（营养与食品卫生学专业论文）膳食色氨酸对小鼠摄食的影响.pdf

摘要 | | i i ii if lr ll lf ll i ll lu i 18 8 9 5 9 6 为了研究膳食中不同色氨酸水平对摄食量的影响及可能机理。选用8 0 只清 洁级三周龄雄性昆明小鼠随机分为四组( t r p l 2 组、t r p l 6 组、m 2 0 组、t r p 2 4 组) ，分别饲喂4 种不同色氨酸水平的饲料( 每千克饲料中分别含1 2 9 、1 6 9 、 2 og 、2 4g 色氨酸) ，2 8d 后记录小鼠摄食量、体重、h p l c 检测血浆中游离色 氨酸含量、e l i s a 试剂盒检测下丘脑5 - h t 含量。2 4 只清洁级三周龄雄性昆明 小鼠随机分为3 组( c o n t r o l 组、b c a a 组、t r p 组) ，分别每天注射生理盐水、 3 0 0m g k g w 剂量的b c a a ( 支链氨基酸) 溶液、1 0 0m g l ( g w 剂量的t r p ( 色 氨酸) 溶液，7d 后，记录小鼠的摄食量，e l i s a 试剂盒检测小鼠下丘脑5 - h t 和g a b a 含量，相对定量p c r 检测下丘脑和胃组织中g h r e l i n 、5 - h t l a r 、 5 h t l b r 、5 - h t l d r 、5 一h t 3 r 的基因表达。 实验结果：( 1 ) 随着日粮中色氨酸水平增加，小鼠血浆中t r p 水平、t r p b c a a 比值也增加，下丘脑中5 - h t 含量也随之提高，而小鼠摄食量降低。( 2 ) 小鼠腹 腔注射b c a a 溶液7d 后，小鼠下丘脑5 - h t 含量显著低于正常组，而g a b a 含 量、g h r e l i n 基因相对表达量则高于正常组( p 0 0 5 ) ；而小鼠腹腔注射色氨酸溶 液7d 后，小鼠下丘脑5 - h t 含量显著高于正常组，而g a b a 含量、g h r e l i n 基因 相对表达量则低于正常组( 尸 o 0 5 ) 。且下丘脑中g a b a 含量、g h r e l i n 基因相对 表达量与下丘脑5 - h t 含量显著负相关( 尸 o 0 5 ) 。( 3 ) 小鼠腹腔注射色氨酸、 b c a a 溶液7d 后，下丘脑中g a b a 含量与下丘脑5 - h t l b r 、5 h t l d r 基因的 相对表达量极显著负相关( p o 0 1 ) ，与5 - h t l a r 基因的相对表达量显著负相关 ( 尸 o 0 5 ) ，其中与5 h t l d r 基因的相对表达量相关性最大；下丘脑g h r e l i n 基因 的相对表达量5 与h t l a r 、5 h t l b r 、5 h t l d r 基因的相对表达量极显著负相 关( 氏o 0 1 ) ，而5 - h t 3 r 基因相对表达量无显著差异。胃组织g h r e l i n 基因的相 对表达量与5 - h t l a r 基因的相对表达量极显著负相关( 氏o 0 1 ) ，与胃组织 5 - h t l b r 基因的相对表达量显著负相关( p 0 0 5 ) ，而5 - h t l d r 、5 h i 3 r 基因相 对表达量无显著差异。 结果表明：( 1 ) 提高膳食中色氨酸水平，可增加小鼠血浆中游离t r p 浓度和 t r p b c a a 比值，提高小鼠下丘脑中5 - h t 的生物合成，进而抑制摄食。( 2 ) 通 过补充和耗竭脑内的色氨酸，可以改变下丘脑5 - h t 含量，5 - h t 含量的变化影响 下丘脑中g a b a 含量、g h r e l i n 基因表达量。说明，5 - h t 抑制摄食的路径中，有 g a b a 和g h r e l i n 的参与。( 3 ) 5 - h t 抑制摄食的路径中下丘脑5 - h t 与下丘脑 g a b a 、g h r e l i n 的相互作用，有5 - h t i a r 、5 - h t i o r 、5 - h t m r 的参与。而胃组 织5 - h t 与胃组织g l l r e l i i l 的相互作用，有5 h t l a r 、5 - h t l b r 的参与。 关键词：色氨酸；支链氨基酸；5 羟色胺；7 - 氨基丁酸；生长素 d i e t ) a f t e r2 8d a y s ，t h ef o o di n t a k ew a sr e c o r d e d ，f r e et r y p t o p h a ni np l a s m aw a s d e t e c t e db yh p l c ，a n dh y p o t h a l a m i c5 - h tc o n t e n tw a sm e a s u r e db ye l i s ak i t t w e n t yf o u r m a l ek u n m i n gm i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o3g r o u p s ( c o n t r o l g r o u p ，b c a ag r o u p ，t r pg r o u p ) ，a n dw e r ei n t r a p e r i t o n e a li n j e c t e ds a l i n e ， 3 0 0 m g k g wb c a aa n d10 0 m g k g 。