（生物医学工程专业论文）基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究.pdf

基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究 以壳聚糖包被f e 纳米线，以戊二醛为交联剂对壳聚糖表面进行醛基化，实 现与a h c g 抗体的交联，制备磁性纳米线壳聚糖a h c g 抗体生物探针。以此生 物探针为基础，与 3 - h c g 、i g g 多抗一起，组装h c g 磁性纳米线标记免疫层析 试纸条，分别对不同浓度的h c g 抗原进行测试，测试结果表明：检测灵敏度为 1 0m i u m l 。与市场上销售的胶体金早孕试纸条的灵敏度2 5m l u m l 相比，本实 验制备的试纸条可以将早孕检测时间提前2 3 天。 提出了一种操作简便、便于携带、响应迅速的磁性免疫检测的具体方案。通 过对系统感应线圈的几何参数进行优化设计，研制了磁性纳米线免疫传感器检测 系统，并对不同浓度的样品进行了检测，实验结果显示：该检测系统的灵敏度可 达0 2m g m l 。 关键词多孔阳极氧化铝模板、磁性纳米线、单轴磁畴各向异性、免疫层析检测、 免疫传感器、磁性检测、生物探针 i v 浙江大学博士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h er e s e a r c ho fm a g n e t i cn a n o w i r e si sh o ts p o ti nn a n o m a t e r i a lf i e l d s ，b e c a u s eo f b o t ht h en o r m a lc h a r a c t e r i s t i co fn a n o m a t e r i a la n dt h eu n i q u ee x c e l l e n tm a g n e t i c p r o p e r t i e s a tp r e s e n t ，m a n yr e s e a r c h e sa r e t h ep r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f n a n o w i r e s h o w e v e r , t h ed e e pr e s e a r c ho fn a n o w i r e si ni m m u n o s e n s o r sa p p l i c a t i o ni s l e s sr e p o r t e d i nt h i sp a p e r ，an e wi m m u n o a s s a y , m a g n e t i cn a n o w i r e sa sb i o l o g i c a lc a r r i e r , i s g i v e no u t m a g n e t i cn a n o w i r e sa r eu s ei ni m r n u n o s e n s o r sf i r s tt i m e a n dn e wa t t e m p t s f o ri m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y o fb i o l o g i c a la c t i v em a t e r i a la n da p p l i c a t i o no f m a g n e t i cn a n o w i r e sa r et r i e d t h e s ew i d e nt h o u g h to fi m m u n o s e n s o r s o p t i m i z a t i o n a n dd e v e l o p m e n t b a s e d0 1 1m a g n e t i cn a n o w i r c s c h i t o s a n a - h c g , t h et e s ts t r i p so f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h yw e r ep r e p a r e da n dt e s t e d m i n ii m m u n o s e n s o rd e t e c t i o n s y s t e mb a s e do nm a g n e t i cn a n o w i r e sw a sd e v e l o p e d m a g n e t i cn a n o w i r e ss o l u t i o n w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nw a sd e t e c t e db yi t t h i sp r o v i d e san e ww a yi ni n t e g r a t i o n a n dm i n i a t u r i z a t i o no fi m m t m o s e n s o r s ，a sw e l la so n l i n ea