（发酵工程专业论文）壳聚糖酶产生菌的诱变育种以及壳聚糖酶的固定化.pdf

l i i i ii i ii l uiiiiii ii iiif y 17 3 817 4 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：爿适、告、 学位论文使用授权说明 萨o f 。年石月，汐日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 一即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 做作者签名：夕。嘲、翩签名：p 似押嶙多月彦日 壳聚糖酶产生菌的诱变育种以及壳聚糖酶的固定化 摘要 以本研究实验室保存的壳聚糖酶产生菌一烟曲霉c k o s p e r g i l l u s f u m i g a t u s c k ) 作为出发菌株，通过紫外线和微波进行复合诱变处理，利用抗 分解代谢培养基，筛选出一株发生基因组正突变的菌株，起始菌株的壳聚 糖酶活是1 3 6 8 u m l ，正突变株后u w - 1 7 壳聚糖酶活高达2 2 4 3 u m l ，是起 始菌株的1 6 倍，且遗传稳定性良好。 分离纯化烟曲霉的代谢产物一壳聚糖酶，通过比较有机溶剂沉淀法、盐 析沉淀法、等电点沉淀法，确定利用等电点沉淀法结合有机溶剂沉淀法分 离纯化壳聚糖酶，在保持溶液的p h 为7 5 ，乙醇体积分数为6 0 的时候，壳 聚糖酶的酶活收率为9 2 1 ，分离纯化效果最好。 通过比较多种固定壳聚糖酶的方法，发现大部分固定化酶方法会出现 酶活力回收率低、稳定性不强、酶活下降快等缺点，最终以聚乙烯醇( p v a ) 复合凝胶作为载体，利用反复冻融法固定化壳聚糖酶，经研究发现壳聚糖 酶经过固定化以后，显著提高了其机械强度和化学稳定性，并且可以多次 重复使用。通过单因素试验和中心组合设计响应面分析，确定了壳聚糖酶 固定化的最佳条件：以1 0 8 8 聚乙烯醇( p v a ) 和1 0 7 海藻酸钠复合凝胶 为载体，置入2 0 冰箱，反复冻融1 8 h ，得到的固定化酶效果最好。并对游 离的壳聚糖酶和固定化的酶的特性进行比较，经固定化的酶，其机械性能 和化学稳定性都得到显著提高，与游离酶相比，固定化酶的最适反应p h 值 由5 5 降至5 0 ，最适反应温度是1 扫6 0 。c 升至6 5 c ，其米氏常数由7 2 4 m g m l 升至1 0 1 2 m g m l ，固定化的酶在连续使用7 次，保持8 0 的酶活。并用固定 化酶反应器( o = 1 5 m m ) 制备壳寡糖，在径高比为1 ：1 0 ，添加固定化酶1 2 9 ， 壳聚糖底物的流加速度为0 8 m l m i n 时，固定化酶的酶促反应效率最快，为 将来工业化应用打下基础。并通过薄层色谱法分析水解产物，可以将不同 聚合的壳寡糖很好的分开，并对其平均聚合度和相对分子量的进行测量， 壳寡糖的平均聚合度为3 ，平均分子量为5 0 1 。 关键词：壳聚糖酶诱变固定化响应面分析壳寡糖反复冻融法 i i b r e e d i n go fc h i t o s a n a s ep r o d u c i n gs t r a i na n dt h e i m m o b i l i z a t i o no fc h i t o s a n s e a bs t r a c t i nt h i sp a p e r , t h ec h i t o s a n a s ep r o d u c i n gs t r a i n - a s p e r g i l l u sf u m i g a t u sc k w h i c hw a sm a i n t a i n e di nt h e l a bw a su t i l i z e d a st h ei n i t i a ls t r a i n i tw a s a l t e m a t i v e l yt r e a t e db yu v a n dm i c r o w a v ei r r a d i a t i o n ，a n du t i l i z i n gr e s i s t a n tt o c a t a b o l i t er e p r e s s i o nw a st a k e nt os c r e e nt h ep o s i t i v em u t a n t s t h ec h i t o s a n a s e a c t i v i