wt r y p t o p h a nr e s p e c t i v e l y a f t e r7d a y s ，t h ef o o d i n t a k ew a sr e c o r d e d h y p o t h a l a r n i c5 一h ta n dg a b ac o n t e n tw a sm e a s u r e db ye l i s a k i t ，h y p o t h a l a m i cg a s t r i cg h r e l i n , 5 一h t la r5 - h t m r , 5 - h t id r , 5 - h 1 3 rg e n e e x p r e s s i o nw a sm e a s u r e db yr e l a t i v eq u a n t i t a t i v ep c r t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：( 1 ) w i t ht h ei n c r e a s eo fd i e t a r yt r y p t o p h a n , t h e p l a s m at r p ，t r p b c a ar a t i o na n dh y p o t h a l a m i c5 - h t c o n t e n ti n c r e a s e d ，b u tt h ef o o d i n t a k ed e c r e a s e d ( 2 ) a f t e r7d a y sb c a a i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n ，t h eh y p o t h a l a m i c 5 - h tc o n t e n to fm i c e w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a nc o n t r o l g r o u p ，b u tt h e h y p o t h a l a m i cg a b ac o n t e n t ，o h r e l i ng e n ee x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n c o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) a f t e r7d a y st r pi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n ，t h eh y p o t h a l a m i c 5 - h tc o n t e n to fm i c ew a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nc o n t r o l g r o u p ，b u t t h e h y p o t h a l a m i cg a b ac o n t e n t ，g h r e l i ng e n ee x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a n c o n t r o lg r o u p ( 尸 o 0 5 ) ( 3 ) a f t e r7d a y st r pa n db c a ai n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n ， t h eh y p o t h a l a m i cg a b ac o n t e n tw a se x t r e m e l ys i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d w i t h5 一h t l b r 、 5 - h t j d rg e n ee x p r e s s i o n 伊 o 0 1 ) ，w a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l y c o r r e l a t e d 谢m5 - h t l a rg e n ee x p r e s s i o n ( p 0 0 5 ) ，w h i c hw a s m o s tr e l e v a n t 谢t ht h e 5 一h t ld rg e n ee x p r e s s i o n t h eh y p o t h a l a m i cg h r e l i ng e n ee x p r e s s i o nw a se x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dw i t h5 - h t l a r5 - h t l b r ，5 - h t l d rg e n ee x p r e s s i o n ( 尸 0 01 ) w h i l et h e5 - h t 3 rg e n ee x p r e s s i o nw a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e t h eg a s t r i c g h r e l i ng e n ee x p r e s s i o nw a se x t r e m e l ys i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d 、i t l l 5 - h t i a rg e n ee x p r e s s i o n ( p 0 01 ) a n ds i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d 、析t h 5 - h t i b rg e n ee x p r e s s i o n ( 尸 0 0 5 ) b u t5 - h t i d r , 5 - h t 3 rg e n ee x p r e s s i o nw a sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：( 1 ) 1 1 1 ei n c r e a s eo fd i e t a r yt r y p t o p h a nc a ni n c r e a s e d p l a s m at r pa n dt r p b c a ar a t i o n ，w h i c hs t i m u l a t e dh y p o t h a l a m i c5 h tb i o s y n t h e s i s ， l e a d i n gt od e c r e a s e do ff o o di n t a k e ( 2 ) 1 1 1 ea d d i t i o na n dd e p l e t i o no fb r a i n i l a b s t r a c t t r y p t o p h a n c a n c h a n g e dh y p o t h a l a m i c 5 - h t c o n t e n t , w h i c hi n f l u e n c e dt h e h y p o t h a l a m i cg a b a c o n t e n ta n dg h r e l i ng e n ee x p r e s s i o n t l i si n d i c a t e dt h a tg a b a a n dg h r e l i nw e r ei n v o l v e di nt h ei n h i b i t i o no ff o o di n t a k ev i a5 h t ( 3 ) i nt h e i n h i b i t i o no ff o o di n t a k ev i a5 - h t ，h y p o t h a l a m i c5 - h t i a r ，5 - h t i d r , 5 - h t i a rw e r e i n v o l v e di nt h e i n t e r a c t i o no f5 h ta n dh y p o t h a l a m i cg a b a g h r e l i n r 1 1 i l e 5 - h t i a 5 - h t i a rw e r ei n v o l v e di 1 1t h ei n t e r a c t i o no fg a s t r i c5 - h ta n dg h r e l i n k e yw o r d s ：t r y p t o p h a n ；b r a n c h e d c h a i na m i n oa c i d s ；5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ； 1 - a m i n o b u t y r i ca c i d ；g h r e l i n i i i 主要缩略词总汇 缩略语 a g r p b c a a c a i c c k c r h g a b a g h g h s r g l p m c 4 r n p y p o m c p y y s s i u 5 h t 5 h t p 主要缩略词总汇 中文名称 豚鼠相关蛋白 支链氨基酸 苯丙胺调节转录肽 胆囊收缩素 促肾上腺皮质激素释放激素族 y 氨基丁酸 生长激素 生长素促分泌素受体 胰高血糖素样肽 黑皮质素4 型受体 神经肽y 阿片促黑素细胞皮质素原 肽y y 选择性5 羟色胺再摄取抑制剂 5 一羟色胺 5 羟色氨酸 i v 。