（野生动植物保护与利用专业论文）白头叶猴（trachypithecus+leucocephalus）线粒体dna遗传多样性的研究.pdf

摘要 向头叶猴( t 1 e u c o c e p h a l u s ) 是仅分布在，、西南部崇左市境内部分喀斯特t ，山的_ i = | 界级的珍稀濒危灵k 类，2 0 0 2 年被世界动物保护组织列入2 5 种首要保护的灵i 王= 类z 一，但白头叶猴的生存状况令人担忧，需 加强对这一世界级动物的保护。要采取科学有效的保护措旖就必须对其遗传多祥陆进行科学可靠的评价。 但到目前为i ，国际和国内关于白头叶猴遗传多样性的研究一亩未见报道。本文采集了扶绥岜盆白然保护 区及崇左板利自然保护区白头时猴3 l 份样品( 米白九群至少9 个不同的个体) 。剥其中的9 个不同个体线 粒体d n a 控制区左端高变区的部分序列进行r 测定和群体分析，以评价当前向头叶猴的遗传多样性水甲， 进一步明确优先保护的群体。研究结果显示：( 1 ) 本文研究的白头州猴的9 份样品的m t d n ad 1 0 0 p 的k 度为3 9 6 b p ， 有1 5 个变异位点其中转换和颠换分别是1 3 个和1 个，另外还有1 个位点有三种碱基，核 甘酸多态性p 1 为o 叭1 6 7 。( 2 ) 9 条序列中共发现7 种单倍型。( 3 ) 本文研究的二个地理单元的向头n i 猴 种群中，九重山白头 叶猴具有较高的碱基差异数、摄高的核甘酸多样性和最高的核苛酸著异平均数。根据 上述结果，本文建议：( 1 ) 九重山白头叶猴种群数量较大，且该种群的遗传多样i + l - f 寓，冈此，从保护物 种基冈多态性的角度，建议将此种群列为晟优先保护的单元。( 2 ) 硼j 遵片平| | 并官j j i 片闩头州猴遗传多样性 i ：k j - l 重山片白头叶猴低，建议紧接着九重山种群的保护顺序予以保护。 芙键词：向头叶t 猴遗传多样性线粒体d n a 保护 a b s t r a e t t h ew h i t e h e a d e dl e a f m o n k e yi sar a r ep r i m a t es p e c i e so f o nt h ev e r g eo f e x t i n c t i o ni nt h ew o r l d ，1w h i c h l i v e so n l yi nt h ek a r s ts t o n ea r e a sw i t h i nc h o n g z u oc i t yi nt h es o u t ho fg u a n g x i i n2 0 0 2t h ew h i t e h e a d e dl e a f m o n k e yi s l i s t e do n eo f t h e2 5 t o pp r i o r i t yp r o t e c t i o np r i m a t es p e c i e sb yw o r l da n i m a l sp r o t e c t i o no r g a n i z a t i o n i no r d e rt os c i e n t i f i c a l l ya n de f f e c t i v e l yc o n s e r v et h i ss p e c i e s ，a n a l y z i n gi t sg e n e t i cd i v e r s i t yi sn e c e s s a r yb u tu p t ou o w ，t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo ft h ew h i t e h e a d e dl e a fm o n k e yi sn o tr e p o r t e di nc h i n aa n di nt h ew o r l d t h e 3 9 6 b ph y p e r v a r i a b l ec o n t r o lr e g i o ns e q u e n c ei nt h el e f to ft h em i t o c h o n d r i a l ( m t ) d n ag e n o m ef r o m3 1 s a m p l e s ( t h e r e a r e a tl e a s t9i n d i v i d u a l sf r o m9p o p u l a t i o n ) o fw h i t e h e a d e dl e a f m o n k e yw e r ec o l l e c t e df r o m c h o n g z u ob a n l in a t u r er e s e r v e ，f u s h u ib a p e nn a t u r er e s e r v eo f c h o n g z u oc i t y t h e9d i f f e r e n ti n d i v i d u a l so f t h e 31 s a m p l ew e r es e q