（矿物加工工程专业论文）溶磷菌株选育及菌群协同作用研究.pdf

武汉理工大学硕+ 学位论文 摘要 随着国民经济的发展，我国对铁矿石的需求量日益增大，而现存的大量铁矿 石资源，由于品位较低，远不能适应钢铁工业和经济发展的需求，产需矛盾日益 突出。因此对难选赤铁矿的开发利用已成为学者们普遍关注的问题，鲕状赤铁矿 就是其中的一种。 鲕状赤铁矿石因原矿品位低，形态复杂，加之选矿成本高，已成为世界公认 的最难选铁矿石之一，而采用传统的选矿方法亦难以获得较理想的效果。本文利 用从广西某温泉和大冶铜矿等地采集来的三种溶磷菌嗜酸氧化亚铁硫杆菌 似c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s , 以下简称爿f 厂菌) ，嗜酸氧化硫硫杆菌 ( a c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ，以下简称a t t 菌) 和鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s s p ) 的浸矿研究，从中发现： 1 ) 在低矿浆浓度条件( 1 ) 下，与单一菌浸矿相比，将彳f 厂和a t t 进行不同 比例混合后，细菌能明显提高铁矿石的脱磷率，其中最佳混合比例为( 4 t 厂：a t f ) 1 ：3 ，通过进一步x r d 和s e m 分析后发现，混合菌较么t 厂单独浸矿相比，能减 少代谢产物铁矾沉淀的生成量，从而更利于矿粉与细菌的接触，提高细菌的脱磷 率。而适当降低培养基中能源物质f e s 0 4 和硫粉的含量，仍然可以获得较为理想 的脱磷效果，同时在一定程度上降低了固相的硫含量。 2 ) 通过改变a t 厂菌的培养基成分后发现，能源物质f e 2 + 的存在形式对其生长 和浸矿具有极为重要的影响。在含f e c l 2 的培养基中，由于过量c l 存在，对么f 厂 的生长和浸矿具有明显的抑制作用。 3 ) 对采集于大冶铜矿的野生菌进行富集和纯化，通过逐渐改变培养基中f e s 0 4 和葡萄糖的比例，选育出一株异养菌s p h i n g o m o n a s s p ，该菌能利用有机能源物质 进行化能异养。对浸矿的研究后发现，s p h i n g o m o n a ss p 较么厂和a t t 相比，具有 明显的优势。在低矿浆浓度条件下，能显著提高矿石的除磷率，同时也解决了固 相成分中元素硫含量过高的问题，具有广泛的应用前景。进一步研究后发现，矿 浆浓度是制约磷浸出率的主要影响因素。 关键词：鲕状赤铁矿，生物冶金，溶磷菌 武汉理工人学硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fn a t i o n a le c o n o m y ，t h ed e m a n df o ri r o no r ei si n c r e a s i n g b u tt h eq u a l i t yo fi r o no r er e s o u r c e si sr e l a t i v e l yl o wr i g h tn o wa n dc a l ln o tm e e tt h e n e e do fs t e e li n d u s t r ya n de c o n o m y t h ec o n t r a d i c t i o nb e t w e e np r o d u c t i o na n dd e m a n d h a st u r n e do u tt ob ei n c r e a s i n g l yp r o m i n e n t ，s ot h a tt h ep r o b l e mo fe x p l o i t a t i o na n d u t i l i z a t i o no fr e f r a c t o r yh e m a t i t eh a sb e c o m eag e n e r a ld i s c u s s i o na m o n gs c h o l a r s o n e o ft h eh o tc o n c e r n si st h eo o l i t i ch e m a t i t e a sf o rt h el o w e rq u a l i t yo fr a wo r ea n dm o r ec o m p l e xs h a p ep l u sw i t hh i g h e rc o s t ， t h er e s e a r c ho fo o l i t i ch e m a t i t eh a sb e c o m ea nu n i v e r s a l l ya c k n o w l e d g e dq u e s t i o n t r a d i t i o n a lm e t h o dc a nn o to b t a i nr e l a t i v e l yp e r f e c te f f e c t ，s ot h i sd i s s e r t a t i o ni s e x p e c t i