n a l y s i sa n dr a p i dd e t e c t i o n o fb i o l o g i c a ls a m p l e p o u ra n o d i ca l u m i n u mo x i d e ( a a o ) t e m p l a t ew a sp r e p a r e db yt w o - s t e po x i d e m e t h o da n dc h a r a c t e r i z e d f o r m i n gm e c h a n i s mw a sr e s e a r c h e da n de x p e r i m e n t c o n d i t i o nw a so p t i m i z e d t h en a n o - h o l e se q u a b l yd i s t r i b u t ea n dp a r a l l e le a c ho t h e ri n a a o t e m p l a t e t h e ya r ee q u i l a t e r a lh e x a g o nw i t h5 0n n ld i a m e t e r ，1 0 6 m m 2d e n s i t y a n d1 0p a nl e n g t h b a s e do na a o t e m p l a t ea f t e rm o d i f i e dw i t hs t e p r e d u c e - v o l t a g em e t h o d ，f ea n d n in a n o w i r ea r r a y sw e r ep r e p a r e db ya ce l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o nm e t h o da n d c h a r a c t e r i z e d t h e i rd i a m e t e ri s5 0n l n a n dt h e f tl e n g t hi s7 5 0n l i l m a g n e t i s mo f n a n o w i m sw a sa n a l y z e da n dt h er e s u l ts h o w nt h a tt h em a g n e t i z a t i o nd i r e c t i o nw a s o b v i o u su n i a x i a lm a g n e t i ca n i s o t r o p yb e c a u s eo ff i g u r ea n i s o t r o p yo fn a n o w i r e s f en a n o w i r e sw e r gc o a t e d b yc h i t o s a n m a g n e t i c n a n o w i r e s c h i t o s a nw a s p r e p a r e db yg l u t a r a l d e h y d e a s c r o s s l i n k i n gr e a g e n t f o r m i n gm e c h a n i s mw a s r e s e a r c h e d a d s o r b i n gb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b a s ) c a p a c i t yw a st e s t e dw i t hd i f f e r e n t p hb u f f e rs o l u t i o na n dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nb a s t h er e s u l ts h o w nt h a tw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fb s ai s2 0m g m la n dp ho fb u f f e rs o l u t i o ni s5 0 ，t h em a x i m u mo f a d s o r p t i o ni s1 4 8 4m g g v 基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究 t h eb i o l o g i c a lp r o b e so fm a g n e t i cn a n o w i r e s c h i t o s a n a - h c gw e r ep r e p a r e db y c r o s s l i n k i n g 、i ma - h c g t h ei m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ct e s ts t r i p so fw e r ep r e p a r e d b ym a g n e t i cn a n o w i r e s c h i t o s a n a - h