（材料学专业论文）青霉素发酵液中生物表面活性剂的分离和鉴定.pdf

中文摘要 青霉素是世界上产量最大，也是最早应用于临床的抗生素。目前，在工业生 产中采用微生物发酵法生产青霉素，其中的提取和纯化工艺则采用溶媒萃取法。 溶媒萃取法存在着弊端微生物在生成青霉素的同时会代谢共生大量的生物 表面活性物质，这些表面活性物质存在于青霉素发酵液中，使提取过程出现乳化 现象，给分离操作带来困难，降低了分离速度，延长了提炼时间，增加了抗生素 损失，影响萃取收率和产品质量。 本论文采用超滤技术( u l t r a f i l t r a t i o n ，简称u f ) 去除青霉素发酵液中的生物表 面活性物质，从而彻底解决了溶媒萃取过程中一直未能很好解决的乳化问题；同 时，运用超滤技术将发酵液中的生物表面活性物质富集、浓缩，再结合冷冻干燥 等手段回收，从而得到一种生物表面活性剂。实验结果表明截留分子量( m w c o ) 为1 0k d 的超滤膜能有效分离料液中起乳化剂作用的生物表面活性物质，消除青 霉素提炼过程中的乳化现象；从青霉素发酵液中提取出的生物表面活性剂经实验 分析证明是一种分子量在6 0 7 0 k d 左右的糖蛋白，1l 发酵液中的含量为2 6 5 9 9 ， 其中蛋白质基团占糖蛋白质量的1 7 5 1 ，糖基占8 2 4 1 。 本文还研究了温度和压力对超滤膜性能的影响，探讨了超滤膜膜污染机理， 并用不同方法和在不同操作温度下清洗超滤膜，最终确定了超滤膜在本实验中的 最佳清洗方案：在3 5 下，用纯水正向负压清洗+ 纯水反向负压清洗+ 0 4 n a o h 溶液清洗，然后用纯水清洗至中性。 关键词：乳化；超滤；生物表面活性剂；截留分子量；膜污染 a b s t r a c t p e n i c i l l i nh a st h em a x i m a lo u t p u ta n dt h el o n g e s tc l i n i c a lh i s t o r ya m o n ga l lt h e a n t i b i o t i c s i ti sp r o d u c o db ym i c r o b i a lz y m o t e e h n i c sa n de x 血a c t e db ys o l v e n t e x t r a c t i o ni ni n d u s t r y t h i sp r o c e s sh a si t so w nd i s a d v a n t a g e s ：t h em i c r o o r g a n i s m , w h i l ep r o d u c i n gp e n i c i l l i n , w i l la l s oe x c r e t eal o to fs u r f a c e a c t i v es u b s t a n c e st h a t d i f f u s ei n t ot h eb r o t h s ob e c o m e si n e v i t a b l ed u r i n gs o l v e n te x t r a c t i o nt h ee m u l s i o n p r o b l e mt h a ta d d su pt h es e p a r a t i o nd i f f i c u l t y , s l o w sd o w nt h es e p a r a t i o ns p e e d , p r o l o n g e dt h ee x t r a c t i o nt i m e ，i n c r e a s e st h ea n t i b i o t i cl o s s ，a n dr e d u c e st h ee x t r a c t i o n e t t i c i a n c ya n dp r o d u c tq u a l i t y i nt h i sp a p e rw eu s et h em e t h o do fu l t r a f i l 廿a f i o nt or e m o v et h es u r f a e t a n t si nt h e a n t i b i o t i cb r o t h b yt h i sm e a n s ，w es o l v et h el o n g l a s t i n gp r o b l e mo f e m u l s i f i c a t i o ni n t h es o l v e n te x t r a c t i o np r o c e s sa n dt h e r e b yi n c r e a s et h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c ya n d p r o d u c tq u a l i t y a tt h es a m et i m et h e s es u r f a c e - a c t i v es u b s t