（生物医学工程专业论文）钴盐与钴卟啉对过亚硝酸根硝化酪氨酸影响的研究.pdf

北京t 业大学工学博士学位论文 i 皇詈皇詈詈曼詈曼詈! 鼍詈詈! 詈詈詈曼曼曹曼曼皇皇曼量! 鼍置鼍皇鲁量! 曼皇詈曼詈! 曼詈詈墨皇詈量富皇篁鲁曼暑置皇量皇量皇量皇詈量詈皇曼皇皇詈詈皇詈詈詈鼍詈鼍鼍 级有关，即对位取代基吸电子能力越强，钴离子所带正电荷数就越多，钴卟啉 晶o m o 和中间体e l u m o 也越低，这些因素都有利于钴卟啉催化过亚硝酸根分解。 通过实验发现，与钴盐类似，钴卟啉也具有催化过亚硝酸根硝化酪氨酸的能力。 最后，本文对还原剂维生素c c v c ) - 与钴盐或钴卟啉协同影响过亚硝酸根与 酪氨酸的反应进行了研究。光谱实验和动力学实验结果表明v c 通过还原催化 中间体对钴盐或钴卟啉催化过亚硝酸根分解和催化过亚硝酸根硝化酪氨酸产生 影响。与v c 协同后，钴盐或钴卟啉抑制硝化产物的生成，且钴盐或钴卟啉催化 过亚硝酸根分解的能力增强。即与还原剂v c 协同后，钻盐或钴卟啉可以起到 过亚硝酸根清除剂的作用，保护酪氨酸等生物分子不被过亚硝酸根硝化。 关键词：过亚硝酸根；钻盐；钴卟啉；催化作用；构效关系 a b s t r a c t a b s t r a c t p e r o x y n i t r i t e ( o n o o 一) i sa i la c t i v em o l e c u l e ，w h i c hc a l lb ef o r m e dt h r o u g h m u l t i p l ep a t h w a y si nv i v o o n o o c a nm o d i f ya m i n oa c i d s ，p r o t e i n s ，d n a ，l i p i d s a n do t h e rb i o l o g i c a lm o l e c u l e si nv i v oa n dr e s u l ti ns e r i o u sb i o l o g i c a lc o n s e q u e n c e s t h en i t r a t i o no ft y r o s i n ei so n eo ft h em a i nm a n n e r st oe x h i b i tt h et o x i c i t yo f p e r o x y n i t r i t e m e t a l l o p o r p h y r i n sa n do t h e rt r a n s i t i o nm e t a lc o m p l e x e sc a t a l y z e o n 0 0 一d e c o m p o s i t i o nt os c a v e n g ei t i nv i t r oa n di nv i v o ，a n dt h e yc a nc a t a l y z e t y r o s i n en i t r a t i o ni n d u c e db yp e r o x y n i t r i t e c o b a l ti sa ni m p o r t a n tt r a n s i t i o nm e t a l e l e m e n tw i ms i g n i f i c a n tb i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，w h i c he x i s t si nm u l t i p l ef o r m si nv i t r o a n di nv i v o t o s t u d yt h ei n f l u e n c eo fc o b a l tc o m p l e x e so np e r o x y n i t r i t e d e c o m p o s i t i o na n dp e r o x y n i t r i t e - m e d i a t e dn i t r a t i o no ft y r o s i n ei sq u i t ee s s e n t i a l t h e r e s e a r c hc o n c e r n i n gt h es c a v e n g i n ge f f e c to fc o b a l tp o r p h y r i n so no n o o p r o v i d e s t h et h e o r yb a s i sa n de x p e r i m e n t a ld a t at oe x p l o r e p e r o x y n i t r i t es c a v e n g e r s f i r s t l y , t h ec a t a l y s i so fc o b a l ts a l t so np e r o x y n i t r i t ed e c o m p o s i t i o na n dt y r o s i n e