c gi b - h c ga n di g g a n dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n h c ga n t i g e nw a st e s t e d t h er e s u l ts h o w nt h a ts e n s i t i v i t yo ft e s ts t r i p sw a s10 m i u m l c o m p a r e dw i t h2 5m l u m ls e n s i t i v i t yo fc o l l o i d a lg o l dt e s ts t r i p si nm a r k e t ， t h ed e t e c t i o nt i m eo fp r e g n a n c yc a l lb ef o r w a r d2 3d a y s a ne a s yo p e r a t i n g ，e a s yt a k i n ga n dr a p i dr e a c t i n gm a g n e t i ci m m u n o s e n s o r d e t e c t i o ns y s t e mw a sd e v e l o p e d a f t e ro p t i m i z e dt h eg e o m e t r yp a r a m e t e ro fd e t e c tc o i l ， d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ns a m p l ew e r ed e t e c t i n g t h er e s u l ts h o w nt h a tt h es e n s i t i v i t yo f s y s t e mw a s0 2m g n 也 k e y w o r d s a n o d i ca l u m i n u mo x i d e ( a a o ) t e m p l a t e ；m a g n e t i cn a n o w i r e s ； u n i a x i a lm a g n e t i ca n i s o t r o p y ；i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y ；i m m u n o s e n o r s ；m a g n e t i c d e t e c t i o n ；b i o l o g i c a lp r o b e s ； v i 浙江大学博士学位论文插图清单 插图清单 图1 1 胶体金免疫层析夹心法检测h c g 的原理示意图1 4 图1 2 夹心式磁标记免疫传感器结构示意图。1 8 图1 3 径迹蚀刻多孔聚碳酸酯模板的扫描电镜刚1 1 6 】2 1 图1 - 4 多孔阳极氧化铝模板的扫描电镜刚1 2 6 】2 2 图3 1 二次阳极氧化制备多孔阳极氧化铝模板的工艺流程图3 4 图3 2 阳极氧化试验装置示意图3 5 图3 3 多孔阳极氧化铝膜f s e m 形貌图3 6 图3 _ 4 多孔阳极氧化铝膜的e d x 图谱3 7 图3 5 阳极氧化过程中电流与时间变化关系【2 0 2 1 4 0 图3 6 不同电解液制备的多孔阳极氧化铝膜f s e m 形貌图4 l 图3 7 不同氧化次数下制备多孔阳极氧化铝膜f s e m 形貌图4 4 图3 8 多孔阳极氧化铝膜扩孔前后的f s e m 形貌图4 6 图4 1 沉积f e 、n i 纳米线后的多孔阳极氧化铝模板f s e m 形貌图5 2 图4 2f e 、n i 纳米线的f s e m 形貌图5 3 图4 - 3f e 、n i 纳米线的t e m 形貌图5 4 图4 - 4n i 纳米线的e d x 图谱5 4 图4 5f e 纳米线的e d x 图谱5 5 图4 6f e 、n i 纳米线长度与沉积时间的变化曲线5 9 图4 7f e 、n i 纳米线在不同磁化方向的磁滞回曲线6 0 图5 1b s a 吸附量与b s a 初始浓度的变化曲线6 6 图5 2b s a 吸附量与p h 值的变化曲线6 7 图5 3h c g 免疫层析试纸条的组装示意图7 0 图5 _ 4h c g 磁性纳米线标记免疫层析实验结果7 1 图5 5 胶体金早孕试纸条与h c g 磁性纳米线免疫层析试纸条的对比实验7 2 图6 1 磁性纳米线免疫传感器检测系统示意图7 6 图6 2 原始时域信号、带通滤波后的时域信号、滤波信号幅频谱。8 0 图6 3 磁性纳米线放入探测头样品腔前后的信号变化8 0 图6 _ 4 温度漂移补偿系统设计框架图8 2 x i 浙江大学博士学位论文附表清单 附表清单 表3 1 不同氧化电压条件下制备的多孔阳极氧化铝膜的孔径变化4 2 表4 1f e 、n i 纳米线在不同磁化方向的磁性能参数。