a n c e sa r ec o n c e n t r a t e db y u f , a n dt h e nc o l l e c t e db yf r e e z e - d r y i n g i ti ss h o w nt h a tt h eu fm e m b r a n e 谢ma n m w c oo f1 0k dc o u l dr e m o v et h es u r f a c t a n t sf r o mt h eb r o t he f f i c i e n t l y , a n dt h e r e b y e l i m i n a t et h ee m u l s i f i c a t i o ni nt h es o l v e n te x t r a c t i o np r o c e s s t h i sb i o s u r f a e t a n ti s p r o v e d ，t h r o u g he x p e r i m e n t a la n a l y s i s ，t ob es o m ek i n do fg l y c o p r o m i no f 6 0 7 0k d o rs o t h e r ei s2 6 5 9 9s u c hb i o s u r f a c t a n tp e rl i t e ra n t i b i o t i cb r o t h b e s i d e s ，w ea l s o s t u d yh o w t h et e m p e r a t u r ea n dp r e s s u r ec o u l da f f e c tt h eu fm e m b r a n e sp e r f o r m a n c e ， d i s c u s st h em e , c h a n i s mo f t h em e m b r a n e c o n t a m i n a t i o n , a n dc l e a nt h eu fm e m b r a n e w i t hd i f f e r e n tm e t h o d sa n du n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r et od e c i d et h eb e s tc l e a n o u t m e t h o d a n d m a n i p u l a t i v e m e t e r s ：a t3 5 c ，f l u s h i n g t h e u f m e m b r a n e w i t h p u r e w a t e r u n d e rm a n i p u l a t i v ep r e s s u r ef i r s t , t h e ni n v e r t i n gt h em e m b r a n ea n df l u s h i n gw i t hp u r e w a t e ra g a i n , t h e nc l e a n i n gt h em e m b r a n ew i t h0 4 n a o hs o l u t i o n ，f m a l l yf l u s h i n g w i t hp u r ew a t e rt i l ll i t m u sl e s s k e yw o r d s ： e m u l s i f i c a t i o n ：u l t r a f i l t r a t i o n ；b i o s u r f a c t a n t s ；m w c o ； m e m b r a n e c o n t a m i n a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得云莲太堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：夏灸复 签字日期：洲年t 月叩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丢洼太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丢洼太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 磊i 色 签字日期：训年 月刃日 导师签 签字日 、 疹 ，侈 p i 穆一 彩。 瓤 天津大学硕士学位论文 第一章前言 第一章前言 青霉素是目前世界上产量最大的一种抗生素，一般采用发酵法生产，通过溶 媒萃取法分离纯化。萃取过程中会发生乳化现象，乳化现象给分离操作带来困难， 降低产品收率和质量。目前工业上解决抗生素萃取过程的乳化问题一直采用加入 吡啶类破乳剂的“破乳法”。但破乳剂并不能完全解决萃取效率降低的问题，而 且破乳剂价格昂贵，本身有毒，对操作工人的身体健康有害，加入了破乳剂的废 液还会污染环境，同时有导致产品毒性的可能性。 