n i t r a t i o nw e r es t u d i e db yu v - v i ss p e c t r u ma n ds t o p p e d f l o wa p p a r a t u s t h r o u g ht h e a n a l y s i so f t h ep r o d u c t sa f t e rc o b a l ts a l t sr e a c t i n gw i t hp e r o x y n i t r i t e ，i tw a sc o n c l u d e d t h a tc o b a l ts a l t si n f l u e n c e dt h er e a c t i o n so fp e r o x y n i t r i t et h r o u g hc o ( i i i ) o o n o i n t e r m e d i a t e s u s i n gs t o p p e d - f l o wa p p a r a t u s ，t h ec a t a l y t i ca c t i v i t i e s ( o fc o b a l t s a l t sf o rp e r o x y n i t r i t ed e c o m p o s i t i o na td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sw e r eo b t a i n e d t h e a c t i v a t i o ne n e r g yf o rs p o n t a n e o u sp e r o x y n i t r i t ed e c o m p o s i t i o nw a s8 0 8k j m o l t h e a c t i v a t i o ne n e r g i e so fc a t a l y z e dp e r o x y n i t r i t ed e c o m p o s i t i o nw e r e6 2 3k j t o o l 1a n d 6 1 5l d m o l ，r e p e c t i v l yf o rc o c l 2a n dc o ( a t ) 2 t h ec a t a l y t i ce f f e c t so fc o b a l ts a l t s o np e r o x y n i t r i t e - m e d i a t e dn i t r a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e dq u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l y c o b a l ts a l t sc a t a l y z e dt h en i t r a t i o no ft y r o s i n e ，t r y p t o p h a na n db s a t h ec h a n g eo f t h r e e - d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r u m ( 3 df l u o r e s c e n c es p e c t r u m ) i n d i c a t e dt h a t t h ed a m a g et ob s aw a se x t e n d e db yc o b a l ts a l t s c o b a l ts a l t sa c c e l e r a t e dt h en i t r a t i o n r a t eo ft y r o s i n ei n d u c e db yp e r o x y n i t r i t e t h ea c t i v a t i o ne n e r g yf o rs p o n t a n e o u s p e r o x y n i t d t e - m e d i a t e dn i t r a t i o nw a s7 5 3k j m o l - 1 t h ea c t i v a t i o ne n e r g i e so f c a t a l y z e dn i t r a t i o nw e r e5 6 5k j m o l a n d5 6 1k j 。