5 9 表5 - 1 妊娠期间h c g 水平的变化6 8 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 臬，也不包含为扶得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对术研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 ， 学位论姗栉签名：诲裂签字腓醐年乡月同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝江盘鲎 有权保留并向国家有关部门或机构送交本 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位沦文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 谁男 导师签名： c 言躺侈 签字同期：砩年厂月r 签字r 期：加g 年多月叩同 浙江大学博士学位论文 致谢 致谢 至此论文完成之际，我要向给予我支持和帮助的家人，师长及学友致以最衷 心的感谢! 首先，我要对我的导师陈裕泉教授在学习和生活上给予我的指导与关怀 表示诚挚的谢意! 陈教授具有开阔的学科视野和丰富的科研经验，治学严谨、一 丝不苟。他在我的科研工作中倾注了很多的心血，使我获益良多。他对科学的严 谨态度和忘我的工作精神给我留下了毕生难忘的深刻印象，他将成为我永远的楷 模和榜样。在生活中，陈教授真心的嘱托和关怀让我备感温暖。他是令我尊敬的 师长，更是爱护我的家长。 衷心感谢潘敏副教授、杨慕杰教授、张孝彬教授在学习和工作中给予我的支 持和帮助。正是他们的无私和豁达，为我提供了良好的科研设备、实验条件和工 作环境，使我的论文得以顺利完成。 感谢杨笑鹤、吴莉莉、方向生、朱丹华、武恩贺，文耀峰、赵祥欣、牛婉婷， 付海霞，王仁慧，李洪涛等在我学 - - j 工作期间给予我的理解和帮助。他们和我组 成了生机勃勃的科研小组，本论文中取得的各项结果和成绩中都凝聚着他们的心 血和努力，从这个意义上讲论文的成绩是属于他们每个人的。值得一提的是，特 别感谢其他学院学长们的帮助陈友汜、糜裕宏等在我的性能表征实验中的实 验设备操作方面提供了大力支持。 最后，我要感谢我的家人。感谢我的父母，我的爱人，他们无私的奉献和一 如既往的支持和鼓励使我安心完成学业。对他们的感谢我无以言表，祝愿他们健 康，快乐。在今后的日子里，我会用自己的努力回报爱我的每一个人。 浙江大学博士学位论文l 绪论 1 绪论 1 1 引言 健康的机体能够通过许多不同的机制，防御微生物和有害物质的侵袭。这些 防御机制包括：天然免疫和获得性或特异性免疫。诱导特异性免疫的外源性物质 被称为抗原。这些抗原能够通过侵入感染或其他途径，刺激动物机体的免疫系统， 诱导产生以抗体和淋巴细胞为主的免疫应答。近年来，由于免疫生物学的发展， 新的免疫理论、技术与方法不断涌现，抗原、抗体与免疫大分子的结构与功能研 究取得重大进展。利用免疫应答过程，进行免疫传感的免疫诊断和治疗技术日趋 成熟。 1 2 免疫分析 1 2 1 免疫分析概述 免疫传感( i m m u n o s e n s i n g ) 或免疫分析( i m m u n o a s s a y ) ，是最为重要的生物 分析方法之一【卜3 1 。它主要是用抗体( 抗原) 作为选择性试剂，来分析测定各种抗 原( 抗体) 及半抗原，以及能发生免疫反应的多种生物活性物质( 例如激素、蛋 白质、药物、毒物等) 。免疫反应最大的特点，就是高度的特异性，即抗体对抗 原的特异性识别。其中专一性可超过酶对底物的识别水平因此，在此基础上的 免疫传感方法也具有高选择性。通过标记，该方法具有很高的灵敏性，对于混合 样品中微量的待测物，不论从灵敏度、花费，还是从分析时间和可操作性方面考 虑，免疫传感分析都成为首选的方法。 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质，抗原进入机体后，可刺激机 体产生抗体和引起细胞免疫。能在机体中引起抗体产生的抗原，多为分子量大于 5 0 0 0 的蛋白质。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗 体的，称为半抗原。例如：某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇， 或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇。 抗体被认为是生物分析和传感中最佳的识别元素，它对相应抗原具有高度的 特异性和亲和性，即使其他共存物的浓度大于待测抗原浓度2 3 个数量级，也 可在上百种共存物中识别微量的抗原。 基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究 1 2 2 抗原抗体反应 免疫分析方法的理论基础，是抗体抗原之间的特异性反应。所谓特异性是指 物质之间的相互吻合性或针对性、专一性。特异性是免疫应答最重要的特点，也 是免疫学诊断与防治的理论依据。抗体和抗原之间存在的弱相互作用力，使得抗 原可以被抗体高特异性地“分子”识别，形成稳定的复合物。抗原与抗体结合形成 抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： a g + a b a g a b ( 1 - 1 ) 抗体的亲和力是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数k 表示： k = a g a b a g l a b 】 ( 1 2 ) 彳g 彳6 的解离程度与k 值有关。 