_ _ _ _ 。_ 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 主要缩略词总汇 1 前言1 1 1 色氨酸与5 - h t 的生物合成l 1 25 h t 及其受体与摄食2 1 3g a b a 、g h r e l i n 与摄食调控4 1 4 立题意义及研究内容5 2 实验材料与方法7 2 1 实验材料7 2 1 1 实验动物与分组7 2 1 2 氨基酸溶液和生理盐水的配制7 2 1 3 血样及组织样品采集8 2 1 4 药品和试剂8 2 1 5 主要仪器9 2 2 实验方法9 2 2 1 摄食量和体重的测定9 2 2 3 血浆中游离氨基酸的测定9 2 2 4 下丘脑和胃组织5 - h t 含量的测定1 0 2 2 5 下丘脑中g a b a 含量测定1 0 2 2 6 小鼠下丘脑和胃组织中5 - h t 受体基因及胃组织中g h r e l i n 基因的相对表达 量测定1 0 2 2 7 数据处理与统计分析1 3 3 结果与讨论1 4 3 1 不同日粮色氨酸水平对小鼠摄食的影响1 4 3 1 1 不同日粮色氨酸水平对小鼠摄食量、体增重及料重比的影响1 4 3 1 2 不同日粮色氨酸水平对小鼠血浆t r p 含量、t r p b c a a 的影响1 5 3 1 3 不同日粮色氨酸水平对小鼠下丘脑中5 - h t 含量的影响1 5 3 1 4 小鼠饲料色氨酸水平、血浆中色氨酸浓度、血浆中t r p b c a a 、下丘脑中 5 - h t 含量以及小鼠总摄食量之间的相关性分析1 6 3 2 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠摄食、下丘脑5 - h t 与下丘脑g a b a 和 g h r e l i n 的影响17 目录 3 2 1 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠摄食量、体增重及料重比的影响1 7 3 2 2 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠下丘脑5 - h t 含量l8 3 2 - 3 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠下丘脑g a b a 含量的影响1 9 3 2 4 料重比、摄食总量、下丘脑5 - h t 与g a b a 含量之间的相关性分析2 0 3 2 5 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠下丘脑g h r e l i n 基因表达的影响。2 2 3 2 6 料重比、摄食总量、下丘脑中5 - h t 含量与g h r e l i n 基因相对表达量之间的 相关分析2 2 3 3 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠下丘脑相关5 - h t 受体与g a b a 和 g h r e l i n 的影响2 3 3 3 1 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠下丘脑中5 - h t l a r ，5 - h t i b r ，5 h t l d r ， 5 - h t 3 r 基因表达的影响2 3 3 3 2 下丘脑5 - h t l a r ，5 h t l b r ，5 - h t i d r ，5 h t 3 r 基因的相对表达量及其与 下丘脑中g a b a 含量、下丘脑中g h r e l i n 基因相对表达量的相关性分析。2 4 3 4 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对胃组织5 - h t 与g h r e l i n 的影响2 5 3 4 1 腹腔注射色氨酸、b c a a 溶液对小鼠胃组织中5 - h t 含量的影响2 5 3 4 2 胃组织5 - h t l a r ，5 - h t l b r ，5 - h t l d r ，5 h t 3 r 基因的相对表达量与胃组 织g h r e l i n 基因相对表达量相关性分析2 7 论文主要结论3 0 j l i 【谢3l 参考文献3 2 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文3 9 l l l 前言 1 1 色氨酸与5 - h t 的生物合成 1 前言 色氨酸是人体的必须氨基酸之一，不能由人体自身合成，必须从食物中摄取。 