（遗传学专业论文）农杆菌介导的gshi和pcs基因转化翦股颖和烟草研究.pdf

l9 9 7 ：r a s k i ne ta 1 ，1 9 9 7 ) ： ( 】) 植物萃取( p h y t o e x t r a c t i o n ) ：指利用些具有较强富集能力的特殊 植物从土壤中吸收重金属或有机毒物，并将其转运和储存到该植物的司收割 部分。嗣前植物萃取的研究丌展的比较多，b a k e r 等在英国首次利用t 1 1 l a s p i c a e r u l e s e n c e s 修复长期污泥导致重会属污染的土地，证实了这一技术的可行性 ( b a k e re ta j 。，1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) 植物降解( 曲y t o d e g r a d a t i o n ) ：指利用植物及其周围的相关微生物 降解有机污染物。 ( 3 ) 植物固定( p h y t o s t a b i 】i z a t i o n ) ：指利用尉重金属植物吸收重金属从 而降低土壤中有毒金属的移动性，从而减少金属被淋滤到地下水或通过空气 扩散进一步污染环境的可能。 ( 4 ) 植物挥发( p h y t o v o l a t i l i z a t i o n ) ：指利用植物吸收壤中的污染物并 将其转化为气念物质释放到空气中。如烟草能使毒性大的二价汞转化为气态 的汞( m e a 曲e r ，2 0 0 0 ) ，革麻可使土壤中4 7 的三价硒转化为甲基硒挥发去 除( b a n u e l o se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 ( 5 ) 根系过滤( r h i z o f l l t r a t i o n ) ：指利用植物根部从污水中吸收、沉淀、 富集污染物，主要是重金属。例如水科植物浮萍和水葫芦可有效吸收清除水 体中的c d 、c u 和a s ( z a y e d o ta 1 ，1 9 9 8 ；z h ue ta 1 ，1 9 9 9 a ) 。 2 超富集植物与植物修复 超富集植物是能适应高含量的重金属土壤环境而生长，并能在其地上部 分富集大基重会属的一类特殊植物。在一些重金属污染严重的地区能够找到 超富集植物( b a k e ra n db r o o k s ，1 9 8 9 ) 。目前，已经发现的超富集植物大约有 4 0 0 多种( k r a m e r e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，其中大部分是在欧洲、美国、新西兰和澳洲 的污染区发现的，在我国也已经发现了一些超富集植物，例如a s 的超富集植 物p t e r i sv i t t a t al ( 蜈蚣草) 。关于超富集植物的一些介绍可以参考c h a u d h r y 等人( c h a u d h r ye ta 1 ，1 9 9 8 ) 和b o n a v e n t u r e 和j o h n s o n 的文章( b o n a v e n t u r e a n dj o h n s o n ，1 9 9 7 ) 。 作为一个理想的植物修复材料，应该具备阻下特点：( 1 ) 具有富集一种 和几种重会属的能力，并做好能富集到植物的地上部分；( 2 ) 对富集到体内 的重会属有州受性：( 3 ) 具有高的生物量，生长速度快；( 4 ) 具有发达的根 系( g a r b i s ua n da 1 k o n a ，2 0 0 l ：k a r e n l a m p je ta 1 ，2 0 0 0 ；k r a m e ra n dc h a r d o n n e n s ， 2 0 0 1 ) 。在这些要素中，研究者认为最重要的特点是要有例受性和富集能力 ( c h a n e ye ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 超富集植物对重金属的富集能力比普通植物高出几十倍到几百倍，但它 们对重余属的吸收有一定的选择性。目前发现的大部分超富集植物不能够富 集好几种重会属( w a t a n a b e ，1 9 9 7 ) 。而且由于超富集植物往往植株矮小，生 长速度慢，再加上受气候、土壤环境的限制，而生长速度快，生物量大的植 物往往对重会属耐受性低，组织中富集量不高。因此，为了能使植物修复具 有更大的实际应用价值，就必须使得普通植物具有超富集植物的优良性能 在这方面，已有研究者将转基因技术应用于植物修复的研究。 3 转基因技术在植物修复中的应用 目阿越来越多的与植物修复相关的基因正被从植物、微生物和动物中陆 续分离出来，例如汞离子还原酶基因明e 删、有机汞裂解酶基因m p 旭、a c c 脱氨基酶基因、余属硫蛋白基因 仃、y 谷氨酰半胱氨酸合成酶基因芦 ，、谷 胱甘肽合成酶基因伊 、植物螫合肽合成酶基因p c s 、铁离子还原酶基因 腓0 i 和锌转运蛋白基因z 伊等，已有研究者将这些基因转入植物中使其表现 出了重金属的唰受性和富集能力( 见表1 ) 。 