抗原抗体的结合，实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点 之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高 度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原( h b s a g ) 、e 抗原( h b e a g ) 和核心抗 体( h b c a g ) ，来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗 体反应。抗原抗体反应的这种特异性，使免疫测定能在非常复杂的蛋白质化合物 ( 例如血清) 中，测定某一特定的物质，而不必预先分离待检物。 1 2 3 免疫分析方法 免疫分析是一种常用的生物分析方法，通过抗原抗体特异性免疫反应，形成 免疫复合物，进而对待分析物进行定量检测。按照免疫检测时是否使用标记物， 分为非标记免疫技术和标记免疫技术两大类。非标记免疫技术包括絮状沉淀反 应、环状沉淀反应、单向琼脂扩散反应、双向琼脂扩散反应和免疫电泳等。 标记免疫技术是在免疫反应中加入标记示踪物，以定性或定量检测抗原( 抗 体) 。随着生物标记技术的不断进步，精密的物理化学手段引进到免疫测试中， 如：分光光度计，酶标比色仪、荧光光度计和发光光度等，免疫分析技术也在不 断地更新与发展，使得免疫学方法的标准化、定量化、自动化，以及灵敏度、特 异性和反应速度有了极大的飞跃。常用的标记物有：放射性同位素、荧光素、酶， 发光剂、胶体金和银等。 根据标记物的不同，标记免疫技术分为：放射免疫分析、酶标记免疫分析、 2 浙江大学博士学位论文1 绪论 化学发光免疫分析和荧光标记免疫分析 1 2 3 1 放射免疫分析 放射免疫分析( r a d i o i m m u n o a s s a y , r i a ) ，是将放射性同位素标记示踪的高 灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来的一种超微量分析技术。它不是直接测 定待测物，而是利用标记物的放大作用，测量待测物的标记信号，从而使免疫分 析从定性转化为定量，从常量提高到微量和超微量。放射免疫分析在应用上的优 点是：准确灵敏、特异性强、技术成熟，在我国仍有广泛的市场和价值。但由于 方法上固有的弱点，使发展受到一定限制，如：检测仪器昂贵；放射性同位素对 环境的污染及对人体的危害；放射性同位素半衰期短，从而导致其试剂有效期短。 1 2 3 2 酶标记免疫分析 酶标记免疫分析( e n z y m ei m m u n o a s s a y , e i a ) ，是在放射免疫分析基本理论 基础上，发展起来的一种非放射标记免疫分析技术。7 0 年代初，e n g v a ue 等f 4 】 发展了固相酶免疫检测技术，即酶联免疫吸附试验( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ，e l i s a ) 其基本原理是，在先行结合到固相载体上的抗体( 抗原) 分子 连接酶，进行免疫反应，免疫复合物上结合的酶将特定的底物转化为特有的颜色， 由颜色的深浅确定待测物的量。酶标记免疫分析最大的优点在于：避免了对环境 的污染和人身危害；试剂有效期长。但存在的问题是：操做步骤复杂，且这种依 靠比色法或偏振光法的检测技术所受到的干扰因素太多，易造成漏诊和假阳性。 1 2 3 3 化学发光免疫分析 化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y , c l i a ) ，2 0 世纪7 0 年代末创立，包含免疫反应系统和化学发光分析系统两个部分，其原理与放射免 疫分析相似。它具有灵敏性高、特异性强、标准物稳定、无放射性污染等特点。 缺点是结果不易重复，本底较高。电化学发光免疫分析( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e i m m u n o a s s a y ，e c l i a ) ，是9 0 年代发展起来的一种新型化学发光免疫分析方法。 与化学发光不同的是，它在电极表面由化学引发的特异性化学发光反应，实际上 包括了电化学和化学发光两个过程。电化学发光和普通化学发光技术相比，具有 明显的优势，主要区别在于：一般化学发光不稳定，为间断的、闪烁性发光，且 基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究 在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定；而电化学发光为电促发光，可 产生高效、稳定的连续发光，且检测步骤大大简化。由于其原理新颖，干扰因素 少，具有结果稳定、重复性好的特点，因此具有较好的发展前景。不足的是试剂 价格过高并且为非开放性试剂系统。 1 2 3 4 荧光标记免疫分析 荧光标记免疫分析( f l u o r o i m m u n o a s s a y , f i a ) ，其原理与放射免疫分析相似， 只是标记物由同位素改成了荧光素。荧光素是一种在激光照射下能发生强烈荧光 的物质。此技术将免疫学方法与显微镜形态学结合起来，使其应用范围大为扩展。 其优点是敏感性较高，不足之处是易发生非特异性荧光干扰。 