m o l ，r e p e c t i v l yf o rc o c l 2a n d c o ( a c ) 2 c o b a l ts a l t sd e c r e a s e dt h ee n e r g i e sf o rp e r o x y n i t r i t ed e c o m p o s i t i o na n d t y r o s i n en i t r a t i o nb yp e r o x y n i t r i t e s e c o n d l y , t h ec a t a l y s i so fc o b a l tp o r p h y r i l l $ o np e r o x y n i t r i t ed e c o m p o s i t i o na n d t y r o s i n en i t r a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e db yk i n e t i c se x p e r i m e n t sa n dt i m e - r e s o l v e d i 北京工业大学工学博士学位论文 u v - v i ss p e c t r u m t h eq s a r ( q u a n t i t a t i v er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n d c a t a l y t i ca c t i v i t y ) o fc o b a l tp o r p h y r i n s f o rp e r o x y r t i t r i t e d e c o m p o s i t i o n w a s i n v e s t i g a t e db yc o m b i n i n gt h ec a t a l y t i ca c t i v i t i e sw i t he h o m oo fc o b a l tp o r p h y r i n sa n d e u ：m oo fi n t e r m e d i a t e s 1 1 1 ep a r a s u b s t i t u t e dc o b a l tp o r p h y r i n sw e r ec o n c l u d e dt o c a t a l y z eo n 0 0 一d e c o m p o s i t i o nt h r o u g ht h ef o r m a t i o no fh i g hv a l e n ti n t e r m e d i a t e s t h eo r t h o - s u b s t i t u t e dc o b a l tp o r p h y r i n sh a dn oc a t a l y s i sc a p a b i l i t yf o rp e r o x y n i t r i t e d e c o m p o s i t i o n t i m e - r e s o l v e ds p e c t r u ms h o w e dt h a t t h e r ew a sn oi n t e r m e d i a t e f o r m e dd u r i n go r t h o - s u b s t i t u t e dc o b a l tp o r p h y r i n sr e a c t i n gw i t hp e r o x y n i t r i t e t h e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nc a t a l y t i ca c t i v i t i e sa n dt h ec h a r g e so nc o b a l t ，e h o m oo fc o b a l t p o r p h y r i n s ，e l u m oo f i n t e r m e d i a t e sw e r es t u d i e d ，r e s p e c t i v e l y w i t ht h ei n c r e a s i n g e l e c t r o n - w i t h d r a w i n gc a p a b i l i t i e so ft h ep a r a s u b s t i t u e n t s ，t h e r ew e r em o r ec h a r g e s o nc o b a l ti o n s t h ee h o m oo fc o b a l tp o r p h y r i n sa n de u r m oo fi n t e r m e d i a t e sw e r e l o w e rw h e nt h ee l e c t r o n - w i t h d r a w i n gc a p a b i l i t i e so ft h ep a r a s u b s t i t u e n t sw e r e s t r o n g e r t h e s ec o n s e q u e n c e sw e r ea l lh e l p f u lt oe n h a n c et h ec a t a l y t i ca c t i v i t i e so f c o b a l t sp o r p h y r i n sf