表1 部分转基因植物对重金属耐受性和富集能力 t a b i ela l t e r e dm e t a it o l e r a n c e u p t a k ei nt r a n s g e n i cp l a n t s 4 植物修复技术展望 植物修复在工程实施中可以原位进行，对土壤性质的破坏和对周豳生态 环境的影响较小，而且其费用明显低于传统的修复方法，因此应用植物修复 技术对大范围的浅度污染的土壤进行修复是具有巨大前景的。 植物修复技术还处在发展和研究的初步阶段，目前，运用转基因技术得 到了一些对不同重会属有耐受性和富集的转基因植物，但要使这项技术走向 产：业化应用还需要很多的工作。我们还需要进步阐明植物吸收、转运和代 谢重金属的机理，还需要进步开发负责吸收、转运重金属的基因，以及在 减短植物修复的时问和修复后植物的处理方面进一步改善。只有在对植物的 霞金属抗性、超富集及体内转运等生物学过程的分子机制有了更为详尽理解 的基础上= ，植物修复技术的潜力爿可能得到更大的挖掘。 第j 二章谷胱甘肽和植物螯合肽在植物修复中的作用 1 植物螯合肽 l 。1 植物螯合肽( p c ) 的结构 植物螯合肽( p c ) 是一种重要的金属结合蛋白，它广泛存在于植物界中， 目静在许多单子叶植物、双子叶植物、裸子植物和藻类植物中发现有p c 的存 在。除了植物界外，还在真菌和线虫中也发现存在p c ( g r i l le ta 1 ，1 9 8 6 ：m e h r a e ta 1 ，1 9 8 8 ；m i e r a c he ta 1 ，2 0 0 1 ) 。p c 是一组复合物，它的基本结构化学式 是( y g l u c y s ) 。一g l y ，n 的值从2 到1 1 不等。此外，在一些植物中也发现一 系列与p c s 结构相似又不相同的化合物，例如( 丫g l u c y s ) 。9 a l a ，( y g l u c y s ) n s e r 和( 7 g l u c y s ) n g l u 等，称为同源p c ( m e u w l ye t a l ，1 9 9 5 ；k l a p h e c k e ta 1 ，1 9 9 5 ：z e n k ，1 9 9 6 ) 。 1 2 植物螯舍肽的合成 p c 在结构上与谷胱甘肽( g s h ) 有相关性，大量的研究结果证实g s h 是 p c 的底物( c o b b e t t ，2 0 0 0 ；r a u s e r ，1 9 9 9 ) 。植物螯合肽合成酶( p c s ，也称 t 谷氨酰半胱氨酸转二肽酶) ，催化g s h 的t 谷氨酰半胱氨酸基团连接到g s h 形成p c 2 或将g s h 的7 - 谷氨酰半胱氨酸基团连接到p c 。上形成p c n + 】。p c 合 成酶基因( p c j ) 最早是1 9 9 5 年在拟南芥中证实存在的( h o w n d e n e ta 1 ，1 9 9 5 ) ， 但直到1 9 9 9 年翻首次从植物中克隆到( v a t 锄a n i u ke ta 1 ，1 9 9 9 ；c l e m e n se t a 1 ，1 9 9 9 ：h ae ta i ，1 9 9 9 ) 。 植物螫合肽( p c ) 合成的调控包括两个方面的途径：对其前体g s h 合成 的调控和对植物螯合肽合成酶( p c s ) 的调控。p c s 的活性可以被很多会属激 活，尤其是c d ，a g ，p b ，c u ，h g ，z n ，s n ，a u 和a s 等( g r i l l e ta 1 ，1 9 8 7 ； 产：业化应用还需要很多的工作。我们还需要进步阐明植物吸收、转运和代 谢重金属的机理，还需要进步开发负责吸收、转运重金属的基因，以及在 减短植物修复的时问和修复后植物的处理方面进一步改善。只有在对植物的 霞金属抗性、超富集及体内转运等生物学过程的分子机制有了更为详尽理解 的基础上= ，植物修复技术的潜力爿可能得到更大的挖掘。 第j 二章谷胱甘肽和植物螯合肽在植物修复中的作用 1 植物螯合肽 l 。1 植物螯合肽( p c ) 的结构 植物螯合肽( p c ) 是一种重要的金属结合蛋白，它广泛存在于植物界中， 目静在许多单子叶植物、双子叶植物、裸子植物和藻类植物中发现有p c 的存 在。除了植物界”：嘉篆型孽昝s 聚登基泻濯竖携鏊蠹；凄l 引：! 。；l i 喇；! | ；i “；，；i l 美l ；i 目 茎；l ? j 镒突变体中，可以使其恢复到和野生型植株一样c d 而4受水平，但是在野生型拟南芥中过表达口cs基因，得到的转基因植株对cd的 敏感性表现出不同的结果：口cs基因转录水平和pc水平较高的转基因植株表 现出较野生型植株更高的cd敏感性，而pcs基因表达较低的转基因植株( pcs水平仍耍高于野生型)比野生型植株有更高的cd耐受性，并且可以积 累 更多的cd(lee e ta 1 ，2 0 0 3 a ，2 0 0 3 b ) 。此外，g i s b e r t 等人将小麦来源的 pc s 基因转入n ，g l a u c a 中，发现转基因植株可以耐受更高浓度的重金属，例如 cd ，p b 等，而且可以积累更高浓度的重金属( g i s b e r te ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 2 谷胱甘肽 2 1 谷胱甘肽的结构和合成 谷胱甘肽( g s h ) 是由谷氨酸( g l u t a m a t e ) 、半胱氨酸( c y s t e i n e ) 和甘氨 酸( g l y c i n e ) 组成的三肽，在谷氨酸和半胱氨酸之间含有一个7 一肽键。