u e n c e da n dp o p u l a t i o na n a l y s i sw a sc o n d u c t e dt oa s s e s st h el e v e lo fg e n e t i cd i v e r s i t yo f p r e s e n t t h er e s u l t ss h o w e d ：( 1 ) i nt h i ss t u d y ，t h el e n g t ho f t h ed l o o po f m t d n a g e n o m ef r o m9s a m p l e sw a s 3 9 6 b p l 5s i t e w e r ep o l y l n o r p h i ca m o n g t h e m ，t h es i t eo f t r a n s i t i o na n d t r a n s v e r s i o n w e r e l 3 a n d lr e s p e c t i v e l y t h e r ew a si s i t ew i t ht l u e eb a s ea n dn u c l e o t i d ed i v e r s i t yw a s 0 。0 1 1 6 7 ( 2 ) 7h a p l o t y p e sw e r ei d e n t i f i e d ! f r o m 攀 s e q u e n c e s ( 3 ) a m o n gt h ep o p u l a t i o no ft h r e eg e o g r a p h i c a lu n i to ft h ew h i t e h e a d e dl e a fm o n k e y ，t h ej c h s h g e o g r a p h i cr e g i o nh a v eh i g h e rn u m b e r so fb a s ed i f f e r e n c e s ，m o s th i g ho fn u c l e o t l d ed i v e r s i t ya n dm o s th i g ho f a v e r a g en u m b e ro f n o c l i o t i d ed i f l i ! r e n c e sb a s e do nt h e s er e s u l t s ，w es u g g e s ts o m ec o s e r v a t i o na n dm a n a g e m e n t m e a s u r e m e n t sn l u s tb e t a k e ot oe f f e c t ( 1 ) i nj i u c h o n g s h a nr e g i o n ，t h ep o p u l a t i o no ft h ew h i t e h e a d e dl e a f m o n k e yw a sr e l a t i v e l yl a r g e r a n dg e n e t i cd i v e r s i t yw a sa b u n d a n t t h e r e f o r e ，i nt e r mo fp r o t e c t i n gg e n e d i v e r s i t yo ft h i sp o p u l a t i o n w ep r o p o s ec l a s s i f y i n gi ta st h eu n i to fh i g hp r i o f i t yp r o t e c t i o n ( 2 ) t h ei g e n e t i c d i v e r s i t yo fb u z u t la n dl o n g g u a n s h a nw a sl o w e rt h a nj i u c h o n g s h a n s w ep r o p o s ea n dt h e nt h eo r d e ro f p r o t e c t i o no ft h e s ep o p u l a t i o na r ep r o t e c t e d k e y w o r d s ：t h ew h i t e h e a d e dl e a f m o n k e y g e n e t i cd i v e r s i t y m t d n ac o n s e r v a t i o n 2 第一部分文献综述 一、白头叶猴研究背景 ( 一) 分类：白头叫猴( r l e u c o c e ：p h a l u s ) 又称白鸟猿、鸟猿、白叶猴等，英文名为w h i t e h e a d e d l e a f m o n k e y ，属灵& e lf 火陆猴类疣猴砸科叶猴属动物”。 ( 二) 分布：仅分布在中国广西南部崇左市境内部分喀斯特石山地区( 包括卉岗国家级i = ：l 然保护区、 扶绥岜盆自然保护区和崇左板利自然保护r ) 图l 白头叶猴分布图( 冯永新，黄乘明等，待发表) ( 三) 形态：白头叶猴身体瘦长，成体体长约5 5 0 m m ，尾长约8 5 0 n m a ，体重约1 0 k g 。