色氨酸化学名为为a 氨基p 吲哚丙酸，结构式如图1 10 1 。在1 8 2 5 年被首次发 现，1 8 9 2 年由n e u m e i s t e r 定名为色氨酸( t r y p t o p h a n ) ，1 9 0 2 年由h o k i n s t 从酪蛋 白中分离获得【2 】。色氨酸有l 型、d 型两种同分异构体。其中d 色氨酸在人体 内几乎不发生代谢作用，也无毒性，而l 色氨酸为人体所必需，参与人体蛋白 质合成和代谢网络调节，并广泛存在于自然界【3 j 。 o h h 图1 - 1 色氨酸的结构式 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo f t r y p t o p h a n l 色氨酸在人体内除合成蛋白质外，还参与免疫和消化功制4 1 。l 色氨酸在 体内的最终去向为合成蛋白质、分解代谢。l 色氨酸在体内的分解代谢主要有2 种途径：一是犬尿酸原代谢途径，机体内大部分的色氨酸经此排泄；二是经过保 留吲哚环的途径代谢【3 ，5 ，6 】。其中代谢产物大部分都参与机体的各种生理活动，如 丙氨酸和乙酰c o a 是体内生糖生酮的原料；尼克酸属于维生素p p 族，可以在机 体内合成n a d 和n a d p ，人体缺乏会患癞皮症，主要表现是皮炎、腹泻及痴呆； 5 羟色胺( 5 - h t ) 是人体内一种重要的神经递质，参与多种生理活动【7 】。 5 - h t 作为人体内一种重要的神经递质，参与调节摄食、情绪、行为、睡眠、 认知等诸多生理活动1 8 ，9 】。5 h t ，又叫血清素( s e r o t o n i n ) ，是r a p p o r t 等人首先 于1 9 4 8 年从血清中分离出来的一种收缩血管的物质，因此命名血清素，次年确 定其结构1 1 0 】。机体内约9 0 的5 - h t 存在于消化道粘膜，8 1 0 存在于血小板， 只有l 2 存在于中枢神经系统中。由于血脑屏障的存在，血液中的5 - h t 很难 进入中枢神经系统，因此中枢神经系统和外周的5 - h t 分属两个独立的系统，但 是5 - h t 的生物合成途径在中枢和外周是完全相同的，5 - h t 的生物合成途径见图 1 2 【6 ，1 1 1 。5 - h t 以色氨酸为前体，首先在色氨酸羟化酶的作用下，生成5 羟色氨 酸，然后在色氨酸脱竣酶的作用下脱羧生成5 - h t 。这个生物合成反应的限速酶 色氧酸羟化酶 羟化酶和l 色氨酸的结合还 则可加速5 h t 的生物合成。 孓羟色氨酸 每羟色胺 图l 一25 一h t 的生物合成 f i g 1 - 2t h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f5 - h t 外周血液中的l 色氨酸要成为中枢神经内的5 - h t 前体，需首先透过血脑屏 障进入到中枢神经系统内的5 h t 神经元细胞内【1 2 1 。研究发现，色氨酸与某些中 性氨基酸，尤其是支链氨基酸( b c a a ) 在经载体转运进入血脑屏障过程中存在 竞争性抑制，因此减少外源性支链氨基酸可增加进入中枢神经系统的色氨酸的 量，加速5 - h t 的生物合成【1 3 , 1 4 。 1 25 - h t 及其受体与摄食 研究发现，5 - h t 系统在中枢神经系统内有重要的调节摄食的作用l l 引。已有 诸多文献指出，5 - h t 及s s r i s ( 选择性5 羟色胺再摄取抑制剂) 能够抑制大鼠 和人的摄食【1 6 ，1 7 1 。其中常见的s s r i s 有：氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、氟伏沙明、 西酞普兰和艾司西酞普兰等，同时这些药物主要用于抗抑郁【l 引。同时有研究指出， 注射各类5 - h t 受体的激动剂，也会减少大鼠和人的摄食量【1 9 挪埘】。研究人员在 研究5 - h t 相关基因敲除或者过量表达时发现，5 h t 2 。受体基因敲除的小鼠，贪 2 1 前言 食，体重逐渐增加瞄1 ；而5 h t p 转运体基因过量表达的小鼠，体重明显轻于正 常小鼠，身长也比正常小鼠短，也与正常小鼠表现出对芬氟拉明不同的耐受性【2 3 j 。 现在研究初步认为，中枢神经系统的5 h t 调控摄食有2 条主要途径：一是通过 靶作用于a g r p ( 豚鼠相关蛋白) 和n p y ( 神经肽y ) 神经元上的5 - h t l b 受体， 抑制a g l 冲和n p y 的释放洲；二是靶作用于p o m c ( 阿片黑皮质素原) 和c a r t ( 苯丙胺调节转录肽) 神经元上的5 h t 2 c 受体，刺激p o m c 和c a r t 的释放【2 5 j 。 2 条途径继续作用于下游的m c 4 r ( 黑皮质素4 型受体) ，进而继续下游的饱食 信号的刺激，达到抑制摄食1 2 6 。 