总之，传统的免疫分析技术由于分析时间长，分离分析操作繁琐，对分析操 作技能要求高，所用仪器、试剂价格昂贵等缺点，不便于分析系统的集成化和微 型化，不能满足实际生物样品在线分析和快速检测的要求以免疫分析技术为基 础而发展起来的免疫传感器，由于其具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便、 检测快速、成本低廉等特点，大大地推动了免疫分析技术在医学、临床、生物、 化学、环境、农业、工业等方面的应用和发展5 4 3 。 1 3 免疫传感器 免疫传感器，是将免疫测定法与高灵敏的传感技术相结合，而构建的一类新 型生物传感器，同样分为感受器、换能器、放大器三部分。免疫传感器的工作原 理和传统的免疫测试法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗体( 抗原) 固定在 固相支持物表面，来检测样品中的抗原( 抗体) 。不同的是，传统免疫测试法的 输出结果，只能定性或半定量地判断，且一般不能对整个免疫反应过程的动态变 化进行实时监测；而免疫传感器将抗体( 抗原) 固定在传感器基体上，特异性免 疫反应发生时，产生物理，化学、电学或光学上的变化，通过换能器将变化量转 变成可检测的电信号，经过信号放大、滤波之后，进行信号检测，从而测定环境 中待测分子的浓度。由于感受与换能同步进行，因此能实时监测传感器表面的免 疫反应。 根据换能器的不同，免疫传感器分为：电化学型( 电流型或安培型、电位型、 电容型、电导型) 、热量型、光学型和质量型等。常用的信号转换器有：电化学 4 浙江大学博士学位论文l 绪论 电极、离子敏感场效应晶体管、热敏电阻、石英晶体徼天平、光纤等。 1 3 1 免疫传感器的分类 1 3 1 1 质量检测免疫传感器 利用石英晶体微天平( q u a r t z c r y s t a l m i c r o b a l a n c e ，q c m ) ) 技术的压电晶体 免疫传感器，是最常见的一种质量测量免疫传感器。其原理是，石英晶体在振荡 电路中振荡时有一个基础频率，当样品中的抗原( 抗体) 与包被在晶体表面上的 抗体( 抗原) 发生特异性结合时，由于增加了晶体的质量，因此晶体的振荡频率 会相应的变化，其变化量与吸附上去的抗原( 抗体) 质量有相关性。 1 9 7 2 年，s h o n sa 掣1 5 1 首次报道了压电现象，并成功地用于免疫测试。随后， 人体铁蛋白以及乳腺癌等肿瘤相关抗原检测的压电免疫传感器也有报道【1 6 1 。这类 传感器灵敏性高、特异性好，而且对样品的要求比较低，不需标记和预处理，能 重复使用。2 0 0 8 年，y a oc 等【1 刀研制了一种新型的压电石英微阵列免疫传感器， 可用于乙肝病毒的测定。这种微阵列传感器中的检测速率快，能在5 0 分钟内完 成检测，而且抗干扰能力强，临床特异性达到9 4 4 4 ，对乙肝病毒的检测极限 为8 6 p e a , 。 1 3 1 2 热量检测免疫传感器 热量检测免疫传感器，利用了酶促反应的放热特性，用酶作标记并使用了酶 热敏电阻。该类传感器的原理是，将抗体( 抗原) 固定在酶热敏电阻上，样品中 的抗原( 抗体) 与之发生反应后，引起酶促反应，可产生5 1 0 0k j m o l 。的热量， 然后通过酶热敏电阻等元件检测信号 u r b a ng 等【l 叼用小型薄膜热敏电阻固定抗体来检测抗原，制成了微型热量检 测免疫传感器，预示着有可能生产出大小适宜且简单的装置。 1 3 1 3 光学免疫传感器 光学换能器，可响应紫外线或可视射线，也可响应生物或化学发光产物，还 适用于含光纤的装置。化学发光免疫传感器是光学传感器的一个重要分支。自 1 9 7 8 年f r e e m a ntm 掣1 9 】报道第一个化学发光h 2 0 2 传感器以来，引起了分析化 学家们极大的兴趣。化学发光免疫传感器是将化学发光试剂、酶( 催化剂) 或者 基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究 荧光物质标记到抗原( 抗体) 上，通过特异性免疫反应与抗体( 抗原) 结合后， 用化学发光反应测定标记物的化学发光强度，以确定被标记的抗原( 抗体) 的量。 s a s a m o t oh 等 ：0 1 报道了以微型管作为反应器的化学发光酶免疫分析方法， 并测定了人绒毛膜促性腺激素的含量。 1 3 1 4 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是免疫传感器中，研究最早、种类最多、也较为成熟的一 个分支。它结合各种电分析技术，如：溶出伏安法、脉冲伏安法、脉冲差分法等， 使灵敏度大大提高。理想的电化学免疫传感器是在抗体与其相对应的抗原结合的 同时，就把免疫反应的信息直接转变成电信号。但是近1 0 年来的研究一般都是 通过对抗原和抗体进行标记，从而实现把抗原抗体结合的信息转变为可测的电化 学信号。电化学免疫传感器按测量信号的不同可分为：电位型【1 4 2 1 - 2 4 、电容型2 5 ， 2 6 1 、电导型【2 7 1 和电流型 2 8 - 3 3 】。 电化学免疫传感器不仅具有生物传感器选择性好，种类多，测试费用低，适 合联机化等优点；又具有电化学体系可实现在体检测，不受样品颜色、浊度的影 响，所需仪器设备相对简单，检测便捷快速等特点，因此被广泛应用于医疗、食 品分析、工业生产、环境检测等领域。 