如太肠杆菌的d n a a 蛋白。这两种蛋白质、 可以和复制起点处d n a 上高度保守的4 个9 b p 长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能 是这些蛋白质与d n a 复制起点结合后能促进d n a 聚合酶复合体的七种蛋白质在复制起 点处装配成有功能的全酶。d n a 复制开始时，d n a 螺旋酶首先在复制起点处将双链d n a 解 开，通过转录激活合成的r n a 分子也起分离两条i ) n a 链的作用，然后单链d n a 结合蛋白质 结合在被解开的链上。由复制因子x ( n 蛋白) ，复制因子y ( n 蛋白) ，n ”蛋白，i 蛋白，d n a b 蛋白和d n a c 蛋白等6 种蛋白质组成的引发前体( p r e p r i m o s o m c ) ，在单链d n a 结合蛋白的作 用下与单链d n a 结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶 ( p r i m a s e ) 组装成引发体( p r i m o s o m e ) 。引发体可以在单链d n a 上移动，在d n a b 亚基的作用 下识别d n a 复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段刖a 引物，然后，引发 体在滞后链上沿5 一3 方向不停的移动，在一定距离上反复合成i l n a 引物供d n a 聚合酶 合成网崎1 1 片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协 同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，井将核苷酸在引发位 置上聚合成r n a 引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反， 所以在滞后链上所台成的i l n a 弓i 物非常短，般只有3 5 个核苷酸长。而且，在同一种生 物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在d n a 滞后链模板上比较特定的 位置才能合成r n a 弓j 物。 图i - 5d m 链的延伸过程 第一部分综述 在d n a 复制叉处要能由两套d n a 聚合酶在同一对间分别进行复制d n a 前导链和滞后 链。如果滞后链模板环绕d n a 聚合酶全酶，并通过d n a 聚合酶，然后再折向与未解链 的双链d n a 在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。这 样，当d n a 聚台酶沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的r n a 引物即可以 由d n a 聚合酶所延伸。当合成的d n a 链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模 扳及刚合成的冈崎片断便从d n a 聚合酶i 上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动， 便产生了又一段单链的滞后链模扳，它重新环绕d n a 聚合酶全酶，并通过d n a 聚合酶 开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多( 最 后只有一个冈崎片段的长度) 。而且，这样引发体在d n a 链上和d n a 聚合酶以同一速度 移动。 按照上述d n a 复制的机制，在复制叉附近形成了以两套d n a 聚合酶全酶分子、引 发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为d n a 复制体( r e p l i s o m e ) 。复制体在d n a 前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的d n a 前导链和由许多冈崎片段组成的 滞后链。在d n a 合成延伸过程中主要是d n a 聚合酶的作用。当冈崎片段形成后d n a 聚 合酶i 通过其5 - t 3 外切酶活性切除冈崎片段上的i i n 引物，同时，利用后一个冈崎片 段作为引物由5 一3 。合成d n a 。最后两个冈崎片段由d n a 连接酶将其接起来，形成完整的 d n a 滞后链。 