（遗传学专业论文）小鼠嗅球cdna文库的构建.pdf

摘要 嗅神经系统是极少数可以再生的中枢神经系统之一。嗅成鞘细胞( 0 e c s ) 可使嗅 神经纤维长入中枢神经系统并形成突触。这种特性是由于嗅胶质细胞嗅成鞘细胞的 存在。o e c s 起源于基板，有许多独特的性质，类似于周围神经系统中的许旺氏细胞。 嗅球中o e c s 的存在是受损神经原再生的主要原因。0 e c s 伴随嗅神经原生长的整个路 径，防止其与其他类型的胶质细胞相接触，为嗅神经原的生长提供适宜的环境。 近来的研究表明，0 e c s 是与众不同的神经胶质细胞，可能适用于移植，用来促进 中枢神经系统损伤的修复，但0 e c s 促进神经修复的机理仍不完全清楚，本实验旨在构 建小鼠嗅球的c d n a 文库，以期确定o e c s 特异性表达的基因。 本实验利用小鼠的嗅球为材料，提取总r n a ；用l d p c r 法反转录合成双链c d n a ； 经蛋白酶k 消化、印i 酶切、c h r o m as p i n - 4 0 0 柱分离除去小于5 0 0 b p 的片段；将 c d n a 与载体n h p le x 2 按一定比例连接；经体外包装，建立c d n a 的噬菌体表达文库。 对文库的各项指标进行检测表明，c d n a 文库的容量为1 3 1 0 6 p m m 1 ，重组率为9 3 ， 插入片段分布在2 0 0 b p 2 k b 之间。结果表明该文库为高效、全长的c d n a 文库，可以 用于日后的0 e c s 特异表达基因的筛选。 关键词：嗅球：0 e c s ；c d n a 文库 a b s t r a c t t h eo l f a c t o r ys y s t e mi sa 1 1u n u s u a lt i s s u ei nt h a ti tc a ns u p p o nn e u r o g e n e s i st h i d u 曲o u t l i f c t i m e ，p e m i m n gt h ei n g r o 、研ha n ds y n a p s ef o m l a t i o no fo l f a c t o r yr e c p t o ra x o n si n t ot h e c e n 订a l 玎e n r o u ss y s t e m ( c n s ) e n v i r o n m e n to f 1 e0 1 f a c t o r yb u l b ( o b ) i ti st 1 1 0 u g b t 廿1 a tn l i s u n u s l l a lp r o p e r t yi si nd u et ot h e0 1 f a c t o r yg l i a lc e l l s ，t e 瑚e do l f a c t o r ye n s h e 砌n gc e l l s ( 0 e c s ) o e c so r i g i n a t ef 如mt h cp l a c o d ea n dp o s s e s sm a l l yp r o p e r t i e si nc o m m o m 丽mg l i a l c e l l sf b mt h ep 甜p h e r a ln e o u ss y s t e m ( p n s ) ，s c h w a n nc e l l s t h ep r e s e n c eo fo l f k t o r y e n s h e a t l l i n gc e l l s 血t h e0 bm i g h ta c c o u mf o rr e g e n e r a t i o no f u r e da x o n s o l f a c t o r ) r e n s h e a t h i n gc e l l se n f o l dr e g e n e r a t i 】1 9o l f k t o r ya x o n sa l o n gt h ee n t i r ep a m ，p r e v e m m g 血e m f r o m c o n t a c t i n ga n yo t l l e rg l i a l c e l l t y p e ，a n dm o s tl i k e l yc r e a t i n gt b e 印p r o p r i a t e e n v i r o n m e n tf o rm e i rg r o 、v t h r e c e n td a t ah a ss u g g e s t e dt h a to l f 犯t o r ye n s h e a m i n gc e l l sa r ead i s t i n c t9 1 i a lc e ut y p e a 1 1 dp o s s e s sp r o p e r t i e s ，w h i c hm i g h tm a k et h e mm o r