（分析化学专业论文）水溶性cdte量子点的合成及其分析应用.pdf

南开大学硕士学位论文ab s tr a c t ab s t r a c t t h i s d i s s e r t a t i o n i s c o m p o s e d o f f o u r c h a p t e r s . i n c h a p t e r 1 , a b r i e f o v e r v i e w o f t h e c h a r a c t e r i s t i c , s y n t h e s i s a n d a p p l i c a t i o n o f q u a n t u m d o t s , a n d t h e t h e o r i e s a n d d e v e l o p m e n t s o f b o t h r e s o n a n c e ti g h t s c a tt e r i n g ( r l s ) a n d fl u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ( f r e t ) t e c h n o l o g i e s w e r e g i v e n . i n c h a p t e r 2 , c d t e q u a n t u m d o t s mo d i fi e d b y t g a w e r e s y n t h e s i z e d i n t h e a q u e o u s s o l u t i o n . f l u o r e s c e n c e s p e c t r a , t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y , i n fr a r e d s p e c t r a a n d x - r a y c ry s t a l d i ff r a c t i o n w e r e u s e d t o a n a l y z e t h e s h a p e a n d s t r u c t u re o f c d t e q d s . t h e e x p e r i m e n t re s u l t s s h o w e d t h a t t h e fl u o re s c e n c e c h a r a c t e r i s t i c s o f c d t e w e r e s a t i s fi e d ; t g a m o l e c u l e s w h i c h w e re e l e c t r o n e g a t i v e w e r e m o d i fi e d o n t o t h e s u r f a c e o f c d t e b y - s h . i n c h a p t e r 3 , t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c d t e q d s a n d l y s o z y m e w a s s t u d i e d , a n d a n a s s a y o f l y s o z y m e w i t h a s e n s i t i v i ty a t t h e n a n o g r a m l e v e l i s p r o p o s e d . s e v e r a l f a c t o r s s u c h a s p h , c o n c e n t r a t i o n o f c d t e a n d i o n s t r e n g t h t h a t i m p a c t e d t h e i n t e r a c t i o n w e r e s t u d i e d . t h e re s o n a n c e l i g h t 一 s c a tt e r i n g s i g n a l s o f t h e s y s t e m w e re e n h a n c e d g r e a t l y b y l y s o z y m e . a l i n e a r r e l a t i o n s h ip c o u l d b e e s t a b l i s h e d b e t w e e n t h e e n h a n c e d r l s i n t e n s i ty a n d t h e l y s o z y m e c o n c e n t r a t i o n i n t h e r a n g e o f 0 . 0 6 一 4 .0 w g m l - 1 . t h e l i m i t o f d e t e c t i o n w a s 9 . 