通过靶作用于5 - h t 系统的药物，虽然短期有很好的减少食欲、抑制摄食的 效果，但是有一定的药物依赖性、耐受性及一些副作用。如，常见的s s r i s 药物， 能选择性抑制突触前膜对5 - h t 的回收，提高5 - h t 的生物利用率，从而有抑制 摄食的效用。但是研究发现，f e n f l u r a m i n e ( 芬氯拉明，s s s 药物的一种) 在长 期实验中，人2 4 周后体重的减少达到最大，但是停止治疗3 5 年后，体重又会 增加明显【2 7 1 。c h o i t 2 8 】等发现，通过对大鼠5 天给予f e n f l u r a m i n e 5 天不给药( 1 0 次循环) ，大鼠体重的下降只在给药的前两天，而在不给药的时间里，大鼠的体 重会恢复。w i n s t o n 2 9 j 等发现长期服用s s r i s 药物的女性患者会患有不同程度的 性功能障碍。其它也有报道s s r i s 药物有恶心、头痛、睡眠障碍等副作用【3 0 1 。而 靶作用于5 - h t 受体的各种激动剂和颉颃剂，对抑制摄食也有很好的效果。但是 由于5 - h t 受体分布和作用广泛，有诸多的副作用。如，一些没有选择性5 - h t 2 受体激动剂会活化5 h t 2 a 受体，这会有致幻作用【3 l 】。5 h t 2 b 受体激动剂如 p h e n t e r m i n e ( 芬特明) 等会导致心脏疾病或者肺高压症【3 2 】。而通过膳食色氨酸提 高下丘脑内5 - h t 水平，来抑制摄食，没有此类的副作用。 5 - h t 在中枢神经系统调控摄食，主要通过靶作用于其它食欲信号的神经元 上的各种5 - h t 受体来实现1 3 3 1 。5 - h t 受体共有7 种亚型：5 h t l 7 ，按照受体的 传导方式，可以分为g 蛋白偶联受体超家族和配体门控离子通道型两种类型。 在5 - h t 的所有受体亚型中，除了5 h t 3 属于门控离子通道型外，其余均属于g 蛋白偶联受体超家蒯3 4 1 。 研究发现，不同亚型的5 h t 受体起到抑制或者刺激细胞功能的作用，比较 常见的如5 - h t l a ，5 - h t l b ，5 - h t l d 型受体是抑制细胞功能；而5 h t 2 a ，5 - h t 2 c ， 5 h t 3 ，5 h t 4 型受体是抑制细胞功能【3 5 】。5 h t l 受体家族总共有5 个亚型：5 - h t l a ， 5 - h t m ，5 - h t l d ，5 - h t i e ，5 - h t l f o5 h t l a 受体广泛分布于中枢神经系统内，已 知参与对摄食、体温调节、认知、睡眠和焦虑等多种功能的调节 3 6 , 3 7 j 。5 - h t l b 受体被研究认为在调控摄食中起到重要作用，研究发现5 - h t l b 受体基因敲除的 基因，体重和摄食量比正常小鼠要高【3 8 】。5 h t l d 受体可分为5 h t l m 和5 h tl d l 3 两种亚型，两者之间的核昔酸序列6 3 同源。5 - h t l d 受体多被研究用作治疗偏 3 江南大学硕士学位论文 头痛的靶点【3 9 1 。5 - h t 3 受体传导方式属于门控离子通道，不同于其它亚型的受体 【加】。有研究认为，5 - h t 3 受体特异激动剂，可诱导黑脚黄鼬结肠收缩，不改变其 基本运动模式，并引起排便【4 1 1 。 1 3g a b a 、g h r e li n 与摄食调控 食欲调节网络的协调性摄食活动是维持人类生命的基本生理活动，食欲调 节具有复杂而精细的调节机制，而下丘脑正是接受、整合与发放食欲调节信号、 维持体重稳定的重要中枢。中枢神经系统或外周组织产生的具有促抑食欲作用 的神经内分泌因子在下丘脑形成复杂的食欲调节网络和相互投射的神经环路，对 食欲进行精确的调控 4 2 , 4 3 。下丘脑中食欲调节因子可分为促进食欲因子和抑制食 欲因子，其中促进食欲因子有：神经肽y f r , 、甘丙肽、黑素细胞凝聚素、 内源性阿片样肽、豚鼠相关蛋白、食欲素、谷氨酸和g a b a 等；而食欲抑制因 子有：促肾上腺皮质激素释放激素族( c l m ) 、神经降压素、阿片促黑素细胞 皮质素原( p o m c ) 、胰高血糖素样肽( g l p ) 1 、黑皮质素等l 4 4 ，4 5 。除了下丘 脑食欲网络外，外周组织也产生相关的食欲调节因子，在摄食调控中起到了重要 作用，如：g h r e l i n ( 生长素) 、甲状腺素、糖皮质激素、胰岛素、c c k ( 胆囊收 缩素) 、p y y ( y y 肽) 等 4 6 , 4 7 ，4 引。 g a b a ( 7 氨基丁酸) 是哺乳动物中广泛分布的一种抑制性神经递质，具有激 活脑内葡萄糖代谢，促乙酰胆碱合成，降血氨，抗惊厥，降血压，恢复脑细胞功 能等功能f 4 9 1 。