白头叶猴的头 顶有一描白色上翘的毛发，两朐为白色，尾部由黑色和白色两部分组成，两种颜色庄尾部i i i 的比例在个体 与个体问不同，或白多黑少或白少黑多，或黑白几乎相等或尾部背面与腹面黑f 1 不同。除尾部、两扁乖i 头部有白色毛发外，其余的毛发均为黑色。 ( 四) 生境：喀斯特石山上。 ( 五) 习性：白头叶猴为集群生活的灵长类，平均群大小为5 只，最小群3 只，最大耕1 8 只，猴群 为雄多雌制”1 。 ( 六) 意义：白头p j 猴是国家一级保护动物，也是世界级的珍稀濒危灵艮类，被w c m c 列为高度濒 物种【2 2 0 0 2 年被世界动物保护组织列入2 5 种首要保护的灵欧类之一【3 o ( 七) 向头叶猴种群数鼍：2 0 0 2 年底至2 0 0 3 年初种群调务表明白头丌1 猴共有7 2 群6 0 0 只。其中扶绥 4 2 群3 1 9 只，崇左3 0 群2 5 t 只，弄岗保护区8 群6 8 只。猎杀可能是引起白头nj 猴种群数量p 降或增长缓 慢的主要原因。此步 ，频繁的人为活动和强烈的干扰对白头日t 猴的繁殖产生了明显的影响”。 = 、白头川猴研究现状 1 白头i i i 猴是为我国的一级保护动物，最早于1 9 5 5 年由谭邦杰描述记录，定名花叶猴( p r e s b y t i s l e u c o c e p h a l l u s ) ( 4 o 随后同绕着白头叶猴的分类地位出现了争论，争论的焦点为白头叶猴是一个独立的种，还是 黑猴的一个皿种。白头叶猴的分类是有争议的，争论的焦点为白头叶猴是一个独立的种，还是黑叶猴的 一个弧种。李致祥等( 1 9 8 0 ) 认为白头叫猴是黑时猴的一个亚种李汉华等( 1 9 8 2 ) 把白头口| _ 猴的形态解剖和 分布与黑叶猴进行比较，也认为白头叶猴是黑叶猴的一个亚种“。除谭邦杰认定白头叶猴是一个年中外饿 e u d e y a ( 1 9 8 7 ) 提山越米越多的证据证明白头叶猴具有种的地位n 卢立仁等( 1 9 9 1 ) 根据其起源演化和形 态特征认为向头时猴与掣时猴至少是姐妹种”。王文等( 1 9 9 7 ) 用线粒体的d n an d 3 - n d 4 基因区系列对白 头n 1 猴和黑叶猴进行了研究，结果表明白头叶猴与黑叶猴的分歧还不足以将其独立为一个种，但在保护行 动中，麻视为一个进化显著性单元( e v o l u t i o ns i g n i f i c a n tu n i t ) 9 1 。 白头叫猴的室内繁殖是向头叫猴研究中的一个重要的部分，南宁动物园在1 9 8 2 年成功进行了宝内繁 殖，赖月梅( 1 9 8 7 ) e 道了室内状态r 向头n l 猴的生活习性，饲养繁殖”o t ，随后人们将白头叶猴与黑口| _ 猴进 行杂交并获得成功 ，胡艳玲等( 2 0 0 4 ) 在广西南宁动物园用白头叶猴和黑叶猴的杂交后代进行回交成功 i t2 1 。 闩头叶猴野外的研究是开展这一珍稀动物保护的重要组成部分之一。最早的野外研究报道是对白头叶 猴生活习性和栖息地的报道”：吴名j | 1 ( 1 9 8 3 ) 对、西境内的灵长类作了数量统计报道，认为白头叶猴的数 鹫约1 0 0 0 只：汀癣声( 1 9 9 1 ) 也对向头舛猴的生活习性和分布作了报道1 4 】f 李兆元( 1 9 9 2 ) 对白头叶 猴的活动时间分配进行了研究”1 ；近，l 年来在国家自然科学基金的资助下，卢立仁等利黄乘明等( 1 9 9 皆 1 9 9 3 a ，1 9 9 3 b ，1 9 9 5 a ，1 9 9 5 b ) 对白头叶猴年龄结构、出洞入洞行为、婚配制度、白头叶猴对夜宿石洞的 选扦等做r 研究”。 有关白头叶猴研究成果的专著到目前为止只有一本中国白头叶猴对白头叶猴的生态学，行为学有 比较全面和深入的研究。但白头叶猴遗传学方面的资料未见报道。 三、遗传多样性概论 ( 一) 遗传多样性禽义 j 。义的遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 是指地球上所有生物的遗传信息的总和【。但通常所说的遗传 多样性是指种内基冈的变化，即同一物种内不同群体之间或同一群体内不同个体间的遗传变异”】，也称为 丛冈多样性。各利，生物的不同亚种域地方品种中都存在着丰富的遗传多样性。 遗传多样性是，眦目民期进化积累的缶与果，也是生物进化的物质基础。通常，遗传多样性最膏接的表现 形式就是个体遗传变异水平的高低。然而，遗传多样性不仅包括个体遗传变异水平的离低，也包括群体绺 遗传结构。 d 群体遗传结构( p o p u l a t i o ng e n e n t i cs t r u c t u r e ) 是指一个种内总的遗传变异群度及其在群体间的分布模 式，是一个种最基础的遗传信息。群体的地理分布型在很大程度上决定了群体的遗传分化式样，如连续分 布型( 或随机交配型，p a n m i c t i cm o d e l ) c p ，个体在生境一致的地区内均匀分布，个体问随机交配，遗传 分化不显著；岛屿删( i s l a n d m o d e l s ) 中群体是由彼此孤立且不连续的f 群构成，各弧群问基因频率早跳跃式 变化。