n gt ou t i l i z et h r e ek i n d so fp h o s p h o r u ss o l u b i l i z i n gb a c t e r i ap u r i f i e df r o mh o t s p r i n gi ng u a n g x ia n dd r a i n a g ef r o mc o p p e ro r em i n ei nd a y e f o c u s i n go nt h es t u d y o fs y s t e m a t i cg r o w t ha n do r el e a c h i n gf r o ma t f ，a t ta n ds p h i n g o m o n a ss p ，w ec a l l c o n c l u d et h a t ： 1 ) w i t hl o w e ro r es l u r r yc o n c e n t r a t i o n ( 1 ) ，t h eb i o l e a c h i n gr a t eh a sr a i s e d d r a m a t i c a l l yw h e na t f w a sm i x e d w i t ha t ti n1 ：3 t h r o u g hf u r t h e rs t u d yo fx r da n d s e m ，t h ea m o u n to f m e t a b o l i t e s - j a r o s i t ei sd i m i n i s h i n gw h e nm i x e d ，t h u sc a nb e m o r es u f f i c i e n t l yc o n t a c t e dw i t ht h eo r e ，i m p r o v i n gt h el e a c h i n gr a t e w h e nr e d u c i n g t h ec o n t e n to ff e s 0 4a n ds u l f u rp o w d e ri nt h em e d i u mp r o p e r l y , i tc a l la l s or e c e i v e r e l a t i v e l yp r e f e c tl e a c h i n gr a t e ，a n dd e c r e s et h es u l f u rc o n t e n tt os o m ed e g r e e 2 ) w h e nt r a n s f o r m i n gt h ec u l t u r em e d i ao f a t f , t h ee x i s t i n gf o r mo ff e 2 十h a sa s i g n i f i c a n ti m p a c to ni t sg r o w t ha n dl e a c h i n g t h ee x c e s so fc 1 。w i l lh a v ead r a s t i c i n h i b i t o r ye f f e c tt oa t f 3 ) w h e nw ee n r i c h e ds p h i n g o m o n a ss p f r o md a y ec o p p e rm i n e ，a n dp u r i f i e d s e v e r a lt i m e s ，w ec a nf i n dt h a ts p h i n g o m o n a ss p c a nu t i l i z et h em a j o r i t yo fo r g a n i c s u b s t a n c ea n dt h e ng e n e r a t eo r g a n i ca c i d f u r t h e rs t u d yc a nb es h o w nt h a ti nt h e b i o l e a c h i n gp r o c e s s ，s p h i n g o m o n a ss p h a sa ni n h e r e n ta d v a n t a g ew h e nc o m p a r e dw i t h 彳t f ，t h a ti s t o s a ys p h i n g o m o n a ss p w i l l n o tg e n e r a t ej a r o s i t ew h i c hh i n d e rt h e p h o s p h o r u sd i s s o l u t i o na n dr a i s e st h ec o n t e n to fs u l p h u r t h u si t w i l lh a v eg r e a t a p p l i c a t i o np r o s p e c t s k e y w o r d s ：o o l i t i ch e m a t i t e ，b i o h