（遗传学专业论文）人类新基因arhgap12的功能研究.pdf

摘要 lr h o 家族蛋白参与各种细胞过程如细胞骨架重组织、细胞周期调控、基因表 达谪控、细胞粘附、迁移等。r h o 家族蛋白激活蛋白( r h og t p a s ea c t i v a t i n g p r o t e i n s ，r h o g a p s ) 是r h o 家族蛋白的负调控因子。所有的r h o g a p 蛋白都含有 一个r h o g a p 结构域，它可以刺激r h o 家族蛋白内在的g t p 水解酶活性，使激活 的r h o 能够及时灭活。除了r h o g a p 结构域之涉h ，许多r h o g a p 蛋白还带有其他功 能域如s h 2 、s h 3 和s h 3 结合m o t i f 等。 本实验室从人胎脑c d n a 文库中分离到一条新的r h o g a p 基因，它具有两种剪 接形式。生物信息学分析发现它有2 0 个外显子，位于l o p l 2 。它的蛋白产物有5 个结构域：s h 3 、1 j w 、删、p h 和r h o g a p 。根据h u g o 命名规则它被命名为a r h g a p l 2 。 在生物信息学分析的基础上，我们对该基因进行了以下的实验研究。表达谱分 析。通过p c r 和n o r t h e r n 杂交，我们分析了它在正常组织和肿瘤细胞中的表达 谱，发现它是广谱表达的；胞内过表达分析。该基因的编码区被转染入h 0 8 9 1 0 细胞以观察可能的对宿主细胞在形态和增殖能力上的影响，结果表明它在胞内过 表达可刺激宿主细胞的增殖能力；绿荧光蛋白定位。用该方法我们检测了该基 因产物在细胞内的定位，发现细胞在静息状态下它主要分布于细胞质中；g a p 活性分析。为测定该基因的r h o g a p 结构域的活性，我们将其原核表达并进行了 体外g a p 活性分析实验，结果排除了该结构域对r h o a ，r a c l 和c d c 4 2 h s 的g a p 活性；体外亲和层析法结合实验。原核表达了该基因的s h 3 和1 v l j r 结构域及基 因内一段可能为s h 3 1 】1 v 结构域结合位点的序列，并用体外亲和层析法检测它们 之间是否相互结合，以验证该基因是否存在自抑制的调控方式，实验结某表明 s h 3 和w w 结构域能和该位点不能结合，不存在自抑制调控。这些实验结果初步揭 示了a r h g a p l 2 基因的功能，为进一步深入研究提供了有用的信息。 关键词r h o 家族； 一 r h o g a p 蛋白；s h 3 结构域；w w 结构域 v a b s t r a c t r h og t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n s ( r h o g a p s ) a r en e g a t i v er e g u l a t o r so fr h o f a m i l yp r o t e i n st h a ta r ep r o p o s e dt op a r t i c i p a t ei nav a r i e t y o fc e l l u l a r e v e n t si n c l u d i n gr e o r g a n i z a t i o no fa c t i nc y t o s k e l e t o n ， g 1c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n ，g e n ee x p r e s s i o n ，c e l la d h e s i o n ，m i g r a t i o n ，p h a g o c y t o s i s a n d s oo n a ilt h er h o g a p sc o n t a i nac o n s e r v e dr h o g a pd o m a i n ，w h i c ha c ta s s t i m u l a t i n gt h ei n t r i n s i cg t ph y d r o l y s i sa c t i v i t yo fr h o b e s i d e sr h o g a p d o m a i n ，m a n yr h o g a p sa l s oc o n t a i no t h e rf u n c t i o n a lr e g i o n s ，s u c ha ss h 2 ， s h 3d o m a i na n ds h 3b i n d i n gm o t i f ，w h i c ha r ei n v o l v e di np r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n s w ei s o l a t e dan o v e lr h o g a pd o m a i nc o n t a i n i n gg e n ew i t ht w os p li c e v a r i a n t s f r o mh u m a nf e t a lb r a i nc d n al i b r a r y b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i s s h o w e dt h a tt h ep u t a t i v ep r o d u c to ft h eg e n ec o n t a i n sf i v ed o m a i n s ：r h o g a p s h 3 。