1 9 5 0 年，首次被f l o r e y 和r o h e r t 的研究小组在哺乳类动物脑萃取 液中发现，g a b a 及其受体在下丘脑、杏仁核、孤束核等摄食和味觉中枢均有分 布【5 0 】。g a b a 具有a 、b 和c 三种受体，其中a 和b 受体参与对摄食行为和味 觉感知。研究发现，g a b a 有促进摄食的作用【5 。研究人员在多种动物中，刺 激g a b a a 或b 受体能促进摄创5 2 】。l g r a n d i s o n 等也研究发现，给大鼠下丘脑 注射m u s c i m o l ( 一种g a b a 受体激动剂) 后，大鼠摄食量显著增加1 5 3 1 。作为一 种在中枢神经系统内广泛分布于神经递质，g a b a 调节摄食与其他很多摄食调节 因子有相互作用，如n p y 、阿皮肽、a g r p 等。在研究治疗焦虑中，研究人员发 现给小鼠注射g a b a 受体的激动剂，能提高5 - h t p 的含量，达到治疗焦虑的效 果【5 4 1 。t o n i n i 5 5 】等在研究豚鼠回肠收缩时发现，胆碱能运动神经元的激活5 - h t 的释放，5 - h t 再刺激g a b a 神经元，进而诱导豚鼠回肠收缩。g r a c e 5 6 】等在研 究5 h t 调节l a 释放时发现，5 h t 对g a b a 神经元有调节作用。n a z a r e l 5 7 j 等 也在研究发现认为5 h t 与g a b a 有相互作用。 g h r e l i n 在1 9 9 9 年被k o j i m a 等人分离发现，是一种新发现的由2 8 个氨基酸 组成的内源性肽，可与生长素促分泌素受体( g r o w t hh o r m o n es e c r e t a g o g u e r e c e p t o r ，g h s r ) 结合促进生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 的分泌，故命名为 4 l 前言 g h r e l i n 5 9 , 5 9 1 。g h r e l i n 是除了g h r h 和生长抑素之后调节g h 分泌的第三个主要 激素。g h r e l i n 是由g h r e l i n 前体( p r e g h r e l i n ) 裂解而成的，人和大鼠的g h r e l i n 前体均为含有11 7 个氨基酸的多肽，其同源性为8 2 9 。g h r e l i n 最初是从大鼠 胃中分离得到的，以后发现它分布于人、大鼠和多种动物的中枢神经系统和外周 组织器官【6 0 】。g h r e l i n 的主要生理功能有：调节g h 的分泌1 6 1 1 ；对消化系统的功 能调节，如促进胃酸分泌、促进胃肠蠕动、保护消化系统黏膜等【6 2 1 ；对机体免疫 和肿瘤的影响，在甲状腺癌细胞系中，g h r e l i n 抑制细胞生长，其作用呈量效关 系1 6 3 1 ；调节能量和糖代谢，研究发现，一定浓度的g h r e l i n 能抑制小鼠胰岛素释 放，降低葡萄糖耐量，而胰岛素可提高血浆g h r e l i n 水平6 4 , 6 5 1 ；参与调节摄食1 6 6 】。 其中，g h r e l i n 对摄食的调节机制。研究已知，g h r e l i n 可通过n p y a g r p 途 径调节摄食，g h r e l i n 激活n p w a g r p 产生神经元。促进n p y 和a g r p 的表达 和释放，刺激动物摄刨d 7 ：l ；g h r e l i n 还可通过激活食欲素( o r e x i n ) 牢* 经元调节摄食， 食欲素是下丘脑外侧区重要的食欲调节因子，g h r e l i n 可与下丘脑外侧g h s r l a 受体结合激活o r e x i n 产生神经元，促进o r e x i n 表达和释放，促进动物摄食【6 引。 也有研究发现，g h r e l i n 的活性水平还受大脑5 羟色胺体系的负反馈调节 6 9 1 。 h i r o s h i 7 0 】等在研究胃肠收缩时发现，第三阶段自发收缩有胃组织g h r e l i n 和5 h t 4 受体的共同介导。k a t s u n o r i 7 1 】等发现，长期厌食的小鼠中，其血浆中d e s a c y l g h r e l i n 水平下降，而下丘脑中5 h t 2 c 和5 - h t l b 受体基因表达会明显增加。 y a k a b i t 7 2 j 等研究发现，5 一h t 2 c 受体颉颃剂能通过提高下丘脑内g h r e l i n 内源性配 体g h s r l a 表达水平来改善由c i s p l a t i n 诱导的厌食。这些研究表明5 - h t 可能对 g h r e l i n 的调节作用。 1 4 立题意义及研究内容 在人体内色氨酸在色氨酸羟化酶的作用下，生成5 羟色氨酸，然后在色氨 酸脱羧酶的作用下脱羧生成5 - h t 。这个生物合成反应的限速酶是色氨酸羟化酶， 正常生理条件下，人体内色氨酸羟化酶和l 色氨酸的结合还未达到饱和，故只 要增加l 色氨酸在人体内的含量，则可加速5 - h t 的生物合成。