5 n g m l - 1 . t h i s m e t h o d i s s e n s i t i v e , r a p i d , a c c u r a t e a n d s i m p l e , a n d p ro v i d e s a n e w a n d re l i a b l e m e a n s f o r t h e q u a n t i ty d e t e r m i n a t i o n o f l y s o z y m e . i n c h a p t e r 4 , a h i g h l y e ff i c i e n t fl u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r s y s t e m w a s c o n s t r u c t e d b e t w e e n c d t e q d s ( d o n o r s ) a n d b u ty l 一 r h o d a m i n e b ( b r b ) ( a c c e p t o r ) i n c t m a b s o l u t i o n . t h e f e a s i b i l i ty o f th e p r e p a r e d f r e t s y s t e m a s fl u o re s c e n c e p r o b e f o r d e t e c t i n g h ga di n a q u e o u s s o l u t i o n w a s d e m o n s t r a t e d . c t ma b m i c e l l e s f o r m e d i n w a t e r r e d u c e d t h e d i s t a n c e b e t w e e n d o n o r a n d a c c e p t o r a n d t h u s i m p r o v e d t h e f r e t e f f i c i e n c y , w h i c h re s u l t e d i n a n o b v i o u s q u e n c h i n g o f d o n o r p h o t o l u m i n e s c e n c e i n t e n s ity a n d a n e n h a n c e m e n t o f t h a t o f t h e a c c e p t o r . s e v e r a l f a c t o r s t h a t i m p a c t e d t h e fl u o re s c e n c e s p e c t r a o f t h e f r e t s y s t e m w e re h 南开大学硕士学位论文ab s t r a c t s t u d i e d . t h e e n e r g y t r a n s f e r e ff i c i e n c y阁 a n d t h e d i s t a n c e ( r ) b e t w e e n c d t e a n d b r b w e r e a l s o o b t a i n e d . t h i s w o r k p r o v i d e s a n e w w a y o f t h i n k i n g t o e x t e n d t h e a p p l i c a t i o n s o f f r e t i n s t u d y i n g t h e i n t e r a c t i o n a n d d e t e c t i o n o f k e y w o r d s : c d t e q u a n t u m d o t s ; r e s o n a n c e l i g h t s c a t t e r i n g ; l y s o z y m e ; f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ; h g ( 1 1 ) t o 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文;学校有权提供目录检索以及提 供本学位论文全文或者部分的阅览服务;学校有权按有关规定向国 家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版;在不以赢利为目 的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活 动。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 苦 2 w 了 年o f 月7 /1 日 经指导教师同意， 本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名:学位论文作者签名: 解密时间: 年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 一黔 一琴 军 菜 粼 启较呱扭亩少于2 0 年之 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担口 学 位 论 文 作 者 签 名 : 忿a ， ) 年。 