t yo ft h ei n i t i a ls t r a i nw a s13 6 8 u m l a n dt h ec h i t o s a n s ea c t i v i t yo ft h e m u t a n t d 肼l7i su pt o2 2 4 3 u m l ，w h i c hi m p r o v e d16 0 t h a nt h a to ft h e i n i t i a ls t r a i n a n di th a st h eg o o dg e n e t i cs t a b i l i t y t h ec h i t o s a n a s ew a sp u r i f i e df r o m a s p e r g i l l u sf u m i g a t u sc k b y c o m p a r i n gt h eo r g a n i cs o l v e n tp r e c i p i t a t i o n ，s a l tp r e c i p i t a t i o na n di s o e l e c t r i c p r e c i p i t a t i o nm e t h o d t h eo r g a n i cs o l v e n tp r e c i p i t a t i o nm e t h o dc o m b i n e dw i t h t h ei s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o nm e t h o dw a sd e t e r m i n e dt op u r i f i e dc h i t o s a n a s e t h e o p t i m u m c o n d i t i o n sf o rt h er e c o v e r yo fc h i t o s a n a s ew e r ea sf o l l o w s ：p h 7 5a n d 6 0 v o l u m ef r a c t i o no fe t h a n 0 1 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h eb e s ty i e l do f e n z y m ea c t i v i t yo f c h i t o s a n a s ew a s9 2 1 m a n yd i f f e r e n tm e t h o d sh a v eb e e nu s e dt oi m m o b i l i z et h em e t a b o l i t e so f a s p e r g i l l u sc h i t o s a n a s ew h i c hw a sp u r i f i e d b u tm o s to ft h ei m m o b i l i z a t i o n i i i w o u l dc a u s et h el o wr e c o v e r yo fe n z y m ea c t i v i t y , s t a b i l i t yi sn o ts t r o n g ，a n df a s t a c t i v i t y d e c r e a s e d t h eo n l ys u c c e s s f u lm e t h o df o ri m m o b i l i z a t i o no f c h i t o s a n a s ew a st h ef r e e z i n g t h a w i n gm e t h o db yap o l y v i v y la l c o h o l ( p v a ) 一 c r y o g e lb e a d s t h ei m m o b i l i z a t i o ni nc r y o p v a - g e ls t a b i l i z e dt h ee n z y m ea n d e n s u r e dh i 曲m e c h a n i c a la n dc h e m i c a ls t a b i l i t yo ft h eb i o c a t a l y s t ，w h i c hc o u l d b eu s e dm a n yt i m e sf o rc h i t o s