（环境科学与工程专业论文）荧光探针的制备、性能研究及其在环境化学中的应用.pdf

硕士学位论文 a b s t r a c t t l l i st l l e s i s 、v o r kw a su s e df l u o r e s c e n tn 印h t h a l e n ea n h y 嘶d e ，锄t l u a c e n et 0s y n t h e s i s n e wf l u o r e s c e n tm a t e r i a l s ，r e s p e c t i v e l y ，a i l d 也ew a t e rc o n t e n to fo 曜枷cs o l v e n t s ，m e t a li o i l s w e r ed e t e 肌i n e d i n v e s t i g a t ei t sp e r f b 咖a n c et h r o u 曲e x p e r i m e n _ t sa n dt os n j d yt l l ec h e m i s 姆 o fv a r i o u sp r o b ep o i n t si i l t 1 1 e 印p l i c a t i o n e n v i r o r l i i l e n t ： ( 1 ) an e wf l u o r e s c e n c ed y e ， - 锄i n o 一4 - ( 2 - h y d r 0 x y e t l l y l 锄i n o ) - 1 ，8 一n a p h t h a l i m i d e( a m 叼， b a u s e do n 4 - b r o m o 一1 ， 8 n a p h t h a l i ca 1 1 h y 血d ew a ss y n t l l e s i z e da san u o r e s c e n c ep r o b ef o rd e t e m l i i l i n gw a t e rc o n t e n t i 1 1 o 唱a l l i cs o l v e n t s c h a i l g i n gf 的man o n - p o l a rt 0ap 0 1 a rs o l v e n ti n c r e 雒e st h es o l v e n t i i l t e r a c t i o n 埘t 1 1e x c i t a t i o ns p e c t r u ma n de m i s s i o ns p e c 胁s l l i r st 0l o n g e rw a v e l e n g t l l s t h e n u o r e s c e n c ei n t e n s i 哆o fn l ep r o b ed c c r e a s e dv v i mt h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fw a t e r t h e l i n e a re q u a ，t i o n sf o rd i o x a i l e ，a c e t o l l i t r i l ea 1 1 de t h a n o lw e r eo b t a i n e d 丽me x c e l l e n t r e l a t i v i t ) ri n t t l er a i l g eo f0 0 0 4 0 0 ( v ，v ) ，t h ea h nn u o r e s c e n c ei n t e n s 时c h a l l g e d 懿al i n e a r 缸l c t i o n o f w a t e rc o n t e n t n l ed e t e c t i o nl i m i t sw e r eo 0 1 9 ，0 0 3 8 ，a n d0 0 6 0 f o rd i o x 锄e ，a c e t o n i t r i l e a n de t t l a n o l ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) an e wn u o r e s c e n c e d y e ，二e t l l y 0 1 4 - ( 2 - e m y l 锄i n e 锄i n o ) - 1 ，8 - n a p h t l l a l i m i d e ( e e n ) ，b a s e do n4 一e m y o l 一1 ，8 - n 印h t h a j i ca 1 1 l l y d r i d e 、 粥s y n t h e s i z e d 弱a f l u o r e s c e n c ep r o b ef o rd e t e m 硒n gw a t e rc o n t e n ti 1 1o 堵a 1 1 i c s o l v e n t s c i l a n g i n gf 如ma i l i d n - p o l a rt oap o l a rs o l v e n ti n