y d r o m e t a l l u r g y ，p h o s p h o r u s - s o l u b i l i z i n gb a c t e r i a l l 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：盘日期：乎丛 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权 保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：盐导师签名：纽日期：哩：竺： 武汉理工人学硕士学位论文 第1 章绪论 近2 0 年来，由于人类对矿物原料的需求不断增长，加之地球矿产资源日趋贫、 细、杂，以及常规的矿物加工技术带来的环境问题，迫使人们正在不断寻找一种 新的、成本低的、环境友好型的矿产开发技术。而生物冶金工艺具有成本低、操 作简单、环境污染小、作用对象广泛等优点，已经日益引起人们的重视。在低品 位难选矿石的金属回收、难处理复杂矿的生物预处理、矿山环境污染治理等方面 都取得了重大进展【i q j 。近来研究结果表明：生物冶金还可用于许多有色金属矿石、 精矿及综合利用海底锰结核等。如果能更有效地利用生物冶金技术处理传统选冶 工艺不能经济回收的低品位、复杂、难处理的矿产资源，以及从表外矿和尾矿中 回收金属，将进一步提高我国矿产资源的开发利用率，扩大可开发利用的矿产资 源量【4 5 1 。 1 1 我国铁矿资源及其开发现状 赤铁矿是自然界中分布极广的铁矿物，是重要的炼铁原料，也可以作为红色 颜料。多数重要的赤铁矿矿床是变质成因的，也有一些是热液形成的，或大型水 盆地中风化和胶体沉淀形成的。赤铁矿的化学结构为f e 2 0 3 ，在还原条件下，赤铁 矿可转变为磁铁矿，称假象磁铁矿。自然界中氧化铁有两种同质多象变种，即 t x - f e 2 0 3 和7 - f e 2 0 3 ，前者在自然条件下稳定，称为赤铁矿：后者处于亚稳定状态， 称为磁赤铁矿。赤铁矿会形成一些矿物亚种，如镜铁矿、云母赤铁矿、鲕状或肾 状赤铁矿等。主要分布在我国的辽宁鞍山、湖北大冶、甘肃镜铁山、湖南宁乡和 河北宣化等地。在我国的铁矿资源中，绝大部分赤铁矿属于低品位矿或多金属共 生矿，一般都比较难选，这些矿石的特点是铁品位低、铁氧化物的晶粒微细、与 脉石嵌布紧密且嵌布粒度较细、单体解离度低。 随着国民经济的发展，我国大量低品位铁矿石资源己远不能适应钢铁和其他 工业发展的需求，每年富铁矿石进口量不断增多，对外进口依赖性增大，产需矛 盾日益突出。因此，难选赤铁矿的开发利用已成为日益关注的问题，而鲕状赤铁 矿就是其中的一种。 鲕状赤铁矿储量约占全国铁总储量的9 ，主要分布在湖南、湖北、广西等地。 一般鲕状构造的矿石，胶结物为疏松的脉石矿物，通常可采用洗矿、筛分的方法 得到较粗颗粒的精矿。对于复杂形态的鲕状矿石，当鲕粒为有用矿物组成，胶结 物为脉石矿物，此时磨矿粒度应取决于鲕粒的粒度，精矿质量也取决于鲕粒中有 用成分的含量。当鲕粒为多种矿物( 有用矿物和脉石矿物) 组成的同心环状构造时， 若鲕粒核心大部分为一种有用矿物组成，另一部分鲕核为脉石矿物所组成，胶结 物为脉石矿物，此时可在较粗的磨矿细度下( 相当于鲕粒的粒度) 得到粗精矿和最终 l 武汉理j ：人学硕+ 学位论文 尾矿。若要再进一步提高粗精矿的质量，常需要磨到相当于鲕粒环带的尺寸，再 继续进行选别作业，而此时往往回收率和精矿质量不能兼得。由于鲕状赤铁矿石 原矿品位低，加之难选，品位很难达到炼铁的要求，故通常只能作为炼铁时的配 料 6 - 1 5 , 8 8 】。 铁矿石中含磷量过高，会严重影响到生铁产品的质量，因为磷能使钢产生冷 脆现象。而在烧结和高炉冶炼过程中，矿石中的磷将全部转入烧结矿及生铁中。 用现行氧气转炉直接冶炼，磷的存在又会使铁增加硬脆性，对钢质量、原材料消 耗、炉衬寿命和转炉生产率均有不利影响。铁矿石中磷大部分以胶磷矿、磷灰石、 氟磷灰石3 1 3 c a o p 2 0 5 c a f 4 、3 1 3 c a o p 2 0 5 c a c l 4 和蓝铁矿f e 2 p 0 4 8 h 2 0 等形式 存在【1 6 】。 1 2 现有选矿方法及存在的问题 传统分离磷元素方式一般包括选矿方法、化学方法和冶炼方法【1 5 , 1 7 , - - 1 9 】。选矿 方法往往需要细磨矿石至含磷矿物完全解离，然后再进行磁选或浮选等进行进一 步分离，采用选矿方法脱磷存在以下问题：是矿物成分较为复杂，提磷效率较 低；二是由于细磨降低了球磨机的处理量，从而使磨矿与选矿成本明显增加；三 是有效资源的损失量较大。因此，传统的选矿方法很难达到令人满意的效果。而 随之带来的高污染、高耗能及成本高等缺点除了对环境有影响，也不适应现代工 业的低成本、高效率的要求，因此寻找低成本、高效率，环境友好型提磷方法才 是可持续性发展的趋势。而生物法正成为一种解决含磷矿石磷元素提取问题的新 途径，也是工业化的必然趋势。 生物法主要是通过某些产酸型微生物代谢的特剧 2 1 1 ，利用其菌液对含磷 矿石进行溶出，从而实现含磷物质的分离。其主要通过直接作用和间接作用两种 方式，直接作用主要是微生物本身通过生物自身代谢产生酸性物质，而磷矿石又 主要是以碱性物质形式存在，酸与之反应后使磷元素溶解从而达到从矿石中脱出 磷元素的效果；间接作用则主要是通过微生物能量代谢作用。