；距离隔离型( 或阶梯型i s o l a t i o n b y d i s t a n c eo rs t e p p i n g s t o n em o d e l ) “0 群体是由一系列连续的弧群构 成，亚群内的个体随机交配而群闻的个体只与地理分布相近的个体发生遗传物质的交换其基冈频率。 连续变化 ”1 。对一个物种来说，其遗传多样性的丰富程度决定了该物种对环境变化的适廊能力和进化滞力。 ( 二) 研究遗传多样性的意义 首先，物种缄群体的遗传多样性是长期进化的产物，也是其生存发展的基础。遗传多样性的存冉：是选 择和突变动态平衡的结果，经过选择后保留下来的并非都是对个体有利的9 l 。遗传多样性变异越丰寓，物 种对环境变化的适应能力越强，越容易扩展其分布范围，进化潜力越人m 1 ，从而有助j j 保护物种和整个生 态系统的多样性，减慢由于适应和进化所导致的灭绝过程。因此对遗传多样性进行研究，可以揭示物种 或群体的进化历史( 起源的时间、地点和方式) ，也能为进一步分析其进化潜力利未来命运提供重要的资 料，尤其有助于对物种稀有或濒危原因及过程的探讨m 1 。 其次，遗传多样性是保护生物学研究的核心内容之一。在物种保护中，尤其是濒危物种保护科学的 保护对策必须考虑尽可能多地保护物种的遗传多样性。只有保护物种的进化潲力，才能真止达到保护物种 ” 的耳_ 自勺，而遗传多样性则是物种具有进化潜力的物质基础。同时，对物种遗传多样性的分析，可为濒危程 度较高的小种群物种的遗传质量的提高和种群数量的恢复提供科学、准确的理沦依据。 再者，d n a 分子水平的遗传多样性研究为正确确定生物保护中的基本单元一进化显著单元 ( e v o l u t i o n a r i l ys i g n i f i c a n tu n i t s ，e s u s ) 2 02 1 1 和管理单元( m a n a g e m e n tu n i t s ，m u s ) 提供了最赢接的依 据2 “。m o r i 乜( 1 9 9 4 ) e s u s 定义为，在线粒体基因绢d n a 水平上为严格的单系群( m o n o p h y l e t i cg r o u p ) ，同 时，在核基因组等位基因频率上应有显著著异的群体，即为不同的e s u s 9 。2 1 e s u s 为系统学上的概念， 将因进化历史事件而形成差异的群体区别开，它注重的是睦期管理。而m u s 代表群体统计学上独立的群体， 通常由等位基因频率定义，侧重于短期管理。 ( 三) 遗传多样一陛的研究方法 1 、遗传多样性的检测方法 随着生物学尤其是遗传学和分子生物学的发展，遗传多样性的检测方法从形态。亨水平、细胞学( 染色体) 水平- 、蛋白质( 等位酶) 水平到d n a 水平，逐渐深入发展年完善。 生物的遗传信息就储存于d n a 分子中，d n a 碱基序列的变化导致生物的形态、细胞、生理、生化等 各方面发生变异，也决定了生物的生态特性。因此，直接对d n a 碱基序列进行分析和比较是揭示遗传多 e 样性最理想的方法。它具有许多优点：d n a 仅由4 种碱基( g 、a 、t 、c ) 组成，其序列上的异同易于比 较分析：d n a 序列含有丰富的进化信息，有些物种的基因组中具有多于1 0 “个碱基对；在一定范周内， d n a 序列变异的积累与时间成正相关：d n a 水平上的遗传变异最丰富2 ”。闻此，d n a 序列比较分析法已 成为遗传多样性 i i j = 究中最重要的方法之一。 但是，要想基于个体水平对每一物种进行d n a 的全序列测定分析在目前还是不太现实的。目前的d n a 序列分析主要是对部分d n a 序列进行研究和分析。从d n a 水平上分析物种遗传多样性的方法已有很多， 义可分为间接分析法利直接测序分析法。间接法是通过d n a 片段的长度多态性来分析的，包括r f l p s 、 d f p 、r a p d 、a f l p 、微卫星d n a 和s a p 等。 限制性片段k 度多态 峰( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p s ) 趋8 0 年代初发展起来的第 一代分子标记技术，是根据特定限制性 _ i 4 切酶所识别的酶切位点是否存在而确定。冈为每一种酶只识别专 一的碱基序列，识喇位点上碱基的替换( 突变) 、d n a 片段上一个或多个碱基的缺失或插入以及重组等d n a 序列的变化就会导致限制性酶切位点的减少或增加，限制性片段的长度发生变化从而显示多样性。操作包 括三人步骤：靶d n a 的制备，包括限制性内切酶酶解基因组d n a 和s o u t h e r n 转移；核酸的标记；探针杂 交显示。r f l p 具有如f 优点，即( j = ) r f l p 标记无表型效应，其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响； 等位基因间是共显性的，非等仿基因间不存在上位效应，互不干扰：( 要) r f l p 起源于基因组d n a 的白然 变异，这些变异袍一数量上几乎不受限制，可以选取足够数量能代表整个基因组的r f l p 标记。