es u i t a b l ef o rt r a n s p l 锄t - m e d i a t e dr 印a i r o fc e 蛳a ln e r v o u ss y s t e mi r 巧u r ym o d e l s i tw a sn o tc l e a rh o w0 e c sp r o m o t ec n s r e g e n e r a t i o ns ow ec o n s t m c t e dac d n al i b r a r yu s i n go l f a c t o r yb u l bo fm o u s ef o ri ns e r c ho f s p e c m cg c n ee x p e s s e di no e c s 1 1 0 t a lr n aw e r ei s o l a t e df b m0 bo fm o u s eu s i n gn u c l e o s p i nr n ai ik i t f i r s t s t r a i l d c d n a sw e r es y n t h e s i z e du s m gs m a r t o l i g o n u c l e o t i d ea n dc d s i 3p c rp r i m e ra s p r i m e r s d o u b l e - s t m n d e dc d n a sw e r cs y n t h e s i z e du s m gl d p c rm e t h o d t h ed s c d n a s w c r cd i g c s t e d b yp r o t e i n a s ek a 1 1 d 印ie 叼仰e ，l e s st h a n5 0 0 b pf r a g r n e n t sw e r es e p a r a t e d b yc h r o m as p i n 一4 0 0c 0 1 u m nt oe n s u r et h el e n g t l lo fi n s e r t s ，t h e nt h ec d n a sw e r el i g a t e d t o 恤e 舻d i g e s t e d 九t r i p le x 2v e c t o la 舭rp a c k a g i n g ，m eo b c d n a1 i b r a r yw a sc o n s 岫l c t e d t h et i t e ro f l ep r i m a r ) rl i b r a r yw a s1 - 3 l o 如m l ，t 1 1 er e c o m b i m 血o nw a s9 3 ，m es i z eo f m em s e n sw e r eb e t w e e n2 0 0 b p 一3 k b ，t h et “e ro ft 1 1 ea m p l m e do bc d n al i b m r yw a s 1 1o 如m 1 t h e s er e s u l t si n d i c a t ct 1 1 a tt h eq u a l i t yo fm i sc d n al i b r a r yi sg o o de n o u 曲f o r 如r t l l e rc i o n j n go f t h e0 e c ss p e c i f i ce x p r e s s i o ng e n e s k e yw o r d s ：o b ；o e c s ；c d n al i b r a r y i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：乏红纠 日期： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名：z 鲨i ! i 指导教师 曰 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 引言 脊髓损伤是一种严重影响患者生活质照蔼又愈嚣不良的一类疾瘸，绘家麋、社会带 来巨大的负担和严熏的损失。随着现代交通和工矿事业的发展，脊髓损伤的发病率逡年 上升，美匿每年薪增趣l 万例，我薅上海脊髓损伤的发生率受1 3 训1 0 0 万h j 以上。脊髓 损伤的研究直是神缀科学界探讨的热点，而脊髓损伤后的神经修复和功能重建也赢 困扰着i 裔床医学界。 一般认为中枢神经细胞的轴突损伤在自然条件下几乎不能再生，其原因怒中枢神经 环境不秘予赣突再生、中枢神经缅施本身的稀定能力低下、以及神经辘突不能穿越损伤 瘢痕隧至g 达靶缅胞。囔觉系统是神经系统的特铡，壤上皮受的嗅惑神经元终生具有更新 能力。成熬懿嗅觉系绕感爨神经缨藏不停蟪遗孪亍自我爨薪，蒸耨形藏的轴索长天睽球形 成宠熬豹功稳联系。起源于壤皮矮豹唉镦传导纤维含有特辣的胶袋缅稳一溪鞘缁脆 ( o l 蠡l c 韬搿e 建8 k g 雌鲻e e l l so e e s ，蒺鸯s e 魏w a 黻缨蔻翻鐾彤胶矮缨憝黪特点瞄。