生物体在三羧酸循 环过程中，将代谢产生的能量以三磷酸腺苷( a t p ) 的高能磷酸键形式保存【1 7 ，2 2 屯6 1 ， 而磷又是构成高能磷酸键的重要元素，微生物会自觉摄取溶液中的各种形态的磷 元素。生物法就是利用以上两种作用方式，达到磷元素浸出的目的。生物法浸出 具有一定选择性，不会造成其他元素较大损失。同时，在能量消耗方面，生物法 多采用简单浸泡方式处理矿石或矿粉，没有较大的能耗及复杂的设备。 2 武汉理工大学硕十学位论文 1 3 溶磷微生物 1 3 1 我国生物冶金的发展 我国是世界上最早采用生物冶金技术的国家。早在公元前2 世纪，就记载了 用铁从硫酸铜溶液中置换铜的化学作用，堆浸在当时就是生产铜的普遍做法。西 汉淮南万毕术里有“自青( 硫酸铜) 得铁则化为铜”的描述。在公元1 1 世纪已 广泛应用了这种工艺，北末时代，又记载有“胆水浸铜”，产铜占当时总产量的 r 1 1 5 2 5 卜“。 近年来，我国微生物浸出的研究及工业化应用有了相当显著的发展。在浸矿 微生物研究方面，张东晨、张明旭等对质粒在硫杆菌中普遍存在的观点提出了质 疑，其研究结果表明：氧化亚铁硫杆菌对f e 2 + 、s 等的氧化能力可能只是与拟核 染色体d n a 有关，而氧化亚铁硫杆菌的遗传物质就是拟核染色体d n a 。徐晓军、 孟运生等报道了经紫外线诱变的浸矿细菌，对黄铜矿的浸出率比原始菌提高了 4 6 以上，到达浸出终点的时间比原始菌缩短了5 1 0 d ，浸矿细菌能更好地氧化浸 出黄铜矿。赵清、刘相梅等利用d n a 体外重组技术，构建了含有强启动子、可在 t r a 基因诱动下转移的组成型表达抗砷质粒p s d r a 4 。通过接合转移的方式将其导 入专性自养极端嗜酸性喜温硫杆菌a c i d i t h i o b a c i l l u s i i i d w 中，构建了冶金工程菌 a c i d i t h i o b a c i l l u sc a d u s ( p s d r a 钐，经检测，重组质粒在喜温硫杆菌中具有较好的稳 定性，在无选择压力条件下传代5 0 次基本保持稳定( 重组质粒保留7 6 以上) ，经 抗砷性能检测，与野生菌相比，构建的喜温硫杆菌工程菌抗砷能力明显提高，从 0 m m o l l 提高到4 5 m m o l l 。在工业化应用方面，生物浸出技术成功运用于江西德 兴铜矿，并建成年产2 0 0 0 t 电铜的堆浸厂；在广东大宝山建立了我国第一个生物 浸铜中试基地；同时，金精矿生物预氧化提金在山东莱州已开始工业应用，镍锌 等硫化矿的生物冶金亦得到不同程度的发展 2 3 1 。 1 3 2 微生物对磷的转化 生物对磷的转化方式主要有两种：一种是生物依靠自身形成的适应机制，另 一种则是由微生物的代谢活动所引起的。磷的地球生物化学循环过程主要包括：a 、 植物根系分泌物和微生物的溶解或其它代谢作用释放出磷酸根离子；b 、植物、微 生物、动物合成有机磷化合物；c 、微生物分解动植物残体中的有机磷化合物；d 、 土壤成份对无机磷或有机磷化合物的固定。磷的地球生物化学循环是典型的不完 全循环，其中磷生物小循环又极为不活跃，因此加强磷生物小循环就可以减弱磷 地球化学大循环，从而可以缓解土壤缺磷、磷矿资源衰竭以及水体富营养化等环 境污染问题【2 7 , 7 8 】。 武汉理工大学硕十学位论文 1 3 3 细菌的溶磷作用 据不完全统计，目前全世界共筛选出3 0 属8 9 种溶磷微生物，其中真菌2 7 个 种，细菌5 8 个种，放线菌4 个种。研究较多的如芽胞杆菌( b a c i l l u s ) 、假单胞杆菌 ( p s e u d o m o n a s ) 、欧文氏菌( e r w i n i a ) 、土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u m ) 、沙雷氏菌( s e r r a t i a ) 、 黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u m ) 、肠细菌( e n t e r b a c t e r ) 、微球菌( m i c r o c o c c u s ) 、固氮菌 ( a z o t o b a c t e r ) 、根瘤菌( b r a d y r h i z o b i u m ) 、沙门氏菌( s a l m o n e l l a ) 、色杆菌 ( c l r o m o b a c t e r i u m ) 、产碱菌( a l c a l i g e n e s ) 、节细菌( a r t h r o b a c t e r ) 、硫杆菌 ( t h i o b a c i l l u s ) 。我国于上世纪5 0 年代开始进行解磷细菌的研究，从土壤中分离得 到了一些分解有机磷能力很强的菌株，如巨大芽胞杆菌( b a c i l l u sm e g a t h e r i u m ) ，极 毛杆菌( p s e u d om o n a ss p 1 等。