5 - h t 作为人体 内一种重要的神经递质，有广泛的生物学作用，在下丘脑中有显著的抑制摄食的 作用。故通过膳食中的色氨酸水平来调控机体内5 - h t 含量进而调控摄食的重要 途径。摄食调控是个复杂的网络调节机制，其中可能涉及到多种激素、神经递 质信号的调节，如：神经肽y ( n p y ) 、黑细胞凝集素、阿片促黑素细胞皮质素 原( p o m c ) 、胰高血糖素样肽( g l p ) 1 、5 h t 、g a b a 和g h r e l i n 等。其中g a b a 被认为是能促进摄食的一种重要神经递质。有研究发现，g a b a 与5 - h t 存在 某种相互作用。还有，g h r e l i n 的活性水平受大脑5 羟色胺体系的负反馈调节。 故5 - h t 调控摄食的机制，可能有下丘脑g a b a 和g h r e l i n 的参与，即5 - h t 通 江南大学硕士学位论文 过靶作用于下丘脑g a b a 神经元细胞和g h r e l i n 分泌细胞上的相关5 - h t 受体， 来影响2 种食欲调节因子的释放，调控摄食。因此，研究膳食色氨酸对摄食的影 响，对5 - h t 调控摄食机制研究的进一步完善，以及在畜牧业中利用饲料中色氨 酸水平来调控动物摄食，具有重要的理论意义和实践意义。 本文的主要研究内容： 1 膳食中色氨酸对小鼠血浆游离色氨酸水平、下丘脑5 - h t 、摄食量的影响，及 其之间的联系； 2 色氨酸通过5 - h t 系统调控小鼠摄食，不同亚型5 - h t 受体基因表达情况，探 讨其在5 - h t 调控摄食中的作用； 3 色氨酸通过5 - h t 系统调控小鼠摄食机制，是否有下丘脑中g a b a 、下丘脑和 胃组织中g h r e l i n 的参与。 6 2 1 2 1 1 2 1 1 责任 2 1 1 为4 氨酸 2 8 d 后断颈椎处死小鼠，记录小鼠摄食量，检n 4 , 鼠血浆中游离色氨酸浓度、下 丘脑中5 h t 含量。 2 4 只小鼠于动物房预饲一周，每天限时给料( 8 ：0 0 1 7 ：0 0 ) 。预饲期后， 随机分为3 组，b c a a 组、对照( c o n t r 0 1 ) 组、t r i o 组。b c a a 组腹腔注射按3 0 0 m g k g w ( v a l ：l e u - i l e = l ：1 ：1 ) 剂量注射配置好b c a a 溶液，对照组腹腔注 射生理盐水，t r p 组按10 0 m g k g w 剂量腹腔注射配制好的色氨酸溶液，三组小 鼠都在给料前腹腔注射。自然光照，自由饮水，环境温度控制在2 3 - 4 - 2 ，湿度 6 0 。1 周后断颈椎处死小鼠，检测相应指标。 2 113 动物饲料 2 5 埏辐射标准饲料，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；配制的四种 不同色氨酸水平饲料，其色氨酸水平为：每千克饲料中分别含1 2g 、1 6g 、2 0g 、 2 4g 色氨酸。其中1 2g 色氨酸水平的饲料配方( g k g 饲料) 见表2 - 1 ，其它3 种饲料分别添加不同水平的色氨酸以达到实验设计的标准。 2 1 2 氨基酸溶液和生理盐水的配制 b c a a 溶液：分别准确称取1g 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸溶于1 0 0m l 蒸 馏水中，配制为1 0m g m l 浓度的b c a a 溶液；生理盐水：准确称取0 9gn a c i 溶 于1 0 0m l 蒸馏水中；t r p 溶液：准确称取lg 色氨酸溶于1 0 0m l 蒸馏水中，配 制为1 0m g m l 浓度的t r i o 溶液。 表2 - 1 基础饲料配方及营养水平 7 江南大学硕士学位论文 注1 ：预混料配方( g k g 预混料) ：硫酸弧铁3 3 - 3 、硫酸锌3 1 2 、硫酸铜8 、硫酸锰1 2 5 、 亚硒酸钠6 8 、碘化钾l l 、胆碱1 0 0 、赖氨酸单盐酸盐4 8 0 、d l 蛋氨酸9 3 、复合维生素预 混料3 0 注2 ：氨基酸含量为实测含量 注3 ：支链氨基酸：为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸之和 2 1 3 血样及组织样品采集 2 1 3 1 血样的采集 小鼠饲养2 8d 后，眼眶采血，肝素抗凝。抗凝血离- t 1 , ( 3 0 0 0r p m 离心1 0m i n ) ， 取上清，2 0 。c 保存备用，用于血浆中游离氨基酸检测。 2 1 3 2 组织样品的制备 断颈椎处死小鼠，迅速取出下丘脑和胃，取一部分精确称重( 剩余部分置液 氮保存，转移至一7 0 保存，提r n a 用) ，用预冷的灭菌生理盐水做匀浆介质4 。c 下制得1 0 组织匀浆( w ：v ) ，以4 0 0 0r p m 离心1 0m i