o rp e r i x y n i t r i t ed e c o m p o s i t i o n c o b a l tp o r p h y r i n sh a dt h ea b i l i t y t oc a t a l y z et y r o s i n em t r a t i o nb yp e r o x y n i t r i t e ，w h i c hw a ss i m i l a rt oc o b a l ts a l t s a tl a s t , t h es y n e r g i s t i ce f f e c to f v i t a m i nc c ) a n dc o b a l tc o m p o u n d sw a si n v e s - t i g a t e d s p e c t r u ma n dc se x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tv i t a m i nc ， a sa r e d u c t a n t , h a ds i g n i f i c a n te f f e c to nt h ec a t a l y s i so fc o b a l ts a l t sa n dc o b a l tp o r p h y r i n s o nt h er e a c t i o n so fp e r o x y n i t r i t et h r o u g hr e d u e i n gt h ei n t e r m e d i a t e s c o b a l ts a l t so r c o b a l tp o r p h y r i n si n h i b i t e dt h en i t r a t i o no ft y r o s i n ei nt h ep r e s e n c eo fv e ，a n dt h e c a t a l y t i c a c t i v i t i e so fc o b a l tc o m p o u n d sf o rp e r o x y n i t r i t e d e c o m p o s i t i o nw e r e e n h a n c e ds h a r p l y t h e r e f o r e ，w h e nc o u p l e d 谢mv e ，c o b a l ts a l t sa n dc o b a l t p o r p h y r i n s s e r v e da s p e r o x y n i t r i t es c a v e n g e r s t o p r o t e c tt y r o s i n e a n do t h e r b i o m o l e c u l e sf r o mt h en i t r a t i o ni n d u c e db y p e r o x y n i t r i t e k e yw o r d s ：p e r o x y n i t r i t e ；c o b a l ts a l t ；c o b a l tp o r p h y r i n ；c a t a l y s i s ；q s a r 一 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：串导师签名 第1 奄绪论 1 1 过亚硝酸根的形成 第1 章绪论 早在1 9 2 9 年，人们就发现臭氧与叠氮化钠作用时有过亚硝酸根( o n o o 一) 生成【l 】，o n o o 一也是过氧化氢氧化亚硝酸生成硝酸过程的中间产物【2 】o1 9 9 0 年 j b e e k r n a n 等人发现在生物系统中有o n o o 一生成【3 1 ，使有关o n o o 一的研究成 为生命科学研究中的一个热点睁1 5 】。在人体中，过亚硝酸根主要通过三种途径 形成。第一：一氧化氮自由基( n o ) 和超氧根阴离子( 0 2 一) 迅速结合形成 o n o o 一，这是过亚硝酸根在体内形成的主要途径【m 1 1 】；第二：n o 一与分子氧( 0 2 ) 反应生成过亚硝酸根【1 2 1 ；第三：n o 与血红素蛋白，如氧基血红素、氧基肌球 素反应也可生成过亚硝酸根【1 2 1 。如式( 1 1 ) 一( 1 3 ) 所示： n o + 0 2 一一o n o o n o - + 0 2 - o n o o 一 n o + h b 2 + 0 2hh b 3 + o 一h b 3 + - o n o o 一 ( 1 - 1 ) ( 1 - 2 ) ( 1 - 3 ) 内皮细胞( e n d o t h e l i a lc e h s ) 、巨噬细胞( m a c r o p h a g e s ) 、神经元细胞( n e u r o n a l e e u s ) 、嗜中性粒细胞( n e u t r o p h i l s ) 、平滑肌细胞( s m o o t h m u s c l ec e l l s ) 等都能 够同时产生n o 和0 2 - 1 4 - 9 ，从而产生过亚硝酸根，两种自由基的结合速率k 约为l x l 0 1 0m 1 s 。