p ha n dt w ow wd o m a i n s b a s e do nt h er e s u l t so fb i o i n f o r m a t i cd a t a 。 w e p e r f o r m e d t h e f o l l o w i n ge x p e r i m e n t s e x p r e s s i o np r o f i l e d e t e r m i n a t i o n t h r o u g hp c ro fh u m a nn o r m a lt i s s u e s c d n aa n dn o r t h e r n b l o t t i n go fh u m a nt u m o rc e l ll i n e s w e c o n f i r m e dt h ef u l ll e n g t ho fi t s c d n aa n df o u n di ti sau b i q u i t o u s l ye x p r e s s e dg e n e o v e r e x p r e s s i o n a s s a y t h ef u l lo r fo ft h eg e n ew a st r a n s f e c t e di n t oh 0 8 9 1 0c e l ll i n e t h e n t h es t a b l ee x p r e s s i o nc e l ll i n ew a ss e l e c t e d t h ep o s s i b l ee f f e c t so ft h e g e n eo nt h em o r p h o l o g ya n dp r o l i f e r a t i o nr a t eo ft h eh o s tc e l l sw e r e o b s e r v e d w ef o u n dt h eg e n ec a ns t i m u l a t es l i g h t l yt h ep r o l i f e r a t i o no f t h eh o s tc e l l s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o ni d e n t i f i c a t i o n u s i n gt h eg f p f u s i o ne x p r e s s i o nt e c h n i q u e ，w ei d e n t i f i e dt h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n o ft h ep r o d u c to ft h eg e n e i ti sm a i n l y l o c a l i z e di n t h ec y t o p l a s mo f r e s tc e l l s g a pa c t i v i t ua s s a y t h er h o g a pd o m a i nw a se x p r e s s e di n c o l i a n d p u r l f i e d t h e i nv i t r og a pa s s a yw a s p e r f o r m e dt o d e t e r m i n ei t s a c t j v i t yt ot a r g e tr h op r o t e i n s w ed i dn o td e t e c ti t sg a pa c t i v i t yt o r h o a ，r a c la n dc d c 4 2 h s 血v i t r ob i n d i n ga s s a y w ea l s op e r f o r m e dt h ei n v i t r ob i n d i n ga s s a yt os e ei fi t ss h 3a n dw wd o m a i n sc a nb i n do n eo fi t s p u t a t i v es h 3 wb i n d i n gs i t e t h er e s u l tw a sn e g a t i v e t h e s ee x p e r i m e n t s p r o v i d ev a l u a b l ei n f o r m a t i o nf o ru n d e r s t a n d i n gt h er o l eo ft h eg e n e k e yw o r d s ：r h of a m i l y ：r h o g a p ：s h 3d o m a i n ：w wd o m a i n 2 一日u 吾 小g t p 结合蛋自( g 蛋白) 是一类能和g t p g d p 结合的分子量在2 0 - 3 0 k d a 左右的蛋白。