士 月 v 日 南开大学硕士学位论文 第一章 第一章 前言 1 . 12子点 量子点 ( q u a n t u m d o t , q d)又称为半导体纳米微晶 ( s e m i c o n d u c t o r n a n o c ry s t a l ) ， 是一种由i i 一 v i 族或i i i 一 v族元素组成的纳米颗粒 ( 表1 . 1 ) 。目 前研究较多的主要是c d x ( x = s . s e . t o。量子点是一种零维纳米材料，其 尺寸范围在1 一 1 0 0 n o t ， 是介于体相材料与分子间的物质状态， 因此展示出许多 特殊的光、电、磁、催化等性质。 表 1 . 1不同的量子点 t a b l e 1 . 1 d i ff e r e n t q u a n t u m d o t s g r o 叩q u a n t u m d o t s i i - v i mg s , mg s e , mg t e , c a s , c a s e , c a t e , s r s , s r s e , s r t e , b a s , i i i - v b a s e , b a t e , z n s , z n s e , z n t e , c d s , c d s e , c d t e , h g s , h g s e g a a s , i n g a a s , i n p , i n a s 纳米晶具有类似体相晶体的规整原子排列。由于量子尺寸效应的存在，纳 米晶的光学及电学性质强烈依赖其尺寸。此外，纳米晶具有大的比表面积，其 表面原子数目已 经与内部晶 格的原子数目 相当，因此表面结构与本身性能关系 密切。通过化学方法合成纳米晶，并对纳米晶进行适当的表面修饰能够明显提 高其化学、光学及催化性质u l 1 . 1 . 1量子点的性质 1 . 1 . 1 . 1皿子尺寸效应 随着晶体尺寸的减小，电子及空穴受到空间限 域效应，这些载流子占 有轨 道的能量比体相晶体的更高。当纳米晶尺寸下降到某一值时，金属费米能级面 南开大学硕士学位论文第一章 附近的电子能级由准连续变为离散，出现半导体连续能带 ( 价带和导带)变为 分立的能级结构及带隙 变宽的 现象， 就是所谓的 量子尺寸效 应 ( 图1 . 1 ) 12 1 0 it 子尺寸效应导致纳米晶的吸收光谱及荧光发射光谱蓝移。 白. 几 . 日 m七d 们 d目 砚汗 nr翻自口.囚 . . .卜 . . 山 . 角 . c口曰翻招目呀 心七 .n d r 抽即 . ， 、 勺如. . .七 . 川幻 ( v . 场“”七 . 月 自 “. 丹 创州 . 曰 目 幻 心睡.璐. n.曰加 目 肠 口 翻 甘.川.口 图1 . 1体相 ( 左)及纳米晶 ( 右)的能级跃迁图 f i g . 1 . 1 e n e r g y t ra n s i t i o no f b u l k s e m i c o n d u c t o r ( l e 幻a n d n a n o c ry s t a l s ( r i g h t ) 1 . 1 . 1 . 2介电限域效应 介电限域是纳米微粒分散在异质介质中由于界面引起的体系介电增强的现 象，主要来源于微粒表面和内 部局域场的增强3 1 。一般来说，过渡族金属氧化 物和半导体纳米微粒都可能产生介电限域效应。 纳米微粒的介电限域对光吸收、 光化学、光学非线性等会有重要的影响。因此，在分析纳米材料光学现象时， 既要考虑量子尺寸效应，又要考虑介电限域效应。 1 . 1 . 1 . 3表面效应 纳米微粒的另一个显著特征是具有大的比表面积。粒子的尺寸越小，比表 面积越大，表面原子数占全部原子数的比例越高。表面原子数的增多虽然会因 为表面原子配位不足、产生大量的悬键和不饱和键，从而出现许多活性中心， 提高某些纳米微粒的催化活性，但对纳米晶的发光性质往往不利。由于表面原 子的增加， 纳米晶存在原子配位不足及高的表面能，这就导致纳米晶 存在大童 南开大学硕士学位论文第一章 表面缺陷 4 -6 1 . 这些表面缺陷 会在能 量禁阻的 带隙间引 入许多表面态， 成为电 子 或空穴的陷阱， 改变纳米晶的光电性质。一般来说，即使纳米晶具有规则的原 子排布，表面缺陷的存在也会破坏其发光效率，使纳米晶吸收的能量以非辐射 的形式散发出去。 1 . 1 . 2最子点的合成方法 1 . 1 . 2 . 1金属有机化学法 金属有机化学法是最常用的一种合成量子点的胶体化学方法，它是迄今为 止最成功的合成高质量纳米粒子的方法，由b a w e n d i 等n 在 1 9 9 3年发明 ( 图 1 . 2 ) ，已 成功 地用于i i 一 vi族和ii i 一 v族半导体 粒子的 合成te - i o 1 该方法通常是在无水无氧的条件下，用金属有机化合物在具有配位性质的 有机溶剂环境中生长纳米晶粒，即将反应前体注入到高沸点的表面活性剂中， 通过反应温度控制微粒的成核与生长过程.