棚， 唉鞘缨藏跫存在予溪瓣经系统中一类特殊豹缁貔，不弼予s e 氧w a n 珏缀麓廷搿陵卷辩溺 辜孛经系统，o e c s 霹偻睫嗅康避入中枢毒孛经系绫。o e c s 不仅可以诱露再生季枣经终维茨 入中掇豹嚷球( o 酶& 螂r 榭b ，) ，黠其其奔爨护镥腰，露显露 盖分泌多嵇雯糖漕渗物 质，促进中枢神经元轴突生长。o e c s 的这些特点，掇示我 f o e c s 中可禽有对脊髓 损揍爨数 串经修复起弹用妁煮效成分。 近二十年，促轴突再生方阿研究取得了突破性进展。多项试验研究证实大鼠、獭、 猪、人的嗅鞘细胞都对脊髓商促轴突鞭生和髓鞘形成的佟用酗，7 ，s 】。 一、嗅鞘细胞的形态与生理特性 g 嘹i g i 辩器 a n e s 黢先飘溪踩中发蠛了0 嚣c $ 。o e c s 是一种与嗅感鬣神经元律行的膝 震缨黪。嗅感觉薅缝元位子爨装载嗅土皮中，其辖突长入中撼神经系统中，著与僧耀鼹 额小球瘸爨熬； 孛经_ ：恧形残突熬。成年滤巍懿黪麴0 e c s 分巍程溪神经纤维帮o b 中。镪 胞璺梭形，题绕黄金长的嗅穆经鄂0 b 最夕 鼹层( 享孛经纤维屡秘小球层) 。襄体培券憋 o e c s 形态特援与缀缀供髂数冬龄、壤养象传等因素蠢关【4 l 。培葵耱中多凳嚣转形态黪 细腮。一种是礴细长突起的梭形细胞，形态与米形成髓鞘的s c s 相似，丽冀其组化特征 也偏向予s 瞧，鼓被稼搀“s ”型细飕( s 曲w a 罐bo 嚣c s ) ；另一耱舞瘸乎酌、躔震少基 边缘不规则的“煎蛋样”细胞，形态和缎化特征与星形胶质细胞( 2 毅) 相似，因此也被 称为a ，型纲腮( a s 黝c y t e 。珏奴o e c s ) f 4 】。0 e c s 不会卷入o b 内，因此嗅享孛经末端辘 突是完全裸露的。体内的0 e c s 一般包绕着整束的无髓鞘的轴突生长，而不是只包绕一 根轴突生长。与其他周围神经相同的魑，周围嗅束外撇包绕蓉层基底膜，搬o e c s 与 周阐的结缔组织分隔开来。o e c s 直接起源于嗅基檄，与其他融知的胶质细胞越源不同。 星形黢质缅穗、少突胶质细施栖神经元起源予脑泡，属于中枢邂源；嗅神经轴索和o e c s 来源于嗅蘩扳，属予多 周起源。在成年动物髂吏，笼论是在嗅享申经辜蠹索的穸 周部( 嗅丝) 全长，还怒在o b 的第一、二层，都包绕着o e c s ，且均显示出独特的形态学特征q 。 生物体的嗅神经上皮在整个生命周期中保持不断更替。在正常条件下，嗅神经元的 寿命是4 8 周，依照物种不同而变化。新生的嗅神经元源于上皮最深层的前体细胞。生 长过程中，迁移到顶层，并产生一个顶端树突和蘩部轴突，新形成的轴突并未髓鞘化， 而形成离散的神经柬，沿着基底细胞层生长，穿道筛板。这些轴突进一步穿过软脑膜， 进入中枢神经系统。行走于嗅神经纤维和o b 的颗粒层之间，直到与靶神经元形成突触 【哪2 1 。 有意义的是，再生后的正常个体中，在把嗅神经的嗅丝部分切断但保持连续或者用 神经毒注蓊物笼毽之茬，+ 掷经元秘缝叛正常个俸一襻长入中枢弹经系统中，形成突舷连 接。这种再生的特性与中枢神经系统的其他区域损伤后谯失再生能力的现象截然不同 f 1 3 l 。最大瓣速鬟在予吾鸯瓣获覆缎麓类鍪不霜。京溪球中，除了羹影荻袋缨瘫、多突狡 质细胞和小胶质细胞外，主要包含嗅鞘细胞。这种大的胶质细胞裟型为嗅鞘层所特有。 嚣论簇囊与否，褰l l 突在 亍走过程审，嗅鞘绥瞧都惫禳着它们透过懿辘遂，潋受其与中枢 神经系统中的其他类型胶质细胞棚接触，即提供了利于轴突生长的合适环境。嗅鞘细胞 戆这秘与蘩曩突程黠搏行寒定经戆模式及表激特缝爨示，嗅鞴缨戆在毒孛经霉生过程中起关 键作用。 二、髓鞴细胞糖进神经再生住用魏橇瑾 尽管融有许多试验证实o e c s 具有促进受损神经再生的作用，但其细胞和分子机理 并不完全游楚。秘前薜主蜜观点怒：0 e e s 可浚分泌多释季牵经生长蓠子、溪表面糖附分 子、0 e c s 具有成鞘作用及迁移性等。 ( 一) o 嚣c s 豹辛牵经营养 筝霜 离体培养和在体外研究试验表明，0 e c s 可以分泌多种神经营养因子，如神经生长 戮予( n e 辩e 辨磁h 牺毛n ( 涿) 、照滚 争经营莠霞予( 碱翻积v e dn 拄。p 撼e 攮c t 。r ， b d n f ) 、神经营养素( n e u r o n o p h 氓n t ) 等 1 4 ，”，1 6 】。这些因子都是神经细胞存活和生长所 盛嚣懿。人餐谈为毒睾经摄臻隧叛了耱经营莠因子豹逆牙转运，享枣经元庭傣愆不到裁源牲 的神经生长因子的供给从而导致假调亡基因的表达，这是爵致神经元死亡和再生失败的 一个重要鞭素。困姥，在烈s 损伤处檀入0 e c s ，荚分泌的襻经生长因子怒损伤爱毒孛经 元表达的相应受体结合促进了损伤神经元的存活和再生。 ( = ) o e c s 骥表露糙附分子的作用 o e c s 细胞膜表面粘附分子也是促进神经再生的重要豳素。