（生物医学工程专业论文）神经芯片及其在生物嗅觉传感机理中的研究.pdf

浙江大学博士学使论文 幸牵经芯片燕敬神经元细臆为蟒粱，袋集势分褥套移淫他测激对生物体襻经系统鹣 撂瘸，因j 墩枣孛经细腿豹钵夕 培养是蕊片礤究中约一个熏溪环节。本砑究对小鼠膝 黪予绸魏遂嚣了穗纛魏俸羚诱导，经其寇肉分让为具纛电生理特糕的襻经元细艨 和舆礴自发搏动能力的心肌细胞，利用l a p s 技术，通过对绷胞生理特性灼检测， 探讨了于细胞芯片在药物筛选分析中的初步应用。 3 采焉生街溪觉感受绸臆黼l a p s 器件藕合，设计了爨有仿整佼憋功麓的唉 爨褪l 经葱冀。生物钵大多熬露灵敏瓣嗅燮系绞，可滥戆知黪谖剩多嵇极其微量豹 气崃分子，本文设诗了基予囊物嗅滗缨熬奄囊理绩号梭溯豹镢型骥觉睾串经蕊片， 通过对坯境气味分子的模拟测攫，鞠步诞实了这群基予枣孛经芯片技术的生物电子 努( b i o e 妣t i l i cn o s e ) ，具有生物嗅觉气味识别的仿生性质，发展了目前的人工嗅 熬( a f t 嫩c i a ln o s e ) 设计恩想。 4 采露激泡缀阵捌式徽探锌芯片，嚣瓣了生赣溪鬃多蛩羧在体检测磷究。舔 予微辍攘热羔技术，采蘑个缝够熬残8 暹遂电极箨裂戆徽擦赞蕊嚣，其审每一 恕辍袭嚣可达1 6 岬。1 2 0 瓣域e 3 峰搿1 2 0 # 撙尺縻，嚣基备逶遵之阕串扰较小， 具蠢较好豹信噪比。溶渡榕定碟知对神经递最多巴胺的敏感性达5 0n m + 将其固定 予大鼠嗅糙膜，对单胺类摊经递质邀行7 在钵测量。遁避c 如剃激三叉襁经动物模 型的验证，证明该芯片可用予神经递质的多饿点实时检测。 关键词：神经芯片，细胞传感器，光寻址电位传感器，生物嗅觉，胚胎干细胞， 神经细胞，微探针，微电极阵列 珏 a b s t r a c t n e u r o n a le l e c 拄o p h y s i o l o g yi so n eo ft h em a i nr e s e a r c hf i e l d so fm en e u r o s c i e n c e h o w c v e r ，黼c 0 一i n gm e 出o d so f 诹ee l e c 圩o i l i c 采s i g n a l s s t i l l d 。p e 耐 o nt b e m i c r o e l e c t r o d eo fm ep a t c hc l 鞠1 ps t i c k 抽gt o 搬em e m b r a n eo ft h ec e l l s i ti sd i 爆c u l t f o rt h o s et e c l l i l i q u e st 0r e a l i z el o n 9 0 e n nm o m t o 血豁e s p e c i 甜l y ，m em u l t ic b a n i l c l s s y n e 融o u s 聪e 随i 娃go fn e 氍o n 蠢n e 鲰。r k s ，d l l e 童。氆e 静豫8 v o i d a b l ed 黼a g e 协e e l l s t h e r e f o r c ，u s i n g m i c r o e l e c 协o i r l e c h 8 i l i c a l s y s t e m s ， r e s e a r c h e r sh a v e d e v o l o p e d 照黼e 啦so f 癌渤e l e c 拄o & 嚣芏f 翠测嚣a ) 髓| 至e l de 甄娃拄a n s i 鲫( f 嚣d 瓣嗡弧d o nc e l l - b a s e db i o s e i l s o r ，t or e c o r dt 1 1 ee x t r a c e l l u l 甜p o t e n t i a l so fn e u r o n s b e i n ga n 加 v 擅移f e e o f d 赫gs y s 把m ，n e u f o e 轴pm e a 砖sa 钯西械q 糙o f c 啦锨f i n gn e 埘静芏l so n 盎es 哦e o fm e ao ff e t a r r a y 8 ，w h e 糟c e l l sc a nc o u p l e 诵t l le l 咖d e so rg a _ t e so ff e t t h r o u g h at h i n1 a y c ro fe l e c 拄o l 孙e t h en o v e lb i o c h i pa 1 1 0 w s 龇c o m m 俩c a t i o nb e t w e e nc m p s a n dc e l l s a sw e l la sm 删t o d 甥也ee l e c 峨c a la c t 至v 娃i e so f n e l l r o 魅s 扭咖法al o n 鬈- t e 潍 a l l dn o n i n v a s i v cw 蚶w t 圭lm e s em 州t s ，n e u r o c h t ph a v eb e e na p p l i e dp r i m 甜i l yt o b i o 撼e d i e 越弧撼i