1 9 7 8 年在大鼠肉瘤病毒中发现了v h a - r a s 蛋白，成为该类蛋白中 第一个被发现的成员。到现在为止，已发现超过1 0 0 种小g 蛋白，它们存在于 从酵母到人类的所有真核细胞中，组成了一个庞大的蛋白超家族。根据蛋白结构 的相似性，这个超家族可分成至少五个家族：r a s ，r a b ，r h o ，s a r l a r f 和r a n 。 通过近2 0 年的研究，对这些家族蛋白的功能已经有了大体的了解：r a s 家族成 员主要控制细胞的增殖和分化；r a b 和s a r l a r f 家族成员调节胞内小泡运输；r a n 家族成员调节在g l ，s 和g 2 期时的核质转运及m 期的微管组织；r h o 家族成 员主要参与肌动纤维骨架的重组织( 详见下文) 。 1 r h o 家族 g h o 蛋白家族成员有：r h o ( 包括r h o a ，r _ h o b ，r h o c ) ，c d c 4 2 ( c d c 4 2 h s 和g 2 5 k ) ，r a c ( 包括r a c l ，r a c 2 ，r a c 3 ) ，t c l 0 ，t t f ，r h o g ，r h 0 6 r n d l 。 r h 0 7 r _ r t d 2 ，r h 0 8 r n d 3 ，鼬m e - r h o d 和r h o h ( 1 ，2 5 ) 。其中研究的最多的 是r h o a ，r a c i 和c d e 4 2 h s 三个成员蛋白。r h o 表示r a s - h o m o l o g o u s ，第一个 r h o 蛋白是于1 9 8 5 年在海蛤蝓4 p 6 e ，幻中克隆到的，并立即在人类中找到了三个 同源蛋白r h o a ，r h o b 和r h o c ( 3 ) ，在1 9 9 0 年前后又相继克隆到了r a c i ，r a c 2 和c d c 4 2 ( 4 ) ，之后其家族迅速壮大。当时r a s 家族蛋白由于和癌症发生相关而 成为研究热点，作为和r a s 同源的一个新家族，r h o 家族也成为了9 0 年代信号 转导领域的热点研究对象。经过十几年的工作，现在对r h o 家族蛋白1 的功能和 活性调控都有了比较全面的了解。 i - i r h o 家族蛋白的功能 r h o 家族蛋白广泛参与细胞内的各种过程，表l ( 5 ) 总结了r h o ，r a e 和c d c 4 2 参与的胞内活动。 r h o + r a c4-4-+ c d c 4 2+ 本史中“r h o 家族蛋白”泛指r h o 家族所有成员蛋白，“r h o 芏f i 白”专指r h o a ，r h o b 和r h o c 表i r h o r a c 平c d c 4 2 参与的胞内活动。这些途释能铍激活的r h o 家族蚩f 1 诱导域能做 显性负敛麻的r h o 家族蚩向抑制。n a p d h 氧化酶复合体只存在r 某些吞噬细胞r h 仃r h o 蛋白参与的分泌只限y - m a s t 细胞。本表米白b i s h o pa l ，h a l la b i o c h e m i 2 0 0 0 1 u n1 ：3 4 8 p t2 ：2 4 l 一5 5 1 - 1 1 参与肌动纤维细胞骨架的重组织 r h o 家族蛋白的主要功能是调节肌动纤维细胞骨架的重组织。j t j r 动出r 1 纤 维通常重组织成3 种结构( 见图1 ) ：f i l o p o d i a ，是一种指状突出，沿突的 方向分布有一束肌动纤维，这种结构常见于运动细胞和神经生长锥 l a m e l l i p o d i a ，是细胞边缘的薄片状突出，突出内分布有肌动蛋白片层结构，常 见于培养的成纤维细胞s t r e s sf i b e r s ，成束的肌动蛋白纤维横贯整个细胞通 过局部粘附和胞外基质连接( 7 ) 。这3 种重组织的调控都有r h o 家族蛋白参与。 通过用重组的r b o 蛋白注射s w i s s 3 t 3 细胞的一系列实验( 8 ，9 ，1 0 ) ，已经知道r h o 蛋白激活可形成s t r e s sf i b e r s ；r a c 蛋白激活促使肌动蛋白纤维在细胞周边从 头合成而形成l a m e l l i p o d i a 和细胞膜皱褶；c d c 4 2 蛋白激活引起肌动蛋白纤维合 成而形成f i l o p o d i a 。