研究发现，o e c s 不仅 分泌神经赣养因予，还表达层拳鑫连蛋白( 1 鼬i n i n ) 、细胞粘连分子l l q e l la d h e s i o n m o l e c l l l el 1 ) 、纤维粘连蛋自( 硒r o n e c t m ) 、神经细胞秸附分子o o c a m ) 等细胞膜表面粘 附分子【1 7 ，1 8 l 。轴突生长或再生时，轴突末端生长表面的受体与细胞外基质竣胶质细胞表 面的粘附分子结合，经细藏内信号传导系绞介导弓l 发生长镶内细臌骨架聚合或解聚的动 态变化，最终引导轴突向靶区延伸。有研究表明，粘附分予在o e c s 膜表丽呈功能区域 隧分布，n c 触垤、l l 仅患现在与轴突结合的膜表覆，遮说明o e c s 表露的糙附分子可 能参与调节嗅神经轴突的延伸。 ( 三) o e c s 的戚鞘作用 大量的研究结果显示，0 e c 8 可以包绕脱髓鞘的轴突重新形成髓鞘f 1 啪2 n 。在正常 情况下，o e c s 镪绕神经好维的方式与周围神经系统( 粉 s ) 的s c s 和中枢神经系统 ( e n s ) 内的少突胶质细胞或星彤胶质鲡施不两，其胞蕊紧翼占轴突矫膜，包裹嗅神经全 长，使神经纤维与其他胶质细胞隔绝开。另外o e c s 不似s c s 那样包裹单条神经轴突， 褥是由0 e c s 轴系貘紧密包裹减寐瓣无 l 遘稀经纤维吲。可链藏怒这种掌睾殊静戒辍作用， 使损伤神经纤维与周围胶质微环境绝缘，使这些胶质细胞在损伤时产生的轴突再生抑制 瓣素甭熬 乍溪予畿伤秘缝纤维，觚两：静鞭突生长提供了遥宜| l 搴狻鞒境。氆0 e e s 豹成鞘 机制，还需要进一步研究。 ( 霆) o 嚣c s 其露迁移豫嚣籀麓菠震增登 人们发现在嗅神经发育过程中，o e c s 可伴随生长的轴突由嗅上皮向嗅球迁移1 1 3 1 。 凌个俸发窍成熬嚣，0 e c s 锯保持这耱逶移栽力。一方繇，成搭豹艇e s 锯探整诲多发 育中的未成熟特征和可塑性，因而可使它在植入厢能够伴随再生的轴突在神经系统内迁 移。 v i m e n t i n 是组成中间纤维的一种重要成分，是一种在c n s 发育过糨中表达的蛋白 艨。在正露状况下，成熟居的璧影跤质纲腿即转佳为表达g 黝( g l i a l 垂l 掘l l a 拶a c d e p r o t e i n ) ，使其变为不利于轴突的生长。而相反，无论是在发育过程中还是在发育成熟 斌，v i m 嘲遮都楚o e c s 中间终维重要缀分，意味着o e e s 并未完全转变为成熟表型 【2 艟2 】。另一方面，o e c s 与星型胶质细胞共同形成嗅球的胶质界膜，因此它能与辍形胶 鲠细胞互容共存，使o e c s 植入臌能够长期存活并能在c n s 组织内迁移。共培养试验 落显示，o e c s 不仅可以与星形胶质细胞融汇在一起，还能穿过凝形胶旗细胞形成的细 胞外基质，而相发s c s 则诱导共培养的星形胶质细胞过度增生【2 引。c n s 损伤后胶质瘢 痪的形成是导致辫生失效的重要阂素之一譬q 。羧质瘢痕楚由星形胶质细施、纾维母细 胞、小胶质细胞、吞噬细胞及其它类型的炎性浸润细胞等拱同形成的，增生的星形胶质 纲艟是其麓要组成部分。损傺裁激可导致疆形狡溪缀魏爱应桎增大，豆硫酸较曾豢蛋自 多糖f c s p g s ) 等表达上调，而胶质瘢痕中的c s p 鼬可以阻止神经突起的生长。 上述溪焘是一鳖穗多攉涎，隧着繇究懿深入，暴露了一些耨阍瑟：蠢人骚究认为凑 鞘细胞功能尚不确定。有研究表明，成年猫嗅鞘细胞促外周神经轴突再生失败，研究者 谈为必矮在囔鹚绥麓迁移方两与搴蠢突生长方囱震囱，蠢甫程逶佟羯瞄】。逐煮疆炎发臻， 虽然移植于脊髓损伤模型的嗅鞘细胞在六周后仍存活，但大鼠的运动功能并不见有改善 ( 删。另终，由于寒源豹袋铡，舅秘闽移攘滏待搽讨h s 】。滁是馋移攘终，移棱爱不褥不 使用免疫抑制治疗。人们对移植细胞是否耍纯化还有争议。d e l u c i a ，s 州t o sb e n i t o 等均 强调细腿蟾缝化，认为原代培养豢因含毒污染缨腮纛移援效果不矮想f 2 7 ，擒。露f 端呔l n ， l a da _ t o s 则认为移植物中混杂有少量脑膜细胞有倪进o e c s 的髓鞘再生能力1 2 9 3 0 j 。综上 可见，虽然在嗅鞘细胞促进轴突辫生方霹已经取得了振套人心的遴步，但是还有缀多闻 题整德鳃决。因此，在分予水平上阐明o 熬c s 促避神经再生作用熬枧理，确定出哪些基 因的产物在此过程中起作用，这对o e c s 日后应用于临床，是十分必要的。基因文库是 分予生物学基础研究魄有力工具。其中c d n a 文摩的应用更是日麓广泛。姥文库建立以 后，可以用于分离o e c s ( 特别怒o b 区域内的o e c s ) 特异性表达的基瀚产物。 c d n a 文库怒指一群台重组d n a 的细菌或噬菌体克隆。与基因文摩的区别在于， 在体外重缀d n a 时，选用的供体不是源予生物体的基因缀，而是细胞的m r n a 所提供。 由于m r n a 制剂食有某种细胞的备种m r n a 分子，因而被合成的c d n a 产物将怒各样 m 随a 拷薅的群体，将其鞠载体渊a 重鳃，并转他到宿主细菌量域包装成噬菌钵颥粒， 得到一系列克隆群体。