可以 防止谷胱甘肽被大部分的肽酶水解。在生物体内，谷胱甘肽有两种形式：还 原型( g s h ) 和氧化型( g s s g ) ，它们的比率通常维持在一定的水平。 8一 、；一趾8 删刊， ma j t a n ie 1a 】，1 9 9 6 ：c h e ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。重金属对p c s 活性的训控不是通过 直接与酶结合而进行的，可能是通过与p c 的前体g s h 结合成复合物来调节 酶的活性的( v a t a n l a n i u ke ta l ，2 0 0 0 ) 。在拟南芥中的研究结构表明重金属 _ 骨 硒虹；二旺- m 。d r l l 当的抗生索) ，3 7 。c 剧烈振荡培养过夜。 ( 2 ) 将1 5 m 1 培养物移入离心管中，1 2 0 0 0 9 ，4 0 c 离心3 0 s e c ，弃上清，若 细菌不多可再加入另1 5 m i 培养物，重复次。 ( 3 ) 吸去上清，使细菌沉淀尽可能干燥。 ( 4 ) 将细菌沉淀重悬于1 0 0 u l 用冰预冷的溶液i( 5 0 m m 0 1 l 葡萄糖、 2 5 m m 0 1 l t r i s h c l ( p h8 o ) 和1 0 m m o l le d t a ( p h8 o ) ) 中，剧烈振荡 混匀。 ( 5 ) 加2 0 0 u 1 新配制的溶液i i ( o 2 m o l ，l n a o h 和l s d s ) ，快速颠倒离心 管5 次，以混匀内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液i i 接触， 然后将离心管放置于冰上5 m i n 。 ( 6 ) 加1 5 0 u l 用冰预冷的溶液i i i ( 5 m o l l 乙酸钾6 0 m l 、冰乙酸1 1 5 m l 和 h 2 02 8 5 m 1 ) ，温和混匀1 0 s e c ，使溶液i i i 在粘稠的细菌裂解物中分散 均匀，之后将离心管放置于冰上5 m i n 。 ( 7 ) 4 。c ，1 2 0 0 0 9 离心5 m i n ，将上清转移到另一离心管中。 ( 8 ) 加2 倍体积的乙醇，振荡混合，于室温放黉5 m i n 沉淀双链d n a ，4 。c ， 1 2 0 0 0 9 离心5 m i n 。 ( 9 ) 弃尽上清，用2 0 0 lt e 溶解沉淀，之后加入2 0 0 l 冰预冷的5 m o l l l i c l 溶液，冰浴5 m i n ，1 2 0 0 0 9 离心5 m i n 。 ( 1 0 ) 转移上清到另一离心管中，加入0 8 m l 无水乙醇，放髯5 m i n ，1 2 0 0 0 9 离心3 m i n 使质粒沉淀，弃去上清后用1 m l7 0 乙醇洗涤沉淀，宣温干 燥至乙醇完全挥发。 ( 1 1 ) d n a 沉淀用5 0 肛1 含无d n a 酶的r n a 酶( 2 0 “g m 1 ) 的t e 液溶解， 3 7 0 c 水浴15 m i n 后于2 0 0 c 保存待用。 1 2 1 8d n a 测序 小提d n a 产物由联合基因有限公司测序，反馈结果经过序列比对后证实 已经从大肠丰 菌b 菌株中克隆到秘 ，基因，并构建到p b s 质粒上。 1 2 1 9 舻 基因和p c a m b i a l 3 0 1 1 质粒连接 ( 1 ) 将p b s 伊 ，质粒和p c a m b i a l 3 0 1 1 质粒分别进行b 踟h i 和k p n i 双酶 切：在2 0 肛l 反应体系中加入适量的d n a ，1 肛l 的l o k b u 疵r 和各2 肛l 的限制性内切酶，用无菌水将体积补充至2 0 “l ，3 7 反应3 h 后，7 0 。c 热变性1 0 m j n 。 ( 2 ) 对酶切后的产物分别进行目的片断凝胶回收，回收方法参照“宝生物工 程( 大连) 有限公司”提供的试剂盒进行。 ( 3 ) 回收产物进行连接反应；在2 0 l 体系中按比例加入适量的上述酶切产 物，2 1 1 0 连接缓冲液和1 “lt 4d n a 连接酶，用无菌水将体积补充 到2 0 “l ，1 6 。c 反应过夜。 1 2 ，1 1 0p c a m b i a l 3 0 1 l - 舻 ，连接产物转化大肠杆菌( 方法参考前面) 1 21 1 1p c a m b i a l 3 0 1 1 一斟向，质粒的小量提取( 方法参考| i 面) 1 2 1 1 2p c a m b i a l 3 0 1 1 - 秘 质粒酶切验证 将p c a m b i a l 3 0 1 l 一伊 ，质粒进行b a m h i 和k p n i 双酶切：在2 0 山反应体 系中加入适量的d n a ，1 斗l 的1 0 kb u 饿r 和各2 “l 的限制性内切酶，用无 菌水将体积补充至2 0 肛l ，3 7 0 c 反应3 h 后，7 0 。