产生乳化现象的根本原因是微生物在发酵产生青霉素的过程中会同时代谢 共生大量的生物表面活性剂，这些表面活性剂分布在有机溶剂水界面形成稳定 的乳化层。生物表面活性剂具有可生物降解性、低毒性、在极端条件( 如温度、 p h 值) 下保持界面活性、结构多样、生态安全等优点，有取代化学合成表面活性 剂的趋势。 迄今为止，微生物代谢共生生物表面活性剂的现象尚未引起化学、微生物学 领域研究者们的足够重视。化学家和化工工程师们在为解决抗生素提取过程中的 乳化问题研究、设计新的破乳剂和提取工艺；而微生物学家却在为如何降低生物 表面活性剂的成本而呕心沥血。目前国际上的生产表面活性剂的方法是以不同碳 源为原料，经过发酵、分离纯化得到产品，这种生产方法的缺点主要在于发酵液 中的有效浓度较低，且其两亲性会降低分离效率，因此提取纯化费用相当可观， 生产成本相对较高，妨碍了大规模工业化的进程。如何降低生物表面活性剂的成 本是当前世界范围的研究热门课题。 本文采用超滤法去除青霉素发酵液中的生物表面活性剂，解决了青霉素生产 过程中的乳化问题，同时首次从青霉素发酵液中分离生物表面活性剂，再结合冷 冻干燥法回收，开辟了生物表面活性剂的新来源和新思路。回收得到的生物表面 活性剂作为青霉素生产工业的副产物，大大降低了生物表面活性剂的生产成本， 使之可以与化学合成表面活性剂竞争，并形成相关的新兴工业体系，有利于可持 续发展保护环境和生态安全，还可以指导其他发酵产品的分离纯化，提高我国发 酵工业的技术水平。 天津大学硕士学位论文第二章文献综述 2 1 青霉素简介 第二章文献综述 2 1 1 青霉素的概念及应用 青霉素是备受关注的抗生素家族中最有价值的种类之一，也是目前世界上产 量最大、最早应用于临床的一种抗生素。合成青霉素的发展使得青霉素的抗菌谱 更宽更广，效力也得到提高。虽然近年来病毒出现了抗药性使得青霉素的应用受 到了一些限制，但青霉素仍是许多温和的局部组织感染或孕期等特殊情况的选择 用药【1 】o 青霉素的发现是在2 0 世纪上半叶。亚历山大弗莱明( a l e x a n d e rf l e m i n g ) 于1 9 2 8 年在青霉菌培养液中偶然发现了一种可以产生抑菌物质的丝状真菌，并 将这种真菌命名为点青霉，将这种具有抗菌活性的物质命名为青霉素。1 9 4 0 年 第二次世界大战初期，f l o r e y 和c h a i n 等人成功的从点青霉培养液中制得了青霉 素结晶，并它的证明临床效果显著，世界上真正具有临床价值的抗生素从此诞生。 青霉素具有抑菌性、分布广泛、对易感染病毒的机体十分有效。青霉素属于 p - 内酰胺类抗生素( 一类在结构上含有p 内酰胺环，呈抗菌活性的天然或经化学 改造的化合物的总称) ，是由不同菌种或不同的培养条件下所得到的同一类化学 物质的总称。青霉素是有机酸，很易溶于醇、酸、醚、酯类，但在炭氢化合物中 溶解度相当小；化学性质很不稳定，遇酸、碱或加热都易分解而失去活性，并且 分子极易发生重排。 青霉素的疗效十分卓越，其毒性在已知抗生素中最低，容易进行化学改造， 并可产生一系列高效、广谱、抗耐药菌的半合成抗生素，且具有良好的药物学性 质。但缺点是可能会有过敏反应。多年来国内外对青霉素的过敏反应及其防治进 行了大量的研究。青霉素会引起过敏，必须具有抗原性，但其本身及其降解产物 系半抗原，并不引起过敏反应，只有当其与蛋白质或多肽等大分子载体结合成多 价抗原时才有抗原性。这些抗原中目前认为最重要的是青霉噻唑蛋白，或者青霉 烯酸与蛋白质上的氨基结合，均称为b p o 蛋白，会引起机体的免疫变态反应， 这就是过敏。其中最危险的是过敏性休克【2 】。 天津大学硕士学位论文第二章文献综述 2 1 2 青霉素的提取工艺及存在问题 青霉素在- v , _ i k 上采用发酵法生产，采用溶媒萃取法【3 1 提取： 青霉素发酵工艺流程： 冷冻管雾 蕊母瓶i ；嵩；繁大米孢子1 嘉；：鹭一 缀种子旺亓篙怠蒿= 缎种子壤鬣鬈冬诺蔷袋 簿罐j i 函f i 害罴忑薪放罐黛墼拯蠊 庙于新的高产菌株不断取代菌种，发酵工艺不断改进，发酵单位以及提高到 5 00 0 0u m l 以上的水平。但发酵液中青霉素的浓度仍很低，折合重量计算仅含 2 5 ，需经浓缩很多倍才便于结晶，况且发酵液中尚含有大量杂质，应预先除去。 提取青霉素的方法有几种：早期曾用活性炭吸附法，目前多用溶媒萃取法。 所谓溶媒萃取法，是利用不同p h 值条件下抗生素的不同化学状态( 游离酸、 碱或呈盐状态) ，以及抗生素在水及与水不互溶的溶媒中溶解度不同的特性，使 抗生素从一种液体转移到另外一种液体中去，从而达到浓缩和提纯的目的【4 l ，其 理论基础是分配定律。溶媒萃取法要求所用的溶媒必须与水互不相溶或者很小部 分相溶，以便能形成两层液体便于分离；同时，所选用的溶媒对抗生素应有较大 的溶解度和选择性，用量较少就能提取完全，并使抗生素和杂质分离。这样，经 过萃取后达到浓缩和提纯的目的。 青霉素提取工艺流程： 过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加破乳剂并降温。 提炼：用溶媒革取法。将发酵滤液酸化至p h 值为2 ，加1 3 体积的醋酸 丁酯( 简称b a ) ，混合后用碟片式离心机分离，得一次b a 提取液。