8 0 年代又推出了多种芽抱杆菌的不同组合形成的系 列产品，包括蜡状芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、短芽胞杆菌饵b r e v i s ) 、坚强芽胞杆 旧) q r m u s ) t 2 7 1 。 1 3 4 真菌的溶磷作用 溶磷真菌在数量上远不如溶磷细菌多，溶磷真菌类主要有青霉菌 ( p e n i c i l l i u m ) 、曲霉菌( a s p e r g i l l u s ) 、根霉( r h i z o p u s ) 、镰刀菌( f u s a r i u m ) 、小菌核菌 ( s e l e r o t i u m ) 等，研究表吲2 7 1 在为数众多的溶磷微生物中- ，曲霉的溶磷活性最高。 1 4 影响微生物浸出的主要因素 微生物浸出是一个复杂的过程，影响其效果的因素很多，必须充分考虑影响微 生物浸出的主要因素，并通过对这些因素的控制来提高浸出速率。 1 4 1 微生物的性质 细菌种类与性质对浸出效果的影响较大，不同细菌对同一矿物浸出的效果会 存在一定差异，而同一种细菌经过不同条件的培养与驯化后其浸出效果也不样。 在不同条件下培养的细菌其细胞具有不同的表面结构，在浸矿时会表现出不 同的附着能力，从而具有不同的浸矿活性。经过驯化的菌株在浸出过程中易于生 长繁殖、能保持较高的活性，矿物表面达到吸附平衡所需要的时间也要短得多。 除了传统的驯化方法，微生物培养还包括诱变育种、杂交育种、原生质体融合技 术和基因工程育种等。 1 4 2 矿石的性质 微生物浸出对象是矿石，因而矿石的性质对浸出效果也会产生重大影响。矿 石的物理化学性质、矿物学特征、电化学性质、表面特性等都将影响细菌与矿物 4 武汉理一1 ：人学硕士学位论文 的作用方式和矿石的溶解特性。 1 4 2 1 矿石粒度 矿石粒度越细，比表面积越大，越有利于微生物与矿石接触，对提高反应速 度越有利。原则上细小粒度更有利于浸出。但过细的矿料不仅增加磨矿费用，浸 出过程中还会产生细泥。因而还需要综合考虑磨矿成本和经济效益等因素。 1 4 2 2 矿石的化学成分 矿石的化学成分除影响矿物的生物浸出速度外，如碱性脉石易溶于酸，由于 细菌浸出多在稀酸介质中进行( p h = 1 2 ) ，这些物质同时溶解，从而大大提高了 过程的耗酸，提高了成本。其中的某些重金属元素如汞、砷、铅等溶解出来也将 会影响生物的生长、繁殖甚至存活。因此，有目的的将矿石混合或除去某些组分， 将会提高浸出率。 1 4 3 环境条件 1 4 3 1 温度 与一般化学反应不同的是，微生物浸出能选择的温度首先受微生物生长的制 约，只能在适宜微生物生长点温度范围内选择。浸出最好在最佳浸矿温度下进行。 最佳浸矿温度不一定就是微生物最佳生长温度，而是微生物的氧化能力最强的温 度。以4 t 厂菌为例，其最适生长温度是3 0 - - - , 3 2 ，当温度低于1 0 c 时，细菌活力 变得很弱，生长繁殖也很慢。当温度高于4 5 时，细菌生长受到影响，甚至死亡。 1 4 3 2 介质p h 值 介质的p h 值主要从以下几个方面影响浸出：( 1 ) 微生物繁殖速率；( 2 ) 微生物 的氧化活性；( 3 ) 固体产物的生成。 每一种细菌都有其适宜的p h 生长范围。浸矿细菌大多为产酸又嗜酸的细菌， 环境酸度对细菌生长有显著影响。以彳f 厂菌为例，细菌氧化f e 2 + 的最适p h 范围为 1 5 , - - , 2 5 ；当p h 在o 9 4 - - - , 3 0 范围时，f e e + 的氧化速率比较快，特别是在p h 在2 o 2 5 时效果更好，在很短的时间里f e 2 + 的氧化率就能达到1 0 0 ；p h 太低时，细菌 基本上没有氧化f e 2 + 的能力；p h 太高时，f e e + 已经沉淀，细菌氧化f e 2 + 能力很差。 所以为了使细菌快速氧化f e 2 + ，一方面通过驯化培养使细菌尽量适应其环境，另 一方面最好调节p h 在细菌最适宜范围内。 1 4 3 3 金属离子浓度 细菌营养成分中有数种微量金属离子，这些离子在细菌生长中起着重要作用， 5 武汉理t 大学硕士学位论文 其中钾离子影响细胞的原生质胶态和细胞的渗透性；钙离子控制细胞的渗透性并 调节细胞内的酸度；镁和铁是细胞色素和氧化酶辅基的组成部分。但如果金属离 子含量过多，将对细菌产生毒害作用。金属离子对细菌的毒害作用主要是使细菌 生长的延滞期增长，从而降低金属的浸出率。不同金属离子，其降低浸出率的机 理有可能不同。另外，金属离子在细菌浸出硫化矿过程中还有催化作用。 1 4 3 4 表面活性剂 细菌浸出速率比较慢，这是细菌浸出的主要缺点，由于微生物浸出体系涉及 微生物、溶液、矿物等多相界面作用，通过调节矿物表面和微生物细胞外膜的性 质可强化微生物与矿物之间的界面作用，提高浸出率。利用表面活性剂可改善矿 石的亲水性和渗透性。试验证明，表面活性剂加入到培养基中可以影响微生物细 胞的生长与分裂，可以改变矿物表面性质，增加矿物表面亲水性，从而有利于微 生物与矿物的接触。因此添加适量的表面活性剂可以大大缩短浸出时间，但表面 活性剂并不能直接促进细菌生长，而且没有提高最终浸出率，同时较高浓度的活 性剂反而不利于浸出。 1 4 3 5 培养基 由于不同微生物的营养要求和代谢方式不同，因而培养基的改变不仅对微生 物的生长有一定的影响，而且对菌种的退化、抑菌化合物的合成和分泌都有影响， 故培养条件的选择也是相当重要的。