a n a s e t h es i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n ta n dt h e r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sw e r es u b s e q u e n t l yd e s i g n e dt od e t e r m i n et h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o n c l l i t o s a n a s ew e r ei m m o b i l i z e di n1 0 8 8 p o l y v i n y la l c o h o l ( p v a ) a n d1 0 7 s o d i u ma l g i n a t e t h ec a r t i e rs y s t e mw a s f r e e z e da n dt h a w e d18 hi n t o 一2 0 cr e f r i g e r a t o r u n d e ra b o v ec o n d i t i o n s ，t h e e f f e c to fi m m o b i l i z e de n z y m ew a st h eb e s t a n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so ff r e ea n d i m m o b i l i z e de n z y m ew e r ec o m p a r e d t h ei m m o b i l i z a t i o ni nc r y o p v a - g e l s t a b i l i z e dt h ec h i t o s a n a s ea n de n s u r e dh i 曲m e c h a n i c a la n dc h e m i c a ls t a b i l i t yo f t h eb i o c a t a l y s t c o m p a r e dw i t ht h ef r e ee n z y m e ，t h eo p t i m u mp hv a l u ea n d t e m p e r a t u r eo f i m m o b i l i z e dc h i t o s a n a s er e s p e c t i v e l ys h i f t e df o r m5 5t o5 0a n d f o r m6 0 t o6 5 a n di m m o b i l i z a t i o ni n c r e a s e di nk mv a l u ef r o m7 2 4 m # m l t o10 12 m g m 1 a f t e rs e v e nt i m e sr e p e a t e db a t c ho p e r a t i o n ，t h er e l a t i v e a c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m ew a sa b o u t8 0 t h eo p t i m u me f f i c i e n c yo f i m m o b i l i z e de n z y m er e a c t i o nw a sd i a m e t e rh e i g h tr a t i o1 ：10 ，i m m o b i l i z a t i o n c h i t o s a n a s e10 9 ，f l o wa c c e l e r a t i o no fs u b s t r a t e0 8 m l m i n i tw a st h eb a s i sf o r f u t u r ei n d u s t r i a la p p l i c a t i o n a n dh y d r o l y s i sw a sa n a l y s i sb yt h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) t h ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sr a n g i n gf r