然后 以1 3 - i 9 的n a h c o 在p h6 8 - 7 i 条件下将青霉素从b a 中提取到 缓冲液中。再调p h 至2 0 ，将青霉素从缓冲液再次转入到b a 中，方法 同上，得二次b a 提取液。 脱色：在二次b a 提取液中加活性炭1 5 0 3 0 0 1 0 亿单位，脱色、过滤。 结晶：用丁醇共沸结晶法。将二次b a 提取液以0 5m n a o h 液萃取，调 p h 至6 6 - 6 8 ，得青霉素钠盐水浓缩液。加3 - 6 倍体积的丁醇，在1 6 2 6 ，5 一1 0m m 汞柱下真空蒸馏，将水与丁醇共沸物蒸出，并随时补加乙 醇。当浓缩到原来水浓缩液体积，蒸出馏分中含水量达2 6 时，即 停止蒸馏。青霉素钠盐结晶析出，过滤，将晶体洗涤后进行干燥得成品。 可在6 0 ，2 0 n l n l 汞柱真空中烘1 6 h ，然后磨粉、装桶。 天津大学硕士学位论文 第二章文献综述 自第一个临床使用的抗生素青霉素问世至今，溶媒萃取法在抗生素提取 中的应用已有五十多年历史。目前，主要医用抗生素生产中( 如青霉素，红霉素、 金霉素、麦迪霉素等) 都采用溶媒萃取法提取嘲。尽管离子交换技术已经相当发达， 但还不能代替溶媒萃取法。例如，金霉素在碱性洗脱剂中不稳定，四环素在强酸 性树脂上易分解为脱水四环素，因此都不能用离子交换法提取。 但是溶媒萃取法存在明显的缺点：在低p h 值条件下萃取，抗生素损失严重； 低温下操作，生产耗能大；醋酸丁酯水溶性大，溶剂回收困难等。 青霉素发酵完成之后，发酵液中除了含有很低浓度的青霉素有效成分( 一般仅 占发酵液的o 1 0 5 左右) 外，还含有大量其它杂质。发酵液经预处理后，虽 然能去除大部分杂质，但残留的杂质，尤其是可溶性的生物表面活性剂却不能充 分去除。 这些生物表面活性剂分散在滤液中呈胶体状态，在进行溶媒萃取时，产生乳 化现象【6 7 j 。乳化现象是因为在有机溶媒相和水相的界面上形成了稳定的乳化层， 使有机溶媒和水难以分层，即使采用离心机往往也不能充分去除，给分离操作带 来困难，不但使分离速度大大降低，延长了提炼时间，也使抗生素的损失增多， 影响萃取收率和产品质量嗍，增加了相分离过程的动力消耗 9 1 。乳浊液中夹带大 量含有抗生素的有机溶剂，造成收率下降和溶媒消耗量增加；更严重的是造成萃 取液浑浊，进而导致下工序的成品质量下降，所以乳化现象的发生将直接影响溶 媒萃取的效果，影响收率和产品质量【1 0 1 。 随着抗生素工业的发展，溶媒萃取技术的研究和应用取得了迅速发展。在萃 取机制方面，研究化学协同萃取( c h e m i c a l l ya s s i s t e de x t r a c t i o n ) 及萃取剂、萃取 设备和萃取方式的改进，反胶团萃取，液膜分离，萃取和其它分离手段相结合的 方法，如萃取离子交换，萃取电泳，萃取吸附，萃取结晶，浸出，萃取和萃淋 树脂等新方法 i i , 1 2 】。但萃取过程中的乳化问题一直没有很好的解决。 自青霉素生产工业化半个多世纪以来，青霉素萃取过程的乳化问题一直靠加 乳化剂解决。“八五”期间，我国还专门把青霉素萃取过程的破乳剂国产化，列 为生物技术四项重大科技攻关课题之一。在抗生素工业中，目前使用的破乳剂有 三种： ( 1 )溴代十五烷基吡啶皿p _ b ) ( 2 )十二烷基磺酸钠 ( 3 )十二烷基三甲基溴化铵 破乳剂的使用不能完全解决萃取收率降低的问题，不仅增加产品成本，还造 成环境污染，并对产品质量造成一定影响，同时又有可能使产品产生毒性。近年 来，由于青霉素生产量剧增，造成供过于求的状况，因此改革工艺势在必行。 天津大学硕士学位论文第二章文献综述 尽管不断有新型青霉素萃取剂的报道，但工业生产仍在使用醋酸丁酯( b a ) 为萃取剂，萃取过程依然存在乳化问题。 关于其它提取方法的研究，曾经有人研究利用离子交换法和吸附法提取青霉 素，但离子交换法生产周期长，产品质量较差，在生产过程中，p h 变化较大， 故不适用于稳定性较差的抗生素，另外寻找合适的树脂也是困难之一，吸附法选 择性差，收率不高，特别是无极吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大， 影响环境卫生。近年来，人们还曾尝试将双水相萃取法、液膜萃取法、沉淀法 等用于青霉素的提取。这些的新的分离提纯方法虽然有许多诱人的优点，但处理 量小、成本高的缺点决定了它们暂时还难以应用于工业化生产。 2 2 超滤法改进抗生素提取工艺 用溶媒萃取法提取青霉素存在着诸多问题，而去除青霉素发酵液中的生物表 面活性剂是消除提取过程中乳化现象的最根本办法。一定分子量的超滤膜能够有 效的截留青霉素发酵液中的表面活性物质，消除提炼过程的乳化现象。 2 2 1 超滤技术概述 超滤是从溶液中分离出大粒子溶质的膜分离过程，其分离机理一般认为是机 械筛分原理，其中超滤膜具有选择性分离的特点。 超滤是在压力差作用下根据膜孔径的大小进行筛分的分离过程，在一定压力 差作用下，料液中含有的溶剂及各种小的溶质从高压料液一侧透过超滤膜到达低 压侧，从而得到透过液或称为超滤液，而尺寸大于膜孔径的溶质分子则被截留， 作为浓缩液被回收，从而达到溶液的净化、分离和浓缩的目的。 