研究表明，培养基中碳源、氮源及c n 比等 都影响到脱磷菌溶解难溶性磷酸盐的能力。供给不同形态的氮素，对有机酸的分 泌有较大的影响。1 9 9 2 年，j a m e s 研究了p e n i c i l l i u mb i l a i i 溶解磷酸钙的机制，结 果证明p e n i c i l l i l g mb i l a i i 在培养过程中主要产生草酸和柠檬酸，且氮缺乏有利于柠 檬酸产生，碳缺乏有利于草酸产生。范丙全等对溶磷草酸青霉菌( p e n l c l l l l u m o x a l i u m ) 溶磷效果研究表明，氮源影响草酸青霉菌产生有机酸的种类，使用氨态氮 时主要分泌苹果酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、琥珀酸，而在硝态氮条件下几乎不产 生这些有机酸，可见氮源的不同影响了有机酸的代谢方向，并且同一种菌的脱磷 机理可能不只一种。赵小蓉等发现2 株曲霉2 t c i f 2 和4 t c i f 6 在n 0 3 存在时，分 泌更多的有机酸，如草酸、苹果酸、乙酸、乳酸、柠檬酸等，溶磷量比供给n h 4 + 或尿素时最多增加了1 倍以上；2 株节杆菌i t c r i 7 和1 t c r i l 4 ，在n 0 3 的培养基 中，其溶磷量比供给n h 4 + 或尿素时减少了近一半，甚至在n 0 3 - 和n h 4 + 同时存在 时，删f j 4 的溶磷量也显著减少。说明供给不同形态的氮素，微生物分泌有机酸 数量和种类发生了变化【3 4 , 8 5 1 。 6 武汉理t 大学硕士学位论文 1 5 菌种的选育和鉴定 1 5 1 菌种的选育 菌种选育包括选种和育种。选种即根据微生物的特性，应用各种筛选方法从 自然界和生产中选择需要的菌种。育种即进一步提高已有菌种的某种性能，使其 更符合需要，一般通过诱变和杂交来实现。变异菌株中通常只有少数在某些性能 方面比初始菌株有所提高，育种工作中也存在选种问题，而选出的新菌种也有待 通过育种过程提高其性能，选种与育种有紧密联系。目前，微生物冶金中的硬件 设施和工艺流程已经比较成熟，但浸矿微生物生长速度慢，只有大肠杆菌的万分 之一，且在实际浸矿体系中，表面活性剂、重金属离子、卤素离子等含量超过一 定浓度时，将抑制细菌生长，甚至造成菌体死亡。因此，要想充分发挥微生物浸 矿方法的优势，提高其矿物浸出效果，除了进一步改进工艺外，更重要的是要加 强高效菌株的选育工作，改良菌种以获得能适用多种矿石、适应能力强、氧化活 性高、浸出速率快并能大规模应用的高效工程菌【3 5 】。 1 5 2 菌种的鉴定 传统的细菌学检验与鉴定的主要依据是形态特征和生理性状，需要进行细菌 培养及一系列生化反应或免疫学检测，表1 1 所示为微生物经典分类鉴定方法。 但这些方法往往复杂费时，对有些细菌也不能给出理想的鉴定结果。随着分 子生物学技术的发展，p c r 技术以快速、准确和特异等优点迅速地应用到微生物 检测领域。p c r 检测细菌的关键之一是模板的选择，即要确定扩增的目的基因。 目前在细菌分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常用的分子是r r n a 。它们由单一 的3 0 s 前体r n a 分解而来，编码3 0 s r r n a 的d n a 称为r r n a 基因或r d n a 。r r n a 结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘关系，高变性则揭示生 物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。r r n a 的这种特性使得这一段核 酸序列成为目前人们利用p c r 技术检测不同细菌种间或种内差异的最为理想的模 板。1 6 s r r n a 基因大小适中，约1 5 k b 左右，含有高度保守的基因片段，同时在 不同的菌株间也含有变异的核酸片段。因其既能体现不同菌属之间的差异，又能 利用测序技术快速得到核酸序列，1 6 s r r n a 已成为理想的基因鉴定靶序列。 1 6 s r r n a 序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中提取16 s r r n a 的基因片 段，通过纯化克隆、测序或酶切、探针杂交获得1 6 s r r n a 序列信息，再与1 6 s r r n a 数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而确定 样本中可能存在的微生物种类【3 7 , 8 7 , 9 6 】。 7 武汉理工大学硕士学位论文 表1 1 微生物经典分类鉴定方法 t a b l e1 1c l a s s i ci d e n t i f i c a t i o nm e t h o do f m i c r o b e 鉴定项目鉴定指标 个体 形态特征 营养要求 生理生化特征 酶 生态学特性 血清学反应 噬菌体的敏感性 其他 细胞形态、大小、排列方式、染色反应、有无 运动、各种特殊构造特征等 菌落形态，在固体、半固体或液体培养基中的 生长状态等 碳源、氮源、矿质元素、生长因子等 代谢产物种类、产量、显色反应等 产酶种类和反应特征等 生长温度、对氧、酸碱度的要求、宿主种类、 生态分布等 对微生物1 6 s r r n a 基因进行测序时最好进行全长测序，尤其是所测序列将要 用于探针设计和新物种确定时。