总的来说，s s b 在d n a 复制中的作用可以归纳为以下几点：1 ) 它可以通过解旋酶增 强螺旋的不稳定性；2 ) 它可以阻止单链的退火和核酸酶的降解；3 ) 它有助于组织和稳 定复制的起始；4 ) 它是复制引发体形成所必需的：5 ) 它确保了复制引发的特异性；6 ) 它提高t d n a 聚合酶的保真度；7 ) 通过降低能使聚合酶中止和解离的d n a 二级结构的 稳定性提高i ) n a 聚合酶的前进速度；8 ) 它可以促进聚合酶与模板的结合。 1 2 2 2 $ s b 在d n a 错配修复中的作用 d n a 错配修复( m i s m a t c hr e p a i r ，m m r ) 是细胞复制后的一种修复机制，起维持 d n a 复制保真度，控制基因变异的作用。m m r 系统首先是在原核生物大肠杆菌中发现 的，随后在真核生物及人类细胞中也相继发现与h 伽t 密切相关的同源基因。近年来， h 彻t 系统的研究越来越受到学者的重视，对m m r 作用机制及组成该系统的几种酶蛋白 7 第一部分综述 结构与分子生物学方面的研究不断深入，为m m r 系统的应用研究打下了坚实基础。 目前研究较为透彻的r 系统为大肠杆菌的甲基定向错配修复。这个系统主要包括 i d u t s 、m u t l 、m u t h 等修复蛋白，d n ah e l i c a s ei i 、s s b 、d n a 聚合酶、外切酶i 和d n a 连接酶等1 1 种蛋白吼堋。m u t s 蛋白是加崛系统中关键的点识别成分，它首先识别锗配 或未配对碱基并与之结合，然后m u t l 蛋白参与形成复合体“m u t l - m u t s d n a ”，从而可 以增加m u t s - d n a 复合体的稳定性，形成的复合体并能进一步激活t t u t h 的核酸内切酶 栝性，在错配位点附近d ( g a t c ) 序列处将无甲基化的一股d n a 新链切割。然后核酸外 切酶在解螺旋酶( d n a h e l i c a s e l i u w d ) 及单链结合蛋白( s i n g l e s t r a n d e d b i n d i n g p r o t e i n , s s b ) 的协助下，将无甲基化的这一股d n a 链从d ( g a t c ) 位点至错配位点整段去除。最 后，d n a 聚合酶及d n a 连接酶根据模板链的序列填补新链被切除的部分，包括错配或 未配对的碱基，从而完成整个错配修复过程陋硐。大肠杆菌错配修复机制模式如图1 6 。 m m r 系统同样也存在于酵母等真核生物细胞中i 篮】，并类似于大肠杆菌细胞中的 m u t l h s 系统。酵母的m m r 系统中有6 个m u t s 同源物( m s h l ，m s h 2 ，m s h 3 ，m s h 4 m s h 5 ，m s h 6 ) ，4 个m u t l 同源物( p m s l ，m l i - 1 1 ，m l h 2 ，m l f l 3 ) 网。其中，m s h i 与线粒体错配修复过程有关，对维持线粒体d n a 复制的高保真度起重要作用；m s i - 1 2 为细胞核错配修复基因，它和m u t l 同源物p m s i 、m l h l 在细胞核的错配修复过程中 是必不可少的1 3 0 l ；m s h 3 除了能与m s h 2 形成二聚体在错配修复过程中起识别作用外， 还具有维持简单重复序列稳定性的作用；而m s h 4 和m s h 5 虽为m u t s 同源基因，但它 们并不参与错配修复活动，而是与减数分裂重组事件有关口”。m s h 6 ( 也称为g - t 错配结 合蛋白，即g t b p ) 能与e s h 2 形成异源二聚体m u t sq 共同起着与错配d n a 双链结合的作 用。 人类细胞中同样也含有与大肠杆菌m u t l h s 系统相似的m m r 系统【3 2 1 。与大肠杆菌 甲基定向错配修复功能相似，人类删r 系统也能有效地修复碱基和碱基错配及碱基的插 入或缺失。但是，人类m 1 4 r 系统有更强的修复能力，它能有效修复c c 碱基错配和7 一1 6 碱基的插入或缺失。大肠杆菌与人类m m r 系统的底物特异性、组成成分的功能和修复机 制的相似使人们对人类错配修复途径的认识更加深入。 人类细胞中的d n a 错配修复主要涉及6 个修复蛋白，即h m s h 2 、h m s h 3 、h 懈h 6 、 h m l h l 、h m l i i 3 、h p m s l 。与大肠杆菌m u t s 蛋白类似的二聚体有h m u t s 和h m u t s l 3 两种， 第一部分综述 错弓位点 p 。