溶质在被超滤膜截留的过程中主要有以下几种作用方式：a 、在膜表面的机 械截留( 筛分) ；b 、在膜表面及微孔内吸附；c 、在孔中停留( 阻塞) 。不同体系 中各种作用方式的影响也不同。 超滤技术有如下特点： 1 ) 与反渗透限o ) 、纳滤叫f ) 及微滤( m f ) 相似，属于压力驱动型膜分离过程； 2 ) 超滤膜的分离范围为分子量5 0 0 - 10 0 00 0 0d 的大分子物质和胶体物质， 相对应粒子的直径为0 0 0 5 0 1 “m ； 3 ) 超滤膜的形态结构为不对称结构； 4 ) 膜组件的形式为板式、卷式、管式、毛细管式及中空纤维等几种形式； 5 ) 过滤的方式一般为错流过滤； 6 ) 操作压力低，一般不考虑渗透压的影响； 天津大学硕士学位论文第二章文献综述 7 ) 易于工业化，应用范围广。超滤主要用于料液澄清、溶质的截留浓缩及 溶质之间的分离1 3 1 。 2 2 1 1 超滤膜性能的表征 超滤膜的性能分为透过性能和截留性能，透过性能一般用透过速率来表征， 截留性能一般用截留分子量和截留率来表征。 1 渗透速率 透过速率是指单位时间、单位膜面积透过组分的通过量，对于水溶液体系， 又称透水率或水通量。渗透速率用来表征超滤膜过滤料液的速率，它是膜性能的 重要指标，以j 表示，可由公式2 一l 计算得到。 了。旦 a l ( 2 1 ) j 透过速率，m 3 ( m 2 h ) 或k g ( m 2 h ) v 透过组分的体积或质量，m 3 或k g a 膜有效面积，m 2 t - 操作时间，h 透水率可用于标定膜的性能指标。一般情况下，超滤膜的透水率约为2 0 1 0 0 0 l ( m 2 h ) ，但实际上由于辩液体系不同，膜的溶液渗透速率约为1 - 1 0 0 l ( m 2 h ) ， 当超滤渗透速率低于1l “1 2 h ) 时没有实际应用的价值。影响渗透速率的因素 如下：温度、料液流速、料液的物理化学性质和浓度、预处理、设计因素及清洗 方法等。 2 膜的截留性能 ( 1 ) 截留率 截留率反映膜对溶质的截留程度，对盐溶液又称为脱盐率，以r 表示，定 义为 露一：x 1 0 0 #，(2-2) 咯原料中溶质的浓度，k g m 3 ； o 渗透物中溶质的浓度，k g m 3 。 1 0 0 截留率表示溶质全部被膜截留，此为理想的半渗透膜；0 截留率则表 示全部溶质透过膜。无分离作用。通常截留率在0 - 1 0 0 之间。 ( 2 ) 截留分子量 截留分子量( m w c o ) 不仅用来表示超滤膜的孔径，而且可以表征膜的分离性 能。通常定义为膜对某标准物质截留率为9 0 时所对应的分子量。所得的截留分 天津大学硕士学位论文第二章文献综述 子量不是膜孔径的绝对值，也不是膜孔径的最大值，但在一定程度上反映了膜孔 径的大小可以称为标称截留分子量( m 俩，c 0 ) 。 ( 3 ) 影响截留分子量和截留率的因素 1 ) 溶质分子的尺寸及形状1 4 】 膜对球形分子的截留远大于线形分子和支链分子。 2 ) 膜材质与膜的形态结构 具有同样截留分子量的不同材质超滤膜对溶质的截留率可能不同。宏观上可 能是由于不同膜的污染情况不同；微观上是由于膜的孔径分布和影响膜与溶质相 互作用的因素如膜的亲水性、电荷性、表面粗糙度及孔形结构等原因造成的。例 如，同聚砜膜相比，醋酸纤维素膜或再生纤维素膜的孔径分布更广、截留率更高 【堋。 3 ) 其他溶质 一般来讲，低分子量的溶质如盐和糖类能够自由穿过超滤膜，但有些膜如聚 砜膜对小分子溶质如氯化钠和葡萄糖有吸附【1 6 1 。 操作参数 影响膜的截留分子量的操作参数为：跨膜压差、温度、溶质浓度、膜表面的 流动状况。 5 ) 吸附的影响 如果采用膜面积较大的超滤膜对体积较小的稀溶液过滤时，膜对溶质的吸附 就变得较为严重，可能改变溶质本体浓度，吸附强化了浓差极化效应 1 3 , 1 7 】。 6 ) 微环境 微环境一般指料液的p h 值及离子强度。由于微环境影响溶质的形态结构、 溶质之间以及溶质与膜之间的相互作用，所以微环境将影响膜的截留率及截留分 子量【1 鄹。 2 2 12 膜污染概述 膜污染是指处理物料中的微粒、大分子、胶体粒子或其他的溶质分子，由于 与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的，在膜表面或膜孔内吸附沉积造 成的膜孔变小或堵塞，使膜产生渗透速率与分离特性的不可逆变化现象，表现为 膜的渗透速率随运行时间的延长而降低。 在超滤过程中，即使选择了较合适的膜和适宜的操作条件，在长期运行中， 过滤通量随运行时间增加必然产生下降现象，即膜污染问题必定发生。浓差极化 乃是超滤膜截留溶质的自然结果。它会导致溶剂通量下降，使溶质的去除效率降 低。因此必须使浓差极化减至最低程度。可采取以下几方面措施：1 提高超滤 天津大学硕士学位论文第二章文献综述 器的进水流速以增大膜面水流速度，使被截留的溶质及时被水流带走；2 适当 提高水温以加速分子扩散，增大过滤速度；3 采取清洗措施。 清洗膜的方法可分为物理方法和化学方法两大类：物理方法是利用机械的力 量来去除膜表面污染物。整个清洗过程不发生任何化学反应。