c r e a s e st h es o i v e n ti m e m c t i o n 、) i ，i me x c i t a t i o ns p e c 协肋a 1 1 d e m i s s i o ns p e c t r u ms k r st ol o n g e rw a v e l e n g t h s t h en u o r e s c e n c ei n t e n s i t ) ，o ft l l e p r o b e d e c r e a s e dw i t l lt 1 1 ei 1 1 c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fw a t e r 1 1 1t 1 1 er a l l g eo f0 0 0 - 4 o o ( v ) ，t l l e l 硫a re q 眦t i o n s 、懈i = - 7 4 0 3 【h 2 0 】+ 8 0 8 31 ( 贮0 9 9 8 9 ) a i l dm ee e nn u o r e s c e n c ei n t e n s 时 c h a i l g e da sal i n e a r 胁c t i o no fw m e rc o n t e n t ，n l ed e t e c t i o nl i m i t sw e r e0 0 4 0 f o rd i o x a n e t h ep r e p a r e dp r o b ew a ss u c c e s s 伽1 ye m p l o y e df o rp r e l i m i m r ya p p l i c a t i o ni i ld e t e 枷i l i n g w a t e rc o n t e n t i i l o 略撕c s o l v e n t s ( 3 ) a n a i l t h r a c e n es c h i f fb a s e d e r i v a t i v e ，1 ， 7 - b i s ( 9 - a i l t l m l d e h y d e ) 一d i e t h y l e n e t r i 锄i n e ( b a d t ) ，b e h a v e sa sa i li o n s e l e c t i v ef l u o r e s c e n c e p r o b ef o rt h ed e t e m i n a t i o no fc u ( i i ) o rh g ( i i ) i i la q u e o u sm e d i u mw a sr 印o r t e d r r h ep r o b e e x l l i b i t e dl i n e a r r e s p o n s e s f o r c u ( i i ) 锄d h g ( i i ) o v e rc o n c e n 僦i o n r a n g e s o f 4 0 0 1 0 - 6 1 o o 1 0 5m o ll 。1a 1 1 d2 0 0 1 0 _ 6 8 o o 1 0 6 m o ll 一t h ed e t e c t i o nl i m i tc o u l db e 嬲 l o w 嬲3 7 0 1 0 。7m o ll 。1f o rc u ( i i ) a i l d6 8 0 1 0 。7m o ll 。1f o rh g ( i i ) t h ep r e p a r e dp r o b ew a s s u c c e s s 如l l ye m p l o y e df o rp r e l i m i n a 巧印p l i c a t i o ni nr e a ls 锄1 p l e s k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c ep r o b e ；n a p h t h a j e n ea r l l l y d r i d e ；w a t e rc o n t e n t ；a n t h r a c e n e ； c u 2 + ；h 孑+ i i i 硕七学位论文 附图索引 图2 1 趾 n 的合成1 6 图2 2 不同溶剂对荧光探针荧光光谱的影响l7 图2 3 探针触 n 在不同溶剂中的斯托克斯位移和取向极化率1 9 图2 4 荧光探针在不同含水量( v ，v ) 的二氧六环溶液中的光谱图2 0 图2 5p h 对a h n ( 1 1o 5m o ll 。