这3 类蛋白激活同时还都能形成整合素粘附复合体，浚复 合体的功能未知( 2 ) 。 幽1 r h o 家族蛋向控制肌动蚩向纤维的重组织。s w i s s 3 t 3 细胞的肌动蛋白纤维( a 、c 、e 、 g ) 和糕合素枯附复合体( b 、d 、f 、h ) 。a 、b ：静息的s w i s s 3 t 3 细胞；c 、d ：r h o 生 白激活：e 、f ：r a c 蛋向激活；g 、h ：c d c 4 2 蚩向激活。本幽米臼h a l l a s c i e n c e 1 9 9 8j a n 2 3 ：2 7 9 ( 5 3 5 0 ) ：5 0 9 1 4 幽l 。 研究还发现r h o 家族蛋白引起的肌动蛋白纤维变化效应是交叉的。激活 c d c 4 2 形成f i l o p o d i a ，同时还伴有明显的i a m e l l i p o d i a 。r a c 激活在静息的 s w i s s 3 t 3 细胞中可引起微弱的s t r e s sf i b e r s 合成，但在生长的细胞中反1 阿减 少s t r e s sc i h e r s 数量( 2 ) 。r h o ，r a c 和c d c 4 2 的关系见图2 。 一； ii i 围困因 | 鳘| 2 r h o ，r a c 雨ic d c 4 2 二者笑系及激活后引起的肌动纤维年| i 粘附复合体变化。小i 划_ 5 据 m a c k a yd j ，h a l la 。jb i o lc h e m 1 9 9 8a u g1 4 ：2 7 3 ( 3 3 ) ：2 0 6 8 5 8 幽2 修改而水。 1 - 1 - 2 细胞生长控制 虽然r h o 家族蛋白对肌动蛋白纤维的调控吸引了众多的研究，现n ：它对细 胞增值的影响也越来越得到关注。往s w i s s 3 t 3 细胞注射r h o 、r a c 或c d c 4 2 蛋 白能促使细胞通过g l 期，d n a 合成量增加，而注射显性负效应的r h o 、r a c 或 c d c 4 2 蛋白能抑制血清诱导的d n a 合成( 1 1 ) 。r h o ，r a c 和c d c 4 2 还“f 转化 细胞的潜能。表达组成型活性的r a c 和r h o 的细胞在低血清条件下的坐长能力 提高，而且是不依赖锚定的，接种裸鼠导致肿瘤( 1 2 ) 。表达组成型活性的c d c 4 2 的成纤维细胞也是不依赖锚定的，在裸鼠罩增殖，但低血清条件下的生长并没有 增强( 1 3 ) 。而且发现r h o 、r a c 和c d c 4 2 蛋白是r a s 诱导的细胞转化所必需的， r a s 和r h o 家族介导的细胞转化不再是两个独立的事件，这两个家族的信号途径 交织成了复杂的网络，最后导致了肿瘤发生和迁移( 1 ) 。 1 1 3 基因转录调控 r h o 家族蛋白的另一大功能是调控基因表达。r a c 和c d c 4 2 ( r h o 除外) 可 以刺激i n k s t r e s s a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ( s a p k ) 和p 3 8m a p 激酶活性( 见表 1 ) 。j n k s a p k 和p 3 8 主要被淋巴因子和细胞压力如紫外线照射，热激等激活， 激活之后进入核内磷酸化转录因子引起靶基因表达。r a c 和c d c 4 2 如似1 j j n k s a p k 和p 3 8 联系起来目前还不太清楚( 7 ) 。另外，r h o ，r a c 和c d c 4 2 还 可刺激血清应答因子( s e r u mr e s p o n s ef a c t o r ，s r f ) 和n f - k b 的活性( 2 ) 。 1 1 - 4 其他功能 r h o 家族蛋白还有许多其他功能，如参与调控细胞粘附和迁移，小泡运输， 分泌，吞噬，轴突生长，胞质分裂等细胞过程( 6 ，1 4 ，1 5 ) ，限j 二篇幅，小m 介绍。 i 2 r h o 蛋白的活性调控 和其他小g 蛋白一样，r h o 家族成员蛋白也结合g t p g d p 。当细胞处j i 静息 状念时，r h o 家族蛋白和g d p 结合，没有活性：当细胞受到某些刺激的时候， 结合的g d p 被换成g t p ，r h o 家族蛋白被激活而可以和下游蛋白作用；完成作 用之后结合的g t p 又被水解为g d p ，r h o 家族蛋白回到原来的无活性状念。仃 3 类蛋白参与r h o 家族蛋白的这一活性循环。 1 2 1 鸟苷酸解离抑制因子( g u a n i n en u c l e o t i d ed i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r s ，g d i s ) g d i s 和r h o g d p 结合，抑制g d p 从r h o 蛋白解离( 6 ) 。它结合在r h o 蛋 白的c 端，还使r h o g d p 从细胞膜上脱离下来并阻止其与膜再结合。