常用的物理清洗方 法有：液流脉冲、反冲洗、压缩空气鼓泡、循环冲洗等。化学方法是利用某种化 学药品与膜面污染物质进行化学或溶解作用来达到清洗的目的。选择化学药品的 原则，一是不能与膜及其他组件材质发生任何化学反应或溶解作用，二是不能因 为使用化学药品而引起二次污染。常用的化学清洗剂有：酸碱液、表面活性剂、 氧化剂、酶等。 2 2 2 超滤法改进抗生素提取工艺 如前所述，解决抗生素萃取过程乳化问题的传统方法“破乳法”存在着弊端， 而去除乳化剂应是彻底解决萃取过程乳化问题的最佳方法。采用超滤法去除青霉 素发酵液中的起乳化剂作用的生物高分子物质，不仅萃取过程不发生乳化现象， 而且将四步萃取简化为两步萃取，萃取收率和青霉素质量有明显的提高。此方法 称为超滤萃取法“刿。 、 超滤法操作简便，成本低廉，分离效率高，而且不引起温度、离子状态及相 的变化。近年来广泛用于生物制品、食品和制药工业、三废处理及其它浓缩、脱 盐及分级分离工序。超滤主要依赖于被分离物质分子量大小、形状和性质的差别； 在一定压力差下( t r a n s - m e m b r a n ep r e s s u r e ) 下，使小分子能够通过具有一定孔径的 特制薄膜，大分子则被膜阻留，从而分离不同大小的分子 2 0 - 2 3 。超滤是分离溶液 中大小分子比较理想的单元操作，可去除青霉素滤液中具有界面活性乳化，同时 也降低了对青霉素的增溶作用。有利于提高产品收率和纯度。 抗生素萃取过程的乳化现象是由于滤液中存在含有亲水基、疏水基的生物高 分子物质( 主要是蛋白质、多糖等) 因其分散在水溶液中呈胶体状态，所以常规 的发酵液过滤处理不能够有效的将其去除。在萃取过程中，蛋白质和多糖的亲水 基和疏水基使其在溶剂相与水相间形成稳定的乳化层，造成相分离困难，增加了 动力消耗，降低了离心机的理论级数，还造成产品收率和质量下降及溶剂消耗增 加。然而蛋白质( 和多糖) 的分子量对乳化现象起着决定性作用，因此确定起乳 化作用的生物高分于的分子量是预测和控制抗生素萃取过程乳化现象的关键。 根据采用不同分子量截留值的膜进行大分子溶液的分级，我们可以得到这样 的结论：用一定截留分子量的超滤膜处理青霉素滤液，青霉素滤液超滤后的透过 液，在萃取过程中不发生乳化现象，分相速度快。这是由于滤液中大于膜的截留 分子量值的生物高分子物质( 主要是蛋白质) 被截留在浓缩液中去除了，没有起 天津大学硕士学位论文 第二章文献综述 乳化作用的物质，( 即生物表面活性剂或者说生物乳化剂) ，所以不发生乳化。同 时亦表明，当分子量小到一定程度( 低于膜的截留分子量) 就没有乳化作用了。 因此我们将在萃取过程中青霉素滤液中能起乳化作用的最小生物高分子的 分子量称为临界乳化分子量。实验结果表明，通过超滤去除临界乳化分于量以上 的生物高分子以后，滤过液在萃取过程中，勿需加入破乳剂就能很快完成相分离 过程，所得萃取液( 醋酸丁酯( b a ) 液) 不必再继续浓缩提纯和脱色就能达到青霉 素g 钾盐结晶的要求，因此，新工艺( 超滤萃取法) 过程简单，所得b a 液质量高， 青霉素g 萃取收率提高，成本降低，提高了药物的安全性，减少污染；特别是省 去了破乳剂，第一次实现了不加破乳剂的青霉素萃取，是对青霉素提取工艺的突 破。 采用u l t r a - f l o 超滤系统有如下优点： 1 1 产物回收率一般为9 7 9 9 ，比采用鼓式过滤或压滤提高5 - 1 2 。 2 ) 无需使用助滤剂或硅藻土。 3 1 离子交换柱和酶柱寿命可延长2 3 倍。 钔最终产物质量比采用鼓式过滤时高 5 ) 减轻工艺提取难度，节约辅消耗。 6 ) 操作工艺流程简化，操作成本低。 刀u l t r a - f l o 超滤系统实行系统封闭过滤，滤液不受人为污染，排渣无须手 动，生产环境改善，操作劳动强度减轻。 8 ) 由于不添加助滤剂，滤渣可直接回收利用，增加了附加收益，而且节省 了助滤剂的成本支出。 在超滤中，大于临界乳化分子量的生物高分子物质被截留在超滤层，这些生 物高分子是在萃取过程中起乳化剂作用的物质。采用超滤法提取抗生素的生产 中，这些乳化剂可以用其他方法提纯并进行表征，这不仅可以得到一种新的表面 活性物质生物表面活性剂。目前，生物表面活性剂还没有进行大规模的工业 化生产，这主要是由于它需要专门的发酵法生产，其经济成本较高。由于抗生素 的生产规模较大，因此超滤法提取表面活性剂不需另起炉灶，大大降低了生产成 本。 2 3 生物表面活性剂概述 表面活性剂( s 从) 是一类在低浓度时能显著降低液体表面张力的化合物。它 的分子一般是由非极性的疏水基( 主要是炭氢链及其取代物) 和极性的亲水基组 成，是一种两亲性分子。在液体中，表面活性剂趋向于集中在该液体和另一相的 天津大学硕士学位论文第二章文献综述 界面( 包括气液、液液、液，固界面) ，形成分子层，从而降低界面能量。这个特 性使得表面活性剂具有乳化、润湿、分散、增溶、发泡、洗涤等多方面的功能。 因而在工业领域有重要的应用，是一种品种多、用途广的精细化工产品。表面活 性剂素有“工业味精”之称，可见它在各个工业领域的重要性。 