1 【1 2 】。此速率比0 2 一与c u - z n s o d 的反应速率( 2 x 1 0 9m 。卜s1 ) 或与m n s o d 的反应速率( 1 9 x 1 0 9 m i l s - 1 ) 高5 倍左右，因此，0 2 一在体内可能 会优先与n o 反应生成o n o o 一。由于与n o 相比，0 2 一的扩散范围更小，半 衰期更短，过亚硝酸根一般在更靠近0 2 一的位置生成。在某些特定情况下，如 发生炎症时，0 2 一和n o 增多会导致o n o o 一增多。 o n 0 0 一在体内可以快速地与多种目标分子进行反应，其存在于体内的量很 难准确测量，一般认为其在体内相对稳定的浓度为每升纳摩尔级的范围内，此 浓度可保持数小时。虽然过亚硝酸根在生理p h 下的半衰期非常短，仅有1 0m s 左右，但是在一个细胞中产生的o n o o 一可以穿过细胞膜影响此细胞周围一到 两个细胞直径范围内( 约5 2 0g a l a ) 的其他细胞 1 2 1 。过亚硝酸根质子化后的共 轭酸一一过亚硝酸( h o o n o ) 的p 磁为6 8 ，在生理p h 下，过亚硝酸根与过亚 硝酸同时存在【l u j 。 北京工业大学工学博士学位论文 1 2 过亚硝酸根的生物学作用 o n o o 一是一种很强的单、双电子氧化剂，具有强氧化性，可引发自由基氧 化反应和芳环硝化，这使得o n o o 一有可能成为多种疾病的引发因子【1 3 2 0 】。大 量的研究表明脂蛋白过氧化和心血管内皮细胞膜受损是导致冠心病和动脉硬化 的主要原因 2 蝴1 ，而内皮细胞产生的o n o o 一正是使脂蛋白过氧化和心血管内 皮细胞膜受损的主要物质【2 5 枷】。过亚硝酸根可导致恶性肿瘤等严重疾病的发 生，其硝化酪氨酸( t y r ) 可影响酪氨酸磷酸化这一调控细胞生长、增殖、分化 的关键步裂3 1 碰】使d n a 断裂以及对碱基的修饰可导致基因突变【3 3 3 4 】。过亚 硝酸根能够与抗氧化剂( 如：维生素c 、谷胱甘肽、q 维生素e 和尿酸) 、脂质 中的不饱和脂肪酸、蛋白质氨基酸残基( 如：酪氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸) 、以 及嘌呤碱基等反应【l o 3 “7 4 】。 1 2 i 过亚硝酸根与氨基酸、蛋白质的反应 在过亚硝酸根的多种反应中，o n o o 一对氨基酸、蛋白质的损伤近十几年来 一直是研究热点【3 2 1 。在所有氨基酸中，o n o o 一可以损伤酪氨酸、色氨酸、半 胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和组氨酸这六种氨基酸，形成硝化产物、氧化产物、 亚硝化产物等多种损伤产物【3 5 1 。 酪氨酸被o n o o 一损伤后的主要产物3 硝基酪氨酸( 3 n t ) 与心脏病、帕 金森症等多种疾病密切相判3 9 啦】，因此，在o n o o 一对氨基酸的损伤中，对酪 氨酸研究最多。o n o o 一损伤酪氨酸的主要产物为3 硝基酪氨酸( 3 - n t ) 、3 羟基 酪氨酸( 3 - o h t y r ) 和3 , 3 二聚酪氨酸( 3 ，3 d i t y r ) c 3 5 】，结构式见图1 1 。 - o o c n ，i 。h 3 + c , - c h 2 - i 兮。h i力 心 。o 一 一广0 h h_一 p o c 一午一c h 2 h n h 3 + o o c - - c - - c h 2 l h h l - 3 _ n i t r o t y r o , s i n e i 嘶葛叮， o o c c 。- - c h 2 h 3 ，3 - d i t y r o s i n e l - 3 - h y d r o x y t y r o s i n e 图1 1o n o o 一与酪氨酸反应后的产物 ，f i g 。1 一lp r o d u c t so f o n o o r e a c t i n gw i t ht y r o s i n e 2 h 第1 章绪论 过亚硝酸根不与酪氨酸直接反应，通过均裂成羟自由基( o h 。) 和二氧化氮自 由基( n 0 2 ) 损伤酪氨酸。在疾病状态下，3 - n t 的量比正常值高出2 1 0 倍【3 2 1 。多 种疾病模型中酶和蛋白被硝化，如牛动脉粥样硬化损伤处前列腺环素合酶、帕金 森综合症鼠模型中的酪氨酸羟化酶、人胰腺癌中的c 2 s r c 酪氨酸激酶、鼠肝和肺 组织中的线粒体蛋白、人帕金森综合症和动物模型中的0 【2 突触蛋白、人心脏衰竭 中的肌浆网钙a t p 酶、镰状细胞病鼠肾和肝组织中的肌动蛋白等、与早老性痴 呆症相关的t a u 蛋白、人肾移植排斥和神经退行性疾病中的m n s o d 、人急性呼吸 窘迫综合症中的几种血浆蛋白、糖尿病鼠模型中的琥珀酰辅酶、肌萎缩性侧索硬 化症鼠模型中的烯醇化酶、a t p 酶、热休克蛋白和肌动蛋白等【3 1 1 。 