e ss b 馥a s 纛耀ss c 揩e 越氅a n de 珏调艄黼越魏敞蛙暇f 砸h c 凇o f e ， n e u c 1 1 i pa l l o w sf o ri n v e s t i g 妇gm el i i g h 觚b o no f 协eb r a i l l ，n e u r o n a lp r o g t l l e s e s a 蕊氇ef e e o n 撇畦o i 珏o fd 瓣毽蓼ds e n s eo 毽鞠s ，w k 珏毽s e d 觑v 的t o 氇en e 凇 s y s t e m t bs e t t l et h ek e y 慨h 1 1 i q u e so fd e v i c ed e s i g na n dc e l l u 跚c u l t i l r e ，t l l ep a p e r i l l 螂妇托畦an o v e ln e w o 幽pb a s e do nl i 曲t 撕d f e s sa _ 蜕ep o t e b 蛀o m e 斑cs 鞠s o r ( l a p s ) ， u s i n gc x c i 掘b l ec e l l sc u l t t l l e d 舶me m b 碍o n i cs t e mc e l l s ，w h i c hc a nb es u c c e s s f i i l l y a p p l i e dt o 舢g s 渊蕊n g m o r e o v c r ，t 圭l en e u r o c l l i pb a sa l s ob c e ne m p l o y e dt 0m e f e s e 黼ho f 龇b i o l 蟛e 蠢o l 融娃o n 如v l v oa sw e l la s 加v 跏，w h i 妇i s8n 。wa 弹l l e a t i 强 o fm en e u r o c h i pr c s c a r c h t h em a j o rc o n t e n t sa n dc o n t r j b u t i o n so f 血i sm e s i sa 心g i v e n a s 氆ef 疆l o 旗耀a s p e e l s 1 。b a s 聪。珏l i 痨ta 醛羚s s i 珏g 馥a 臻睬薯s 。fl a p s ，也en e 瑾站e 玲羚疆i 嚣醚e d l t r a c k i n ga 1 1 dd e t e c d o n b o mm e aa n df e ta r r a ya r er e g c t e dt on l e a s u r i n gt h e l l i 浙江大学博士学位论文 e x n a c e l l u 猷p o t c n t i a lo n l ya tal i m i t c dm m l b e ro fa c t i v e “l c a s l l r i n gs i t e s ( m et i po f e a c h 瘫i 媚d 潍l 黻i e # o h e l e e l 如鞠d 氇eg a 圭e e l e c 攮翻e ) ，l i s 鑫i 蓬e 穗t 。黼l 她ec | l sj 醢s 毛黼 t h o s es i t e s l a p si sa n a m 舒rc o m m o n l yu s e ds e i n i c o n d u c t o rc h i p w b e nc e l l sp f o d u c e p o t e n t i a lc ha i _ i g e s ，w l l i c hc a nb er e c o r d e db ym e a s 面n gt l i ep h o t o c u r 艄n tg e n e 掘t e df 衲m l a p s 。b y a n n 遗氇el i 辫一p o i 毪融鑫圭。裙l 艘s ，e e l l s 蘸鼢y & s 主嘲p o 巅鞠c 黼& r e c o r d e d ，h e n c e 主tc 锄o v e r c o m et 1 1 el i m j t a t i o no f o m e rn e u r o c h i p sm 蹴m o n e db e f o 2 。a 嚣铡e le e l l 硅嚣e 垂醢n e 疆h 冷w 8 sp 罚蠢e d ，努l 羲d 轻e i 毽g 瓣。