许多生物体为了细胞内和细胞外生命活动( 如食物乳化、细胞壁内外的物质 传输、细胞识别等) 的需要都会产生一些具有表面活性的化学物质，从植物( 如 s a p o n i n s ) 至u 微生物( 如g l y c o l i p i d s ) 再到包括人类在内的结构复杂得多的动物( 如 b i l ea c i d s ) 。这些表面活性物质在广泛存在，对生命体有着非凡的重要意义，通 常被称为生物表面活性剂( b i o s u r f a c t a n t s ，简称b s ) t 2 4 j 。这类表面活性剂主要是蛋 白质或多糖，或是两者的复合物，其特点之一是可以稳定油水乳化【2 5 】。 与动物、植物法相比，由微生物( 细菌、酵母、真菌等) 代谢产生的生物表面 活性剂表面活性较高，具有很好的亲水、亲油性能和界面优先分配能力，生产需 要时间很短，更适合工业化生产闭。从生物表面活性剂发展使用的简短历史来看， 具有非常广阔的应用前景。 近半个世纪以来，人们在研究开发新的抗生素的同时观察到许多培养液在后 期表现出表面活性，随后展开了以生物表面活性剂为目标的系统研究口”。目前在 商业上生物表面活性剂还没有被广泛接收，可能是由于工业化方面的一些问题还 没有彻底解决，而且其应用技术也仍需完善。 2 3 1 生物表面活性剂的分类 生物表面活性剂的主要生产方法是以一定的碳源( 如碳水化合物、炭氢化合 物、油类、脂肪或是它们的混合物) 为原料，使微生物在有氧条件下在液相培养 基中生长，这一过程中微生物会分泌生物表面活性剂以帮助不溶物质在细胞膜两 侧进行传递和交换。 生物表面活性剂一般而言不是非离子型就是阴离子型。目前还没有文献报道 过阳离子型生物表面活性剂，除了一些个别的情况如含氮基团的存在使得分子的 一部分表现出阳离子性质。与所有的表面活性物质一样，生物表面活性剂含有一 个或者几个亲水部分和亲油部分。亲油部分可以是蛋白质或含有大量憎水侧链的 脂类，这类侧链通常是含有1 0 1 8 个碳原子的脂肪酸炭氢链，亲水部分可以是酯、 羟基、磷酸盐、羧酸盐或是碳水化合物。 g e r s o n 和z a j i c 2 s ，c o p p e r 和z a j i c t 2 9 1 ，z a j i c 和s e f f e n s 3 0 1 ，s h a w l 3 ，s p e n c e r 等【3 2 】，a s s e l i n e a u 3 3 】已经对生物表面活性剂做了回顾，生物表面活性剂可以分为 五类： 天津大学硕士学位论文 第二章文献综述 表2 1 生物表面活性剂分类 m l b l e2 1c l a s s i f i c a t i o no f b i o s u r f a c t a n t s 类别典型产物 生产菌是否可产生抗生素 a r t h r o b a c t e r m y e o b a e t e r i a 海藻糖脂 n o c a r d i a 糖脂 c o r y n e b a c t e r i a r h o d o c o c c u s 鼠李糖脂 p s e u d o m o n a s是 槐糖脂 t o r u l o p s i s 甘酸脂，脂肪酸 a e i n c t o b a c t c r 中性脂月旨肪酸 脂肪酸，蜡c l o s t r i d i a 脂蛋白，脂肽 b a e i l l i 是 n o c a y d i a c o r y n e b a c t e r i a 脂氨基酸 s t r e p t o m y c c s 是 含氨基酸类脂 ( 如s u r f a c t i n ,my c o b a c t e r i a p o l y m i x i nb 1 p s e u d o m o n a s是 a g r o b a c t e f i a ( 3 1 u c o n o b a c t e r r h o d o c o c c u s 磷脂磷脂酰乙醇胺 t 1 l i o b a c i l l u s 脂杂多糖a c i n e t o b a c t e r 聚合物脂多糖复合物c a n d i d a是 蛋白质多糖复合物a c i n e t o b a c t e r是 除了以上五类之外，许多细胞培养基也能够降低界面张力，有显著的乳化和 破乳活性，因此可以认为是一类特殊的生物表面活性剂。 2 3 2 生物表面活性剂的特性 生物表面活性剂与化学合成的表面活性剂在性能上有许多相似之处，也有许 多超过化学合成表面活性剂的性质。 天津大学硕士学位论文 第= 章文献综述 2 3 2 1 表面活性剂的通性 a ) 表面性能优良与化学合成表面活性剂一样，生物表面活性剂的分子中 既具有极性亲水基团，因此能在水油两相界面上定向排列形成整齐的 分子层，能显著降低界面能量，即表面张力。一些生物表面活性剂可将 表面张力3 0m n m 左右，同时可以降低临界胶束浓度c m c 和水油两 相的界面张力。并具有渗透、乳化、润湿、增溶、发泡、消泡、洗涤和 去污等各种表面性能。表2 - 1 列举了集中生物表面活性剂和化学合成表 面活性剂的性能。有些生物表面活性剂其表面性能超出了已应用多年的 化学合成的表面活性剂，如p s e u d o m o n a ss p 生产的鼠李糖脂的乳化性 能很好，甚至超过了常用的化学合成的乳化剂吐温( t w e e n ) 。