c 热变性1 0 m i n ，然后进行l 的t a e 琼脂糖凝胶电泳检测。 1 2 2 ，c s 基因的克隆和表达载体的构建 1 2 2 1 拟南芥总r n a 的提取 ( 1 ) 组织样品：用液氮速冻，将组织磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，把粉 术转移到e p p e n d o r f 管中，每l o o m g 组织加1 m 1 的t r i z 0 1 。 ( 2 ) 加入2 0 0 u l 氯仿，剧烈振荡混匀3 0 s e c 。 ( 3 ) 1 2 0 0 0 9 ，室温离心5 m i n 。 ( 4 ) 小心将上清转移到r n a s e f r e e1 s m le p p e n d o r f 管中，加入与上清等体 积的异丙醇，室温放景5 m i n 。 ( 5 ) 1 2 0 0 0 9 ，室温离心5 m i n 。 ( 6 ) 小心弃去上清，用7 0 乙醇洗涤沉淀，1 2 0 0 0 9 ，室温离心2 m i n 。 ( 7 ) 尽可能弃去上清，室温下将乙醇空干。 ( 8 ) 用3 0 “ld e p c - h 2 0 溶解。 1 2 2 2r t p c r 按照f e r m e n t a sf i r s ts t r a n dc d n as y n t h e s i sk i t 操作 ( 1 )1 5 m le p p e n d o r f 管中加入o 1 5 扯g 总r n a 和l p lo l i g o ( d t ) p r i m e r ， 用d e p c h 2 0 将体积补充到1 2 “1 ，温和混合后，7 0 。c 保温5 m i n ，然后 冰二冷却，简短离心将所有液体收集到管底。 ( 2 ) 将离心管置于冰上，按顺序加入下列试剂： m m l v5 r e a c t i o nb u 虢r4 m r i b o n u c l e a s ei r 血i b i t o r2 0u n i t s1 l 1 0 m md t n pm i x2 “l ( 3 ) 温和混合后，简短离心将液体收集到管底。 ( 4 )3 7 。c 水浴5 m i n 后，加入m m l r vr e v e r s et r a l l s c r i p t a s e ( 2 0 0 u p 1 ) l “1 。 ( 5 ) 4 2 。c 水浴6 0 m i n ，然后7 0 。c 终止反应1 0 m i n ，冰上冷却。简短离心将 所有溶液收集到管底。 1 。2 2 3 p c r 扩增p c s 基因 以r t - p c r 得到的c d n a 为模板，p c r 法扩增尸c s 基因 ( 1 )p c r 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 引物l ：5 一g c 鱼q 坠g a a t g g c 工a t g g c g a g t t t a t - 3 k p n i 引物2 ：5 ，g c 鱼鱼丛娶三q a c a a t g a a c t a 声正a g g c a g g 一3 b a m h i ( 2 ) p c r 反应体系 ( 3 ) p c r 反应程序 9 4 。c 预变性5 m i n ；9 4 0 c 变性3 0 s e c ，5 5 。c 退火l m i n ，7 2 。c 延伸2 m i n 3 5 个循环：7 2 。c 延伸1 0 m i n ； 1 2 2 4 | p 基因回收 r t - p c r 产物电泳检测后，进行回收。回收方法按照“宝生物：】：程( 大连) 有限公司”提供的试剂盒进行( 具体方法参考前面) 。 12 2 4p c s 基因和p g e m 7 z f ( + ) 质粒的连接 ( ”将回收的尸c s 基因和p g e m 一7 z f ( + ) 质粒分别进行b a m h i 和k p n i 双酶 切：在2 0 一反应体系中加入适量的d n a ，1 “i 的1 0 k b u f f e r 和各2 的限制性内切酶，用无菌水将体积补充至2 0 “l ，3 7 。c 反应3 h 后，7 0 。c 热变性l o m i n 。 ( 2 ) 酶切后的产物进行连接反应：在2 0 u 1 体系中按比例加入适量的上述酶 切产物，2 斗1 1 0 连接缓冲液和1 肛lt 4d n a 连接酶，用无菌水将体积 补充到2 0 u i ，1 6 。c 反应过夜。 1 2 2 5p g e m 一尸c s 连接产物转化大肠杆菌 具体方法参考前面。 1 2 2 6 提取抗性单菌落进行d n a 小提 具体方法参考前面。 1 2 2 7d n a 测序 小提d n a 产物由联合基因有限公司测序，反馈结果经过序列比对后证实 已经从拟南芥中克隆到p c s 基因，并构建到p g e m 质粒上。 1 2 2 8 尸c s 基因和p c a m b i a l 3 0 1 1 质粒连接 ( 1 ) 将p o e m p c s 质粒和p c a m b i a l 3 0 1 1 质粒分别进行b a m h i 和k p n i 双 酶切：在2 0 p l 反应体系中加入适量的d n a ，l l 的l o kb u f 艳r 和各 2 l 的限制性内切酶，用无菌水将体积补充至2 0 1 ，3 7 。