该方法的前驱体为烷基金属 ( 如二 甲基锅) 和烷基非金属 ( 如二 . 三甲硅烷基硒) 化合物;主配体为三辛基氧化 磷，及溶剂兼次配体的三辛基磷。该方法反应条件过于苛刻，需要严格的无氧 无水操作;原料价格昂贵，毒性太大，且易姗易爆。尽管如此，制备出的纳米 晶具有较高的量子效率和较窄的荧光半峰宽度， 量子效率可以达到9 0 %，半峰 宽 仅有3 0 n m左右。 通过该方法己 经制备出c d s e . z n s e s 1 . c d s e / us . c d s e / z n s 等i i一 v i 族纳米晶 19 1 及i n p . i n a s 及i n a s / z n s 等i ii一v 族的 纳米晶【 1 0 1 1 . 1 . 2 . 2水相合成法 有机相中的纳米晶必须通过进一步的表面亲水修饰才能具备生物亲合性。 亲水修饰过程不但需要复杂的表面配体交换，而且会破坏纳米晶的发光性质， 大大降低量子点的荧光强度。 水相合成法1 1 . 12 1 的 基本原理是在离子型前驱体溶液中 加入稳定剂 ( 如疏基 化合物等) ， 通过水相离子交换反应得到纳米粒子， 通过回流前驱体混合溶液使 纳米晶逐渐成核并生长 ( 图1 .3 ) 。 在水相中合成量子点以水为合成介质，以普 通的盐为原料，毒性小、制备成本较小且合成方法简单;无须无氧无水设备， 一般的合成实验室就能制备;可大批量生产，产量是普通有机法的几十倍:无 需进一步的表面亲水修饰即可应用于生物荧光探针研究。由 于纳米粒子是直接 南开大学硕士学位论文 第一章 wa 吕 1 ， e 血 目 d- r e r 图 1 . 2金属有机法合成高质it纳米晶示意图 f i g . 1 .2 s c h e m a t i c p r o c e d u re f o r t h e p r e p a r a t i o n o f h i g h q u a l i t y n c s v i a o r g a n o m e t a l l i c ro u t e s 在水相中合成的， 不仅解决了纳米粒子的水溶性问 题， 而且大大提高了q d s 的 稳定性，可以在暗处放置一年以上。 图 1 .3水相中以 硫醉为稳定剂合成高质量c d t e 纳米晶示惫图 f i g . 1 .3 s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n f o r t h e o f h i g h q u a l i t y c d t e v i a 明二。 .s y n t h e s i s b y u s i n g t h i o l s t a b i l i z e r s 南开大学硕士学位论文第一章 h . m o h w a l d 等人通过表面修饰提高了c d t e 纳米晶的量子产率 i 1 1 .即 在新 制备的c d t e 纳米晶 水溶液中 加入疏基金属复 合物， 并调节溶液p h值， 使纳米 晶的表面形成一层疏基金属复合物的壳，这样处理过的纳米晶溶液量子效率可 以达到1 8 %e h . w e l l e r 等人将制备好的c d t e 纳米晶进行离心分级 ( 选择性沉 淀) ， 发现分级后不同样品的量子效率差异很大， 某些纳米晶的量子效率可以达 到3 0 % 3 1 。 用疏基水相方法， 人们还合成了 蓝光的z n s e 纳米晶 和近红外区的 h g t e 纳 米 晶 ( 1 4 , 1 5 1 ， 弥 补了c d t e . c d s e 纳 米 晶 只 能 覆 盖 从 绿 光 到 红 光 光 谱 范 围 的局限，获得了水相中的全色发光纳米晶。 1 . 1 . 3量子点的光学性质 近年来，量子点由于具有独特的光学特性而成为人们的一个研究热点。与 传统的有机荧光染料相比，量子点作为荧光探针具有极其优良的光学特性: 1 .童子点的激发波长范围很宽，可以涵盖整个光谱，从紫外到远红外区， 因此可以用同一波长的光激发不同大小的量子点。 2 .发射波长可通过控制它的粒径大小和组成来 “ 调谐” ，被激发的量子点 所发射的荧光光谱也很宽，根据其半导体核心直径可发射绿色一黄色一橙色一 橙红色的荧光 ( 图1 . 4 ) 0 3m书劝4 6 0 b 因压 翻 ，a 的6 侧 ，7 口 】7 阴 . . 二 翻 ， 妇 柑 创 翻口h ( 1 1 时 图1 .4几种量子点的荧光性质 f i g . 1 .4 f l u o r e s c e n c e c h a r w t c r i s t i c o f s e v e ra l k i n d s o f q d s 南开大学硕士学位论文第一章 3 . 单个量子点的荧光谱峰狭窄而对称， 半高峰宽通常只有4 0 r a n 甚至更小， 且斯托克斯位移较大，因而几种不同发射波长的量子点用于不同靶点的同时监 测时，可避免光谱千扰. 4 . 量子点发 射光 强是有机荧光染料的2 0 倍， 稳定性是其1 0 0 倍以 上 1 6 1 可以经受反复多次激发，而不像有机荧光染料那样容易发生荧光漂白。 