珏s ce 臻搿o n i c s t e mc e l l s 加v f 帕d i f f c r e n t i a t i o nc u l t u r c n e u r o n a lc e i li sm eb r i d g eo fm en e u r o c h i p a n dn e u r a ls y s t e m ，w h i c hc a ns e r l s et h ed i 日、e r e n tp h y s i c a l 趾dc h e m i c a ls t i i n u l a t i o n so f 龟e 珏e u 臻l 锣蝾秘，确e 聪您羚，e 珥鼬o f 国en e 瑚奄磊鑫| e 蘸l si sv e 搿i 辩p o 蛀8 壬薹稔壕o n e u r o c h i p w ei n d u c e d 黼e m b r y o n j cs t e mc e l l s 加v 打阳t od i 玎c r e m i a t ei n t o s p o n t a n e i 够b e a t i n gc a r d i o m y o c y t e s a n de x c i t e dn e u r o n s r e s p e c t i v e l y u 8 i n g e x 咄e l 醚嚣p 啦两杰o f 妇e 蘸l s 蚴氐硅谤l 艘s ，ap 豳霹鑫翔l 铭童遗i 拄翻g s s c r e e n i i l go f t l l es t e mc e l lc h i p 、v a sd i s c u s s c d 3 a 毯枷co l 蠡嘲l l 懿瑚c h 玲w a sd e s i 擎赋b 巍s e d 摊a 姆镰ds y mo f 毛艘s 觚d0 1 f a c t o f yn e l 瑚n s ，w h i c hi ss c n s i t i 、雄t oo d o r s m a n 船a 差i 髓o l f 融t o r ys y s t e mc a n d i s 如g u i s hm o u s a l l d so f o d o r se v e ni na 删h i r n a lc o n c 删i o nl e v e ll no r d e rt or e a l i z e 氆eb o 鲥妇e 蛙e & s i g no fe 靶e 她l i en o 辩赚氇ep f i n c i 群eo fo l f 趋c l o 拶s y s 胁，氆e 穗i p w 嬲d e s i g n e d b a s e do n 她e l e c t r o p h y s i o | o 影d e t e c 矗o l io f 舭o l f h c 呻e e l l s t h r o u g h t t l es i m u l a t i v er e s p o n s ew l d c rs t i m u l a t i o n so fm ee n v i r 0 i l i n e n to d ( 煅m t s ，t h cr e s u l t s 照o w 氆采镪eb i o e 圭e e 拄。撼e 釉s eo f 饿 s 蓦i o i 征m 砥e 辩黝e h i pi ss 。黼瓣v e 圭oo d o 糙臻s c h 柚g e s t h o 枷q u e 埘d e n e d 也ed e s i g ni d e ao f t h e 懈i d i t i o 脚a n i 矗c i a ln o s e 4 。d o p a 捌n e 址r a to l 攮c 虹。珏m 槭t o r e d 扬v 渤，u s 妯gam i c f o p b ew i 斑 f n i c 僦| e c 拍d ea r r a y b a s e do n 攮et 就淑i l i q u eo fm i c f n e 重e e f c 嗄n e c h a 董l i e a i 印s t e 撒s ，a p r o b ec h j p 、稍t h8c h a i m e l se l e c 协) d ea 盯a y sw a sf 如r 王c a 把d t h es e n s o ra r c ao fe a c h e l e c 拓0 d ci s1 6 l m 1 2 0 鹏o fo 。3 l m 1 2 0 斗m 戳像l h ev e f y1 0 w0 o s s 翻薹 i n gn o l s e o fe a c hc h a n n e l ，t h ep r o b ec o u 重d 。v d e o e c td o p a 群娃n ck5 0n m c a t e c h o i a m i n e s w e r ea l s om o n i t o r e dmv “w i m 也ep r o b es e m i n gi nr a tn a s a lm u c u s u s i n gm e l v a b s l i t a n m m im o d e lo f 埘g e i n i n a | s n m u l a t i o nb yc 0 2 ，u l er e s u l t sd e m o n s 订a t et h ec h i pc o i l l d 璜。越t o f 氆et 涵ee o 獬s eo f 魏o u 翔蕾a 壬l 辍癫魏rs 泊髓翘c e s 姆m 越l 强l es 懿s 钟s i t e s k 姆w 。砖s ：n 蹦瓣c 魏i p ，c 。l l 七8 s e db i o 辩黼o f ，l i 鬈瓤舞d 撑s s 痨l 。p o e n 重量。糙e 扛i e s e n s o r ，b i o l o g i c a lo l f a c t i o n ，e m b r y o n j cs t e mc e l l ，n e u r o n ，m i c r o p r o b e ，枷c m e l e c 协3 d e a l 臻y v 1 1 神经芯片的研究目的 第一章绪论 神经系统信息的感知、编码与传递历来都是神经科学研究的主要课题。