c 反应3 h 后， 7 0 。c 热变性1 0 m i n 。 ( 2 ) 对酶切后的产物分别进行目的片断凝胶回收，回收方法参照“宝生物工 程( 大连) 有限公司”提供的试剂盒进行。 ( 3 ) 回收产物进行连接反应：在2 0 u l 体系中按比例加入适量的上述酶切产 物，2 斗il o 连接缓冲液和1 扯1t 4d n a 连接酶，用无菌水将体积补充 到2 0 1 1 6 。c 反应过夜。 1 2 2 9p c a m b i a l 3 0 1 1 p c s 连接产物转化大肠杆菌 方法参考酊面。 1 2 ，1 1lp c a m b i a l3 0 1 1 一p c s 质粒的小量提取 方法参考自u 面。 1 2 1 1 2p c a m b i a l3 0 1 1 - p c s 质粒酶切验证 将p c a m b l a l3 0 1 1 - 尸c s 质粒进行b a m h i 和k p n i 双酶切：在2 0 “l 反应体 系中加入适量的d n a ，1 l 的1 0 kb u f b r 和各2 “1 的限制性内切酶，用无 菌水将体积补充至2 0 川，3 7 。c 反应3 h 后，7 0 。c 热变性1 0 m i n ，然后进行】 的t a e 琼脂糖凝胶电泳检测。 2 结果和分析 2 1 黟 ，基因的克隆和p c a m 伊 ，表达载体的构建 通过n c b l 数据库得到大肠杆菌( e c d f f ) 船 基因的编码框，自行设计 引物，在s e n s e 引物中引入k p n i 酶切位点，a n t i s e n s e 引物中引入b a m h i 酶切 位点，通过p c r 扩增得到了预期大小的基因片断( 图1 1 a ) 。将得到的基因 片断连接到p b s 质粒上并通过酶切鉴定证实已经将基因连接到p b s 载体上 ( 图1 1 b ) 。将这连接好的质粒由联合基因科技有限公司测序，结果证实已经 从大肠杆菌中克隆到f ，基因。然后将秽 ，基因从构建好的p b s 舻 ，质粒上 切下连接到p c a m b i a l 3 0 1 l 质粒上，得到p c a m 饿 质粒，通过酶切鉴定证 实已经将芦a ，基因构建到表达载体p c a m b i a l 3 0 1 1 ( 图1 i c ) 。 2 2p c s 基因的克隆和p c a m p c ，表达载体的构建 对提取的拟南芥总r n a 进行了浓度测定和电泳检测，结果显示所提r n a 的质量尚可。以拟南芥总r n a 为模板，通过r t - p c r 合成c d n a ，然后以c d n a 为模板进行p c r 扩增，p c r 引物参考n c b i 数据库中拟南芥p c s 基因c d n a 序列设计，在s e n s e 引物中引入k p n i 酶切位点，a n t i s e n s e 引物中引入b a m h i 酶切位点，电泳结果显示克隆到了预期大小的基因片断( 图1 2 a ) 。将克隆到 的基因连接到p g e m 7 z “+ ) 质粒上并通过酶切鉴定证实已经将基因连接到 p g e m 一7 z “+ ) 质粒上( 图1 2 b ) 。将这连接好的质粒由联台基因科技有限公司 测序，结果证实已经从拟南芥中克隆到p 基因。然后将p 摹因从构建好的 p g e m - p c j 质粒上切下连接到p c a m b i a l3 0 1 1 质粒上，得到p c a m 巾c s 质粒， 通过酶切鉴定证实已经将尸c s 基因构建到表达载体口c a m b i a l 3 0 1 l ( 图 12 c ) 。 3 讨论 植物表达载体的构建是植物遗传转化的基础，载体构建的基本原理是先 用限制性内切酶切割质粒d n a 和目的d n a 片断，然后在体外使两者连接， 再利用得到的重组质粒转化细菌。在实际的操作过程中往往会遇到不同的问 题，如找不到合适的限制性酶切位点，载体自身环化现象严重，连接效率低 等，因此在设计可行的构建策略时，需要考虑周全。本研究从大肠杆菌中克 隆伊 ，基因和从拟南芥中克隆尸c s 基因时，考虑到基因测序和表达载体构建 等因素，在s e n s e 引物中引入k p n i 酶切位点，a 1 1 t i s e n s e 引物中引入b a m h i 酶切位点。 笫二章农杆菌介导的秘厅，和p 岱基因的翦股颖遗传转化 摘要：荜坪草的遗传转化体系建立较晚，1 9 9 2 年获得转基因高羊茅，这 是第个被成功遗传转化并获得转基因植株的草坪草( w a n g e ta 1 ，1 9 9 2 ；h a e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。大多数的草坪草遗传转化方法采用原生质体直接吸收藿繁基跫 岑氯露豁钌j 譬蠢j 矧；匕一黼明褥韩“鼬囊霪扛鼽鏊妻惺疲喝瑙阍i 冀堡制各 ( 1 ) 受体菌培养：从l b 平板上挑取新活化的d h 5a 单菌落或直接从甘油保 存液中活化，接种于1 0 m ll b 液体培养基中，3 7 。c 下振荡培养1 2 h 左 右，直至对数生长后期。将该蓠液以1 ：1 0 0 1 ：5 0 的比例接种于1 0 0 m l l b 液体培养基中，3 7 。