o md p lt od p 6c a n i v b ec l e a r l ys e p a r a t e dw i t l lt l c t h ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sw e r ep r e p a r e d a n d t h em e a nd e g r e e so fp o l y m e r i z a t i o na n dm e a nm o l e c u l a rm a s sw e r em e a s u r e d ， w h i c hw e r e3a n d5 01r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c h i t o s a n a s e ；m u t a g e n e s i s ；i m m o b i l i z a t i o n ；r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s ；c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ；f r e e z i n g t h a w i n gm e t h o d ； n 第二章产壳聚糖酶菌株的复合诱变育种一1 3 2 1 前言1 3 2 2 实验材料与仪器设备1 3 2 2 1 菌株l3 2 2 2 培养基。l3 2 2 3 主要试剂和仪器15 2 3 实验方法1 5 2 3 1 纯化和复壮方法1 5 2 3 2 诱变方法15 v i 2 3 3 培养条件1 6 2 3 4 分析方法1 6 2 4 结果与分析1 7 2 4 1 壳聚糖酶标准曲线的绘制1 7 2 4 2 紫外诱变18 2 4 3 微波诱变育种2 0 2 4 4 出发菌株与突变菌株的特性2 1 2 5 本章小结2 2 第三章壳聚糖酶的初步分离纯化2 3 3 1 前言2 3 3 2 材料与设备2 3 3 3 方法2 3 3 3 1 游离壳聚糖酶等电点的初步确认2 3 3 3 2 壳聚糖酶的硫酸铵沉淀2 3 3 3 3 壳聚糖酶的乙醇沉淀试验2 4 3 3 4 壳聚糖酶的s d s 聚丙烯酞胺凝胶电泳及相对分子量测定。2 4 3 4 实验结果2 4 3 4 1 游离壳聚糖酶等电点的初步确认2 4 3 4 2 壳聚糖酶的硫酸铵沉淀2 5 3 4 3 壳聚糖酶的乙醇沉淀试验2 5 3 4 4 壳聚糖酶的s d s 聚丙烯酞胺凝胶电泳2 6 3 5 本章小结2 6 第四章固定化壳聚糖酶的制备2 7 4 1 前言2 7 4 2 材料与设备2 7 4 3 方法j 2 7 4 3 1 游离壳聚糖酶的提取与纯化2 7 4 3 2 固定化酶方法一2 7 4 3 3 固定化酶的最适制备条件的确定2 9 4 3 4 壳聚糖酶活力的测定3 0 4 3 5 蛋白质浓度的确定3 0 4 4 结果与讨论3 0 4 4 1 最佳载体的选择3 0 v 4 4 2 固定化最适条件的确定31 4 5 本章小结3 6 第五章固定化酶的酶学性质及其在反应器中反应条件的研究3 7 5 1 引言3 7 5 2 材料与设备3 7 5 3 方法3 7 5 3 1 最适温度的确认3 7 5 - 3 2 最适p h 的确认3 7 5 3 - 3 温度稳定性3 8 5 3 4p h 稳定性3 8 5 3 5 固定化酶的操作稳定性3 8 5 3 6 米氏常数的测定3 8 5 3 7 贮存稳定性3 8 5 3 8 固定化酶反应器的反应条件的研究3 8 5 3 9 固定化酶产物分析3 9 5 4 结果与分析3 9 5 4 1 最适温度的确认3 9 5 4 2 最适p h 的确认j 。4 0 5 4 3 温度稳定性4 1 5 4 4p h 稳定性4 1 5 4 5 固定化酶的操作稳定性4 2 5 4 6 米氏常数的测定4 2 5 4 7 贮存稳定性4 3 5 4 8 固定化酶反应器反应条件的研究4 3 5 4 9 固定化酶产物分析4 5 5 5 本章小结4 7 第六章总结与展望4 8 6 1 总结4 8 6 2 工作展望4 9 参考文献5 0 附录5 7 附录1 还原糖的测定。5 7 附录2b r a d f o r d 法测定蛋白质含量5 9 i i 附录3 端基分析法测定壳低聚糖的平均聚合度和相对分子质量6 1 附录4 主要试剂材料及设备6 3 致谢6 5 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录。