5 . 量子点具有空间兼容性， 一个量子点可以偶联两种或两种以上的生物分 子或配体，使量子点探针同时具有分离和检测的功能。 1 . 1 . 4 19子点在生物医学研究中的应用 发光量子点所具有的优点十分突出，在生物化学、分子生物学、细胞生物 学、基因组学以及蛋白质组学等研究中有极大的应用前景。 1 . 1 . 4 . 1生物探针 在生物医学及生命科学中应用最多的是分子光谱分析方法。由于荧光光谱 的灵敏度高，因此对分子荧光方面的研究十分活跃。由于生物体系的特殊性和 复杂性，为了能测定更多的生物活性物质，对生物荧光探针有很高的要求:它 们应当具有较好的光稳定性，不易被光解或漂白:对生物体本身功能的影响要 小; 要有较高的荧光效率; 对所测量的生物活性反应敏感; 光谱特征突出等等。 利用童子点作为生物荧光探针就能较好的满足这些要求。 1 9 9 8 年， n i e 1 6 1 和a l i v i s a t o s 1 7 1 两 个研究 小组分别 发 表论 文， 以 量子点 作为 生物探针，并且用于活细胞体系，解决了将量子点溶于水溶液以及量子点通过 表面的 活性 基团与 生 物大分子偶联的问 题。 a l iv i s a t o s 等“ 71 报道可以 通过静电引 力、 氢键作用或特异的配体一 受体相互作用将生物分子结合在量子点的表面。 他 们采用两种大小不同的量子点标记3 t 3 小鼠 成纤维细胞，一种发射绿色荧光， 一种发射红色荧光，将发射红色荧光的量子点特异地标记在f 一 肌动蛋白丝上， 而发射绿色荧光的量子点则通过与尿素和乙酸结合标记细胞核，因此可以同时 在细胞中 观察到红 色胞 浆肌动蛋白 和绿色的 细胞核。 n i e等 l 6 】 报道在量子点 表 面包被经修饰的蛋白 质，可使量子点水溶性稳定两年以上，并为量子点提供多 种功能基团，这些功能基团可与不同的生物分子共价结合。该研究小组将转铁 蛋白 与量子点共价交联， 在受体的介导下发生内吞作用， 将量子点转运进h e l a 细 胞中 ， 证 明 连 接 了 量 子 点 的 转 铁 蛋 白 仍 然 具 有 生 物 活 性. m u r p h y 等 1 a 1报 道 ， 南 开 大 学 硕 士 学 位 论 文 _ _ _一一一一一一一一一一一一一一七 “ 与 蛋白 质大小相当”的c d s q d s 能 够与不同 形状的d n a结合，并 且根据平 衡常数以 及荧光碎灭速度的差别， 可以区分“ 直链” 、 “ 弯曲” 或“ 扭接” 的d n a . 他们还用c d s q d s 吸附不同 序列的d n a ， 以 此作为非特异的蛋白 质 一 d n a相 互 作 用 模 型 1 19 1 1 . 1 . 4 . 2光谱编码 量子点 在生 物芯片领域的 应用前景也很广。 h a n等2 0 1 的 研究结果证明， 包 入量子点的高分子聚合微球可标记寡核昔酸探针或抗体，用于基因芯片或蛋白 质芯片的搜索。他们巧妙地将不同数量、不同荧光特征的量子点组合进内部镂 空的高分子小球，从而形成具有不同光谱特征和亮度特征的可标记到生物大分 子上的微球。实验发现，将5一 6 种颜色、6 种发光强度的量子点进行不同组合 即可形成1 0 0 0 0 一 4 0 0 0 0 种可识别编码的it子点微球。如果发光强度的变化增加 到1 0 种，就可以提供1 0 0 万种可识别的编码微球，理论上就可以对1 0 0 万种不 同的d n a或蛋白质进行识别。 这种量子点微球标记物的发射荧光强， 稳定性能 好。量子点微球可编成密码标记不同探针，同时搜索生物芯片中的很多靶点， 从而实现更为快捷的高通量筛选。 1 . 1 . 4 . 3医学研究 张 春阳 等2 1 1 将纳米粒子引入中 药 领域研究。 他们将量 子点 用来标记天花粉 蛋白( t ri c h o s a n t h i n , t c s ) ，研究了量子点标记天花粉蛋白的吸收光谱、荧光 光谱和酶活性变化。实验结果证实标记上量子点的天花粉蛋白的酶活性没有发 生改变。 他们还用双光子激发扫描荧光显微镜观察标记上量子点的天花粉蛋白 在人绒癌细胞( h u m a n c h o ri o c a r c i n o m a c e l l ) 的分布， 这对于研究靶向药物的作 用机制具有重要的开拓意义。 量子点还可能应用于医学成像，由 于可见光最多只能穿透毫米级厚度的组 织，而红外光则可穿透厘米级厚度的组织，因此将某些在红外区发光的量子点 标记到组织或细胞内的特异组分上，并用红外光激发，就可以通过成像检测的 方法来 分 析研究组织内 部的情况， 达到 诊断的目 的 2 2 1 2 0 0 2 年， 有人将z n s 涂层的c d s e it子点用聚合磷脂酞乙醇胺 ( p e g一 p e ) 和卵磷脂混合物包裹成胶囊，利用其荧光性，注入青蛙胚胎细胞内观察胚胎发 育 过 程 2 3 1 南开大学硕士学位论文 第一章 量子点向人们展示了独特的魅力，吸引了众多科学工作者的关注和投入， 将在生物医学领域的研究中蕴含着巨大的应用前景。 1 . 