细胞伍静 息状念下，r h o 蛋白绝大部分以g d p 结合的形式和g d i s 形成复合体存在于细胞 质中。g d i s 与r h o 分离是g d p 换成g t p 必需的，但分离机制现在还不清楚。 1 2 2 鸟苷酸交换因子( g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g ef a c t o r s ，g e f s ) g e f s 又称g d p 解离刺激因子( g d pd i s s o c i a t i o ns t i m u l a t o r s ，g d s s ) ，其e 要功能是使g d p 从r h o 蛋白解离，从而促使r h o 蛋白和g t p 的结合，因为胞 内g t p 摩尔浓度大约是g d p 的1 0 倍( 8 ) 。r h o 蛋白的g e f s 都有两个共嗣的结 构域：一个是d b l h o m o l o g y ( d h ) 结构域，它是体外g e f 活性必需的( 7 ) ；另 一个是p h ( p l e c k s t r i nh o m o l o g y ) 结构域，决定着g e f s 在胞内的证确定位( 9 ) 。 有些g e f s 的p h 结构域是d h 结构域的负调控因子，p h 和d h 结合形成白抑制， 当p i p 3 和p h 结构域结合时才释放d h 结构域( 4 ) 。 1 - 2 - 3 g t p 酶活化蛋白( g t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n s ，g a p s ) r h o 蛋白有内源性的g t p 水解酶活性，但活性很低，g a p s 能促进这种活性 从而加速r h o 蛋白水解结合的g t p 。有关g a p s 的内容详见下文。 2 r h o g a p 蛋白 由于r h o 家族蛋白自身的g t p a s e 活性很弱，因此它被激活后的活性持续时 间主要是出r h o g a p 蛋白决定的。r h o g a p 蛋白可以极大促进r h o 家族蛋白的( 川， 水解酶活性，如p 5 0 r h o g a p 可使r h o a 的g t p 水解酶活性提高1 0 i 倍( 2 2 ) 。 2 1 r h o g a p 蛋白的发现 最甲发现含r h o g a p 结构域的蛋白是在1 9 9 1 年。在这之j i 已经征人类j | j f 加i ： 抽提物中分离出一个2 9 k d a 的蛋白具有r h o g a p 活性，对这个蛋白部分测序后加 s w i s s p r o t 数掘库中搜索出了两个蛋白：b c r 和n - c h i m a e r i n ，它们成为最先找 到的含r h o g a p 结构域的蛋白( 2 3 ) 。后来发现分离到的2 9 k d a 蛋白其实岁 足 个更大蛋白( 5 0 k d a ) 的一部分，这个蛋白到1 9 9 4 年j 获得完艘序列，称为 p 5 0 r h o g a p ( 2 4 ) 。 自从第一个r h o g a p 蛋白被找到以后，发现的r h o g a p 蛋白越来越多，迄今 为止( 2 0 0 2 5 1 3 ) ，用c d a r t ( c o n s e r v e dd o m a i na r c h it e c t u r er e t r i e v a lt o ol ， h t t p ：w w w n e b i n l m n i h g o v s t r u c t u r e l e x i n g t o n l e x i n g t o n c 西) 在g e n b a n k 数据库 中查到的含有r h o g a p 结构域的蛋白序列共有3 1 4 条( 见图3 ) 。对于二为什么会有 如此多的r h o g a p 蛋白( 比r a s g a p 蛋白多的多) ，目盼还没有合理的解释。不| i 可 的组纵分布是一个原因，但不是主要的，因为大部分r h o g a p 蛋白都是广谱表达 的( 见表2 ) ；底物特异性和催化能力不同可能是另一个原因；另外，不同的r h o g a 可能被限制在胞内不同的部位起作用，因为很多r h o g a p 蛋白都有蛋白相互作用 的结构域或膜结合的结构域( 见图3 ) 。 2 2 主要r h o g a p 蛋白的组织分布和底物特异性 不同的r h o g a p 有不同的底物特异性和组织分布( 例子见表2 ) 。体外实验获 得的底物特异性可能比体内实际的底物特异性要宽，如p 5 0 r h o g a p 在体外可以刺 激r h o ，r a c ，c d c 4 2 的g t p 酶活性，但在体内却只能和r h o 作用( 2 5 ) 。 农2 ：哺乳动物一些含r h o g a p 结构域蚩自的底物特异性年l l 细织分柿。本收地仡i 吼i v ( a 1 g e n e sd e v e l o p m e n t1 9 9 7 ：l l ：2 2 9 5 2 2 表2 基础上补充而米。 崩鼍o o 。 二，：一。- _ 。