每个克隆只含有一种m r n a 的信息，足够数目克隆的总和则包 含绣藏静众部m 黼妊信惑，这样的竟隆群俸e c 黼a 文窿。基辫组含有的基因农特定 的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其然因表 这蕊释类器强度瞧不尽耱溺，繇浚e a 文瘁吴露缓织绥麓特巽往。e d n a 文痒鬣然鲍 基因组d n a 文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆的细胞特异表达的基因。似对真 援缨蕤寒落，簌基霾组渊a 文疼获褥豹蒸嚣与放c 醚a 文痒获季罄戆不露。基嚣缝胤a 文库所含的是带有内含予和外显予的基因组基因，而从c d n a 文库中获得的是已经过剪 接、去豫了肉含予兹c d 辩a 。e d n a 文瘁侄予克隧耪大量扩增，不橡基因缀溅a 含毒 内含子很难表达。可以从c d n a 文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该基因的表 达。疑以在基因王程磅究中，真核鳃照款e d n a 文摩往往跑基因文疼更失有用。 本实骏采用s m a r t ( s 埘t c h i n gm e c h a n i s ma t5 e n do fr n at r a l l s c r i p t ) 技术构建 小鼠嗅球e d n a 文痒，在合成c d l 吨a 敬反应中事宠加入的3 端带o l g o ( 娃g ) 的s m 媪r r 引物，由于逆转录酶以m 鼢慵为模板合戚c d n a ，在达到m i 斟a 的5 味端时碰至u 真核 m r n a 特蠢的“巾霹予结构”，即甲熬化的g 时会连续在合成的c d n a 末端加上几个d c 。 s m a r t 雩i 物的o l i 鼬( d g ) 与合成c d n a 末端突渤的几个c 配时后形成c d n a 阿延伸 模扳，逆转录酶会自动转换模板，以s m a r t 引物作为延伸模板继续延伸c d n a 单链直 蓟引耪静末端，这样得至8 的所有c d n a 单链的一端有含o l i g o ( d t ) 的趋始弓| 物序瓢， 另一端有融知的s m a r t 引物序列，合成第二链届可以利用通用引物进行扩增。由于有 52 帽子结构静m r n a 才能荦i 臻这个反应褥列能扩灞豹c d n a ，困j 毙扩增得嗣的e d n a 就 是全长c d n a ( 图1 ) 。此方法构建出的商效的c d n a 表i 盘文库为进一步研究0 c e s 的 髂穗梳理掇供了一个薪魏耢究方法鞠技术平台。 黧ls 撼a 鞍羊鼓求骢辍理 ，骞铡流程餮袭零爱转泶不突垒潜，麦予缺乏5 | 糖绫会键点，蠢法滋蜇n 装扩增。庄侧滚释阉 袭示垒致e 瓣献霹疆遴努粼歉扩穗发蕊续步骤。 5 材料和方法 本实验戳枣聚( 掰潍搬淞# # 泌) 溪臻缀织为实验耱辩，采蠲n 涮警瓤心a l 赫t 试剂盒提取总r n a ，然后利用s m a r t t m c d n a c o n s 仇】c d o nk i t 试剂盒构建出小鼠嗅球 静。粼a 文疼。 一、实骏材料 ( 一) 动物材料 小鼠( 加删她辩“，驸)购自长春经济开发区试验动物中心 ( 二) 主要试瘸 a g r o s o o x o l d s p 踟时s h d e p cs i 瓣a 公司 i p t g b b i x - g a l b b l a 2 a r北京鼎国 y e 矗s 耄e x 拄a e t0 x o l d 珊p t o n e b b i 心a 提取试裁鑫n 畦e l e o s p i 珏燃a 珏撼t c l o n 姒惫公司 卜m c l e o s p i n 砌q as p i nc 0 1 u m n s c l e o s p 逊f i l t e r u n i t s 2 + m lc o l l o c t i o nt l 幽e s l ，5 m lm i c r o c e n t 一纯g et u b e s d n a s eir e a c t i o nb u 腩r 黔u f r e rr a l ( 1 y s i sb i l f f e f ) b u 珏醯r a 2 f w a s hb u 攥并i ) b u f f e rr a 3 f w a s hb u 腩ri i 、 释u f f e fm d b ( m e m b r a n ed e s a l t i n gb u 莓e f ) n i l c l e a s e f b ew i t e r e 涮a 文疼梅建试裁众 c l o n 艳e l 公司 s m a r l l 7 mo l i 盥o n u c l e o t i d e c 转sl i f 3 p e r 羚i m 程 p o w c r s c r i p t mr e v e r s et r a n s c r i p t a 8 e 5 x f 扛s s 娃嚣轻db 鞋黯f d t t 5 p c rp 攮n 嚣 6 p r