由 r h o d o c o c e u ss p h 1 3 生产的甘油酯和b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sj f - 2 菌生产 的生物表面活性剂可将水溶液的表面张力降至2 6 - 2 7m n m ，将癸烷或 辛烷的界面张力降至1 0 一m , n m 1 3 4 , 3 5 j 。 b ) 生物表面活性剂和化学合成表面活性剂一样具有较好的热稳定性和化 学稳定性。如由b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sj f - 2 菌生产的脂肽在7 5 时， 可耐热1 4 0h ，保持活性。多数生物表面活性剂在很广泛的p n 值范围 内能保持稳定，直到p h 值很小时才逐渐失去活性。a ，a - d 海藻糖6 棒 杆霉菌酸酯在0 1m 盐酸中7 0 h 也仅有1 0 左右分解。 2 3 2 2 生物表面活性剂的特性 与传统的化学合成表面活性相比，生物表面活性剂有许多独特的性质和优 a ) 表面和界面活性：生物表面活性剂有着更高的表面和界面活性，能够 在更低的浓度下达到更低的表面张力。高分子量的生物表面活性剂，如 乳化剂，借由几个结合点吸附在油水界面并在连续相内伸展其分子链使 得乳液在空间结构上达到稳定。每个大分子都占据大面积的相界面且有 多个结合点，确保分子碰撞时不会发生表面活性剂解吸附的现象，从而 大大提高了乳状液的储存稳定性。大分子的缺点是不易流动，这可以通 过加入少量小分子量的化学合成表面活性剂来解决。 表2 1 几种生物表面活性剂和化学合成表面活性剂表面张力 t a b l e2 - 2s u r f a c et e n s i o no f s o m eb l o s u f f a c t a n t sa n dc h e m i c a ls u r f a c t a n t s 表面张力c m c参考文献 种类表面活性荆 ( r e n m )，( m 虮) 天津大学硕士学位论文 第二章文献综述 十二烷基磺酸钠3 72 1 2 0 【2 4 】 化学合成的 十六烷基三甲基溴化铵 3 01 3 0 0 2 4 】 表面活性剂 t w e e n - 2 0 3 06 0 0 【2 4 】 烷基苯磺酸盐4 75 9 0 【2 4 】 槐糖脂3 78 2 【3 7 】 s u r f a c t i n2 7l l 【3 7 鼠李糖脂r l 2 7 5 0 【3 7 】 鼠李糖脂r 22 64 0 【3 7 】 鼠李糖脂r 3 3 0 2 0 0 【3 7 】 鼠李糖脂凡2 52 0 0 f 3 7 】 海藻糖脂海藻糖6 霉菌酸酯 3 2 2 0 3 6 】 海藻糖脂海藻糖- 6 。6 - - - 霉菌酸酯 3 62 0 【3 0 】 海藻糖脂海藻糖- 2 ，3 ，4 ，2 一四酯 3 01 6 0 0 【3 0 】 葡萄糖6 一霉菌酸酯4 02 0 0 【3 5 】 生物表面活性剂 纤维素二糖岳霉菌酸酯 3 54 o 【3 5 】 黑粉菌酸3 02 0 【3 6 】 脂肽 2 71 2 2 0 3 6 】 枯草菌脂肽2 7 - 3 22 3 - 1 6 0 【3 6 】 甘露糖岳霉菌酸酯4 05 0 3 5 】 麦芽糖- 6 霉菌酸酯 3 32 0 3 5 】 麦芽糖6 ，6 - 霉菌酸酯4 61 0 3 5 】 麦芽三糖- 6 ，6 ，6 - 双霉菌酸双酯 4 41 0 3 5 】 脂肪酸 1 0 k d 2 0 k d 5 0 k d 1 0 0 k d 1 4 0 k d 原料液 接触角，度4 94 9 35 05 3 + 55 76 1 55 7 5 由图4 3 可以看出，超滤膜的截留分子量( m w c o ) 越小，其截留液与载玻片 表面的接触角也越小，表明其中的表面活性剂含量越大、表面活性越强。m w c o 为4k d 、1 0k d 、2 0k d 的超滤膜，其截留液与载玻片的接触角比较接近，都在 4 9 度到5 0 度之间，说明这三种超滤膜对截留大分子表面活性物质的贡献差别不 太大，这与溶剂萃取实验的结果是一致的。5 0k d 、1 0 0 k d 、1 4 0k d 的超滤截留 液与载玻片的接触角分别为5 3 5 度、5 6 度和6 1 5 度，呈依次增大的趋势，说明 超滤膜的截留分子量越大，透过膜的表面活性剂越多，被截留液中的表面活性剂 浓度越低。 天津大学硕士学位论文 第四章结果与讨论 图4 1 3 不同超滤截留液与载玻片表面的接触角 f i g4 - 3c o n t a c ta n g l eb e t w e e n d i f f e r 自a tu l t r a 丘l t m t ea n dg l a s s 4 3 3 油膜铺展法 m o r i k a w a 等( 2 0 0 0 ) 研究发现，对于在水面充分铺展开的单分子层油膜，如果 在其表面加入表面活性剂，会破坏油膜，并在膜中间形成一片圆形的无油区域。 这个区域的直径与表面活性剂的浓度呈线性关系州。 取串联超滤各分子