2共振光散射技术 共 振光散射( r e s o n a n c e l i g h t s c a t t e ri n g , r l s ) 技术是近年来发展起来的一 种分析方法，这是一项在普通荧光分光光度计上进行光散射分析的技术。在荧 光分光光度计上选择合适的激发和发射带宽度， 采用相等的激发和发射波长( 即 a x = 0 ) 同时扫描激发和发射单色器所得同步光谱即为散射粒子的共振光散射光 谱。共振光散射法显示出的高灵敏度和选择性表明它对生物大分子的测定和表 征是一种非常有用的技术。 1 . 2 . 1共振光散射基本理论 1 . 2 . 1 . 1光散射现象 光散射现象是指一束光线通过介质时在入射光以外的方向上观察到的光现 象，是电磁辐射与物质相互作用的一种表现形式。它源于光电磁波的电场振动 而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动 着的偶极振子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。当光 照射到分散体系时， 粒子的尺寸小于入射光波长，发生光散射。 . 2 . 1 . 2瑞利散射 当 介质中粒子很小 ( d :5 2 0 ) w )时，分子在吸收能量较低的光子之后，电子 跃迁至 基态较高能级， 并 在很短时间 ( 1 丫2 s )内 返回原来的能 级， 并伴随 着在 不同 方向 上发出 瑞 利 散 射( r a y l e i g h s c a t t e ri n g , r s ) s 1 , 散 射 光 波 长 与 入 射 光波长相同，强度与入射光波长的 4次方成反比，并与散射粒子的大小、溶液 浓度、溶液折射率等因素有关。 瑞利散射在化学研究中主要用于分子量的测定、分子旋转半径、形状和尺 寸的测定，及反应过程的动态行为研究等。但由于信号水平低，对于研究极稀 溶液中物质的浓度和结构信息非常困难，而选择性差则限制了它在复杂体系中 的 应用 rz w ,z 7 l 南开大学硕士学位论文 1 . 2 . 1 . 3共振光散射 第一章 当 瑞利散射位于或者接近于分子吸收带时，由于电子吸收电 磁波的频率与 其散射频率相同，电子因共振而强烈吸收散射光的能量发生再次散射，其散射 强度通常较单一的 瑞利散射提高几个数量级12 8 1 ，并且不再遵守散射强度与入射 波长4 次方成反比的瑞利散射定律。 这种吸收 一再散射的过程称为共振光散射。 r l s由于在某些波长的散射光强度急剧提高，其散射强度能够比瑞利散射 提高几个数量级，因此可用于更低浓度组分的分析研究。由于 r l s有极高的强 度，因此入射光可用普通光源，这不仅使方法更为简便，而且普通光源 ( 如佩 灯)通过单色器即可提供连续波长的入射光，这就为得到r l s光谱提供了条件 口 司 由于r l s 强 度不再与入射波长的4 次方成正比，其散射光谱特征直接受到 吸收光谱的影响，具有不同吸收光谱的分子会出现彼此不同的r l s光谱特征和 相应的r l s 峰，因此r l s 法较单一的r s 具有更好的选择性。 r l s 对于大分子非键作用，如缔合、聚集、偶极一 偶极作用、长距离组装等 作用非常 敏感12 9 .3 0 1 ， 这对于生物大分子的 测定、 表征以 及反 应历程的 研究极为 有 利;同时，静电作用、疏水作用以及电 荷转移作用对于r l s强度和光谱特征有 重要影响13 1 ,3 2 1 。 这 就为 通过离子缔合反 应， 用r l s 技术测定痕量的生 物大 分子、 金属、 非金属、 有机化合物和药物等奠定了基础。 总之， 与单纯的r s 相比， r l s 不仅灵敏度高， 选择性好，而且可提供更丰富的信息量。 共振光是一种同步发光，因此可以 根据同步发光方程理解其定量基础13 3 1 . i s l = k- c b e +( a , , ,) e m ( a. + a x ) ( 1 . 1 ) 其中， e t.为在给定激发光波长处的橄发函数， e .为在对应的发射光波长 处的发射函数， k为与仪器条件常数有关的常数， b 为液池厚度，c为溶质的物 质的量浓度。由 于共振光散射a d = 0 ， 故: 玩s = k- c， b 凡 ( d 动， e, ( a,) 0.2 ) 由 此可知，当仪器条件一定时，共振光散射强度与溶液的溶质的量浓度成 正比，这就为共振光散射测定物质浓度提供了定量依据。 1 . 2 . 2共振光散射在生物检测中的应用 南开大学硕士学位论文第一章 共振光散射现象是在上世纪初由r . w. wo o d 最早观测到的。1 9 9 3 年以后， p a s t e m a c k 等使用普通荧光光度计获取了一种共振光散射光谱， 首次用共振光散 射技术研究了 叶琳类化合物在核酸表面的j 一 型聚集24 .2 9 1 ，并且于 1 9 9 5年在 ( s c i e n c e ) 上具体阐述了 共振光散 射技术 2 8 1 , 1 9 9 6 年童沈阳、 黄承志等将r l s 技术 应用于核酸的定量分析3 4 1 ， 从而 揭开了 共振光散射技术在生物大分子分析 及 金 属 离子 分 析中 应 用的 序 幕1 3 5 ,3 6 1 0 2 0 0 1 年， 黄 承志等用其 测定了 金霉 素 1 3 7 1 2 0 0 3 年， v i d a l 等人结合流动注射法测定了 总蛋白 质含i t 3 9 1 . 