6 6 i x 曩口器糖萄 产生苗的 r j 阡以及a 妇曩糖的固定化 1 1 壳聚糖概述 第一章绪论 1 8 1 1 年，h b r a c o n n o t 教授发现了甲壳素，并把该物质称为f u n g i n e 。1 8 2 3 年由法国 学者a o d i e r 从甲壳动物外壳中提取，并命名为c h i t i n t l l 。至1 1 8 9 4 年，e g i l s o n 证明c l l i t i l l 中含有氨基葡萄糖f 2 】，前后几乎用yl o o 年才研究清楚其结构。 甲壳素( c h i t i n ) 广泛的存于节肢动物虾、蟹和昆虫的外壳和软骨、藻类细胞，低等植 物菌类中，是由n - 7 , 酰一2 一氨基一2 一脱氧一d 一葡萄糖以b 1 ，4 糖苷键连接而成的多糖1 3 1 ，其 n 脱乙酰度在5 0 以下，其结构式如图1 1 所示： 图1 - 1 甲壳素的结构式 f i g 1 - is t r u c t u r ef o r m u l ao fc h i t i n 壳聚糖与甲壳素主要区别是d 氨基葡萄糖残基( g l c 乙酰化程度不同，壳聚糖 ( 出t o s a l l ) 是甲壳素脱乙酰化产物，它是由法国人c r 0 u g e t 首先在1 8 5 9 年发现的【4 】。如图 1 2 。是膳食纤维中唯一的一种含有阳离子的天然高分子化合物5 1 。 一。 图1 - 2 壳聚糖的结构式 f i g 1 - 2s t r u e t t l r ef o r m u l ao fc h i t o s a n l 曩妇睦糖酶产生笛的育种以及曩妇睫糖的固冀弭匕 作为一种低聚糖的壳寡糖，是壳聚糖进一步降解后产生一种聚合度低于二十的可溶 解于水的氨基糖类化合物。因为甲壳素与壳聚糖都是在自然界中晟丰富的多糖之一，作 为一类可以再生的和可以生物降解的物质，作用十分的广泛【6 7 1 。但是相对于甲壳素和 壳聚糖，分子量在1 0 0 0 0 以下的壳寡糖具有了许多优于高分子量的壳聚糖的功能，研究 表明【引，壳寡糖是目前已知的自然界中的唯一的带正电荷的碱性多糖，并且壳寡糖的水 溶性好，容易被人体吸收，还具有有效的降低血压、增强机体细胞的免疫功能、降低了 胆固醇、止血、止痛、促进了伤口愈合等生理功能，特别是壳六糖与壳七糖在抑制肿瘤 方面的作用重大。 1 2 低聚壳聚糖的制备 低聚壳聚糖具有如此重要的生物活性，因此现在的问题是如何制备壳寡糖，如何能 够大批量的制备，形成一个具有相当规模的产业，是国内外研究，开发的重要领域，一 般来说，低聚壳聚糖的制备有三种方法：酸水解法，氧化法，酶解法，下面对这三种方 法分别介绍： 1 2 1 酸水解法 壳聚糖在酸性的溶液中会发生长链的部分的水解，产生很多分子量的不小不等的片 段，而酸在多糖的水解过程中主要起到了催化的作用，但是酸水解不容易控制，在制备 壳寡糖的时候，很难得到所需要的活性寡糖。酸水解主要由盐酸法 9 1 ，乙酸法，磷酸法 1 0 l ，氢氟酸法【1 。现在许多工作研究都是想获得控制酸水解的关键技术【1 2 l 。 1 2 2 氧化法 氧化法在近些年有比较多的研究，目前氧化法【1 3 l 主要有过氧化氢法，过硼酸钠法， 次氯酸钠法，其中以过氧化氢法为主，它在生产已经使用，过氧化氢法又有酸法，碱法， 中性法三种，因为水解反应的条件对产物的影响比较大，曹彩芹等的研究发现，控制 介质酸的强度和浓度，以及选择适当的h 2 0 2 的用量是制备特定聚合度低聚壳聚糖糖的关 键。 1 2 3 酶解法 酶解法是利用专一性的或者非专一性的酶1 1 6 】对壳聚糖或者甲壳素降解的方法，在 2 曼妇r 糖酶产生菌的育种以及五口甓糖的固定化 酶解过程中，基本不需要其它的反应试剂，所以其它副反应基本不会出现，在最近的2 0 年来，是国内外的研究的热点。 现在大约已经发现了3 0 多种酶可以降解甲壳素或者壳聚糖，主要包括【玎- 2 0 壳素 酶，壳聚糖酶，溶菌酶，纤维素酶等，其中研究最多的是壳聚糖酶，它是在1 9 7 3 年，由 m o n a g h a n 2 1 】等人发现，并在1 9 8 4 年通过了国际酶学委员会的审核，它的登记编号为 e c 3 2 1 9 9 。 1 3 壳聚糖酶概述 1 3 1 壳聚糖酶的来源 壳聚糖酶的分布十分的广泛，目前已经从多种微生物，植物的不同组织和动物的消 化系统中检测发现了壳聚糖酶。在大多数的微生物中，壳聚糖酶是被作为一种诱导酶的， 只有在适当的底物存在的时候，才会大量的合成壳聚糖酶。而在正常细胞的代谢活动时， 含量很少。