一_ _ ：- 一- _ _ -” j 如= ”。o i = ；j j 生 = _ _ _ j ：k 一一oj 二一一- _ - w j 0 # = 一一。 裂备：。_ 嚣。， 兢，o 岳i = 1 - = 出= 。o s 。= 一一。h 勰= _ 一 ，：一_ _ _ _ l _ - i 一 - 。l l - 材， “吉，_ - 点h ：= - - 一 二h 赫，o i ；z “_ ：一 老b 1 “o - _：一- _ _ _ _ 一 巍，1 “。? o g ：二= 。= 可= ：一 j ：= p = 一o j ：，- 一。_ 。_ _ 0 ：一_ 卜- _ _ _ - 卜 d j k 一。l ，。_ _ _ 。 2 _ _ _ - - - 岳赫鼍 幽3 g e n s a n k 中含r h o g a p 结构域的蛋向汇总。贝育相同蛋向结构的铍升为一类。幽中红色 饮方形代表r h o g a p 结构域。 2 3 r h o g a p 蛋白的催化机理 r h o g a p 结构域大约长1 5 0 个氨基酸，含该结构域的不同蛋白的蚓源比对表 明它们的r h o g a p 结构域的相同程度( i d e n t i t y ) 在2 0 4 0 之间，有3 个保守 区域( 2 4 ) 。r h o g a p 结构域和r a s g a p 结构域没有明显同源。1 9 9 7 年p s o r h o g a p 的r h o g a p 结构域的空间结构被解析出来，发现其有9 个a 螺旋，其中4 个集结 成束，并推测一个保守的a r g 残基( p 5 0 r h o g a p 的a r 9 2 8 2 ) 是g a p 结构域结合r h o 家族蛋白的关键( 2 6 ) 。随后p 5 0 r h o g a p 与c d c 4 2 h s - g m p p n p ( g t p 的类似物，不 能被水解) 结合以及p s o r h o g a p 与r h o a g d p a i f 一( g t p 水解的过渡念类似物) 结 合的晶体结构也被解析出来( 2 7 ，2 2 ) ，在空间结构上阐明了r h o ( ；a p 刺激r h o 家 族蛋白g t p 水解活性的作用机制：p 5 0 r h o g a p 的一个a r g 残基( 在所有r h ( ) g a p 蛋白中保守) 对g a p 活性起关键作用，当r h o g t p 由基念向过渡念转变时，该 a r g 残基的侧链改变角度插入了r h o g t p 的活性位点，从而使过渡念得到稳定。 在，上化水平上，p 5 0 r h o g a p 的g a p 结构域催化c d c 4 2 一g t p 的反应动力、参数 已经被测定( 2 8 ) 。p 5 0 r h o g a p 和c d c 4 2 一g t p 迅速结合并达到i 卜衡，二枵毛侩f ： 是反应的限速步骤：用不同的r h o g a p 蛋白和c d c 4 2 作用发现催化效率和亲和常 数成正比；p s o r h o g a p 和c d c 4 2 一g d p 不能结合，说明反应产物对反应无抑；i j j j f l ；l t j ( 2 8 ) 。这与r h o a 不同，r h o a - g d p 和g a p 还有相当的结合能力( 2 9 ) ，这表i 蚶了 不同r h o g a p 蛋白对r h o 家族蛋白在催化动力学上的多样性。另外还发现了m g 在陔反应中的作用：r h o 家族蛋白结合g t p 不需要m g ，但m g 能够稳定r h o g t p ， r h o g a p 对r h o 家族蛋白的催化作用在m g 。存在条件下可提高i o 倍，而且特异性 增强( 3 0 ) 。 f l m o d e l1 i b ) m o d e l2 r e s t i 呻c e l l sr e s u n gc o i l s s h m u l a t s dc 酣s 图4 r h o 家族蚩舟激活的两个模型。本陶来臼s y m o n sm ，s e t t l e m a nj ，t r e n d sc e l lb i n l 2 0 0 0o c t ：1 0 ( 1 0 ) ：4 1 5 9 凹2 。 2 4 r h o g a p 蛋白的活性调控 含有r h o g a p 结构域的蛋白一般都比较大，大多数还含有其他结构域如洲、 s h 2 、s i t 3 等。很可能r h o g a p 除了可以促进g t p 水解以外，还在细胞信号转导中 有更多的作用，这一猜测已在n - c h i m a e r i n 上得到证实。研究发现它除了有对 r a c 的g a p 活性外，其n 端不含g a p 结构域的一段区域还可辅助r a c l 和c d c 4 2 蛋白诱导细胞骨架形态改变( 3 1 ) ，这一功能是与g a p 活性相独立的。另外， p 1 9 0 g a p 可以和p 1 2 0 r a s g a p 结合形成复合体，可能在r a s 和r h o 信号途径的交q ： 办调中起桥梁作用( 3 2 ) 。 