但是，该方 法不能检测出限制性内切酶酶切后相同长度d n a 片段内的碱基变异，还必须使用高质量基因组d n a ，而 且川量很大。对野生动物获得大量的高质量d n a 是十分困难的。许多材料，如毛发、分泌物、粪便或腐 败的材料就不能适川此方法。：另外，r f l p 的周期长、费时、费力，并使用放射性同位素对人体健康危害 较火。 真核生物的线粒件d n a 是一类环状的简单d n a ，其碱基数较少，只有1 6 k b 左右，当川限制性核酸 内切酶酶解后可直接电泳检测酶解片段的多态性，不必经过复杂的转移和杂交；而真核生物的基因组 d n a 分子很大，当t 【 j 限制性内切酶酶切时，会产生很多的d n a 片段；且其大小几乎是连续的。这些d n a ： 片段经过凝胶1 b 泳早连续分布，根本无法进行分析比较。 r f l p 技术 要在动植物遗传多样性、基冈作图、连锁分析、系统发育等方面得到了j “泛廊_ l | j 。 d n a 指纹( d n af i n g e r p r i n t ，d f p ) 技术始丁8 0 年代基冈组小卫星和微卫星d n a 的发现。其原理及操 f 1 。，r f l p 标记相问，只是采川高拷贝的小甲星d n a 、微卫昂d n a 的核心序列为探针一次检测众多的 小m 厦或微：p 星位点。冈基冈纲内小卫星d n a 和微卫星d n a 存在广泛的多态性，因此，杂交产生的d n a 幽带具有高度变异性汞1 个体特异性，就象人的指纹一样，特称为d n a 指纹图2 ”。d n a 指纹具有两个显著 特点：多点性：d n a 指纹i 到谱中每一个条带代表一个位点，其位点广泛分布于整个基冈组中，一个d n a 6 指纹探针一次能同时检测十几个至二十几个位点的变异。高变异性：d n a 指纹变异主要表现在多个u _ 分辨的条带数和单个条带在群体中的低频率出现。d n a 指纹所检测的位点是基冈翔中有根高变异的仿点， 由多个这种位点上的基因所组成的图谱就具有更高的变异性。它的缺陷与r f l p 的相似。 d n a 指纹图目前主要用于遗传多样性分析、个体识别、亲缘关系鉴定、系谱分析、遗传幽谱构建及 开发位点高度变异的小卫星和微卫星探针等。 随机扩增多态d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 技术是1 9 9 0 年由w i l l i a m s 和 w e l s h 两个研究小组同时发展起来的一项d n a 多态检测技术。r a p d 是一砷以1 0 b p 左矗的隧机短寡核茁 酸为单引物，对所研究物种的基闪组d n a 进行p c r 反应，产生2 0 0 2 0 0 0b p 的d n a 片段，经电泳分离 可检测d n a 的多态性。与r f l p 相比，r a p d 具有以f 优越r 胜：( 1 ) 无须知道受试材料基闻组d n a 序 列的信息；( 2 ) d n a 剧量少，灵敏度高：( 3 ) r a p d 不需要使心同位素，安全性好；( 4 ) r a p d 引物没有 种属界限具有j 泛性、通用性，人大降低了研究费用；( 5 ) 操作过科不需要进行s o u t h e r n 转移、分子 杂交等，因此简便、快速等。r a p d 也有其缺点：r a p d 标记为显件标记，不能判断检测到的多态d n a 片段为纯合子还是杂合子，不能提供完整冉勺信息；r a p d 所剧的引物序列是随机的，因此，榆测到的基冈 组位点也不清楚：r a p d 受条件影响很大，对设备、条件及揲作的要求都很严格；加之退火温度较低，稳 定性和重复性较差【2 4 1 2 5 1 。 目前，r a p d 标记在生物学的许多领域都得到了广泛的庵用，如物种遗传多样性的分析、遗传图谱构 建、基因定能秆i 克隆、外源导入基因的跟踪、物种系统发育关系研究、品科，鉴定等。 扩增酶切片段多态+ ( a m p l i f i e d f r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 是1 9 9 2 年由荷兰利学家z a b e a u 和v o s 发展起来的一种检测d n a 多态性的新方法。与r f l p 类似，a f l p 也是通过限制性内切酶片段 的不同k 度米检测d n a 多态性的一种d n a 分子标记技术。其基本原理是，对基冈组d n a 的内切酶酶切 片段相连接作为扩增反应的模板。如果不同的样揣d n a 碱基发生插入、缺火缄酶切位点的改变等，通过 内切酶的切割就会产生不同人小的片段。这些不同大小的片段再通过与接头的连接，经p c r 扩增，从而可 以表现出扩增片段的长度多态性。优点：a f l p 只需极少量的d n a 材料：不需要预先知道d n a 的顺序信 息；实验结果稳定可靠；a f l p 产物呈典型的孟德尔方式遗传；不需要s o u n h e m 杂交，方便快速。缺点： a f l p 要求高质茸的d n a ；费用昂贵：实验涉及面广，要求技术比较全而，对操作人员素质要求也高。 a f l p 技术的应用领域与r f l p 和r a p d 的基本相同。 