1 ) 荧光强度的影响j 2 0 图2 6 二氧六环中不同含水量的a h n 荧光强度变化曲线2 1 图2 7 乙腈中不同含水量的a h n 荧光强度变化曲线2 2 图2 8 乙醇中不同含水量的a h n 荧光强度变化曲线2 3 图3 1e e n 的合成2 6 图3 2 不同溶剂对荧光探针荧光光谱的影响2 7 图3 3 探针e e n 在不同溶剂中的斯托克斯位移和取向极化率2 9 图3 4 荧光探针在不同含水量( v v ) 的二氧六环溶液中激光谱图3 0 图3 5p h 对e h n ( 1 1 0 由m o ll 1 ) 荧光光谱的影响3 0 图3 6p h 对e h n ( 1 1 0 而m o ll 以) 荧光强度的影响3 1 图3 7 二氧六环中不同含水量的e e n 荧光强度变化曲线3 2 图3 80 4 0 ) 二氧六环中水含量与荧光强度的线性拟合3 2 图4 1 荧光分子探针b a d t 的合成3 6 图4 2 荧光分子探针b a d t 的荧光光谱3 6 图4 3 荧光分子探针b a d t 的i r 谱图3 7 图4 4 络合物b a d t c u ( i i ) 的i r 谱图3 7 图4 5 相对荧光强度q 和金属铜离子对数的关系3 9 图4 6 加入不同体积乙醇荧光强度的影响3 9 图4 7 各种金属离子对荧光强度的影响4 0 图4 8 加入表面活性剂s d s 各种金属离子对荧光强度的影响4 1 图4 9p h 值对荧光强度的影响4 2 图4 1 0 铜( 汞) 离子浓度对荧光强度的影响4 2 v l i 荧光探针的制备、性能研究及其在环境化学中的应用 附表索引 表1 1 常用有机化合物荧光测定法9 表1 2 无机离子的荧光测定法简表9 表2 1 在不同的溶液中荧光探针的光谱性质1 8 表2 2 不同有机溶剂中水含量的测定2 4 表3 1 在不同的溶液中荧光探针的光谱性质2 8 表3 2 二氧六环中水含量的测定3 3 表4 1 荧光探针的初步应用4 3 v i i i 硕士学位论文 1 1 荧光光谱 第1 章绪论 1 1 1 荧光的产生 荧光是一种光致发光现象。室温下，大多数分子处于在基态的最低振动能层。 处于基态的分子吸收能量( 电能、热能、化学能或光能等) 后被激发，跃迁到激 发态，激发态不稳定，分子将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐 射，这种现象称为“发光。荧光和磷光是最常见的两种光致发光。但是，荧光和 磷光这两种光致发光过程的产生机制有十分明显的区别。 荧光的产生有对光子的吸收和再发射这两个过程。两个过程都是瞬时的，在 这两个过程中存在时间间隔，一般为8 以o s 左右，这一间隔的时间长短是可变化的。 因为在这一段时间内处于激发态的分子发射荧光去活过程与各种无辐射去活过程 是相互竞争的，当光进入物质以后，可能有两种情况：一种是进入物质后，能量 几乎不被吸收；另一种是能量效率取决于分子的环境因素，而荧光发生的内在因 素则取决于分子的结构，大多数荧光物质都含有兀一兀幸跃迁的苯环及其衍生物【1 2 】。 1 1 2 荧光光谱的基本概念 根据量子理论，微观体系( 原子、分子等) 的内部运动一般是不连续的，它具 有一系列分立的能级。体系由一能级向其他能级的过渡称为跃迁。体系由高能级 向低能级的跃迁伴随着能量的释放；由低能级向高能级跃迁伴随着能量的吸收。 能量的释放和吸收可以以辐射的方式进行( 放出或吸收光子) ，成为辐射跃迁【3 】； 也可以以无辐射的方式进行，如离子相互碰撞而产生的能量就是无辐射跃迁的例 子。全部能级间可能的辐射跃迁对应于一系列辐射频率，成为该物质的光谱。荧 光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下 测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率： 发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也 就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。同辐射发射和吸收相关联的除了原子 和分子外，还有他们的聚集结构如晶格、半导体中的电子空穴对等等。 荧光现象涉及分子的激发和发射两种过程，因而它能提供比吸收光谱更多的 信息。 荧光光谱具备以下三个特征【4 】： 激发光谱的形状和吸收光谱极为相似： 发射光的形态和激发光的波长无关； 荧光探针的制各、性能研究及其在环境化学中的应用 发射光的形状和吸收光谱极为相似，且基本上呈镜像对称关系。 1 1 3 荧光光谱的主要参量 、 1 激发谱和发射谱 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光团在不同波长的激发光作 用下测得的某一波长处( 通常是其荧光光谱峰位的波长) 的荧光强度的变化情况， 也就是不同波长的激发光的相对效率。激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相 似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样。 这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。 发射光谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情 况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。荧光发射光谱显示了若干普遍 的特性【5 1 。 ( 1 ) 斯托克斯位移。