色氨酸是除酪氨酸外另一种芳环氨基酸，近些年对o n o o 一损伤色氨酸也 有一定的研究【州引，普遍认为其损伤机理也有类似损伤酪氨酸的自由基的参 与。o n o o 一质子化后可以直接和色氨酸反应( 图1 2 ) ，产物主要有硝基色氨酸、 羟基色氨酸、甲酰犬尿氨酸、羟吲哚、羟吡咯吲哚等【4 5 】。 o n o o 。+ h + = ；= 兰= o n o o h + 彳h 2 h o q c h n h 2 i | o 图1 2o n o o 一与色氨酸反应途径 f i g 1 - 2t h em e c h a n i s m o f t h er e a c t i o no f o n o o w i t h t r y p t o p h a n 过亚硝酸根与半胱氨酸的反应是最早报道的过亚硝酸根与氨基酸的反应 。半胱氨酸是与过亚硝酸根反应最快的氨基酸，此反应的二级速率常数为 4 5 x 1 0 3m 1 s ，是半胱氨酸与过氧化氢反应速率的3 倍鲫。过亚硝酸根与半胱 氨酸上的硫醇反应生成二硫键和亚硝酸根。硫醇首先与过亚硝酸反应生成 r s o h ，r s o h 再与另一分子硫醇反应生成二硫键，如式1 4 、1 5 所示【3 5 1 。 r s 一十o n o o h r s o h + n 0 2 。 r s 。+ r s o h - r s s r + 0 h 一 ( 1 - 4 ) ( 1 - 5 ) 过亚硝酸根与蛋氨酸的反应速率约为2 1 0 2 m - 1 s ，产物为蛋氨酸亚砜和亚 硝酸根【3 5 , 4 9 - - 5 1 1 。与酪氨酸一样，苯丙氨酸和组氨酸与过亚硝酸根也不直接反应， 北京工业大学工学博士学位论文 暑寡暑皇i i 一j , i i 鼍窟皇詈鼍皇曼詈詈詈詈皇宣皇詈皇皇皇皇寡皇皇鲁! 阜 过亚硝酸根也通过自由基机理损伤苯丙氨酸和组氨斟3 5 1 。苯丙氨酸被过亚硝酸 根损伤后的产物有邻、间、对位酪氨酸和硝基苯丙氨酸。过亚硝酸根损伤组氨 酸后产生硝化产物和氧化产物。 过亚硝酸根损伤氨基酸后的产物以及检测到的反应中间体多种多样【3 5 】，总 结于表1 1 。 表1 - 1o n 0 0 一与不同氨基酸反应后的产物及检测到的反应中间体 t a b l e1 - 1p r o d u c t sa n di n t e r m e d i a t e sd e t e c t e di np e r o x y n i t r i t e - d a m a g e da m i n oa c i d s 过亚硝酸根损伤蛋白质，即特定位置的氨基酸残基被过亚硝酸根损伤后可 以改变蛋白质的结构和功能【3 o 】，从而造成多种生物学后果。如鼠冠状动脉微 血管上电压门控的k + 离子通道和鼠巨噬细胞中的铁蛋白1 ( r a p 1 ) 都是因为被硝 化而使其功能受到了抑制。过亚硝酸根在细胞中干扰线粒体的代谢过程，硝化 线粒体蛋白【1 2 】。i v l n s o d 和细胞色素c 的硝化可以引起细胞凋亡或细胞坏死。 过亚硝酸根可损伤多种酶从而使其失活，如细胞色素p 4 5 0 上的巯基被氧化后会 导致失活，前列腺环素合酶、谷氨酰胺合酶、钙a t p 酶和蛋白激酶c 等也会被 过亚硝酸根氧化或硝化而失活。过亚硝酸根与i v l n s o d 反应后，t y r 3 4 被硝化， 阻碍了底物靠近活性中心而致使其失活【l ，。表1 2 列出目前已经确定的过亚硝 第l 章绪论 酸根损伤致失活的酶以及损伤的位剧3 5 1 。 表1 2o n 0 0 一损伤的酶及损伤位点 t a b l e1 - 2e n z y m e sd a m a g e db yp e r o x y n i t r i t ea n dt h er e s i d u e sd a m a g e d e n z y m e m o d i f l e dr e s i d u e a t p a s e b s u c c i n a t ed e h y d r o g e n a s e b f u m a r a t er e d u c t a s e ( t r y p a n o s o m ae r u z i ) 6 n a d h ：u b i q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s e b c y t o c h r o m ep 4 5 0b m - 3 。 c y t o c h r o m ep 4 5 02 b1 。 p r o s t a o y c l i ns y n t h a s e b c i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e 。 g l u m t h i o n ep e r o x i d a s e b 声 a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e cz i n c a c o 血t 觞e b 。 