c 振荡培养2 3 h ，至o d 6 0 0 = o 5 左右。 ( 2 ) 将上述培养液转入1 0 m 1 离心管中，共1 0 管，冰上放簧1 0 m i n ，然后于 4 。c 下3 0 0 0 9 离心l o m i n 。 ( 3 ) 弃去上清，每管用2 m l 预冷的o 0 5 m o l l 的c a c l 2 溶液轻轻悬浮细胞， 冰上放置1 5 3 0 m i n 后，4 下3 0 0 0 9 离，心l o m i n 。 ( 4 ) 弃去上清，用含1 5 甘油的预冷的0 0 5 m o l l 的c a c l 2 溶液每管4 0 0 “l 轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟后，即成感受态细胞。 ( 5 ) 将感受念细胞分装成2 0 0 u l 的小份，7 0 。c 保存待用。 1 2 1 6 2d n a 转化大肠杆菌 ( 1 ) 从7 0 。c 冰箱中取2 0 0 “l 感受态细胞，室温下使其解冻后立即簧于冰上 或直接使用新鲜制备的感受态细胞。 ( 2 ) 加入5 u 1 连接产物，温和混匀后，冰上放置3 0 m i n 。 ( 3 ) 4 2 0 c 水浴热激9 0 s e c 后，迅速置于冰上冷却5 m i n 。 ( 4 ) 向管中加入l m ll b 液体培养基，混匀后3 7 。c 振荡培养l h ，使细胞恢 复f 常生长状态。 ( 5 ) 将上述菌液混匀后取1 0 0 “l 涂布于含适当抗生索的平板上，正面向上放 置3 0 m i n ，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，3 7 。c 培养1 6 2 4 h 。 ( 6 ) 挑耿抗性单菌落，进行d n a 扩增抽提。 笫二章农杆菌介导的秘厅，和p 岱基因的翦股颖遗传转化 摘要：荜坪草的遗传转化体系建立较晚，1 9 9 2 年获得转基因高羊茅，这 是第个被成功遗传转化并获得转基因植株的草坪草( w a n g e ta 1 ，1 9 9 2 ；h a e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。大多数的草坪草遗传转化方法采用原生质体直接吸收d n a 法 和基因枪法，直到2 0 0 0 年农杆菌介导法转化草坪革j 有成功报道，目前通过 农杆菌介导法成功转化的草坪革有高羊茅、匍匐翦股颖和结缕草。本研究尝 试通过农杆菌介导法将构建的p c a m - 豁 ，和p c a m - p c j 质粒转入翦股颖中， 得到了6 株转矗，和l 株转p 基因的转基因植株。对部分转基因植株进行 了p c r 检测和s o u t h e m 杂交检测，证明外源基因在转基因植株中的拷贝数较 少，为1 2 个拷贝。 关键词：翦股颖：农杆菌介导法；遗传转化 l 。材料和方法 1 1 材料 1 1 1 菌株 根癌农杏t 菌e h a 】0 5 。 1 1 2 质粒 p c a m - g s h i ，p c a m p c s 1 1 3 受体植物材料 翦股颖( 爿g 加j 出p 口z “s r ，括h u d s ) 。 1 1 4 培养基和缓冲液 抗生素、常用培养基配方和缓冲液见附录b 。 用于转化的各种培养基如下： 诱导和继代培养基：m s 基本培养基，2 ，4 d2 o m g ，l ，6 - b a0 1 m l 脯 氨酸l o m m ，a g a r l o g ，l ，p h 5 _ 8 共培养基： m s 基本培养基，肌醇2 0 9 l ，乙酰丁香酮1 0 0 p m l ， a g a rl o g l ，p h5 8 选择培养攀 分化臻养基 生根培养基 m s 基本培养基，2 ，4 一d2 0 m g l ，6 b a0 1 m g l ，脯 氨酸 l0 m m ，c e f o t a x i m e 3 0 0 m l ，h y g r o m y c i n 5 0 m g l ，a g a r1o g l ，p h5 8 m s 基本培养基，6 也a2 m l ，c e f b t a x j m e2 0 0 m g l ， h y g r o m y c i n5 0 m l ，a g a r1 0 9 ，l ，p h5 8 l 2 m s 大量，m s 小量，m s 铁盐，1 2 m s 钙离子， m s 维他命，肌醇1 0 0 m g l ，蔗糖3 0 9 l ，c e f o t a x i m e 2 0 0 m g l ，a g a r1 0 9 l p h5 8 1 1 5 化学试剂和酶类 限制性内切酶购自t a k a r a 公司，r t a q d n a 聚合酶为p r o m e g a 公司产品 s o u t h e r n 杂交试剂盒为r o c h e 公司产品，常用化学试剂为国产分析纯级。 1 2 方法 1 2 id n a 导入农杆菌 1 2 1 1 农杆菌感受态细胞的制备 ( 1 ) 活化农杆菌e h a l 0 5 ，然后挑取单菌落到1 0 m ly e b 中，2 8 0 c 振摇过夜。 ( 2 ) 取2 m l 菌液于1 0 0 m ly e b ( 含4 0 g m lr i f ) 中稀释，2 8 。c 振摇过夜。 