1 3 2 免疫传感器中抗体( 抗原) 的固定化技术 固定化的目的在于，使抗体( 抗原) 在保持固有性能的前提下，处于不易脱 落的状态，以便同换能器的探头组装在一起构成传感器的探头。具体来说，固定 化的首要目的就是，将抗体( 抗原) 限制在一定的空间，但又不妨碍底物的自由 扩散。与游离相相比，固定相具有一系列的优点：热稳定性提高；可重复使用； 不需要在反应后进行催化物质与反应物质的分离；可以根据已知的半衰期确定生 物传感器膜的寿命；能够避免外原微生物对生物功能的污染和降解等。 常用的固定化技术有以下几种方式：吸附法、交联法、包埋法、共价键合法 以及分子自组装法等。 1 3 2 1 吸附法 吸附法，用含抗体( 抗原) 的溶液涂覆或浸泡电极，通过物理或化学吸附作 6 浙江大学博士学位论文l 绪论 用使其表面生成具有识别功能的生物膜。该法简单、快速，但易阻碍特异性反应 的发生，导致非特异性吸附和脱落。 1 3 2 2 交联法 交联法，借助于双功能团试剂的桥梁作用，使抗体( 抗原) 与惰性载体相结 合或彼此交联，形成网状结构。此法需严格控制p h 值，一般在蛋白质的等电点 附近操作。在交联反应中，抗体( 抗原) 不可避免地会部分失去活性，而且在固 定化过程中需要的生物样品量较多。 1 3 2 3 包埋法 包埋法，将抗体( 抗原) 包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质 中，形成稳定敏感膜。包埋法的优点是：可采用温和的实验条件及多种凝胶聚合 物；大多数抗体( 抗原) 可很容易地掺入聚合物膜中，一般不产生化学反应，对 分子活动影响较小；膜的孔径和几何形状可任意控制，可固定高浓度的抗体( 抗 原) ；被包埋物不易渗漏，待测物分子可以在膜中任意扩散等。缺点是：必须控 制很多实验因素；聚合物形成过程中，产生的自由基对抗体( 抗原) 可能产生去 活化作用等。 1 3 2 4 共价键合法 共价键合法，使抗体( 抗原) 通过共价键，与不溶性载体结合而起到固定化 的作用。通常要求在低温( 0 。c ) 、低离子强度和生理p h 条件下进行。一般包括 3 个步骤：基底载体表面的活化；抗体( 抗原) 的偶联；剩余价键的封闭以及除 去键合疏松的组分这些步骤中每一步合适的实验条件取决于抗体( 抗原) 及偶 联试剂的特性。共价键合法的优点是结合牢固，抗体( 抗原) 不易脱落，载体不 易被生物降解，使用寿命长等；缺点是操作步骤较麻烦。 1 3 2 5 分子自组装法 分子自组装法，是将基片放入含有抗体( 抗原) 的溶液中，抗体( 抗原) 在 基片表面发生自发的化学吸附或化学反应，在基片表面形成化学键连接的二维有 序单层膜。如果单层膜表面也是具有某种反应活性的活性基团，则又可与别的物 质反应。如此反复，构筑同质或异质多层膜。分子自组装法操作简便，具有良好 7 基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究 的稳定性和有序性，但由于起步较晚，仍是一种不成熟的方法。许多问题如：杂 质吸附、分子聚合、溶剂选择、基片表面加工、分子设计、有序性、缺陷的程度 和性质等需要更深入的研究。 ， 总之，将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应结合起来的免疫传感器，具 有分析灵敏度高、特异性强、使用简便、检测快速、成本低廉等特点。在过去的 数年中，不同学科背景研究者的密切协作，使得免疫传感器的设计和应用以前所 未有的速度迅速发展，具有广泛的应用前景和巨大的市场潜力。 1 4 纳米材料 1 4 1 纳米材料概述 纳米科学技术是2 0 世纪8 0 年代末期诞生并正在崛起的新科技，是原子物理、 凝聚态物理、胶体化学、固体化学、配位化学、化学反应动力学和表面、界面科 学等多种学科交叉汇合而出现的新学科。它的基本涵义是：以纳米尺度的物质或 结构为研究对象，通过一定的微细加工方式，按人的意志直接操纵原子、分子或 原子团、分子团，使其重新排列组合，形成新的具有纳米尺度的物质或结构，研 究其特性，并由此制造新功能的器件、机器以及其它各方面应用的科学与技术。 具有组成相或者晶粒结构的、空间尺寸在1 0 。9 1 0 1 m 范围以内的材料叫做 纳米材料。按照空间结构不同纳米材料分为： 纳米颗粒：零维纳米材料，是指在空间三维尺度均为纳米尺度的材料， 如纳米颗粒，原子团簇等。 纳米线：一维纳米材料，是指在空间中有二维是纳米尺度的材料，如纳 米线、纳米棒、纳米管等。 纳米薄膜：二维纳米结构，是指在空间中有一维是纳米尺度的材料，如 薄膜、多层膜、分子束外延膜等。 纳米块体：三维纳米结构，即纳米块体材料，如气凝胶等。 1 4 2 纳米材料的特性3 4 i 当材料尺寸减小到纳米量级，会产生在宏观尺度上完全看不到或者是特别优 异的性能，例如：合成的t i 0 2 纳米晶体陶瓷在室温下可被弯曲，塑性形变可达 浙江大学博士学位论文l 绪论 1 0 0 ；氮化硅陶瓷在纳米状态时，出现与极性相联系的压电效应；用纳米t i 0 2 薄膜制成的新型太阳能光电转换器件，在阴雨天也能工作；纳米金属颗粒以晶格 形式沉积在硅表面，可以形成高效电子元件或高密度信息存储材料；纳米氧化锌 薄膜具有很好的压电效应等等。 