目前 学术界基本认为，上述神经信息主要都是通过神经元群体的网络协同活动而实现 ( 黄秉宪，2 0 0 0 ) 。尤其对于感觉神经系统而言，即便是较为简单的外界刺激，也 都是感觉神经元组成的神经元群体，通过时间与空间编码向中枢传递。可见，如 果能够深入了解神经元群体网络信息处理的时间与空间过程，这将对认知科学的 发展起到极大的促进作用( f r e e m a i l ，2 0 0 4 ) 。但是，要想研究神经元网络的动态工 作原理，则必须对细胞嘲络所涉及的各方面因素进行同步检测，并且要保证细胞 信号在得到记录的同时不受损害。因此，能否对指定区域的多个神经细胞同时进 行长时程、多位点的电信号采集和( 或) 刺激，已成为当前神经科学研究所急需 解决的重要问题之一。 传统的神经电生理检测，是用微电极进行细胞内记录，即将装有盐溶液的微 电极刺入细胞，对细胞的跨膜电位进行记录，或者应用膜片钳( p a t c hc l 锄p ) 技术， 将内装电极的玻璃毛细管紧贴于细胞膜，在吸破细胞膜后进行全细胞记录，也可 在吸取一小片细胞膜后进行单个离子通道的研究。微电极和膜片钳所存在的问题 主要在于( 康华光，2 0 0 3 ) ：用微电极刺入细胞或者钳制细胞，都会对细胞造成一 定的损害，并导致细胞在很短的时间内死亡，这样就限制了对动作电位以及离子 通道电流记录的实时检测；同时，可供选择采集信号的细胞数较少，并且难以确 定突触的确切位置，所记录到的信号难以具有代表性；另外，由于技术上的限制， 膜片钳技术目前仍难以实现对多个神经元进行同步测量。当然，也有使用电压敏 感染料对细胞进行染色，从而对细胞电位改变进行记录的电生理染色方法。但由 于染料本身对细胞的生物毒性作用，会对细胞的存活率造成一定的影响，并且其 测量信号精度往往难以满足实验要求，也就限制了它的广泛应用。 近年来，生物传感器( b i o s e n s o r ) 得到了迅速的发展，突破了原来以酶电极为 代表的传统生物传感器，出现了可以连续传输受体与配体相互结合实时信息的亲 和性生物传感器( 捕n 畸b i o s e n s o r ) ，尤其是，以整个细胞作为敏感元件的细胞传 感器( c e l l - b a s e d b i o s e n s o r ) 得到了迅速的发展( t u m e r ，2 0 0 0 ；p a l l c r a z i oe ta 1 ，1 9 9 9 ： 浙江大学博士学位论文 w 抽ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。目前，已经可以在硅器件表面培养并固定多种神经细胞和组 织，构成神经元与半导体硅材料相耦合的新型细胞传感器神经芯片 ( n e u m c h i p ) ，用以进行细胞电生理的传感检测( 例如，g r o s se ta 1 ，1 9 9 5 ；m a h e rc ta 1 ， 1 9 9 9 ：f o 瑚h e r ze ta 1 ，2 0 0 3 ) 。其实质就是利用微机械加工技术，在玻璃或硅基底上 刻蚀出一个由金属微电极或场效应管栅极所构成的阵列芯片，将神经细胞在器件 表面固定并培养，利用芯片作为神经细胞和外围电路之间的桥梁，通过它将神经 元细胞在受外界刺激( 电刺激、化学刺激等) 时的生物电信号传递给外围电路， 从而进行细胞电生理活动的测量。与膜片钳技术相比而言，这类阵列细胞传感器 最大的优点是可以对细胞间的信号耦联和传导进行长期、实时、无损的测量( n e h e r 2 0 0 1 ) 。 本课题主要研究了基于光寻址电位传感器( 1 i g h ta d d r e s s a b l ep o t e m i o m e t r i c s e n s o r ，l a p s ) 的神经芯片，该技术是将细胞培养在传感器表面，通过移动光点对 细胞进行寻址跟踪，并在一定时间内记录细胞胞外电位的变化( x ue ta 1 2 0 0 5 ) 。 本论文基于对l a p s 神经芯片的详细介绍，探讨了胚胎干细胞( e m b f y o n i cs t e m c e l i s ) 来源的神经芯片及其在药物筛选分析中的应用，接着将神经芯片用于生物嗅 觉研究，从离体和在体两个方面对生物嗅觉感受与信息传导进行了初步的探讨。 本章主要介绍神经芯片的研究现状。 1 2 神经芯片的研究现状 目前，研究较多的神经芯片主要包括基于微电极阵列( m i c r o e l e c 仃o d ea n 张 m b a ) 和场效应管( 矗e l de 腩c t 打a i l s i s t o r ，f e t ) 阵列的豫类神经芯片。m e a 和f e t 阵列都可以用来检测细胞膜电位改变，从而可用于神经元电信号的发生与传导过 程研究。其中，m e a 有两种工作方式，即离体检测和在体检测。离体检测是指在 电极表面进行神经细胞的体外培养，神经元之间可通过突触连接相互形成网络样 结构，利用电脉冲或药物刺激之后，将发生改变的细胞电位信号用m e a 进行记录 的一种方法。