l 一3 ，新生链 3 t _ t 5 聪 多博舯式 3 厂t 5 陋 3 厂t 5 4 睁玉 5 l 一3 ， 3 t _ t 一5 mc 目 3 t - r 一5 睦酶 3 厂t 5 4 e 5 一3 3 厂t 5 mc m 图i - 6 丈肠杆菌错配修复机制模式 2 7 】 复合物成分分别为h m s h 2 h m s h 6 和h m s h 2 h m s h 3 j 3 ，前者识别单个碱基错配及一个碱基 的缺失插入错配，后者识别2 4 甚至更多个碱基的缺失插入错配。可见与识别错 配相关的h m s h 2 蛋白是必需的，而h m s h 6 和h m s h 3 的功能则有一定的互补性阻一5 1 。人 类肼r 系统的运行与大肠杆菌类似，不同之处在于区分新生链和母链的信号仅仅是新生 链的单链缺口，而不是未甲基化的腺嘌呤。h m s h 2 蛋白与h 蛄s h 6 蛋白结合形成的异源二 9 第一部分综述 聚体可与结合到d n a 链上的h m u t s 形成一种暂时性的复台物，从而启动错配修复，切 除含有错配的d n a 片段，并台成新的瑚a 片段以代替被切除的部分，与有关的酶配合， 进而完成错配d n a 链的修复过程。人类错配修复机制如图1 7 。 当大肠杆菌、真核生物或人类细胞中的m m 基因由于某种原因发生突变而造成其错 配修复蛋白缺陷或丧失时，就会使细胞失去正常的错配修复功能，从而使得许多突变累 积在细胞内，最终导致细胞发生异常病变南，。 s s b 在错配修复系统中究竟发挥什么作用? 在甲基定向错配修复途径中，有三种关 l 啪b m u 毗t f i 删 燃密“崮訾 一 碱基城基错配插缺失错配 ， 图i - 7 人类错配修复机制模式 2 7 h m s h 2 与h m s h 6 结合形成异源二聚体h b u t sa ；h m s h 2 与h m s h 3 结台彩成异源二聚体h 帕u t s 口；h m l h i 和h p f b 结合形成h m u t ln 异源二聚体；1 ：一个碱基插入错配：2 ：两个碱基 插入错配：4 ：四个碱基插入错配 键酶都与s s b 有功能性的相互作用：1 ) d n a 解旋酶，其解旋过程需要s s b 的参与和 促进i2 ) 核酸外切酶i ，s s b 促进该酶对包含错配碱基的d n a 链的核酸外剪切；3 ) 为 了修复错配的碱基，有时需要由d n a 聚台酶及d n a 连接酶根据模板链的序列重新 合成上千个核苷酸碱基，根据s s b 在d n a 复制中的作用，此时需要s s b 参与此过程。 第一部分综述 1 2 2 3s s b 在基因重组中的作用 已有的研究证明大肠杆菌的s s b 在基因重组中起着非常重要的辅助功能，至于其在 重组分子机制中的具体功能和相互作用有着不同的看法。过去的几十年里，对重组分子 机制的研究已经去的了很大的进步，c l a r k 啦初提出重组事件与细胞中的中间产物代 谢途径相似，包括一个或多个途径，这些途径的定义很大程度上都是以遗传分析为基础 m 。在大肠杆菌中，同源重组的主要途径是r e c b c d 途径，此外还有r e c e 和r e c f 两个途 径，这三个途径的共同点是它们都需要重组酶r e c 。r e c a 是第一个被发现的介导同源 重组的基因【4 1 1 ，在细菌中高度保守吲，是一个约3 8 i 回，具有d n a 依赖的a t p 酶活性的单链 多肽。r e c a 蛋白可以在单链d n a 上形成一个螺旋纤维丝，催化同源d n a 分子间链的配对 和转移，起始同源重组旧。突变研究表明，r e c a 是重组所必需的，其中在r e c e 作用与 p l a s m i d p l a s m i d 和i m n b d a - l a m b d ad n a 异源双链重组时一】和l a b d ar e d 途径h 5 1 中例外。 现有大量证据表明，s s b 在同源重组的链交换环节中是必需的。通过蔗糖密度梯度分离 到了两种复合物：r e c a 结台异源取链d h a 和s s b 结合错位的单链d n a ( s i n g l e - s t r a n d d n a ，s s d n a ) ，在电子显微镜下可以观察到这两种复合物h “q 。研究表明，s s b 可以通过 与错位的s s d n a 的结合提高体外r e c a 在重组中链的交换h 埘，其交换的效率比s s b 不存在 的情况下提高两倍多m ”j 。 第一部分综述 2 基于表面等离子共振的新型生物传惑技术简介及其应用 生物分子相互作用是一种基本的生命现象，也是现代生命科学研究的重大问题之 一，因为这些相互作用不仅控制着基因转录、细胞分裂和增殖，同时还介导细胞坏死过 程中的信号转导、致癌转化和凋亡等。