1 4 2 1 小尺寸效应 在o 1 1 0 0n m 的纳米尺度范围内，材料系统因为结构和组成尺寸达到了纳 米级而呈现出异常的物理、化学和生物学特性，这种效应叫做纳米材料的小尺寸 效应。当纳米材料的尺寸与光波的波长、传导电子的德布罗意波长以及超导态的 相干长度或穿透深度等物理特征尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被 破坏，声、光、电、磁、热力学等特性均会呈现新的小尺寸效应。例如，光吸收 显著增加并产生吸收峰的等离子共振频移，磁有序转为磁无序态，超导相转为正 常相，声子谱发生改变等。 1 4 2 2 表面效应 纳米材料由于尺寸小，表面积大，表面能高，位于表面的原子占相当大的比 例。这些表面原子处于严重的缺位状态，因此其具有极高的表面活性，极不稳定， 很容易与其他原子结合，产生一些新的效应。例如，金属的纳米粒子在空气中会 燃烧，无机的纳米粒子暴露在空气中会吸附气体，并能与气体进行反应。 1 4 2 3 量子尺寸效应 当纳米材料尺寸下降到最低值时，费米能级附近的电子能级由准连续变为离 散能级的现象。低温下电子能级是离散的，而且这种离散对材料的热力学性质有 很大影响。例如，超微粒子的比热、磁化率明显区别于大块材料。库波( k u b o ) 提出了相邻电子能级间距和颗粒体积的如下关系： 万：兰生v 一1( 1 - 3 ) 3 式中n 为一个超微粒的总导电电子数；e f 为费米能级；v 为超微粒体积。 对于宏观物体包含无限个原子，一o o ，由上式知，万一0 ，能级连续。而 对纳米材料，所含的原子数有限，很小，万就有一定值，能级分立。 当能级间距万大于热能、磁能、静磁能，静电能、光子能量或超导态的凝聚 9 基于磁性纳米线的免疫检测技术的研究 能时，必须考虑量子效应，这就导致纳米材料的磁、光、声、热、电以及超导电 性与宏观特性有着显著的不同，称为量子尺寸效应。例如，颗粒的磁化率、比热 与所含电子的奇、偶数有关，相应地会产生光谱线的频移、介电常数变化等现象。 1 4 2 4 宏观量子隧道效应 微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应。近年来，人们发现一些宏观量， 如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁通量等也具有隧道效应，称之为宏观 量子隧道效应。宏观量子隧道效应的研究对基础研究及实用都有着重要意义，它 限定了磁带、磁盘进行信息储存的时间极限。量子尺寸效应，隧道效应将会是未 来微电子器件的基础，或者说它确立了现有微电子器件进一步微型化的极限。因 此，当微电子器件进一步细微化时，必须要考虑上述的量子效应。 纳米材料本身所具有的这些特性，使其在催化、滤光、光吸收、医药、磁介 质、传感器及新材料等诸多领域有十分广泛的应用前景。 1 4 3 纳米材料在免疫传感器中的应用 纳米技术的发展，不仅为传感器提供了优良的敏感材料，而且为传感器制造 提供了许多新型的方法，例如：扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p e ， s t m ) 技术，单分子层复合( l a n g m u i r - b l o d g e t t ，l b ) 膜技术，微电子机械系统 ( m i c r oe l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 技术等。与传统的传感器相比，纳米 传感器尺寸减小、精度提高、性能大为改善，更重要的是利用纳米技术制作传感 器，是站在原子尺度上，从而极大地丰富了传感器的理论，推动了传感器的制作 水平，拓宽了传感器的应用领域。 1 4 3 1 纳米材料作为修饰材料 纳米材料由于其巨大比表面，使量子化尺寸十分突出，因而从一个惰性体转 变为一个活泼的能提供电子和获取电子的物体，或者说变成了一个化学活性物 质。因此具有：能有效增加电极比表面积，加快电子传递，提高抗体的固定量， 增强传感器灵敏度和稳定性，提高传感器响应速度，选择性好，抗干扰能力强等 优点，成为免疫传感器中常用的修饰材料 3 5 - 3 8 】。 h ex 等3 9 1 利用一种新的固定技术，将纳米金电沉积到普鲁士蓝修饰的碳电 1 0 浙江大学博士学位论文l 绪论 极上，不用标记，并将抗体固定其上，来完成对抗原的检测。通过纳米金的放大 信号和表面效应的作用，大大提高了其灵敏度和稳定性。 吴永强 4 0 1 研究了在石英晶体表面上组装纳米金，利用水溶性聚合物聚乙二醇 ( p e g ) 为凝集剂，加入聚乙烯醇( p v a ) 增加其凝聚力，利用金纳米粒子对传 感器的信号放大增敏作用、比表面积大以及较好的生物相溶性等优良特征，在晶 振表面固定乙肝核心抗体( i g m ) ，构建了一种高灵敏度的乙肝液相压电免疫传感 器，应用于样本检测。该方法与酶联免疫分析方法( e l i s a ) 无显著差异。 p a n i n in v 等【4 1 】用多壁碳纳米管修饰玻碳电极，研究出免疫传感微流集成系 统，用于在人血清样本中，快速灵敏的定量检测前列腺特异性抗原( p s a ) 。鼠 单克隆抗体( 5 g 6 ) 被固定于旋转圆盘上，前列腺特异性抗原与鼠单克隆抗体和 辣根过氧化物酶标记的二抗反应，过氧化氢作为催化剂，电化学检测在1 分钟内 完成，整个检测过程耗时3 0 分钟。 s a n c h e zs 等【4 2