在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于 激发波长，因为首次发现这种波长位移现象的人是s t o k e s ，故称s t o k e s 位移。这是 由于受激分子通过振动驰豫而失去振动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的 碰撞，也会有能量的损失。因此在激发和发射之间产生了能量损失。 ( 2 ) 荧光发射光谱的形状与激发波长、发射波长无关。这是因为分子吸收了 不同能量的光子可以有基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。 由于较高激发态通过内转换及振动驰豫回到第一电子激发态的几率是很高的，远 大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的 光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能 层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。 ( 3 ) 镜像规则。通常荧光发射光和他的吸收光谱呈镜像对称关系。 在发射谱中最大荧光强度的位置常记为九m 。x ，它是荧光光谱的一个重要参数， 且对环境的极性和荧光团的运动均敏感。 2 荧光寿命 当某种物质被一束激光激发后，该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一 激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态当激发停止后，分子的荧光强度 降到激发时最大强度的1 e 所需的时间称为荧光寿命，通常用1 ，表示。通过测量寿 命可以得到有关分子结构和动力学等方面的许多信息【6 ，7 1 。 3 荧光量子产率 荧光量子产率( f l u o r e s c e n tq u a n t u my i e l d ) 又称荧光量子效率，通常用f 表示。是指激发态分子中通过发射荧光而回到基态的分子占全部激发态分子的分 数，荧光量子产率( m f ) 即荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激 发光的光子数之比值。它的数值在通常情况下总是小于1 。f 的数值越大则化合 2 硕士学位论文 物的荧光越强，而无荧光的物质的荧光量子产率却等于或非常接近于零 8 ，9 】。m 对于荧光团周围的环境以及各种猝灭过程很敏感，f 的改变必然会引起荧光强度 的改变。因此，若要研究西f 的相对值，我们只需测荧光强度就可以。 4 荧光强度 荧光强度f 取决于激发态的初始分布i a 与f 的乘积。这里的f 指的是向各个方 向上发射的荧光强度的总和，实际上，光谱仪收集的只是其中的一小部分，因此 仪器测到的荧光强度为f = i a f z ，这里z 是仪器因子【1 0 ，l 。 很显然荧光强度与样品在波长h 处的消光系数有关，而消光系数与激发波长 是密切相关的，消光系数随波长的变化称为即吸收谱，因此荧光强度也随激发波 长的变化而变化。实际上仪器因子z 与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱 并不完全相似。 1 2 荧光分析法 1 2 1 荧光分析法的发展简史 具有荧光性质的物质分子中都具有一系列紧密相隔的电子能级，当物质受到 紫外光或可见光照射时，由于这些光子的能量较高，可引起物质分子中的电子发 生能级间的跃迁而变成电子激发态分子。电子激发态分子不稳定，可能通过辐射 跃迁等分子内去活化过程丧失多余的能量返回基态，在此过程中，发生光子的发 射，伴随着荧光产生。荧光是某种物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，具 有不同的颜色和不同强度。根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量 的方法，称为荧光分析法【1 2 ，1 3 】。 第一次记录荧光现象的是1 6 世经西班牙的内科医生的植物学家n m o n a r d e s ， 1 5 7 5 年他提到在含有一种称为“l i g n u mn e p h r i t i c u m ”的木头切片的水溶液中，呈 现了极为可爱的天蓝色。1 7 世纪和1 8 世纪中还发现了其它一些发荧光的材料和 溶液，然而在解释荧光现象方面却几乎没有什么进展。直到1 8 5 2 年，s t o k e s 在考 察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长些， 判明这咱现象是是物质在吸收光后重新发射不同波长的光，从而导入了荧光是光 发射的概念。历史上首次利用荧光做分析的是1 8 6 7 年g o p p e l s r o d e r 应用铝桑色 素配合物的荧光进行铝的测定。自此，荧光分析越来越受到人们的关注。