p c r 扩增反应体积5 0 9 l ，反应条件为：9 5 预变 性5 m i n ，9 4 变性l m i n ，5 5 退火l m i n ，7 2 延伸2 m i n ，共进行2 9 个循环。另 外，采用正反向引物对所测序列进行重复验证可以确保序列的准确性。但由于目 前测序费用还比较高昂，因此许多研究者也采用测1 6 s r r n a 基因部分序列的方法 进行微生物多样性分析和平行样品比较。研究表明，4 0 0 - - 6 0 0 碱基的序列足以对 环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计，但这样短的序列通常不能用 于新物种鉴定和探针设计。有了微生物1 6 s r r n a 基因序列，不论是全长还是部分， 都可以提交到g e n b a n k 采用b l a s t 程序与已知序列进行相似性分析。 g e n b a n k 将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及 这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析。 系统发育分析，就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分子( 如1 6 s r d n a 、a t p 酶基因) 的序列同源性，计算不同物种之间的遗传距离，然后采用聚类分析等方法， 将微生物进行分类，并将结果用系统发育树( p h y l o g e n t i ct r e e ) 表示【3 引。 1 6 生物湿法冶金技术的发展趋势 随着科学技术的发展，生物应用技术将渗透到人们生活中的各个角落，因而 将会对选矿技术的发展产生深远的影响，具体将表现在： ( 1 ) 将生物工程的进步与成就用到生物湿法冶金上来，筛选并培养出性能更 8 武汉理1 二大学硕士学位论文 好，更能满足冶金过程需要的微生物菌种。可能的方向有： 1 ) 把基因组解码技术用到微生物湿法冶金领域，揭示浸矿微生物浸矿特性与 其基因表达的内在规律并在其指导下实施菌种的基因工程改良，获得既能耐高温 又能耐磨、耐酸、耐毒性的综合性能好的微生物； 2 ) 能在极端环境中生存的微生物“嗜极 的发掘与应用。 ( 2 ) 应用范围进一步拓展并走向产业化，具体表现在： 1 ) 基础金属硫化矿浮选精矿的细菌浸出； 2 ) 难处理金矿的细菌堆浸预处理； 3 ) 氧化矿的微生物浸出； 4 ) 用微生物从水溶液中提取与富集金属； 5 ) 微生物用于废水、废气与固体废弃物的治理。 7 本课题的目的及意义 我国铁矿石品位低，与脉石嵌布紧密且嵌布粒度较细、单体解离度低，选别 十分困难。而随着生物工程技术的巨大进步，利用微生物处理矿产资源的研究将 日趋活跃，采用微生物浸出铁矿石中的难溶性磷，具有环保、经济和节能的特点， 而其浸出工艺及基础理论的研究又是一个新的研究领域，具有理论意义与重要的 工业应用前景。因此本课题的主要目的就是选育优良菌种，提高细菌的浸磷效率 【3 9 ，7 0 】 o 本文首先通过对彳六厂菌、a t t 菌进行不同比例混合，并利用其氧化能源物质， 产生硫酸溶解铁矿石中的难溶性磷，同时进一步选育出一株能利用葡萄糖等有机 能源物质进行化能异养的溶磷菌，从而对高磷铁矿除磷具有重要的应用前景。 1 8 本课题的研究目标及内容 1 8 1 研究目标 利用实验室培养的硫杆菌进行不同比例混合，从而进一步提高细菌的产酸能 力和浸出效果。同时通过对采集于酸性矿坑水中的野生菌进行不断分离和纯化， 提取出一株较为理想的异养菌，通过对其最佳生长条件的研究，考察多种细菌协 同作用的影响，从而实现提高浸出率、缩短浸矿时间、节约浸矿成本的目的。在 分析影响细菌浸出的影响因素、优化浸磷工艺的基础上，进一步研究其浸矿机理。 1 8 2 研究内容 1 研究硫杆菌不同混合比例对浸矿的影响，分析混合菌浸磷的影响因素； 9 武汉理工大学硕士学位论文 2 通过尝试改变培养基成分对细菌浸矿的影响，进一步降低浸矿成本： 3 对采集自酸性矿坑水的菌液，进行富集和纯化，获得所需要的优良细菌； 4 尝试利用优良细菌与硫杆菌进行混合浸磷试验，以期得到较高的浸出效果； 5 通过分析影响异养菌浸出的影响因素，进一步优化浸磷工艺，并探讨其浸 矿机理。 l o 武汉理! r 大学硕+ 学位论文 第2 章实验材料、仪器与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 实验中所用的硫杆菌为a t f 菌、a t t 菌，含有原菌的水样采自广西某温泉3 9 ，柏】 异养菌采自大冶某铜矿。 2 1 2 实验药剂 本实验所采用的药剂由国内化学药剂公司生产，药剂名称及药剂用途见表 2 - 1 。 