除了培养得到的神经细胞以外，离体检测的对象也可以是脑片( b r a i n s l i c e ) 、视网膜等分离培养的神经组织。在体检测则是指将带有m e a 的微探针插 入或植入动物神经系统，用于检测处于活体状态的神经电生理信号或神经递质等 生物化学信号。f e t 阵列目前则主要仅限于与m e a 类似的离体研究。 第章绪论 1 2 1 离体检测微电极阵列( m e a ) 神经芯疗 1 1 b o m a s 等人首先构建了一个微型的电极阵列，用于体外熔养心肌细胞的胞外 电位记录，其设计方式是用微机械加工技术在玻璃盖玻片上制作了一个具有3 0 通 道熬电投黪确( 强鳓鑫se l 越，1 9 7 2 ) 。虽然i 袖m 黼等人熬检瀵对象隽心鼹激溪魂， 但是心肌细胞与神经细胞均具有兴裔性，在电生理研究上具有一定的相通之处， 所以仍然可以认为是神经芯片研究的开端。接着，( s s 应用激光去绝缘层的方法 裁掺了邀缀壹径荛l o 畔兹m e a ，劳对螟字齄瓣经节迸行了狻溺( 鑫s se ta 1 ， 1 9 7 9 ) 。p i n c 则最早报道了用m e a 对体外分离培养的乳鼠颈上神经节动作电位的 记录，并指出m e a 也可用于细胞胞外电刺激( p m ，1 9 8 0 ) 。同时，g r o s s 也将实 验接爱裂了骚寅老簸黉髓分裹瓣襻经元( 的5 s 贰菇。，1 9 鸵) 。毽是，因为瑷究孛楚 用倒置盥微镜观察，衙金属电极不透明，所以难以通过这个系统对细胞进行精确 定位观察。为了解决这个问题，g r o s s 用透明的i t o 电极来制备徽电极阵列，这种 榜瓣导毫歉簿，褒予瓣察( g se t 瓣。，1 9 菸) 。l 残方蠖了缨蘧豹显微鬣察，同 时也表现出了良好的生物相容性。缺点是增加了电极的阻抗( 比相同尺寸的金电 极阻抗高4 s 倍) ，从而降低了动作电位信号的僚噤比。 匿l lm e a 神经拣持 鬣胚神经缨庭在一个6 4i 莲遂m e a 芯片表嚣培葬之嚣，捧经元之弱穗照连接形成襁经廷网 络。右强酃分为季串经元的各种形态及其与电极之阏魏藕念荚系。 图1 1 所示为g r o s s 等在一个6 4 通道m e a 表瑚培养的鼠胚神经细胞，神经元之 浙江大学博士学位论文 间可以生长形成突触结构，并且最终相互连接形成神经元网络( n e l l r o n a l 咖r k ) ( g r o s sc ta 1 。1 9 9 5 ) 。通过观察，在神经胶质细胞存在的环境中，该神经元网络结 构可保持其生理活性达9 个月之久。于此同时，g r o s s 及其同事研究了受到药物刺 激之后，神经元网络峰电位轨迹( 自发的节律性动作电位) 的变化情况，研究发 现在加入不同浓度m g c l 2 和士的宁( 中枢神经兴奋性药物) 后，可以监测到体外培 养的大鼠脊髓神经元的动作电位发放频率的节律性改变。在接下来的十多年，他 们继续从事大量的药物实验，来证明这些药物对培养的神经元网络电信号的作用， 结果表明，这种微电极阵列可以用于药物筛选或者环境毒性监测( g r o s se ta 1 ，1 9 9 5 ； s t e n g e r c ta 1 ，2 0 0 1 ；s e l i n g e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。目前，这种基于m e a 的细胞传感芯片已 经得到了商业化生产，我国的上海交通大学和华中科技大学等单位也已经购置并 投入了研究使用。 豳1 _ 2“神经井”型m e a 神经芯片 ( a ) 海马神经元在“神经井”中培养，部分突起从井中探出，与其它神经元构成突触联 系，形成神经元网络，比例尺1 0 0 岬1 ；( b ) “神经井”的剖面图，井底中央有一6 岬的金电 极，比例尺2 0 岬；( c ) “神经井”中细胞培养示意图。 但是，限制m e a 神经芯片技术进一步推广应用的关键，在于细胞的精确定位 问题上，也就是说，随机培养之后所形成的神经元网络，很难恰好被培养在微电 极的表厦部位( 图1 - 1 ) 。并且，常用的电极材料表面处理或细胞外基质涂层等方 法也难以将细胞限定生长在检测电极上。所以，一个比较成功的例子便是加州理 工大学的m a l l e r 等人研制出的“神经井”型结构的神经芯片( m a h e r e ta 1 1 9 9 9 ) 。 - 4 籀一章绪论 这种神经芯片是完全依嚣凹坑形式的“神经井”求实现细胞定位的( 图l - 2 ) 。利 溪“神经多 ”可敬藏少接簸毫疆，淤定续蕤透移褥游离子邀缀之努豹表嚣。其翱 作方法魁在硅片表面利用光刻技术，蚀刻出略大于神经细胞的井状小坑，把打散 的单个大鼠海马神经元用微操作技术放置在这些2 0 岬大小的凹坑里丽。硅片上有 1 6 令递邋静“孝孛经势”簿确，每个坟豹瘾部有嘏缀帮雩| 线与乡 部电臻褐藏逐攘， 这种方法使电极与细胞一一对应。提高了测量的有效性和一数性，但神经突起需 要长出“神经井”才司以和其它神缀元连接，不自& 很好地建立神经元网络。并且， 每个襻戆井霎神经嚣豹虢态不完全一致，溅量信譬氇蝰有差潮，在分拆数搽对存 在一定的难度。 l ，2 。2 褒俸捡溅徽鸯缀薛臻( 醚嚣a ) 搽锋芯麓 由于在体检测的实验对象是动物个体，不受体外培养技术的限制，因此，用 于在体检测躲m e a 搽镑鲍硬究也零予囊体测定豹氧懂a 。