6 - p h o s p h o g l u c o n a t ed e h y d r a t a s e b f u m a r a s e 心 c r e a t i n ek i n 嬲e b 声 g l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e b 。 g l u t a m i n es y n t h e t a s e c s u c c i n y l c o a ：3 o x o a c i dc o at r a u s f e r a s e b m n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e b 。 c u z ns u p c r o x i d ed i s m u t a s e c t y r o s i n eh y d r o x y l a s e b 。 ， t r y p t o p h a nh y d r o x y l a s e c c a 2 t - a t p a s e b c a s p a s e3 b 。 p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e c n i c o t i m a m i d en u c l e o f i d et r a n s h y d r o g c n a s e b r i b o n u c l e o f i d er e d u c t a s e 。 z n 2 t - g l y c e r o p h o s p h o c o l i n ec h o l i n e p h o s p h o d i e s t e r a s e 。 n a d p h - c y t o c h r o m ep 4 5 0r e d u c t a s e 。 g l u t a t h i o n er e d u c t a s e o n d 4 n d n d n d c y s ，t y r t y r t y r h e l n e s e l e n o c y s t e i n e z i n cs u l f u rc l u s t e r i r o ns u l f u rc l u s t e r i r o ns u l f u rc l u s t e r i r o ns u l f u rc l u s t e r c y s c y s t y r , m e t t y r t y r h i s t y r , c y s c y s c y s c y s c y s t y r t y r t y r n d t y r g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s p 芦 n d 5 g l u t a r e d o x i n b p r o t e i nk i n a s ec b 詹 o m i t h i n ed e c a r b o x y l a s e b 。 x a n t h i n eo x i d a s e 。 l y s o z y m e c n d t y r t y r m o l y b d e n u mc e n t e r t r p a n d ：n o td e t e r m i n e d j b e 耻：y m ei nc e l le x t r a c t s ，e xv i v o0 1 i nv i v os y s t e m s ，c p u r i f i e de n z y m e 对过亚硝酸根与生物分子反应的动力学研究越来越受到各国学者的重视， 多种氨基酸、肽链和蛋白质与o n 0 0 一反应的速率已被确赳3 5 1 ，如表1 3 所示。 通过测定过亚硝酸根与多种分子的反应速率，可以帮助人们了解o n 0 0 一这种 毒性小分子在体内的作用靶点和代谢途径。 表1 3 一些氨基酸、蛋白质与o n 0 0 一反应的二级反应速率 t a b l el - 3s e c o n d - o r d e rr a t ec o n s t a n t so ft h er e a c t i o n so f p e r o x y n i t r i t ew i t h f r e ea m i n oa c i d sa n dp r o t e i n s 第1 章绪论 p h ：t h i sc o l u m ns h o w st h ep ha tw h i c ht h er a t ec o n s t a n tw a sd e t e r m i n e c , “i nt h ec a s eo fp r o t e i n s ， t h ec r i t i c a lr e s i d u ei ss h o w ni np a r e n t h e s i s ，c n r ：n o tr e p o r t e d 过亚硝酸根损伤氨基酸、蛋白质主要通过直接损伤机理和自由基损伤机理 进行。