将菌液倒入离心管后，冰上放置1 0 m i n ，然后予4 。c 下3 0 0 0 9 离心1 0 m j n 后去上清。 ( 3 ) 用预冷的o ，0 5 m o l ，l 的c a c l 2 溶液每管5 m l 轻轻悬浮细胞，冰上放置】5 3 0 m i n 后，4 。c 下3 0 0 0 9 离心1 0 m i n 。 ( 4 ) 弃去上清，用含1 5 甘油的预冷的o 0 5 m o l 兀的c a c l 2 溶液每管l m l 轻 轻悬浮细胞，冰上放冕几分钟后，即成感受态细胞悬液。 ( 5 ) 将感受态细胞分装成2 0 0 “l 的小份，7 0 0 c 保存待用。 1 2 1 2 转化 ( 1 ) 向2 0 0 斗l 农杆菌感受惫细胞中加入0 5 1 o 嵋质粒d n a ，冰上放置5 m i n 后， 立即放入液氮中5 m i n 。取出离心管，3 7 。c 保温5 m i n 后，用1 m 1 y e b 在无 菌条件下稀释，2 8 。c 振摇2 4 h 。 ( 2 ) 取2 0 0 i 涂御于古5 0 “g m i 卡那霉素( k a n ) 和4 0 l g n 1 i 利福平( r i f ) 的y e b 平板中，2 8 0 c 培养得到单菌落。 1 2 1 3 嘲转化签定 ( 1 ) 挑取农杆菌单菌落，扩增抽提质粒d n a ( 方法参考第：章) 。 ( 2 ) 将质粒d n a 回转化至d h 5q 感受态细胞并进行鉴定( 方法参考第二章) 。 1 2 2 农杼菌介导的翦股颖转化 j ，2 2 1 草坪草愈伤组织的诱导 翦股颖种子在7 0 乙醇中浸泡3 0 s e c ，经1 0 n a c l o 消毒1 0 m i n ，无菌水 漂洗8 次，接种于愈伤诱导培养基上，得到的愈伤用同样的培养基继代。 1 2 2 2 筛选培养基选择压力的确定 将来转化的翦股颖愈伤组织转移到含不同潮霉素浓度( 0 、2 5 、5 0 、7 5 、 】o o 、】5 0 m g 1 ) 的继代培养基上，2 5 。c 暗培养两周，然后转移到新的含相应 潮霉索浓度的继代培养基上继续2 5 。c 暗培养两周。 1 ，2 2 3 农卡1 菌介导的草坪草转化 1 2 2 3 1 农杆菌准备 ( 1 ) 从7 0 。c 冰箱取出含重组质粒的农杆菌e h a l 0 5 ，于含有抗生豢的l b 固体培养基上活化。 ( 2 ) 两天后l b 培养基上长出农杆菌单菌落，挑取单菌落于合有抗生素的 1 0 m ll b 液体培养基中扳摇培养。 ( 3 ) 两天后，液体培养的农杆菌o d 6 0 0 约为0 8 ，将农杆菌划线培养于含有 抗生索的y m 固体培养基上。用来转化的农杆菌在y m 培养基上需要 生长3 天左右。 1 2 2 3 2 转化方法 ( 1 ) 草坪草愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上预培养4 7 天。 ( 2 ) 农杆菌在y m 固体培养基上生长3 天后，收集农杆菌悬浮培养在a a m 培养基上( 含1 0 0 岫乙酰丁香酮) ，使初始的o d 6 0 0 = 0 8 ，然后振摇培 养l 小时。 ( 3 ) 将预培养的愈伤收集到无菌的三角瓶中，倒入上述振摇的农杆菌液，浸 3 4 没愈伤，暗处静_ 置3 0 m i n ，接着用无菌滤纸吸干愈伤表面多余菌液后， 转移到铺有滤纸的共培养基上共培养三天。 ( 4 ) 共培养3 天后，从共培养基上收集愈伤到三角瓶中，经过如下洗涤： 先用无菌水漂沈愈伤，然后用加有5 0 0 m lc e f 的a a m 培养基沈，这 样作为一个循环，沈2 3 个循环，然后无菌滤纸吸干。 ( 5 ) 然后将愈伤组织转移到选择培养基上，进行两轮的筛选。 ( 6 ) 经过个月( 两轮) 的筛选后，将愈伤组织转移到分化培养基上进行再 分化。 ( 7 ) 再分化的愈伤转移到生根培养基上进行生根培养。 1 2 3c t a b 法提取转基因植株基因组d n a ( 1 ) 称取o 5 9 的翦股颖叶子，减碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1 5 m l 离心管中，然后加入7 0 0 h l 预热至6 5 。c 的2 c t a b 提取缓冲液及0 1 的巯基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于6 5 。c 水浴保温2 h ，不时 颠倒混匀。 ( 2 ) 混合物冷却至室温后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：i 4 ：1 ) ，4 0 c 下 1 0 0 0 0 9 离心1 0 m i n 。 ( 3 ) 将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，4 。c 下1 0 0 0 0 9 离心1 0 m i n 。 ( 4 ) 将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀， 2 0 。c 放置3 0 m i n 沉淀d n a 。 ( 5 ) 4 。c 下l o o o o g 离心1 0 m i n ，弃去液体，并用7 0 乙醇洗涤两次，室温 干燥d n a 后，加入l o o 肛l 含无d n a 酶的r n a 酶( 2 0 岭m 1 ) 的t e 液 溶解，3 7 。