在微生物中很多的细菌能够产生胞外壳聚糖酶，研究人 ，k j b a c i l l u s 2 2 也6 l 一个 属中就发现了许多菌株如b a l v e i , b c i r c u l a n s , b c e r e u s 、b s u b t i l 趣b p u m i l u s 、b e h i m e n s i s 从中分离纯化得到了壳聚糖酶，研究人员也从放线菌和真菌中发现了壳聚糖酶， b o u c h e r b i 等f 2 7 】发 s t r e p t o m y c e sn 17 4 能产壳聚糖酶，在a s p e r g i l l u sf u m i g a t a s 、 f u s a r i u m s o l a n i f s p 和彳印p 厂g 讲搬够y 2 k 等真菌口8 捌中也分离纯化出了壳聚糖酶。 1 3 2 壳聚糖酶的分类 最初根据酶的底物的专一性壳聚糖酶分为两类 3 0 l ：一类是底物为壳聚糖，而另一类 是底物为羧甲基纤维素或者壳聚糖。但是随着研究研究者的开始质疑这种分类法。于是 研究者将水解壳聚糖的但又不酶解g l c n a c - - g l c n a c 键的酶归为壳聚糖酶，此外又根据 其底物专一性的差异将壳聚糖酶进一步的再细分为了三类【3 1 l ：即壳聚糖酶i 、壳聚糖酶 i i 、壳聚糖酶i i i 。另外，糖苷水解酶还可以根据酶的氨基酸序列的相似性分为了许多家 族3 2 1 ，到目前为止，可将测得序列的壳聚糖酶归为5 号、8 号、4 6 号、7 5 号和8 0 号这五类 糖苷水解酶。此外还可以根据酶对壳聚糖的降解方式，将壳聚糖酶划分为内切酶和外切 酶，还可以根据酶的产生的特点，把壳聚糖酶分为了诱导型和组成型。 3 毋臼艮糖翻，产生菌的育种以及壳聚糖的固定化 1 3 3 壳聚糖酶的性质 通过研究发现来源不同的壳聚糖酶，其相对分子质量由于构成和结构的不同而存在 了差异，一般来说壳聚糖酶的相对分子质量都在2 0 - - - 4 0 k u 之间，而从植物中分离出的壳 聚糖酶的分子量一般为1 0 - - 一2 3 k u ，另外也存在了少量的高分子量的壳聚糖酶圈。 壳聚糖酶大多部分是碱性蛋白，其最适p h 范围大部分在4 0 8 0 之间，酶的等电点 的变化的范围比较大，p i 大部分集中于4 0 - - 1 0 1 之间。另外来源于大多数微生物的壳聚 糖酶的热稳定性比较好【4 2 】，其最适反应温度大多在3 0 , - 6 0 。c 之间。虽然该酶也有比较强 的稳定性，但根据研究发现还有部分的金属离子特别是重金属离子不同程度的影响了酶 的活性，y o o n 等【3 4 1 把来 刍b a c i l l u s s p k f b - - c 1 0 8 d p 的壳聚糖酶纯化后，用烷化剂、螯 合剂和多种金属离子处理后，发现烷化剂、螯合剂对酶的活性没有影响，c 0 2 + 金属离子 能抑制酶的活性。 大部分的壳聚糖酶都归于内切酶，能把壳聚糖酶解为单糖以及壳二糖等寡聚体的混 合物，其反应速度很大程度上与壳聚糖的乙酰化的程度相关p 卯。在反应的过程中壳聚糖 酶的活性还随着n 取代基团、n 乙酰化度、不同取代位置、均相以及非均相反应体系的 变化而变化着。 1 3 4 壳聚糖酶的应用 壳聚糖酶作为酶解壳聚糖的专一性的酶，可以把高分子聚合物的壳聚糖分解为低分 子量的壳寡糖。具有其独特的生物学功能的壳寡糖是当今国内外的研究、开发的热点， 其在医药、农业、食品等领域有着广泛的用途。 在医药领域的应用，壳寡糖容易被人体吸收，可以抑制肿瘤细胞的生长，提高人体 的免疫能力【3 6 1 。在2 0 世纪8 0 年代，就有一些科学家发现了壳寡糖或几丁质可以用于制各 肿瘤转移抑制剂或抗肿瘤制剂的药剂，在后续的研究中聚合度为六的壳聚糖普遍的被认 为具有较好的抑瘤效果，随着提高的壳聚糖的浓度，抑瘤率也提高。官杰等用荷瘤小鼠 作为动物模型进行了体内的试验，发现了质量分数为1 5 的壳聚糖可以明显的抑制实体 瘤的生长，抑制率可达4 7 1 7 ，体外的抑制率平均达7 6 。 壳寡糖进入体内后，可以吸附一些毒性的物质，排除体内有害的物质及各类毒素， 加强受损伤肝细胞的再生的能力，促进肝脾抗体的形成，强化肝脏的机能。由于壳寡糖 是已知自然界中唯一的带正电荷的多糖，人体吸收后，可以维持身体体液在一个弱碱性 的健康环境里，清除人体的氧负离子自由基，降低某些疾病的产生，延缓衰老，并且壳 4 广西大学明甄士掌位论文 费口陵糖酶产生菌的育种以及靖妇民糖的固芡匕 寡糖还具有降低血糖、降低血脂、降低血压、调节胆固醇的活性，改善消化道的功能， 治疗皮肤的损伤等功能【3 7 圳】。