由于很多r h o g a p 蛋白都是广谱表达的，因此它们在细胞内必须受到小心的渊 控，才能使r h o 家族蛋白在必要的时候能被激活。r h o 家族蛋白激活仃炳个午5 j ! 魁 ( 见图4 ) ：模型l 认为细胞静息时r h o g a p 和r h o g e f 活性足鄙受到抑制的，“1 细胞受到刺激时r h o g a p 和r h o g e f 活性都增强，但r h o g e f 活性增强程度史人， 使平衡向r h o - g t p 方向移动；模型2 认为细胞静息时r h o g a p 和r h o ( ；e f 都足仃活 性的，但r h o g a p 活性更强，当有刺激信号时r h o g e f 活性增强，丽r h o ( ；a i i 再- f l - ： 受到抑制，r h o g t p 因而大大增多( 3 3 ) 。有实验证据支持模型2 ：抑制r h o ( ；a i 的 活性，在r h o g e f 未被激活时就足以诱导r h o 蛋白介导的肌动纤维重组织( 3 4 ) 。 无论哪种模型，r h o g a p 蛋白活性在r h o 家族蛋白激活f ；i 后都有很大变化，这说 明对r h o g a p 蛋白的活性调控是r h o 信号途径中很重要的一环。有研究表明r h o ( ；a p 蛋白的非r h o g a p 结构域部分会影响到其g a p 活性，如b c r 的r h o ( ；a p 结构域比伞 长蛋白具有更强的g a p 活性( 2 8 ) ，n - c h i m a e r i l 3 的一段c y s 富集区能结合脂类， 这种结合直接影响到其体内的g a p 活性( 3 5 ) ，p 1 9 0 g a p 的g a p 活性受到其n 端的 g t p 结合结构域的调节( 3 2 ) ，p 5 0 r h o g a p 的c 端一个区域对g a p 活性是必需的( 3 6 ) 。 但目前对r h o g a p 蛋白的活性调控方面的工作还很少。 本实验室经大规模c d n a 测序从人胎脑c d n a 文库中克隆到2 条全新的c d n a ， 一条长4 ，1 7 3 b p ，另一条长4 ，0 8 3 b p 。这两条c d n a 序列上只相差9 0 b p ，经分析 是同一基因的2 种剪接形式。信息学分析表明该基因编码的蛋白的c 端有个 r h o g a p 结构域，除此之外，还含有一个s h 3 结构域，一个p h 结构域，两个w w 结构域及一个s h 3 1 】1 v 结合m o t i f ，因此它是一个典型的r h o g a p 蛋白。两条c d n a 序列已经提交g e n b a n k 数据库，编号分别为a y 0 3 3 5 9 4 和a y 0 3 3 5 9 5 。经h u g 【) 基因 命名委员会批准，该基因被命名为a r h g a p l 2 。本论文从该基因的表达谱、产物 胞内定位、r h o g a p 结构域活性、超表达对细胞的影响等方面研究了该基因的功 能。由于基因产物既含有s h 3 、w w 结构域又有该结构域结合的m o t i f 而且在咳 m o t i f 的邻近有两个s e r i n e 激酶位点，因此推测可能静息时该基因产物的s 1 1 3 w w 结构域和陔m o t i f 结合，蛋白不能正确定位而无活性，当有信号使上述位点磷 酸化时，结合被破坏，释放出s h 3 或，| v w 结构域，蛋白有活性，因此本论文中还 检测了在体外s h 3 和w w 结构域是否和s h 3 w w 结合m o t i f 结合。 1 ) 实验所需质粒的构建 二材料与方法 名称载体抗性 插入片段内切酶j i j 途 ( 5 一3 ) p c f u l l p c d n a 4h i s b ( i n v i t l o g e r l ) 氰苄2 7 4 1 。2 7 2 8 b pe c o r ix h o i “+ 鱼转染 4 l s h 3 p e t 4 1 b ( n o v a g e n ) 卡挪 2 7 4 7 8 7 b p e c o r i x h o i 抓核是逃1 外p j 城 3 2 w w p e t 3 2 b ( n o v a g e n ) 鲺苄1 0 6 0 1 9 3 9 b p e c o r i x h o l 崃七蠡农选* 绌f 4 城 ；f p f u l lp e g f pc l ( c l o n t e c h ) 卡爿j 2 7 6 2 7 5 9 b p x h o i e c o r i 缄荧光止f p 1 5 p e pd g e x 一2 t ( a p h a r m a c i a )氨苄1 0 1 6 一1 0 6 0 b p b a m h i e c o r i 帐恢曩边s i l ：l 拈a 似一_ p g g a p p g e x 一4 tl ( a p h a r m a c i a ) 氨苄2 1 4 7 2 7 2 8 b pe c o r i x h o i 衄i 盘曩逃r h r l ；a