表2 1 实验所用主要药剂 t a b l e2 1m a i nr e a g e n t su s e dd u r i n gt h er e s e a r c h 武汉理工大学硕士学位论文 2 1 3 培养基 培养基 4 1 , 8 7 1 是微生物进行生命活动所需的基本物质条件，是其获取营养和能源 的源泉。这些营养物质一般包括碳素化合物、氮素化合物、无机盐类、维生素和 水分等。由于不同微生物的营养要求和代谢方式不同，这就导致了各种微生物的 培养基成份和配制方法也有差异。常见溶磷菌培养基及其成份组成如表2 - 2 所示： 表2 2 几种常用溶磷菌的培养基及其组成 t a b l e2 - 2c o m p o n e n to ft h em e d i ao fs e v e r a lm a i nb a c t e r i a 2 1 4 铁矿样 2 1 4 1 矿样制备 试验所用铁矿石采自鄂西某矿山。从矿山开采出来的铁矿石，不仅含有铁矿 物，还包括脉石及有害杂质，铁矿石选矿就是把铁矿石中的铁矿物富集起来，得 到铁精矿，把其他矿物和脉石及有害杂质尽可能分开。选矿前的准备工作，主要 包括矿石破碎、筛分、磨矿和分级等工序。原矿的处理流程如图2 1 所示。 1 2 武汉理工大学硕士学位论文 2 1 4 2 矿石化学成分 原矿( d 5 0 m m ) 实验所用矿样 - 2 0 0 目1 0 0 图2 1 铁矿预处理流程 f i g 2 1t h ep r e p r o c e s s i n go fh e m a t i t e 原矿的多元素化学成分分析和铁的化学物相分析如表2 3 ，2 4 所示。 表2 3 原矿的主要化学成分 t a b l e2 3m a i nc h e m i c a lc o m p o s i t i o no fh e m a t i t e 表2 4 原矿中铁的化学物相分析 t a b l e2 - 4t h ec h e m i c a lp h a s ea n a l y s i so fi r o ni nh e m a t i t e 武汉理下大学硕士学位论文 由表2 3 ，2 - 4 可以看出： ( 1 ) 矿石中可供选矿回收的有用组分铁是以变价态的形式存在。铁的品位为 4 3 5 0 ，主要是以f e 2 0 3 形式存在，矿石中t f e f e o 的比值为2 6 0 5 ( 属氧化矿) 。 ( 2 ) 需要选矿排除的脉石组分主要是s i 0 2 ( 石英) ，其次为a 1 2 0 3 ，其含量分 别为1 8 8 0 和6 6 7 。有害杂质硫和砷的含量都很低，对矿石的质量不构成影响， 但磷的含量为0 8 5 ，远高于铁矿冶炼的一般要求( o 1 5 ) ，属典型的高磷铁矿 石。 2 1 4 3 矿物组成及含量 矿石在肉眼下多显红褐色，对其进行x 射线衍射分析如图2 2 所示。矿石的 组成矿物种类较为简单，铁矿物以赤铁矿为主，脉石矿物以石英居多，其次为鲕 绿泥石、伊利石、胶磷矿、白云石、方解石和高岭石，其他微量矿物还包括黄铁 矿、电气石等。 咖u a r t z ；h - - h e m a t i t e 图2 2 原矿固体x r d 衍射图 f i g 2 - 2x - r a y d i f f r a c t i o no ft h er a wo r e 2 1 4 4 磷的存在形态及矿物粒度特性 对原矿中磷进行化学物相分析，如表2 5 所示。 表2 5 原矿中磷的化学物相分析 t a b l e2 - 5t h ec h e m i c a lp h a s ea n a l y s i so f p h o s p h o r u si nh e m a t i t e 1 4 武汉理+ r 大学硕士学位论文 由表可以看出，矿石中磷主要以胶磷矿的形式存在，分布率为9 4 8 3 ，而以 其他形式存在的磷合计分布率仅占5 1 7 ，因此，可以认为矿石中的磷基本上以独 立的胶磷矿形式产出。 2 2 实验仪器 实验所用仪器及其型号如表2 - 6 所示。 表2 - 6 实验所用主要仪器设备 t a b l e2 - 6m a i na p p a r a t u s e su s e dd u r i n gt h er e s e a r c h 2 3 实验方法 2 3 1 灭菌方法 常用的灭菌方法有以下几种： ( 1 ) 加压蒸汽灭菌 加压蒸汽灭菌又称高压蒸汽灭菌，简称高压灭菌。此法是将待灭菌的物品放 1 5 武汉理工大学硕士学位论文 入高压蒸汽灭菌器中进行灭菌。通常在0 1 m p a 的压力下，温度可达到1 2 1 ，维 持1 5 - - - 3 0 m i n ，可完全杀灭物品内外的微生物和芽孢及孢子。此灭菌方法效果较好， 故常用于各种耐热的培养基、液体、玻璃器皿、橡胶制品、金属器械、纱布、工 作服及废气的培养物等的灭菌。加压蒸汽灭菌器也称高压锅，有立式、卧式和手 提式，其中手提式灭菌器最为常用。 ( 2 ) 常压蒸汽灭菌 常压蒸汽灭菌又称流通蒸汽灭菌，灭菌是在流通蒸汽器内进行，也可以用蒸 笼代替。热蒸汽对被灭菌的物品进行加热灭菌。流通蒸汽灭菌不能杀死芽孢和孢 子，所以必须进行间歇灭菌，每次3 0 m i n ，间隔2 4 h ，连续3 d ，即可达到灭菌目的。 该法用于不耐热的物品，如明胶、牛乳、糖类培养基和氨