因此经生物酶降解壳聚糖而生成的壳寡糖是功能特殊、水 溶性好、生物活性高的低分子质量的生物制品，在将来保健品、医药方面的应用前景十 分的广阔。 在农业领域的应用【4 2 删，在植物的生长、分化及抗逆等方面壳寡糖具有了信息传达 活性的能力。壳寡糖在提高植物的免疫力方面效果很显著，能诱导植物产生酶，提高植 物的抗病的能力，灭杀病虫害，陆引罡等人的研究发现，用壳寡糖拌种可有效的促进了 油菜生长，提高了种子的出芽率，明显的抑制油菜菌核病菌菌丝生长，降低了发病率， 有效的提高了产量：另外壳寡糖被誉为“不是农药的农药，不是化肥的化肥 ，它可增 加土壤中的有益菌从而减少了化学农药的使用量、减轻了农业环境的污染。 在食品工业领域壳寡糖( c o s ) 具有改善食品的结构和调味的能力，因为它的甜味、 吸湿性、保湿性以及在水中的溶解度，有利于调整食品的保水性和水活性【4 5 1 。壳寡糖还 是具有了优良性能的保健因子，可以有效的促进双歧杆菌等有益菌群的生长，抑制有害 菌的生长，具有重要的开发利用的价值8 】。此外壳寡糖还是一种天然绿色无毒的“防 腐剂，可以用来做增稠剂、填充剂、稳定剂、脱色剂和保鲜包装膜等食品工业。 在动物饲养方面的应用，在人类医疗保健中特别是在治疗癌症的方面壳寡糖已经有 了很广泛的应用，在生物兽药领域，主要是利用了壳寡糖的抗菌作用，用于预防或治疗 由大肠埃希杆菌等细菌引发的动物疾病；其次利用壳寡糖可以加快伤口的愈合，可用于 动物的外伤或者骨折的辅助治疗；还可根据它降血脂的作用用于治疗宠物肥胖症【4 9 】。在 动物的生产领域，壳寡糖的无热源、无毒性、无变异性等的特殊生理活性和功能都适合 动物饲料添加剂的特性，通过深入研究发现，在饲料中添加壳寡糖可以有选择的活化、 增殖双歧杆菌等有益菌群，调节动物肠道内的微生物的代谢能力，降低血脂和胆固醇的 含量，增强了免疫能力和提高了瘦肉率，特别高聚合度的壳寡糖，还可以抑制病原菌的 生长繁殖，从而提高了畜禽的生产能力【5 0 1 。最后羧甲基壳寡糖对锌离子、铁离子和钙离 子等具有良好的络合能力，有望生产出新的天然的补锌剂、补铁剂和补钙剂。 1 4 固定化酶技术及其应用 天然酶寿命短，易失活、稳定性不高、不能重复使用，在生产反应后，很难从产品 中纯化，极大的限制了在生产中的应用【5 l 】。于是出现了固定化酶，酶的固定化 5 霸妇畏糖酶产生菌的育种以及壳聚糖的固定化 ( i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ) 是用固体材料将酶束缚于或限制于一定区域内，仍能进行其 特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术，固定化酶是不溶于水的酶。固定化 酶的研究开始于1 9 1 6 年i s 2 ，正式研究在2 0 世纪的6 0 年代，从2 0 世纪的后半叶，科研人员 已经大量的研究水不溶性的固定化酶，并且开始投入到生产，这些成功是因为固定化酶 与游离酶相比，有着许多的优点【5 3 - s 4 1 ，固定化酶可多次重复的使用，方便反应器的过程 控制，从而降低工业生产的成本；固定化酶还可以制作成稳定的生物传感器，可以反复 的应用于工业产品测定和临床检验；还可以作为固相蛋白质化学的基础工具等。固定化 酶不仅在生物学、生物工程、化学、生命科学及医学等学科领域得到迅速发展，并且因 为其具有节省了能源与资源、防治了或减少了生态环境效应的污染，十分符合我国的可 持续发展的战略要求。 1 4 1 固定化的方法分类 无论固定化酶怎么的制，也无论其的性质怎样，任何一种固定化酶都有两个最基本 的功能：非催化功能( n c f ) 和催化功能( c f ) 。在实践的过程中，为了获得结构高度适 应性，高时空的产量，高生产力以及催化剂的高持久性，并尽量的减少副反应，设计的 是时候就必须符合这些要求，还要满足其非催化功能( n c f ) 的选择。以上非催化功能 ( n c f ) 和催化功能( c f ) 决定了固定化酶的最终的应用，反过来，酶的各种应用的特点 决定了这两个最基本的功能要素的选择和设计，因此固定化酶的主要的任务是选择一种 适当的固定化的方法( 载体，酶以及固定化条件) ，从而设计出一个能满足催化需求和 非催化需求的生物催化剂，综合的考虑，酶固定化的基本的方法可以粗分为四类，即吸 附法，共价结合法，包埋法，和交联法，但是这些原始的的方法可以相互的组合，形成 了数百倍的方法【s s , s 6 。 