莠崴，在钵检溅朝便是 在离体检测方法成熟以后，也不耱被最终取代。离体检测只能说是对在体检测神 经元网络的简化，即用人工构建的细胞网络来探索生物体复杂的神经系统，所以 是在体梭测弓l 导羞离传捡溅方法豹发震。同时，舞震在体检测授拳，将极大戆推 动神经修复和入工器宙移植等方面鑫臼研究，其肖豢甍的研究意义。 早期神经电生理的测量是用灌注电解液的微电极插入神经纤维或神经元之 中，对动作邀位信号邀褥记录，毽憝鑫鼓灌注金瘸( 滚态灌浚，凝霆残固态) 蕊 微电极出现以后，就肖发展成m e a 的趋势。1 9 7 0 年，w i s e 等人利用集成电路的加 工方法制作了一个微电极探针，并成功测得成年獭大脑皮层内的电活动。在他所 擐遂的m a 探赞上，众徽电极竣鬟予醚基痣上，魄摄的其余酃分圭一薄层s i 铙赝 覆盖，越绝缘和隔离髂用( w i s ee ta 1 。1 9 7 0 ) 。 在以后的研究中，m b a 微探针获得了长足的发展。例如，b l a u 等人开发了一 秘毒藐的黧簸孑l 状懿徽瞧壤，霹强绕在筛孑上弱魄投可瓣逶遐藐遵夔褪经终缍进 行电藕激相信号测定( b l a ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 。它包括处于中间的穗基质徽阵列，以及 引导通道和两端的圆形接头。将其植入兔坐骨神经，可以记录到下肢运动所引起 豹毫生理交踅。但是褥裂蕊毫信号臻臻跑较低，芬显稳定性不瘫。毽鬟逶邀往耗 电极、降低电极阻抗以便信号的采熊，同时提高电荷释放的电容以便对神经纤维 浙江火学博士学位论文 迸行电刺激，最终使检测效莱获褥了菠善。努乡 一稀m e a 搽针，与虢面挺副静一 种微阵列一样，用空腔的方法来限制神经元，只是做成了探针的形状，易于植入 体肉( t a t i c ，l u c i ce ta 1 ，1 9 9 7 ) 。当将诧探针插入动物神经系统后，探针内包蠼的神 经元就生长蹦来与周围的神经元整合，被包埋的每个神经元郁紧贴个电极，可 以同步监控神经元网络。 勰o o 冬，b f 8 9 i 挂等人残凌豹憋带窍m 嚣a 魏掇铃植入烈袋年大藏戆大糖孛， 并在活动的大鼠身上进行长时间的电信号记漾( b r a g i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。由于探针上有 1 6 个微毫投，当丈鬣豹孬麓芍| 起搽锋所在藏嚣的兴资辩，褥今毫掇帮会毒信专输 出，其幅度有一定的梯度趋势。根据此信号差异，w 以大致确定神经元兴奋区域 距离探针 最泶位点的远近，樽靥缀绞亿学方法固定箍组缓，便可醴确定徽阵列探 针的位置，从丽碍到某种彳予为所对成的大脑部位的滔动情况。 目前，微探针芯片也已经商品化，比如荧国n e u r o n e x 瞄t c c h n o l o g i e s 公司已 经掺瀣了可以对神缀元进行投测、刺激，甚至能够靶淘绘药黥在髂瓣a ( 翳1 3 ) 。 瘸l o 徽攥铥銎m 嚣a 神经蒜冀 n e u r o n o x l l st e c h n o l o g i e s ，i n c 公司所推出的商品化的多通道m b a 微探针神经芯片。及其 电极g l 线结构。 1 2 3 场效殿晶体管( f e t ) 阵列神经芯片 相对于m e a ，f e t 阵列用于记淤神经元的动作电位比较晚，相关报道也较少， 餐楚，虱磊魏轰壹，箕梳理磷究去| j 激深入。 f e t 可以放大模拟信号和数字倍号，因此常被用以微弱信号的检测。f e t 有 栅极( g a t e ) 、源极( s o u r c e ) 和漏极( 出a i n ) ，源极与漏极之间形成电流通道( c h a n n e i ) ， 第一章绪论 电流通道的物理直径是固定的，但通过栅极的电压变化可以改变通道的有效直径。 在某一给定时刻，f e t 的导电性依赖于通道的电学直径，栅极上很小的电压变化 可以引起从源极到漏极的较大的电流变化。如图l - 4 所示，1 9 9 1 年f r 0 i i l h c r z 领导 的小组在s c i c n c e 杂志发表文章，采用微型的场效应管芯片来检测单个神经元的电 生理活动( f o 瑚h e r ze ta 1 ，1 9 9 1 ) 。其机理便是将神经元培养在源极和漏极之间的 栅极上，从而利用了f e t 的电流变化对神经细胞的电信号改变进行检测。 图1 4f e t 阵列神经芯片 在f e t 源极( s o u r c e ) 与漏极( 功嘲n ) 之间的栅极( g a t e ) 上培养神经元，栅极上很小 的电压变化可以引起从源极到漏极的较大电流变化，从而对细胞的电信号改变进行检测记录。 他们采用的具体方法是：在n 型硅片( 1 0 n l i n 3 0 m m ) 上加工了一个4 4 的 f e t 阵列，f e t 之间的距离为3 0 0 岬，每个f e t 之中源极和漏极之间的距离是6u m 。 在栅极所在区域( 2 0 肛m 3 4 肛m ) 铺上一层厚度为1 2m n 的s i 0 2 ，周围铺上一层更 厚的s i 0 2 作为绝缘层，使中间区域成为一个开口的栅极。