微卫星( m i e r o s a t e l l i t e ) d n a 技术是重复序列分析法中的一种，九十年代才兴起，主要以p c r 技术为核 心，以扩增和检测基因组中微卫星区域的短串联重复序歹u ( s h o r tt a n d e mr e p e a t s s t r ；i n t e r s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，i s s r ；s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，s s r ) 蔓j 目标，通过检验重复单位的重复次数的著异米显 示个体间的遗传差别，分析遗传多样性。与其它分子标记相比，它具有以下突出特点：共显性的遗传标 记；丰富的多态性：重复性雨l 稳定性好。只要能够得到微量甚至高度降解的d n a 就可以成功地分 析，方便采样。检测结果可以进行数字编码，不同批次的结果间可以进行比较分析。缺点是要大量筛选 引物，复台扩增比较凼难。 微卫星d n a 在动植物遗传变异检测、确定品种( 品系) 的遗传分化、基因定位、目标基冈早期鉴定 利遗传幽谱构建笛多个方面得到廊川。 特异性扩增艮度多态瞄i ( s p e c i f i ca m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，s a p ) ，又称为序列特异性扩增区( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z a la m p l i f i e dr e g i o n ，s c a r ) ，是1 9 9 3 年，p a r a n 和m i c h e l m o r e 建立的一种可靠的、稳定的标记 技术，它是在r a p d ( 或r f l p ) 分析中选取特异的d n a 片段后，将该片段测序，依据片段两端的d n a 序列，重新设计戳引物进行常规特异性p c r 扩增，得到的s c a r 在不同个体间可能表现为存在缺s k ：，为 显性标l 己，也可能表现为扩增片段跃度的差异，为共显性标记。s a p 的优点是可以解决r a p d 中稳定性和 重复性差、p c r 扩增片段多使结果分析困难的缺点 2 7 _ 2 ”。 s a p 技术目前麻用于遗传多样性检测、基因定位、外源导入基因的跟踪、物种( 品种) 鉴定、系统嚣 育研究等。 直接测序( d i r e c ts e q u e n c i n g ) 分析法主要是利用通用引物( 或特异引物) 对一些特定基因或d n a 片 段进行p c r 扩增( 域是直接克隆) ，然后直接测定目的d n a 的核苷酸序列，并运用软件包进行电脑分析，。 直接考察核营酸的变异，可以直接计算种间或种内的遗传差异。该技术克服了传统的d n a 样品制备、分 析的周限能够快速获得大量个体的同源d n a 序列数据而不必通过核酸杂交、r f l p 分析等技术来间接估 汁遗传差异。尤其是，d n a 自动测序技术的出现，使操作更简单、安全、快速，且一次可处理大批样品。 口前，陔技术泛麻j hr 遗传图谱、遗传多样性检测、系统发育研究、个体识别、物种( 品种) 鉴定、物 种起源等。 2 、遗传多样性的度鼙方法 ( t ) 多态序f t 自分率( p e r c e n to fp o l y m o r h i cl o c i ) p ，是表示群体遗传变异程度的一个参数鹏。 一般地，当一个库位上最常见的等位基因的频率小 二或等于0 9 9 时，该座位就称为多态座位( p 0 1 y 珊o r p h 照 l o c u s ) 。所研究座位中，属丁多态座何的数日0 ) 除以座位总数( n ) 的卣分率即为多态座位白分率：p = p n 1 0 0 ； ( 2 ) 等伉基j 川数( n u l n b e ro fa l l e l e s ) n 比p 对遗传多样性的评价更为数督化。对丁- 两个座位，哪 个座位的等位基冈数多则该座位具有更火的遗传多样性【3 0 】。 ( 3 ) 杂台皮( h e t e r o z y g o s i t y ) h 和平均杂台度h 。这是对等位基因频率敏感的指标。3 “。对于随机交 配的自然群体，若某座位上有m 个等位基因，第1 个等位基因频率为x ，则该座位的杂台度定义为 h = 1 - - - x 9 2 平均杂合度h 为所有研究库何上杂合度( h ) 总羽i 的算术平均值。n e i ( 1 9 7 3 ) 称h 为基耳i 多样度( g e n ed i v e r g e n c e ) 或基因多样性( g e n ed i v e r s i t y ) ，并将1 一h 称为基冈一致度( g e n ei d e n t i t y ) 。 ( 4 ) 核苷酸差异平均数( a v e r a g en u m b e ro fn u c l e o t i d ed i f f e r e n c e s ) k ，牲庠何或任伺定义的d n a 区 域水平，限制性山切酶的切点和d n a 序列数据都可得到该值。该值越高，遗传多样性水平越高 3 “3 1 1 。 ( 5 ) 分离切点数( n u m b e ro fs e g r e g a t i n gs i t e s ) s ，是所研究群体中有关d n a 区域上 多态性的限制 酶切点或核苷酸的数目【3 0 】。 ( 6 ) 等位基因树( a l l e l eo r h a p l o t y p e t r e e ) ，反映了等位基因问的进化关系，综合了遗传多样性和系统 发育信息【3 0 l 。 ( 7 ) 遗传距离( g e n e t i cd l s t a n c e ) 是将两个群体间的遗传筹异_ l = j 单个数值表示吲，是衡量群体间分化程 度和遗传著异火小的重要数量指标。目前，遗传距离的表示方式有很多，如s n e a t h 遗传相似指数一一 t j u i c e s c a n t o r 距离、k i m u r a 距离等，但n e i 的遗传距离应用比较广泛。 在单瘴位时，n e i ( 1 9 7 2 ) 遗传相似指数眇3 4 1 ( n e i ss i m i l a r i t yi n d e x ) l 。 n - - e ( p 崩g t 巧) ( p 2 ( 巧2 ) ：g e e ，p 、。和q 。分别是群体x 和群体y 中第个座位上第个等位基因的频率。 当两个群体内同一等位基因具有相同的频率时，不论该座何是否多态，i n = 1 ，若两个群体没柯等位基 4 因，则i n = o 。 多座位时n e i 遗传相似指数： 加= ，p 巧 ( ，p z 。j ) ( z ；，g 毛) 必 1 9 7 8 年，n e i “1 用偏差进行校正后为： 如： 一1 ) ，p ：, i z ，国，西一1 ) z ；( 砭，磊一形 标准标准遗传距离d 为： d = 一i n ( i n ) 当i n 接近l 时，d 接近1 - i n ：当i n o 时d 高到难以置信的程度，为纠止这个缺陷，n e i 义提出了最 小遗传距离d “。的估计公式： = ( 1 一勘鳓) 一y 2 医( 1 面) + ( 1 一西) 对于序列之间的遗传距离，由j = _ 多重替换的影响，很难直接从己对准的序列中计算出真正的遗传距离，所 以有很多校正方法，k i m u r a 双参数法8 3 5 。3 0 是其中之一。在k i m u r a 双参数法中，假设转换和颠换以不园i 的述率发生：4 种碱基组成比例相同；序列上各位点的替换速率相同。则k i m u r a 的遗传距离估计值公式为： d = 一必1 n ( 1 2 p g ) 乒面 2 k t p = 坼 q = 以 咒= m + 坼+ 骗 k = p + 2 q 其中，p 为序列中发生的转换频率，q 为序列中发生的颠换频率；n 为比较序列的总位点数；u 。为序 列中发生转换的位点数，u 。为序歹0 中发生颠换的位点数：m 为序列中具有相同残基的位点数，k 为碱基替 换帆总频率，t 为两个序列的分歧时间。 3 、d n a 测序技术的研究进展及现状 1 9 5 3 年，w a t s o n 承jc r i c k 提出了d n a 双螺旋结构模型。此后，人们就开始探索研究d n a 一级结构 的方法。由于没有发现分别降解4 种脱氧核糖核酸( a 、g 、c 、t ) 的专一酶，当时人们只能通过测定r n 氏 的序列来推测d n a 的序列m 1 。1 9 6 5 年h o l e yj l _ j 经典方法测出酵母丙氢酸t r n a 的7 5 个核营酸顺序，同 年，英国s a n g e r 提i ir 测定小、证基r r n a 序列的指纹图谱法”1 。1 9 7 5 年，s a n g e r 又提出了测定d n a 序列 的加减法。 1 9 7 7 年，美国的m a x a m 和g i l b e r t 发明了化学降解法+ 又称m g 法i “。此方法的原理是：将模板 d n a 的一端标记，在4 组或5 组互为独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每- e f t 反应特异地针对 某一种或某一类碱基。这儿组反应中通过化学裂解形成的放射性标记的分子具有共同起点，即放射性标记 未端，而其终点( 发生化学降解的位点) 不同。每组混合物中含有长短不一的d n a 分子，其长度嚷决于 该绸反廊所针列的碱丛在待测d n a 全k 片段位置。最后，将各组反应产物进行序列胶高压电压分离，再 通过放射白显影显示序列结果。该法的缺点是费时、使用危险化学药品以及测定的序列较短，但其独真鬻 特点是可咀探测d n a 构象和蛋白质d n a 相互作用。 同年s a n g e r 建立了戏脱氧核苷酸( d d n t p ) 终止法测序川。该法是片j 酶法降解d n a ，它是将模板d n a o 在体外复制成分别终1 r 于a 、c 、g 、t 四种基本核营酸的d n a 片段。由j j 取脱氧核i _ 1 ：酸( d d n t p ) 缺乏 3 - o h 基，它的参入使d n a 链不能形成f 一个磷酸二二酯键，因此d n a 链的合成终j h 这样，可以设计4 个反应，每个反应中含有相同的d n a 模板、引物、4 种d n t p ( 即d a t pd g t pd c t p 利d t t p ) , i i 一种 d d n t p ( d d a t p 或d d g t p 或d d c t p 或d d t t p ) ，加入d n a 聚台酶在一定条什r 便沿模扳从5 向来3 、移动。 