c 水浴3 0 m i n 。 ( 6 ) 加入2 0 0 “1 无水乙醇，温和混匀，2 0 。c 放霞3 0 m i n 沉淀d n a 。 ( 7 ) 4 。c 下1 0 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，弃去液体，并用7 0 乙醇洗涤两次，室温 干燥d n a 后，加入5 0 l 无菌d d h 2 0 溶解d n a ，4 。c 保存待用。 ( 4 ) 预杂交结束后，倒掉预杂交液，耿出膜，放到干净的杂交袋中，然后加 入含有探针的杂交液( 步骤3 ) ，挤掉气泡，封好杂交袋，6 8 。c 杂交过 夜。 1 2 5 5 检测 1 2 5 5 1 检测前的洗膜 ( 1 ) 含有0 1 s d s 的2 s s c ，室温漂洗1 5 m i n 共两次。 ( 2 ) 含有o 1 s d s 的o 5 s s c ，6 8 。c 漂洗l5 m i n ，共两次。 ( 3 ) 含有o 1 s d s 的0 1 s s c ，6 8 。c 漂洗1 0 m i n 。 ( 4 ) 0 1 s s c ，6 2 。c 漂洗1 0 m i n 。 1 2 5 5 2 检测 ( 1 ) 5 0 m lw a s h i n gb u 行c r 中简短漂洗5 m i n 。 ( 2 )l0 0 m lb l o c k i n gs o l u t i o n 中，2 5 。c 振摇3 0 m i n 。 ( 3 )2 0 m la n t i b o d ys o l u t i o n 中，2 5 。c 振摇3 0 m j n 。 ( 4 ) 1 0 0 m 1w a s h i n gb u f 艳r 漂洗1 5 m i n ，共两次。 ( 5 ) 2 0 m ld e t e c t i o nb u f 梵r 中平衡5 m i n 。 ( 6 ) 取出膜，j 下面朝上放到杂交袋中，加入7 0 0 n lc s p dr e a d y - t o - u s e ( b o t t l e 5 ) ，盖上袋子，挤摔气泡，然后放到2 5 0 c 下5 m i n 。 ( 7 ) 5 m i n 后，取出膜放到干净的杂交袋中，封好杂交袋，3 。c1 0 m i n ， ( 8 ) x 光片曝光3 0 m i n 后观察结果。 1 2 6r t _ p c r 检测 方法参考第一章。 2 结果和分析 2 1 农杆菌转化予鉴定 分别将p c a m 嘻， ，和p c a m - 尸c s 转入农杆菌，提取农杆菌转化子的质粒 d n a 。然后将提取的质粒d n a 转入大肠杆菌中，再从大肠杆菌中提取质粒 d n a 进行酶切鉴定结果证实已经将p c a m 私自，和p c a m p c s 分别转入农 丰t 菌e h a l 0 5 中。图2 1 a 是回转化p c a m - 舻 j 质粒b a m h i 和k p n i 双酶切电 泳图，图2 2 b 是回转化p c a m 尸c s 质粒b a m h i 和k p n i 双酶切电泳图。 幽2 1 同转化质粒酶切电泳检测 a ：1 为g s h l 基闪片断，2 - 3 为p c a m f 质粒b a m h i 和k p n i 敬酶切； b ：l 为p c a m 中质粒b a m h i 和k p n i 取酶切2 为d n a m a r k e h f i g _ 2 lr e s t r i c t j o ne n 珂m ed i g e s t i 仰o fp i a s m i d a ，l a n e1 ：g s h ig e n e ，l 基n e 2 - 3 ：r e s t f i c t i o ne n 2 y m ed i 錾s t i o no fp c a m 喀s 始 b ，】a n el ：r e s l r i c t l o ne n z y m ed g e s t i o no fp c a m 巾c s ，m ： m a r k e r 2 2 筛选压的确定 将未转化的翦股颖愈伤分别转移到o 一1 5 0 m g l 不同潮霉素浓度的培养基 上培养两周后，再转移到含相应潮霉素浓度的培养基上继续培养两周。实验 结果( 表2 1 ，图2 2 ) 表明翦股颖愈伤组织在1 0 0 m g l 潮霉素浓度的培养基 中生长一个月后，生长明显受到抑制，愈伤颜色变深，但不会褐化死亡，在 5 0 m g l 潮霉素浓度培养基中生长一个月后，愈伤颜色也会变深，愈伤质量的 增长鼍抑制了半左右。将上述愈伤转移到不含潮霉索的分化培养基中，1 2 周后发现经过5 0 m g 几潮霉素一个月时间选择后的愈伤大部分已经不能分化 ( 图2 3 ) 。因此我们选择了半抑制浓度( 5 0 m g l 潮霉素) 作为转基因翦胶颖 愈伤的选择浓度，并且在分化培养基中添加5 0 m l 潮霉素。 表2 1 不同选择压力对翦股颖愈伤的影响 7 i a b l e2 1e f f b c t so fd i f f e r e n ts e l e c t i o np r e s s u r eo nc a l l u so fb e