直接损伤机理为o n o o 一或者其共轭酸o n o o h 直接与氨基酸反应，产 生损伤产物，可直接与过亚硝酸根反应的氨基酸包括半胱氨酸、色氨酸和蛋氨 酸；自由基损伤机理是通过过亚硝酸根均裂后的自由基损伤氨基酸，这类氨基 酸包括酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸。 在过亚硝酸根损伤酪氨酸的反应过程中可检测到有酪氨酰自由基( t y r 。) 存 在。过亚硝酸根损伤酪氨酸的过程包括酪氨酸与羟基( o h ) 或二氧化氮自由基 0 2 ) 反应生成t y r 。，以及t y r 再与n 0 2 结合生成3 - n t 的步骤。反应过程及 速率表示如下【l u j ： 0 n o o h + 0 3o h + 0 3n o + 0 7n 0 3 。+ o 7 旷 七= 0 9s 。1 ( 1 6 ) t y r h + n 0 f + t y r + n 0 2 。 七= 3 2 x1 0 5m - 1 s 1 ( 1 - 7 ) t y r h + o h 。二0 9 5t y r o h 。+ 0 0 5t y r 。 尼= 1 4 1 0 1 0m - 1 s - 1 ( 1 - 8 ) t y f + n o l _ t y r - n 0 2 t y f + t y ，一d i t y r 七= 3 x 1 0 9 m 1 s - 1 ( 1 - 9 ) 后= 4 5 x 1 0 8m - l s - i ( 1 1 0 ) 2 t y r o h 。t y r - o h + p r o d u c t s 七= 3 x 1 0 8m 1 s 。1( 1 - 1 1 ) t y r o h 。 t y r + h 2 0 k = 1 8 x 1 0 sm q s - 1 ( 1 - 1 2 ) 式1 - 6 至1 - 1 2 是目前国际上普遍认可的o n o o 一损伤酪氨酸的自由基机理。 其他损伤机理认为o n o o 一质子化后变为一种激发态( o n o o h ) ，或者产生硝酰 正离子( n 0 2 + ) ，由它再去氧化、硝化酪氨酸 4 3 】，见图1 3 。 北京工业大学工学博士学位论文 n o + 0 2 。一一o n o o o = n o o h 2 + _ 损伤酪氨酸 图1 3o n o o 一损伤酪氨酸的其他机理 f i g 1 - 3t h eo t h e rm e c h a n i s m so f o n o o d a m a g i n gt y r o s i n e 上述机理为没有影响因素时过亚硝酸根损伤酪氨酸的机理，当有金属化合 物时，其机理发生改变【4 3 ，限。7 1 】。含有金属的蛋白质与过亚硝酸根反应后，硝化 产物的量比不含金属的蛋白质高得多，这些蛋白质包括血红蛋白、细胞色素c 、 细胞色素p 4 5 0 等畔m l 。经过大量研究，人们发现这些蛋白中的金属中心铁在 过亚硝酸根硝化蛋白时起到了催化作用，并且使硝化位点出现了选择性：离金 属中心近的酪氨酸残基更容易被硝化。金属化合物参与后，o n o o 一先与金属反 应，生成一种类似于硝酰正离子的中间体，此中间体可发生亲电硝化，直接硝 化酪氨酸，如f e e d t a 可以通过这种机理催化过亚硝酸根硝化酪氨酸和色氨酸 ( 式1 1 3 、1 1 4 和1 1 5 ) 【4 3 】。 o n o o 一+ f e 3 + e d t a _ n o2 8 + 一6 - o - - f e 3 + e d t a ( 1 - 1 3 ) p h e n o l + n o l 2 8 + _ 6 - o f e 3 t d t a _ n 0 2 - - p h e n o l + 矿+ 一o - - f e 2 + e d t a ( 1 1 4 ) 2 h + + 一o - - f e 2 + e d t a _ h 2 0 + f e 3 + e d t a ( 1 - 1 5 ) 此外，近些年的研究发现在生物系统中过亚硝酸根诱导生成3 - n t 的过程 与二氧化碳( c 0 2 ) 密切相关。c 0 2 与过亚硝酸根反应生成更强的二：级氧化剂一一 碳酸根自由基( c 0 3 一) ，c 0 3 - 与酪氨酸反应生成t y r 1 0 , 3 7 1 ，如式1 1 6 所裂1 0 1 。 因此，二氧化碳存在时，硝化产物的量会由于t y r 。的增加而增加。 t y r h + c 0 3 _ t y r 。4 - h c 0 3 一 k = 4 5 1 0 7 m 以s ( 1 1 6 ) 综上所述，过亚硝酸根在不同条件下可通过不同机理损伤氨基酸、蛋白质， 这些机理可总结如图1 4 。 t l h 当 第1 章绪论 n 0 + 0 2 4 “叶1 卜 r s s r a ，a - o h 图l - 4 过亚硝酸根损伤氨基酸的具体途径 f i g 1 - 4t h em e c h a n i s m so f t h er e a c t i o n so f o n o o 一、i 吐1a m i n oa c i d s 1 2 2 过亚硝酸根与d n a