定量分析生物分子的相互作用和相关的动力学， 对于揭示生物反应过程的分子机制和研究生命现象发生发展的基本规律具有十分重要 的意义。日益增加的新蛋白和d n a 序列数据也迫切需要能够准确、快速鉴定生物作用的 方法。b i a c o r e ( b i o m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n a n a l y s i s ) 是基于表面等离子共振( s u r f a c e p l a s m o n l 吧s o l l a n e e s p r ) 。并用于实时观察生物分子相互作用的技术。通过它可以得到很多传统 技术难以提供的生物分子互作信息，困为它可以实时观察分子相互作用过程中每一秒的 变化情况。目前，b i a c o r e 技术在蛋白质组学、信号转导、新药开发、遗传学分析和食 品检测等领域已显示出广阔的应用前景。 b i a c o r e 是基于s p r 技术开发的新型生物传感分析技术口o “。s p r 技术是一种基于 物理光学特性的分析技术。当入射角咀临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生 全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后， 由于入射光可引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其 中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率 而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。b i a c o r c 将s p r 的 物理光学检测技术与集成化多元芯片技术相结合，发展形成7 新型的并行、快速生物分 子识别和检测技术。实验时，先将种生物分子( 1 i g a n d ) 固定在传感器芯片的葡聚糖 表面，将与之相互作用的分子( a n a l y t e ) 溶于溶液( 或混合液) 流过芯片表面。s p r 检测 器能跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化，记录成一张传感 图。b i a e o r e 与其它研究相互作用的方法如酵母双杂交、亲和印迹、免疫共沉淀、荧光 能量转移等技术相比，具有以下优势：1 ) 无需标记样品，保持样品的活性：2 ) 分析范 围广；3 ) 实时定量测定，可得到精确的动力学数据：4 ) 灵敏度高，样品用量少；5 ) 检测快速；6 ) 可以分析混合物，如细胞提取物、血清等。 通过b l a c o 不仅可以了解分子结合的特异性，还能精确计算分子结合的动力学数 据，包括结合解离速率和平衡结合解离常数。这在研究抗原抗体，配体受体，药物 第一部分综述 药靶等结合过程中非常重要。在b i a c o r e 测定中，一个反应物要固定在柔性的葡聚糖 表面上，这样会限制分子的旋转和扩散，使之与溶液中测定的方法有所不同。d a y 等踟 分别用b i a c o r e 技术、等温滴定热量测定( i s o t h e r m a tt i w a t i o nc a l o r i m e t r y ) 和停留荧光 法( s t o p p e d - f l o w f l u o r e s c e n c e ) 测定小分子c b s d n s a 与碳酸酐酶i i ( c a r b o n i c a n h y d a r s e i i ) 的平衡常数、热力学常数和速率常数。结果显示，基于表面的b i a c o r e 技术与基于溶液 测定的方法所得到的数据是一致的，从而证明以s p r 为基础的b i a c o r e 技术是动力学测 定的可靠方法。b i a c o r e 所测量的动力学范围很广，平衡解离常数范围在i 0 - 4 _ 5 1 0 - “ m o l l 左右，所以能够检测与靶蛋白亲和力很低的生物活性分子。生物系统中弱亲和作 用的意义日益重要，例如在细胞与细胞的相互作用、细胞和底物的作用、物质代谢、免 疫识别以及病毒和细菌与靶细胞的识别等口“。b i a c o r e 技术可以用来快速、动态、特异 和重复性地测定弱亲和力的结合反应。o h l s o n 等口q 设计了运用b i a c o i e 技术，用单抗 来监测和定量测定病人血清中糖类的方法，而且无需再生芯片，即可连续进行免疫检测， 提供了在线读取病人血清分析物的方法。随着相互作用的分子探针的发现和改进，b i a c o r e 的应