由于水蛭的r e t z i u s 神经元 形体较大，直径有3 0 7 0 肛m ，易于操作，故被选为记录电信号的对象。将神经元 置于栅极上，用膜片钳全细胞钳制方法先限定神经元的电位低于激发的阈值，再 注入电流引起细胞产生动作电位，这时可以观测到源极与漏极之间的电流变化。 接着，为了达到神经元与芯片之间的双向通讯，即用芯片对神经元产生电刺激， 同时用芯片记录神经元的电冲动。f r o i i l l l e r z 和s t c t t 用p 型硅以电容耦合的方法对神 经细胞进行胞外电刺激( s t e t te ta 1 ，1 9 9 7 ) 。由于p 型硅上有一层1 0n r n 厚的薄层 s i o z ，它与神经元之问有紧密的贴附作用，因此相对于金属微电极阵列来说，这里 浙江大学搏士学位论文 没有法拉第电流通过电极和电解液界面，刺激效果较好，同时也避免了电化学作 用。通过减小刺激位点和场效应管的大小，让它们同时位于一个r e t 五u s 神经元的 底部，便可获得神经元与芯片之间的双向通讯。同时，为了便于研究某种特定离 子通道电流，将电压门控的钙离子依赖的钾离子通道k c 。在髓k 2 9 3 细胞中大量表 达，用f 矾阵列可以记录到 。通道开放所引起的胞外电压改变，同膜片钳的记录 结果相对照，证明此微阵列能较好的感应离子电流( s t r a u be ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 除了进行电刺激研究，f e t 阵列还可以记录药物刺激下细胞的电活动。y c u n g 等人将心肌细胞培养在f e t 阵列上，然后加兴奋性药物或者抑制性药物到细胞培 养腔中，在药物作用下，心肌细胞自身的节律性发生改变( y c 岫ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。y e l l l l g 的实验中所使用的是4 4 阵列的f e t 器件，具有独立的漏极但共享一个源极，一 个圆形开孔的树脂玻璃皿粘到切割好的f e t 表面作为细胞培养腔。贴壁培养2 4 4 8h 后，心肌细胞产生自动节律性搏动，使用药物来刺激心肌细胞，从所得动作 电位的频率和幅度变化可以判断药物对心肌细胞的影响。 圈1 5 “小立柱”型f e t 阵列神经芯片 培养在“小立柱”芯片的神经元网络：( a ) “小立柱”( 比例尺2 0 岫) ，刺激翼( s t ) ，晶 体管( s 源极，d 漏极，g 栅极) ；( b ) 蜗牛神经元离体培养3 天后，固定在“小赢柱”内( 比 例尺2 0p m ) ；( c ) 经过2 天培养后，神经元伸展出突起形成网络连接( 比例尺1 0 0 岬) 。 和m e a 技术所面临的问题一样，f e t 阵列同样需要解决检测位点上的细胞固 定培养问题。z e c h 等用微小的聚酰亚胺材料制成了如图1 5 所示的“小立柱”样 结构，每六个“小立柱”结构围绕在晶体管的栅极、源极、漏极( 分别用g 、s 、 d 表示) 和被激励器双翼( 用s t 表示) 包围的位置，形成一个栅栏小圈。“小立柱” 的高度是4 0 m ，直径是2 5 斗m 。将单个神经元用微操纵仪置于栅栏之中，这样就 一8 第一章绪论 将单个神经元胞体固定在半导体硅片上，丽神经突起在平两上则可自由伸腰获得 较稳定豹秘经元溺终模型。裁澈移诞录都对镶藏没存任餐损伤，容往激瓣器在芯 片上用电压脉冲来刺激贴附的神经元，信号在神经元网络上传导，产生的动作电 位国前一缀神经元传导到下一级神缀元上( z e c he ta i ，2 1 ) 。 l 。2 。4 毙寻疆电位传感器( l a p s ) 神经薅片 l 多8 s 霉瓣a f e 戳黼将表巍光电毯( s 疆e 强。奄。吖o l 轾塔e ) 测量技术弓l 入嘏解滚 一绝缘层一半导体结构，提出了l a p s 芯片传感器( h a f c m a ne ta 1 ，1 9 8 8 ) 。实验 表锈，律为传懑籍，瘸泌p s 及其测试系统可获褥优良静往能，镪翔高度耄复往、 测豢准确性以及良好的线性簿。 图l l a p s 神经蕊片 以一定频枣的正弦调制光照射l a p s 器件，半母体的吸收光产生大量电子空穴对，簌外电 路产生光生电流。只要移动兜点，l a p s 袈面任何醒域均可作为记录测试位点，方便对细胞进 行定位，降低了细胞的培养要求。 这种传熊器的结构特点如图1 塔所示，采用一京很细韵被调制的激光束，对传 感嚣表蘑任何所需测试区域均可扫攒寻址。辨且，对予没蠢柽俺结构限制鲍传感 器表面来说，方便神经元的培养与生长。所以，l a p s 技术以其光寻址特性，便可 方绞豹竟l 受上述m 嚣a 霸f 嚣罩阵列蕊片捡溅经点足舞特蛙静羧裁。蠢关a p s 裤 经芯片的详细检测原理将集中论述于本论文篇四章，此处仗对其光溽址特性进行 褪步交特。 我们实验室利用l a p s 技术，设计了一种单细胞传感器( x ue ta l 。2 0 0 5 ) ，因 第一章绪论 本论文主要采用l a p s 神经芯片进行了研究。 1 3 神经芯片的应用研究 神经芯片和蛋白质芯片、d n a 芯片等其它生物芯片一样( 程京，刑婉如 2 0 0 3 ) ，建立了生物学和工程学的一个接口，在其加工制作取得进展的同时，被迅 速的应用到了生物医学领域的多个方面。 