1 . 2 . 2 . 1几种常用共振光散射探针 r l s 技术能十分灵敏地测定生物大分子，测定的基础是探针在生物大分子 上 堆 积导 致强烈的共振光散射增强， 增强程 度与 待测物浓度呈线性关系 3 1 有 机染料探针是 研究 最多的一 类生物大 分子r l s 探针。比 如， 澳酚蓝【3 9 1 苯甲 天青4 0 1 等与蛋白 质结合后， 在染 料的最大波长的 长波区 产生共振光散射增 强: 铬 黑t 作 为 共振光散 射探 针测 定 蛋白 质， 其 检测限 达到3 9 g g l 1 14 1 1 : 另 外， 酸性 铬蓝k 4 2 1 、 酸性绿2 5 14 3 1 、 绿色盐f c f 14 4 1 , 铀试剂4 5 1 等， 都被用做蛋白 质 共振光散射探针，并且具有较好的检测性能，三氛乙酸是一种有机酸探针，其 灵 敏 度 稍 低 于 染 料 探 针 4 6 1 。 使 用r l s 技 术 研 究 铬 天 青s 一 铝 ( i ii ) 一 聚乙 二 醉 4 0 0 0 体 系 光 谱， 共振 散 射 光强 度与a t ( i ii ) 的 浓 度 在0 .0 8 4 - - 0 .8 4 l tg m l 1 范 围 内 呈良 好的 线 性 关 系 14 71 上述蛋白 质散射探针测试的精密度低，千扰因素较多。蛋白质分析水平的 进一步深入要求继续优化散射探针并寻找新的性能优良的探针试剂。 1 . 2 . 2 . 2纳米粒子共振光散射探针 纳米粒子的 特殊结构赋予了纳米粒子独特的物理化学性质， 比如表面效应、 宏观量子隧道效应等。另外由于纳米粒子的直径范围与生物大分子相当， 所以 非 常 适 合 与 生 物 大 分子 作 用 4 8 ,4 9 1 蒋治良 研究小组利用r l s 光谱 法对纳米粒子 进行了 研究。 他们通过 对a g , a g / a g c l , t i o 2 , c o f e 2 0 4 , 碳、 把、 二 氧化锰等纳米微粒的r l s 光谱研究5 0 -5 5 得出超分子的粒径、 形貌、 吸光特征等是影响共振散射光谱的主要因素。 同时， 他们还解释了纳米粒子的颜色与粒径的关系， 验证了共振光散射强度函数。 近年来开发的无机发光纳米粒子， 特别是量子点， 因其具有宽的激发光谱， 南开大学硕士学位论文第一章 对称且相对较窄的荧光发射， 强的抗光漂白能力和高的发光稳定性等独特优点， 在生物成像、 标记、 免疫等科学研究领域获得了 极为重要的 应用” 6 - 5 8 1 。王 伦等 合 成了 一 系 列m s 一 砰+ 似= z n , 以 p b , n i , c d ) 纳 米 粒 子实 现了 对蛋白t 一 i g g 的 检测 15 9 .6 0 1 ， 并 通过实 验 证明: 和传统 有机染 料 探针 相比， 量子点 探针光强 更 强、对光电腐蚀更稳定且不受 “ 闪烁”现象的影响，检测过程简单、快速、干 扰小。 张 萍等6 1 利用l 一 半脱氨酸包覆的z n s 纳米粒子， 来定量分析人血清样 品中的总蛋白 质. 建立了一种灵敏的测定微量蛋白质的方法，其结果与临床数 据一致。 总之， 把量子点优良的光学性质与r l s 技术的高度灵敏性相结合，为研究 生物大分子结构、功能和相互作用提供了一种新的思路。 1 . 3荧光共振能f转移技术 1 . 3 . 1荧光共振能最转移基本理论 1 . 3 . 1 . 1荧光共振as转移 荧光共振能量转移 ( f lu o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r f r e t ) 现象是 p e r r i n 在2 0 世纪初首次 发现的，由f o r s t e r 等6 2 1 于1 9 4 8 年 创立了 系统的 理论。 它是指荧光能量给体与受体之间通过偶极 一偶极祸合作用以非辐射方式转移 能量的过程，即电子激发能在能量供体和受体对之间的传递。这种传递距离最 大可达7 . 0 一 1 0 . 0 r u n ， 其直观的表现就是供体和受体之间达到合适的距离( 1 一 1 0 n m) 时，以供体的激发光激发，由于偶极 一偶极相互作用， 供体分子激发态能 量以非辐射的形式传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子而弛豫 ( 图 1 .5 ) ，同 时 伴随 它 们的 荧光 寿 命的 相 应缩短 和拉长。 据 此， s t ry e r 等6 3 】 在1 9 6 7 年提出， f r e t可以作为光学尺，用以测量1 . 0 - 6 . 0 n m之间的距离。 一对合适的能量转移对的供体和受体之间必须满足一定的条件:( 1 )两种 荧光物质的激发光谱要分的足够开;( 2 )两种物质的发射光谱要分的足够开; ( 3 ) 供体物质的发射光谱要与受体物质的激发光谱要有相当的重叠; “) 两种 物质的偶极具有一定的相对取向; ( 5 ) 两种物质的分子相对距离在1 - 1 0 nn 内。 