2 0 世纪 以来，随着激光、微处理机和电子学的新成就等一些新的科学技术的引入，大大 推动了荧光分析法理论方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、 时间分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧 光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析 方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析 3 荧光探针的制备、性能研究及其在环境化学中的应用 仪器的问世，方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、环境保 护、公安情报和科学研究等各个领域中。如今，荧光分析法已经成为一种十分重 要而且有效的光谱化学分析手段，并不断地有新方法、新技术、新应用和研究进 展的专著出版1 4 2 们。 1 2 2 荧光分析法定量分析 荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。 1 直接测定法： 利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测定法。某 些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去 干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度【2 1 ，2 2 1 。具体方法有两种。 ( 1 ) 直接比较法：配制标准溶液的荧光强度f x ，已知标准溶液的浓度c s ，便 可求得样品中待测荧光物质的含量。 如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从f s 和f x 值中扣除空白溶液的 荧光强度f 。，然后进行计算。 ( 2 ) 标准曲线法：将己知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列 标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定 样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。 为了使各次所绘制的标准曲线能重合一致，每次应以同一标准溶液对仪器进行校 正。如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则必须改用另一种稳定而荧光峰相近 的标准溶液来进行校正。例如，测定维生素b 1 时，可用硫酸奎宁溶液作为基准； 测定维生素b 2 时，可用荧光素钠溶液作为基准来校正仪器【2 3 1 。 2 间接测定法： 有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低，仅能显现非常 微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法【2 4 1 。 间接测定方法有以下几种： ( 1 ) 化学转化法：通过化学反应将非荧光物质变为适合于测定的荧光物质。 例如金属与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物【2 5 ，2 6 1 。有机化合物可通过光化学反 应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。 ( 2 ) 荧光猝灭法：这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光 化合物的荧光猝灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该 物质的浓度m 2 引。 ( 3 ) 敏化发光法：对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法， 其荧光信号太弱而无法检测，可使用一种物质( 敏化剂) 以吸收激发光，然后将 激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。 4 硕士学位论文 在实验室，一般采用工作曲线法进行校正。既用处理过的已知量的物质，和式 样溶液配成标准溶液，测定其荧光强度，再以标准溶液浓度为横坐标，以荧光强 度为纵坐标绘制工作曲线。然后由所测得的试样溶液的荧光强度对照工作曲线以 求出试样溶液中分析物质的浓度。 有时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合物可特效地猝灭 分析物质的荧光，从而获得一种很接近于真实空白的空白溶液【2 9 刈。 1 3 荧光分析法的灵敏度和选择性 荧光分析法在近年来发展十分迅速，其原因之一是荧光分析法具有很高的灵 敏度。在微量物质的各种分析方法中，应用最为广泛的至今仍首推比色法和分光 光度法。在吸光光度法中，是由吸光度的数量来测定试样溶液中吸光物质的含量， 而吸光度的数值则决定于溶液的浓度、光程的长度和该吸光物质的摩尔吸光系数， 几乎与入射光的强度无关。在荧光分析中，是由所测得的荧光强度来测定试样溶 液中荧光物质的含量，而荧光强度的测量值不仅和被测溶液中荧光物质的本性及 其浓度有关，而且与激发光的波长和强度以及荧光分析检测器的灵敏度有关。