通过控制d n t p 和d d n t p 的比例，就可得到不同长度的、终l r 点相同的4 组d n a 新链。川放射性同仿素 标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射白显影显示序列结果，后来m e s s i n g 等统建了一系列的噬凶体m 1 3 2 载体系统，为d d n t p 链终止法提供了天然模板和万能引物，使该法成为d n a 测序的最好方法。但当时， 该法采用克隆测序、放射性同位素标记，手 ：进行序列分析，操作相当繁琐、耗时。1 9 8 3 年p c r 技术山 现后，迅速应用于d n a 测序，即p c r 产物直接测序，尤其是荧光染利标记法利d n a 自动测序技术的山 现，使操作更简单、安全、快速，且一次可处理大批样品。该技术通过p c r 扩增目的d n a ，j - t 4 色荧光 染料代替放射性同位素标记，高分辨率的变性p a g e 分离，信息商接送计算机处理。它克服了传统的d n a 样品制备、分析的局限，能够快速获得大量个体的同源d n a 序列数据，井利川计算机通过相关软什进行 序列分析，赢接计算种间或种内的遗传差异。这是目前广泛廊_ l = | j 的成熟的d n a 测序力珐m 。 近年来，又出现了毛细管凝胶电泳、阵列毛细管电泳、超薄层凝胶电泳等新方法，使分离和检测核茁 酸片段更加快速准确，灵敏度极高，易于实现自动化。另外，还出现了利州分析仪器i l 接检洲d n a 序列 的方法，其原理与上述方法完全不同，它利州尖端仪器如质谱仪、扫描隧道显微镜、原于力显微镜等直接 扫描和观测d n a 一级结构，是未来发展的另一类d n a 快速测序方法，但目前还在探索中【”】。 四、动物线粒体d n a 的遗传多样性 ( 一) 脊椎动物线粒体基因组的特点 线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器，是细胞进行氯化磷酸化的场所。 线粒体白身的遗传物质即线粒体基冈组被称为真核细胞的第二遗传信息系统，或核外摹冈及表达系统( 还 包括月i 绿体基冈组) ，是8 0 年代以米分子生物学研究的热点之一。高等动物线粒体基冈绸具有如r 特点： l 、据目前的线粒体基冈组全序列测定表明，脊椎动物线粒体d n a 是共价| ! j 1 合的环状般链d n a 分 子大小为1 5 1 8 k b ，绝火多数为1 6 5 k b 左右。根据碱基氯化铯密度梯度离心中戕链密度不同分为重链( h 链) 和轻链( l 链) ，由1 3 个编码蛋白质的基因、2 个r r n a 基冈、2 2 个t r n a 基冈、控制| ；互( d 环匿) 和轻链复制起始区组成。编码的1 3 个蛋白质多肽包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的基：细胞色 素b ( c y t b ) 、2 个a t p 酶的基、3 个细胞色素c ( c ”c ) 氧化酶的弧基( c o i 、c o i i 干c o i i i ) 和7 个n a d h 还原酶复合体的亚基( n d i 、n d 2 、n d 3 、n d 4 、n d 4 l 、n d 5 利n d 6 ) 。除一个蛋白质基冈( n d 6 ) 利8 个t r n a 基因由l 链编码外，其余的人部分基因都由h 链编码“2 “”。线粒体组成结构地剀1 - 1 【4 4 】。 2 、线粒体各基因间排列紧密，非编码序l j u 4 , 。脊椎动物中，基冈排列的顺序基本一致( 只在有袋类 l l 和呜类中有微小变化) 。基因内不含内含子，碱基的使用节约、高效i ”1 。 3 、线粒体d n a 厂泛存在于动物各种组织细胞中，每个细胞中有1 0 0 0 - 一1 0 0 0 0 个拷贝f 4 5 - 4 8 ，易于分离 和纯化。 4 、早严格的僻系遗传方式，无重组及其它遗传重排现象。便于进行群体分析，只需少量材料就能反 映群体的遗传结构。 5 、进化速度快，线粒体基网的碱基替代率( s u b s t i t u t i o nr a t e ) 是单拷贝核基因的s l o 倍 4 5 4 8 1 ，所以 线粒体d n a 一直是系统进化上一种很好的分子标记。 冈为d n a 序列可以提供半富的有关群体遗传结构方面的信息，而迅速进化的线粒体d n a 是检 测种内和种问进化关系和遗传变异的有价值的分子2 2 “5 。”1 ，所以野生动物研究者很重视对物种线粒体 d n a 的测序研究。 国外对线粒体d n a 的序列研究起步较早，1 9 8 1 年测定了人线粒体基因组的全部序列【5 8 j l l d , 家鼠( m u s n m s c u l u s ) 5 9 1 ，1 9 8 2 年完成了牛线粒体d n a 的全部序列测定 6 0 l 。1 9 8 3 年p c r 技术出现之后，至冷已有 3 0