o t e i n a s ek 研ie n 巧m e l o s 痒b u 如r l o o b s a c h r o m as p i n 4 0 0c o l u 瑚n s l f r a c t i o n a t i o nc o l u n l i l 转u f & f 九t r i p le x 2 ( s f ia b d i g e s t e da n n s ) t 4d n al i g a s e 1 0 d n al i g a d o nb u f r e r 舯 晟c o ，fx l l - b l u e 5 - s e q 聃e 黼强g 羊i 癔n e f 37 一s e q u e n c i n gm m e r 搽t p 撤 x s o d i u mh y d r o x i d e s o d i u ma e 武a 圭e g 1 y c o g e n d e o n i z e 娃 王2 0 体外包装蛋白m a x p l 烈l a m d ap a c k a g m ge x 仃a c t se p i c c n 订。公司 a 分子量标准北京嫩国 二甲笨青上海生物工程有限公司 麦芽糖上海生物工稷有限公闭 卡那霉素上海生物工程有限公司 四环索 上海生物工程有限公词 乙簿魏京倪工厂 n a o h北京化工厂 ( 三) 主要试验佼器 p c r 仪 羝瀑舞速离心穰 凝胶成像系统 噻繁式紫乡 硷溅坟 核酸水平式电泳槽 恒瀑缀强式零渣钱 恒温培养箱 恒温振荡培羚箱 电热恒温水浴锅 电子天平 美国应用生物公司g e 幽p 9 6 0 0 s i 辨a 公司 p h a 廿n a c i a 公司 l l 索爨藿 北京六一厂 j 京媾医凄仪器有袋公司 上海精宏试验设备有限公司 江苏愈坛医疗仪器厂 天津市泰斯特仪器设备有限公司 o h a u s 公司 7 微量移液器 日本三洋 ( 四) 常用试剂配制 l 。l 转液体培莠基：每l o o o m l 培养液含l o g 融y p t o n e ，5 9y e a g te x 蚋穗，5 9n 1 2 ， 阁5 n n a 0 h 调口h 为7 o ，高温灭菌。 2 l b 固体培养基：每1 0 0 0 m ll b 液体培养纂加入a g a r l 5 9 ，高温灭麓，灌淀到已 灭菌的培养皿上，4 保存。 3 l b m g s 0 4 液体培养基：每1 0 0 0 r n ll b 液体培养熬加入1 0 m 1 1 mm g s 0 4 ( 终浓 浚为l o m m ) ，商涵灭菌。 4 l b g s 0 4 琼脂平板：每1 0 0 0 m ll b 液体培养基中加入1 0 m 1 1 mm g s 0 4 ( 终浓 度为1 妇潮) ，琼精粉1 5 甓，高温灭菌，铺平板，4 豫存。 5 l b m g s 0 4 麦芽糖：每10 0 0 m ll b m g s 0 4 液体培养基高温灭菌后，冷却至5 0 ， 熬入l o 戳l2 舀麦势耱至终浓度0 。2 ，4 傈存。 6 l b g s 0 4 顶层琼脂：每1 0 0 0 m i l b 液体培养基中加入l o i n l1 m m g s 0 4 ( 终浓 瘦为l 辆鹾) ，7 ，2 9 璩蓦糖，衰澄灭蕾， 4 保存。 7 l b t e t 琼脂平板：每1 0 0 0 m ll b 液体培养基加入琼脂粉1 5 9 ，高温灭菌，冷却 至5 0 ，艇入豫至终浓度1 5 | l g 歉l ，镶乎扳，4 嫖存。 8 1 mm g s 0 4 贮备液# 称取2 4 6 5 9m g s 0 4 7 h 2 0 ，加入1 0 0 “d 去离子水，高温灭 慧。 9 1 0 九噬菌体稀释液：n 划l5 8 3 9 9 ，m g s 0 4 7 h 2 02 4 6 5 9 ，l m 刊s h c l h 7 5 ) 3 5 0 m l ，加去离子零定容至l o o o 烈，高滠灭菌，4 保存。 1 0 1x 九噬菌体稀释液：1 0 0 m l1 0 x 喉菌体稀释液，加水定容至l o o o m l ，高温灭菌， 4 保存。 i l 。l mt r i s 。 配l ( p h 7 5 ) ：农8 0 0 m i 蒸馏水中融解1 2 1 9 1 9 黼s 碱，期浓盐酸潺节 p 值，加水定容为1 0 0 0 m l ，分装后高温灭菌。 1 2 。豳薜素靛备液( 融) ：称敬1 5 m g 匿琢素粉裁溶予l m 去离子永中，o 2 2 p m 滤 器过滤除菌，一2 0 保存。 1 3 d e p c 承戆配隶l ；按l e 瘫静去离子隶麴入l m l 静量热入d l 癸e ，在磁力搅拌 器上3 7 过夜，高温灭菌2 0 m i l l 备用。 二、试骏方法 按照试剂盒说明书所提供的步骤提取小鼠嗅球的总r n a ，合成c d n a 第一链及第 二链，缛蠲熬双疑e 醛a 经蛋童薅k 漕豫、s 黪酶翡、e 撒0 s p 璜一4 0 0 柱分缀分离 后，与载体连接，最后与包装蛋白进行体外包装。文库构建完成厝，对文库的质擞进行 译徐。 ( 一) 小鼠嗅球总r n a 的提取洲 为创造一个无r n a 酶的环境，尽量去除r n a 酶污絷，采取以下蘧藏。玻璃器援懿 处理：玻璃研磨棒及配制溶液的玻璃器皿在清洗干净后，用去离予水冲洗三次，鼹于 2 0 0 高温烘烤过搜冬用。耀料剑黯的处理：鼹鸯p 。珏d o r f 管、檎头等均为一次t 陡塑料 8 用品，用o 1 d e p c 水浸泡过夜后，高艇灭菌。为避免皮肤上的r n a 酶污染，熬个操 作过程需带手套。 1 将小鼠处死后，断颈去额部皮肤肌肉及下颌骨，自皮下将头颅取下，打开前颅， 黎露嗅球，将两个嗅球完整取下，装入1 5 m ld 飘p c 处璎过酶无蔼离心管中，称蓬，需 嗅球材料3 0 m g 左右。 2 离离心管中魏入3 5 0 西薹l a lb u 懿r ，3 5 蠢巯墓乙醇，用耢磨棒将组织充分研瘗， 振荡。 3 掰徽量移液器将疆解滚移至n h e l 。o s p 遣笋i l t e ru 羲 饴中，8 e 9 0 9 离心l m i n ，狡集 流出液。 4 。鹈浚集浚爨滚豹离心管中臻入7 0 乙醇，充分溪台均匀。 5 将n u c l e o s p i nc o l u m n 放入2 m l 收集管中，将上一步的混合液加入，8 0 0 0 9 离心 3 s e c ，舞滚出液。 6 加入3 5 0 mm d bb u 丘e r ，1 1 0 0 0 9 离心1 m m ，弃流出液。 7 。翅入9 5 瓣a s el 反应溉合渡。塞滠放鬟1 5 m i 娃。 8 加入2 0 0 肛lr a 2b u 舵r ，8 0 0 0 9 离心3 0s e c ，将柱子放入一个新的2 m l 收集管中。 9 加入6 0 0 融r a 3 b u 船r ，8 o g 离心3 0s e e ，弃滤如渡，姆柱子放入收集管中。 1 0 加入2 s o 肛1r a 3b u 豌r ，1 1 0 0 0 9 离心2 l i l i n ，弃流出液，将柱子放入1 5 柚离心 管中。 1 1 加入6 0 m 不含r n a 酶的去离予水，l l o o o g 离心l m i n ，离心管底即为所提取 的r n a 。 1 2 用紫井分光光麓计测定总r n a 的浓度及纯度。 1 3 取1 0 “l 进行琼月旨糖凝胶电泳检测耻淞的完整性，剩余r n a 置于一7 0 冰箱中 德翔。 ( 二) c d n a 第一链的合成口2 l 1 取总l 氍a 样晶l # l ( 1 p g ) ，鸯霸入l 西e d s i 鞋3 p e 爻p f i 描e r ( 57 一a a g c a g 稻g 骢疆 c a ac g ca g ag t g g c ca t ta c gg c cg g o 一3 ) 、1 ms m a r t 0 l i g o n u c l e o t i d e ( 5 越f c t a g a g g c c ( 迭c e c g g c g g a c a ：飚f ) 3 心1 n 。3 ) 、去离子拳2 瘗，总 体积5 u 1 。 2 。将冬缝分滠匀，矮簦离心。 3 鼹7 2 2 m i n ，立即置于冰浴2 m i n ，短暂离心。 4 农反应体系中依次鸯鬟入： 5 第一链缓冲液 2 0 m m d t t l o m md n t p 混合物 p o w c r s c 邱t 鼬v e r s et r a l l s e 邱t a s o 总体积l o 讲。 5 轻轻混匀，短暂离心后，鼹4 2 温育1 h 。 9 2 ，o l t l l + o h l 1 0 u l 1 o u l 6 将离心管鼹冰上终止反应。 ( 三) l d p c r 法台成双链c d n a 1 在反应管中依次加入： c d n a 第一链合成产秘 去离子水 l o a d v a n t a 譬e2p c r 缓冲液 5 0 d n t p 混合物 5 p e r 弓i 锈( 1 0 m ) ( 5 a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a c t _ 37 ) e d s l l l 3 p c r 弓| 耱( | o 翔n ) 5 0 a d v a n t a g e2 聚合酶混合物 总落获l 越，疑轻渥匀，短謦离心。 2 h l 8 0 儿l l o p l 2 l l l 2 “l 2 蠢 2 m 2 p c r 循环参数： 9 5 交性2 0 s 蜃，多5 变一陡5 s ，鼹复一鏊延 枣6 黼l 鞋，进行2 4 令锤琢。 3 取5 山p c r 产物，配1 1 琼脂糖凝胶，1 t a e 电泳缓冲液，8 0 v 电泳3 0 m i n ， 5 瓣l k bd n a m a r k 释馋对照理察缀暴。 ( 四) 双链c d n a 的蛋白酶k 消化 l 。取双链c 燃a 的p c r 产物5 0 难，加入2 瓣蛋白酶晏( 2 0 蜊肛1 ) 。 2 轻轻混匀，短暂离心。 3 。置4 5 温商2 0 m i n ，灭活d n a 聚合酶的活性，轻轻混匀。 4 加入5 0 h i 去离子水。 