i 蚺# 城 材料与仪器 1 e l o n g a s e 2 t a q 3 e c o r i 4 x h o l 5 t 4 l i g a s e 6 d n am a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) 7 质粒抽提试剂盒 8 p c r 纯化试剂盒 9 割胶回收试剂盒 1 0 载体 1 1 p c r 仪( 2 4 0 0 ) 1 2 引物： g f p f u l l g i b c ob r l 生工 n e w e n g l a n d b i o l a b s n e w e n g l a n d b i o l a b s n e w e n g l a n d b i o l a b s t 出a r a q i a g e n q i a g e n q i a g e n 见上表 p e r k r ne i m e r s ( 2 7 6 ) 5 一c c ct c ga g aa a tg g ct g ac a ga a gt g g ( ；一3 a ( 2 7 5 9 c ) 5 一c g ga a tt c at c ca g ct t ct a tt c ca c a ( ；一3 p c f u l l s ( 2 7 4 ) 5 - c g ga a tt c ga a aa t gg c tg a ca g aa g tg 一： a ( 2 7 2 8 c ) 5 c c ct c ga g ta a ( ja a tc a ac g tc c ga a ga - 3 p g g a p 试剂 s ( 2 1 4 7 ) 5 一c g ga a tt c tc c aa t ct c 6c t aa t ct g t ( 一j a ( 2 7 2 8 c ) 5 c c ct c ga g ta a ga a tc a ac g tc c 6a a ga - 3 4 l s h 3 s ( 2 7 4 ) 5 一c g 6a a tt c 6a a aa t gg c tg a ca g aa g tg 一3 a ( 7 8 7 c ) 5 一c c ct c 6a g at t ct g gc t 6g a aa c tt t ag 一3 3 2 w w s ( 1 0 6 0 ) 5 一c g 6a a tt c gg c aa t tc a 6a t ta t tg g a6 - 3 a ( t 9 3 9 c ) 5 - c c ct c ga g tt c aa t tc c tt c at c ag r tt - 3 注：所有引物都加酶切接头和保护碱基，e c o r l 的保护碱基是c ( ；，x h o i 的保护碱基是c c 。 1 5 p e p s ( 1 0 1 6 )5 - g a tc c ct g aa a at t a6 c ca g ag c gc g ct g cc ( ；c c ( ；ct ( ：c c g gg t a6 c cc g ta a g - 3 a ( 1 0 6 0 c ) 5 一a a tt c tt a cg g gc t ac c cg g ca g c6 g cg g ca g cg c gc t c t g gc t aa t tt t ca g g 一3 注：1 5 p e p 的插入片段直接合成，无需p c r 扩增。s ( 1 0 1 6 ) 的5 端带b a m h i 酶切位点右侧序列“6 a t c ”，a ( 1 0 6 0 c ) 的5 端带e c o r i 酶切位点右侧 序列“a a t t ”，二者其余部分是互补的，退火后自动形成5 b a m h i 和 3 e c o r i 的粘性末端，不需酶切。 1 0 5 m o i ie d t a( p h8 05 0 0 m i ) ： e d t a n a 2 ( 乙二胺四乙酸二钠) 9 3 0 6 9 ，加入3 0 0 m l 水和l o m ll o m o l ln a o h 调 p h 至8 0 ，加水定容至5 0 0 m l ，分装后高压灭菌，备用( 或过滤后就无需灭菌) 。 2 t f b l ( p h5 8 ， ： 0 m m l o m m 5 0 m m 5 0 0 m 1 ) ： 乙酸钾( m = 9 8 ) 氯化钙( m = 1 4 7 ) 氯化镭( m = 1 9 8 ) 1 4 7 9 0 7 4 9 4 9 5 9 l o o m m氯化铷( m = 1 2 i ) 6 0 5 9 1 5 甘油7 5 m l 无水甘油 加入2 0 0 m im i l l y q 水搅拌溶解后，加无水甘油7 5 m l ，用l m 乙酸凋节p j ( 5 8 ) 定容至5 0 0 m l ，过滤备用( 滤纸灭菌，试剂无需灭菌) 。 3 t f b 2( p h6 5 ， 1 0 m m 7 5 m m l o m m 1 5 甘油 l o o m ) ： m o p s( m = 2 0 9 ) 氯化钙( m = 1 4 7 ) 氯化铷( m