1 3 1 用于神经元网络研究 在m e a 出现之前，大量有关神经元网络的知识往往是通过测量单个或少数几 个神经元的活动而获得。由于神经元网络的高度复杂性，研究一个或少数几个位 点来分析大脑的活动状态，已经显示出了很大的局限性。神经芯片正是出于这种 需求而产生，它提供了一种多位点、非损伤以及长时间持续记录胞外电信号的测 量方法。用芯片研究体外培养的神经元网络、脑组织切片以及将其植入大脑，构 成了一个由简单到复杂的全方位研究过程。利用芯片研究体外培养的神经元网络， 在简化的网络系统中了解神经元之间的相互作用，有助于探索神经元是如何联系 成一个整体来处理和储存信息的。例如，最近通过m e a 神经芯片的研究发现，作 为一种简化的神经网络结构，在学习记忆的研究中，似乎是上位神经元教会了下 位神经元，如何对外界刺激进行放电反应，这对整个认知神经科学的研究都有一 定的启示意义( s h a l l a fe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。而植入式研究神经元网络可以记录时间和空 间上的电信号变化，通过精确的定位，可以研究所在脑区的神经通路。而大脑组 织切片的研究也具有承上启下的作用，而且组织切片易于培养和维持，操作方便， 故在神经元网络研究中具有重要地位。 1 3 2 用于神经药理学研究 鉴于神经系统对于一些理化因素，特别是毒性物质非常敏感，人们正积极从 事这方面的研究，以开发其在药物筛选和军事化学武器探测领域的应用。这方面 的工作主要是观察离体培养在微阵列芯片上的神经细胞，对不同培养基成分的敏 感性，即细胞对物质或浓度的特异性产生的电生理 x 浙江大学博士学位论文 一性的电生理改变，而箭毒和a j d s 病毒g p l 2 0 蛋白则引起其它不同的神经元网络 变化( g r o s se ta 1 。1 9 9 5 ) 。同时，实验证明，采用神经元与神经胶质细胞共同培养 时，神经细胞具有较好的稳定性，使得体外培养的神经元网络成为一种能够可靠 使用的检测系统，可用于检测化学物质和显示化学物质的生物学特性。本论文所 开展的药物筛选和气昧检测研究，应该说都是神经芯片在本研究领域应用的不同 拓展。 1 3 3 用于脑的高级功能研究 在有关神经芯片用于脑的高级功能研究中，其中最为成功的研究实例便是我 国华东师范大学林龙年等开展的，在小鼠受到惊吓刺激的情况下，运用多通道在 体记录技术，同时记录小鼠海马结构中上百个神经元的活动，辨认出特定的神经 元单元( l i ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。该研究利用一种具有9 6 通道电极阵列的记录系统，将 其固定在小鼠脑内负责对位置和事件形成记忆的海马结构，同时记录到多达2 6 0 个神经元的电活动。采用多种不同的惊吓刺激，并控制刺激发生时的环境条件， 以便观察分析上述神经元在刺激中的活动状态。研究发现，海马的神经元网络中 存在着许多神经元，它们对惊吓刺激发生各种各样的放电反应，而每一种惊吓情 景的刺激，又在海马中产生不同的大脑活动模式。根据神经元的反应特征，可发 现它们按不同的活动模式，组成记忆的基本神经编码单元。这些编码单元被命名 为神经元簇( n e i l r a lc l i q u e s ) 。以各个编码单元的激活状态为依据，可将任何一种 惊吓经历转化成一串二进制数字。此种信息编码方式有可能是记忆过程中实时神 经编码的基础，为研究在神经元网络水平上解读记忆密码提供了一条途径。研究 者还进一步论证，由神经编码单元的激活模式所产生的大脑密码，有可能像遗传 密码一 x 第一章绪论 通过神经芯片这一中介，使受损的神经纤维重新形成连接。例如，色素性视网膜 炎，是其视网膜上能够感受光刺激的视锥和视杆神经细胞受到损坏，无法将光信 号转换成电位信号，从而导致大脑视皮层无法感受视觉信息。将芯片植入到视网 膜上，如果能用一个微型的高速、高分辨率照相机采集光信号，利用光电转化技 术将光信号转化成电信号并传给芯片，则可以引起视神经冲动，这样大脑视皮层 就能接收到视觉信息。同样，电子耳蜗则是通过一个电极阵列由耳蜗直接刺激昕 神经，通过传导路向大脑听觉中枢发放电信号，产生听觉反应。 1 4 本论文主要研究内容 本章已经详细介绍了神经芯片的研究背景，比较了目前研究较多的几种神经 芯片，并说明了我们的实验中所选用的l a p s 芯片技术。 第二章，简要介绍了神经元生物电信息传导的纂本过程，围绕嗅觉感受的分 子机制和信息的编码对其嗅觉生理进行了介绍，作为本文研究的生物学基础。 第三章，结合神经芯片对细胞选择与培养的要求，介绍了本论文所涉及的各 类细胞培养方法，并重点说明了小鼠胚胎干细胞体外诱导定向分化培养技术。 第四章，阐述了l a p s 神经芯片的器件设计和制各，以及相应测试系统的构 建方法。同时，对细胞测量培养腔和系统的培养环境也进行了相关介绍。 第五章，分析了干细胞芯片在药物筛选体外检测中的应用结果，对开展干细 胞来源的神经芯片进行了详细论述，同时也是对l a p s 神经芯片的验证。 第六章，对嗅觉芯片及其在体外气味检测中的应用结采进行了分析，证明这 种基于仿生设计的人工生物电子鼻在气味检测中具有良好的应用前景。 第七章，介绍了用于在体测量的m e a 微探针芯片电极阵列的设计与制备，并 在此基