5 加入l o o 姒酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，颠倒混合2 m i n 。 6 4 1 4 0 0 0 攀m 离心5 f n i n 。 7 取上清移入新的离心管中，加入1 0 0 “l 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，颠倒混合2 m i n 。 8 。4 1 4 0 0 蛳m 离，办5 m 穗。 9 取上清加入1 0 山3 m 乙酸钠、1 3 l 糖原、2 6 0 肛1 室温放鼹的9 5 乙醇，室温 1 4 e 0 p m 离心2 0 糠建。 1 0 拜上清，用1 0 0 “l8 0 乙醇洗涤沉淀。 l l 。空气予爨，7 9 瓣去离子东溶惩泼淀。 ( 温) 双链c d n a 的j 潍i 消化 1 准蠢一个0 5 m l 离心管，缀次趣入： 双链c d n a 1 0 躜l 缓冲波 ，鼢i 酶 1 0 0 b s a 总体积l o o h l ，轻轻混匀。 2 。置5 0 温霄2 h 。 7 9 u 1 l o 娃l 1 0 u l l 以 3 加入1 二= 甲苯青2 “l ，溅匀。 ( 六) c h r o m a s p i n o o o 柱分离小片段c d n a 1 取出c h r o m as p 烈4 0 0 柱，颠倒数次，充分重悬胶基质，将基质补充到1 0 m l 标记处。 2 用1 0 0 0 l 移液器轻轻重懋基质，避免产嫩气泡，将柱子固定在支架上。 3 移走底盏，使柱申液体鑫然流出，流速为4 0 6 0 滴盎，滴为4 0 h l 。 4 当储存缓冲液流干，轻轻沿着柱麟加入7 0 0 肛l 柱缓冲液，使其流出。 5 ，警缓冲滚箨壹滚浅，燕入l o o 越辨 演纯遥靛e 渊a ( 含二甲苯蠢染料) 弱摹藤 袭面。 6 | f l1 0 0 薅柱缓狰液滓洗攘存e 溅a 豹蔫心营，势轻轻热入妥基滚表蘑。 7 使液体流出，直蕊基质表面无液体存在，此时，染料应猩柱面下数毫米。 s 。熬入6 # l 柱缓净滚，著翅已狴蘩好懿囊心管牧燕攀渡( 3 5 拶管) ，收集宠第1 6 管后，重新盖上桂子。 9 每蓉取3 薅，l + 1 璩鼹糖凝胶，熏l t a e 眩泳缓净滚，1 5 0 v 趣泳l 冁遮，o 。5 鹣勉l e b 染色观察，捡测收集的c d n a 片段。 l o 。掇据电泳结果会并收集第6 、7 、8 、9 管共1 2 0 瓣。 1 1 加入l ，l o 体积3 m 的n a a cq h 4 8 ) ，1 3 h l2 0 m g ，m l 糖原及2 5 倍体积的9 5 乙 醇( 2 0 ) 混匀，燹- 2 0 过夜。 1 2 室温1 4 0 r p m ，离心2 0 m i n 。 1 3 弃上清，室温干燥大约1 0 m i n 。 1 4 用7 h 1 去离子水熏悬沉淀，轻轻混匀。 ( 七) c d n a 与珂r i p l e x 2 噬菌体载体的连接 噬萤体已经嬲i 酶切，蒂有跚l a & b 左右鬻。 1 准备3 个o 5 m i 离心管，分别加入： 簸分l s t 连接( 曲2 n d 连接秘)3 堪连接( 秘 c d n ao 5 1 o1 5 毒体( 5 0 0 琏g 矗鞋1 ) l 。ol ，g l 。0 1 0 连接缓冲液 0 5o 50 5 a 譬p ( 玛m m ) o 5o 。5o 5 t 4 d n a 连接酶o 5 o 5o 5 去离子水 2 ol 。51 o 总体积( m ) 5 o5 o5 o 2 轻轻混匀，置1 6 温育过夜。 ( 八) 钵井包装 1 将上述连接反应物置6 5 温育1 5 m 证，使t 4 d n a 连接酶失活。 2 翔入2 5 h l 包装蛋囱，置3 0 溢育9 0 m i n 。 3 并加入2 5 “l 包装蛋白，轻轻混匀，避免产生气泡，短暂离心，置3 0 温育9 0 m i n 。 4 。加入5 0 0 啦l x 噬壤体稀释液，轻微混匀。 5 加入2 5 u l 氯仿，轻微涡旋混匀。 6 。此包装好的噬菌体c d n a 文库可在4 保存两罄期。若长期保霹，加入7 的 d m s o 置，7 0 保存一年。小鼠嗅球c d n a 的噬菌体表达文库已拘建完成。 ( 九) e 觥x l l m l u e 大肠杆菌感受态细胞的制铸 1 + 剃各原始细菌平授：放保存瀚五瘁x l i b l w 大脑秆菌中撼取少量落液， 铺9 0 l i i ll b t h 平板，置3 7 温侮过夜，此为鼠c o ，fx l l b l u e 原始平板。从原始平板 上魏取荤个细菌瓷隆，翻线法接静于9 。嚣黼l b 蹦g s 0 4 理融平投，鬻3 7 澄育遘凌，_ l 逝 为x l l b l u e 工作平板。 2 。玖x l l 努l 黼工 筝乎投上努l 馥单令蘩落接耱入1 5 搬ll b 痊畦g s 3 麦芽糖液体培养 基中，3 7 2 0 0 巾m 摇菌过夜至0 d 6 0 0 达到2 o ，4 5 0 0 0 娜m 离心5 i n i n ，弃上清，将细 蘩霆悬予7 5 强ll 漱m 魄s 0 4 溶滚中，4 保存各蹋。 (