荧光物质分子之间的能量转移方式可以 分为辐射转移与非辐射转移，荧光共振 南开大学硕士学位论文第一章 a c c e p t o r 图 1 .s f r e t发生的示惫图 f i g . 1 . 5 s c h e m a t i c d r a w i n g o f f r e t 能量转移属于非辐射能量转移6 4 1 。 故这种方式的能量转移可以发生在两种不同 的分子之间或同一分子的不同生色团之间。 1 . 3 . 1 . 2荧光共振能里转移效率与距离 能量传递效率和给体的发射光谱与吸收光谱的重叠程度，给体与受体的跃 迁偶极的 相对 取向， 以 及给体与受体之间的 距离等有关6 2 .64 ) 能量传递效率e可从时间分辨数据式和相应的荧光强度表达式求得: e=1 一r d a / r d =1 一 f d a / f d ( 1 .3 ) 式中: 以为受体存在时给体的荧光寿命，: 。 为受体不存在时给体的荧光寿命。 凡人 为受体存在时给体的荧光强度，凡 为受体不存在时给体的荧光强度。 根据f r e t理论， 能量转移效率与供受体间距离r 的关系如式( 1 .4 ) 所示。 因此，可由e通过 ( 1 .4 )计算求得r e e 二 r a b / ( r o b + r 与( 1 .4 ) 式中; 为供受体间 距: r o ( 如式1 .5 ) 为f r e t效率为5 0 % 时供受体间距， 与二 者之间偶极 一 偶极相对空间取向、介质折射率及光谱重叠因子j 等因素有关。 南开大学硕士学位论文第一章 r d 一 0 .0 2 1 1 it 1 /3 o d 1/6 j ( x ) 1 /6 / 产( 1 . 5 ) j ( a ) 为供体荧光光谱与受体吸收光谱的重盈积分，由公式 ( 1 . 6 ) j ( a ) =i f d ( a ) e , ( a ) a 4 d a / i f d ( a ) d a 得出: ( 1 . 6 ) 1 . 3 . 2呈子点在荧光共振能量转移中的应用 f r e t因其对距离的敏感性，被广泛应用于生物大分子结构、性质、反应 机理以 及 定量分析 等方 面的 研究 6 5 ,6 6 1 。 能 量转 移荧光分 析也 适合 对环 境、 生 物 医学科学和临床化学等领域中复杂、低含量组分的分析，是基因工程研究中的 一 种新手段6 7 - 7 1 1 童子点应用于f r e t 体系有很多优点， 首先， 量子点的激发波长范围很宽， 因此可以通过选择合适的激发波长来避免对受体分子的直接激发。其次，量子 点有持续可调的光谱性质，可以通过改变量子点的大小来调节蚤子点的发射光 谱从而调节其与受体分子吸收光谱的重叠程度，进而可以调节f r e t的效率。 再次，量子点的荧光谱峰狭窄而对称、发光强度较强、且荧光量子产率较高， 不易 荧光 漂白 2 ,7 3 1 。由 于这些独特的 优势， 近来对其应用于f r e t的 研究更为 深入，范围不断扩展。)t 子点在f r e t中既可以作为供体，也可以作为受体。 目 前，以量子点为基础的f r e t主要应用于以下几个方面。 1 . 3 . 2 . 1核酸检测 分子信标 ( mo l e c u l a r b e a c o n ， mb )是根据核酸碱基配对原则和 f r e t原 理 而设 计的发夹型荧 光探针 7 4 1 . 它包括一个环和一个干， 其中 环是由 与靶 分子 互补的核酸碱基序列组成，干为两列互补的碱基序列，荧光基团和碎灭基团分 别标记在其干的两末端。 通过荧光基团和碎灭基团之间是否发生f r e t来区分 靶分子。由于有机染料光漂白速率较快、寿命较短以及其荧光色彩的有限性， 限 制了u : , 在活体检测中的应用7 5 1 。 为了克 服这些缺陷， k i m等7 5 1 设计了 一 种 新的分子信标( 图1 . 6 ) ， 用疏基乙酸包覆的量子点作为荧光基团， 与n o 的5 端 的 一 n h 2 相连，d a b c y l作为碎灭基团，连接到mb s 的3 端，以此实现对核 酸的识别与检测。 1 . 3 . 2 . 2免疫分析 南开大学硕士学位论文第一章 妇沙今 0 目 凡 图 1 .6，子点修饰的分子信标 f i g . 1 . 6 s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f q u a n t u m d o t ( q d ) m o d i f i e d m o l e c u l a r b e a c o n s f r e t作为一种最简便的均相免疫分析方法， 不仅适用于小分子 ( 如半抗 原) ， 而且适用于大分子 ( 如蛋白 质) 。 实验方法包括两种: 竞争法和夹心法7 6 1 竞争法 f r e t中，能量转移的供体和受体分别标记抗原和抗体中的一种。夹心 法中能量供受体分别标记针对同一抗原的抗体。 w a n g 等 (7 7 1 将 两 种 分 别 发出 绿 色 荧 光 ( g 一 n p s ) 和红 色荧 光 ( r 一 n p s ) 的c d t e 纳米粒子用于免疫分析法。 他们用r一 n p 。 标记牛血清白蛋白( b s a ) ， 用g - n p s 标记 抗b s a的i g g 。当 形 成b s a 一