1 4 1 1 吸附法【5 7 - c o l 基于吸附的固定化的方法是最早发展起来的酶的固定化的方法之一，是由n e l l s o n 和g r i f f m 在1 9 1 6 年最早的报道的，吸附法是利用离子结合、物理吸附、亲和吸附等方法， 将酶固定在琼脂糖、纤维素等多糖类或者离子交换树脂、多孔玻璃等不溶性载体上的固 定方式。在过去的几十年的研究发现，吸附法具有可逆性，简易性，工艺简便，条件温 和，能很高的保持酶活力等优点。同时在吸附的过程可以同时达到两个目标：纯化和固 定化。 因为吸附法固定化酶的活力表达多取决在载体的物理和化学的性质，并且其载体的 6 a 钉墨糖葺产生菌的育种以及骞黾聚稠 的固定化 选择范围十分大，包括了天然的或者合成的有机、无机的高分子材料，虽然材料载体之 间的性质差别很大，但一般都要符合酶连接于载体的表面的物理性质和化学性质的几个 基本的要求。于是根据酶与载体之间的亲和力的不同，此方法又可以大体的分为以下五 种类型：非特异性物理吸附法、生物特异性吸附、亲和吸附法、静电作用和疏水作用。 1 4 1 2 交联法【6 1 ，6 2 】 交联法是用多功能的试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能的试剂之间形 成了共价键，得到三向的交联网架的结构，除酶分子之间的交联外，还存在了一定的分 子内的交联。根据使用的条件和添加的材料的不同，还能产生不同物性的固定化酶。 1 4 1 3 共价结合法【6 3 】 酶的共价结合固定化是用共价结合的方式将酶蛋白分子上的功能团固定到了一个 合适载体的表面上的反应基团中。该方法是在2 0 世纪的5 0 年代开始多的，现在是酶的固 定化的一个很重要的基础方法。 该方法由于酶和载体间的连接非常牢固，不容易导致酶的脱落，有着最少的酶漏量， 有着良好的稳定性并且可以重复的使用，从严格的意义上讲，载体的共价的结合是对酶 进行了物理作用和化学作用的修饰，是一种激烈的固定化的方式，与其它的方法比较， 它的性能有了明显的提高。所以这一类固定化的方法是现在研究最活跃的方法之一。到 目前为止，已经建立的方法包括：重氮法、肽键法、烷基化法和芳基化法。 1 4 1 4 包埋法【6 4 ，6 5 】 包埋法就是酶制剂或者酶分子被限制在了某种载体中，通过把催化了的组分分散到 了流体介质中，然后利用物理方法或者化学方法来形成的含有了酶或者别的生物催化组 分的不溶性的载体。这是一种最简单的酶的固定化的方法之一，最早在2 0 世纪的5 0 年代 中期，就有了酶能被包埋在无机凝胶的载体中还存在有酶活的报道。这方法酶蛋白的氨 基酸残基不需要化学的修饰，反应条件温和，并且酶的结构很少改变。它的原理就是酶 溶液和载体相互的混合，再通过引发剂发生的聚合反应，把酶固定在了载体材料的网格 中。大部分的酶、粗酶制剂甚至是完整的微生物的细胞都可以用这种包埋的方法。 适用于包埋法的制备的固定化酶的常用到的载体材料包括了高分子载体、有机载 体、和无机载体等。但包埋法会产生严重的扩散限制，这就会减少了酶的表观活力，因 此这样的方法比较适用在小分子的产物和底物的酶，不适合那些作用于大分子的产物和 底物的酶，因为包埋法的凝胶的网格只有小分子可以通过扩散，并且此现象还会部分的 改变固定化酶动力学的行为，降低了酶的活力 6 0 3 。 7 广西大掌硕士学位论文 a 妇墨糖酶产生l m 的p 件以刀。色聚糖的固定化 1 4 2 固定化酶的应用 1 4 2 1 在工业上的应用 自从酶的固定化技术的出现以来，不论是什么样来源的酶都已经处于在了固定化酶 的研究领域中。固定化酶的最早的目的是为了满足工业化生产的要求，并且到目前为止， 固定化酶的最大的应用范围还是在工业生产上。 其中，世界上生产规模最大的一种固定化酶是固定化葡萄糖异构酶，可以利用它来 催化玉米糖浆来生产高甜度高果糖糖浆，可以大量和廉价生产果葡糖浆。另外氨基酸和 有机酸生产也越来越需要固定化酶的帮助6 7 1 ，如l 天门冬氨酸就是最早用固定化酰化氨 基酸水解酶实现在工业上大规模生产的氨基酸，它不仅减少了产品后处理的成本，而且 降低了酶的消耗量。 1 4 2 2 在临床医疗中的应用【鹋】 现在，人们已将固定化酶来生产一些较高纯度的医用制剂，氨基酸是最早的生产的 产品，还有核酸、抗生素、高纯度的蛋白酶、蛋白质抗体等。另外还可以用固定化酶作 为药物应用在了医疗上，发展成为了酶疗法。因为酶本身就是一种蛋白质，用于治疗时， 进人人的身体后，就会产生抗体，产生抗体反应，容易引起病人的过敏性的休克。另外 作为药物使用的酶本身也不太稳定，容易被蛋白酶降解，从而丧失了治疗作用。如果将 酶微囊固定化，形成微小的胶囊型的固定化酶，就可以克服了上面的缺点，再进人的身 体后，不但可以增加了酶的稳定性，而且还不会产生抗体反应