加 大激发光的强度，可以增大荧光强度，从而提高分析的灵敏度。随着现代电子技 术的发展，对于微弱光信号栓测的灵敏度已大大提高，因此荧光分析的灵敏度一 般都高于吸光光度法。荧光分析的灵敏常可达亿分之几，目前，在与毛细管电泳 分离技术结合、采用激光诱导荧光检测法时，已能接近或达到单分子检测的水平 1 3 l 】 o 荧光分析的另一个优点是选择性高。这主要是指有机化合物的分析而言。吸 光物质由于内在本质的差别，不一定都会发荧光，况且，发荧光的物质彼此之间 在激发波长和发射波长方面可能有所差异，因而通过选择适当的激发波长和发射 光测定波长，便可能达到选择性测定的目的。此外，由于荧光的特性参数较多， 除量子产率、激发与发射波长之外，还有荧光寿命、荧光偏振等。因此，还可以 通过采用同步扫描、导数光谱、三维光谱、时间分辨和相分辨等一些荧光测定的 新技术，以进一步提高测定的选择性。至于金属离子的荧光分析法，其选择性并 不高，这是由于许多金属离子常于同一有机试剂组成结构相近的配合物，而这些 配合物的荧光发射波长又极为靠近的缘故1 3 2 1 。 除灵敏度高和选择性好之外，动态线性范围宽、方法简便、重现性好、取样 量少、仪器设备不复杂等等，也是荧光分析法的优点。 荧光分析法也存在不足之处。因为有很多物质本身不发荧光，只能间接进行 的荧光测定，从而妨碍了荧光分析应用范围的扩展。因此，对于荧光的产生与化 合物结构的关系还需要进行更深入的研究，以便合成为数更多的灵敏度高、选择 性好的新荧光试剂，使荧光分析的应用范围进一步扩大。 荧光探针的制各、性能研究及其在环境化学中的应用 1 4 荧光的影响因素 1 4 1 分子结构与荧光的关系 经大量实验研究证明，有机试剂分子的荧光特性如荧光强度，紫外吸收光谱， 荧光发射激发光谱等首先取决于它自身的能量状态，即取决于它自身的分子结构， 而外界因素，如温度，浓度，压力，介质，酸碱度等对荧光特性的影响是次要的。 经过大量实验表明，荧光性能与其共扼体系的大小，分子母体上取代基的种类及 取代基所在位置，共轭大兀键的共平面性及刚性程度和分子的几何结构等因素有 关，下面分别给予讨论。 1 分子共扼体系大小对荧光的影响 在有机荧光试剂中，有机分子中具有发射荧光的基团称为荧光团。荧光团必 须含有共轭大键，当共轭兀键达到一定程度才会发射出荧光，如苯、蒽、萘、 菲、对苯二醌等基团。芳香类碳氢化合物与直链的烯烃化合物相比，激发能向振 动能的转换更难，因而荧光强度更大。而对于具有强荧光的有机化合物和荧光试 剂，仅有大的共轭体系还是不够的，分子的共轭体系必须具备共平面性并且还要 有一定程度的刚性。例如萘和维生素a 都有五个共轭丌键，前者为平面结构，后者 是非刚性结构，而萘的荧光强度为维生素a 的五倍。 2 取代基对荧光的影响3 3 - 3 6 】 取代基效应是有机结构理论的重要组成部分，取代基的性质对荧光体的荧光 特性和强度均有强烈的影响。芳烃和杂环化合物的荧光光谱和荧光产率常随取代 基而变，取代基对荧光体的荧光强度、激发光谱、发射光谱和荧光效率的影响规 律和机理，是人们甚为关注的领域，但到目前为止，我们对激发态分子的性质依 旧了解不多，其影响规律大多数是通过实验总结出来的。 ( 1 ) 取代基种类的影响 推电子取代基，增强荧光 属于这类取代基的有：n h 2 ，n h r ，- n r 2 ，一o h ，一o r ，一c n 等，由 于这些基团上的n 电子云几乎与芳环上的兀电子轨道平行，因而实际上它们共享了 共轭玎电子结构，扩大共轭体系。因此，这类化合物的吸收光谱与发射光谱的波 长，都比未被取代的芳族化合物的波长长，荧光效率也提高了许多。 得电子取代基，减弱荧光 吸电子取代基有：c = 0 ，一n 0 2 ，一c o o h ，一c o r ，卤素除氟外，它们对荧 光强度的影响与推电子基相反，即减弱荧光。这类取代基也都含有n 电子，然而其 n 电子的电子云并不与芳环上的兀电子云共平面，不像给电子基团那样与芳环共享 共轭兀键和扩大其共轭兀键。这类化合物的尢兀木跃迁属于禁戒跃迁，摩尔吸光系数 很小( 约为1 0 2 ) ，最低单线激发态s l 为n ，兀l 型，s i t l 的系间跨越强烈，因而荧光 6 硕士学位论文 强度都很弱，而磷光强度相应增强。 ( 2 ) 取代基在分子上的位置及取代基的数量对荧光的影响 只有一个推电子取代基，处于空间位阻最小或无位阻的位置时，可使荧光增 强，对于不同的发光母体，同类取代基所处位置不同所表达的荧光强弱变化规律 也不相同。另外对荧光的影响还要看取代基的种类，小体积取代基所贡献的共扼 效应小，只是体现出电荷的影响，若一个大的取代基如苯或乙炔基苯，其共轭效 应大，取代后扩大了试剂的共扼体系，使荧光增强效应大于其吸电子使荧光减弱 的效应，结果是取代后的荧光强度不是减弱而是大大增强。 1 4 2 环境因素对荧光的影响 溶液中的环境因素对分子荧光可能产生强烈的影响，了解和利用这一重要因 素，可以提高荧光分析的灵敏度和选择性。以下讨论一些比较重要的环境因素的 影响。 1 溶剂对荧光的影响 一般溶剂效应指的是溶剂的折身率的介电常数的影响。这种影响十分普遍。 同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都可能会有显著的差别。 一般情况下，折射率加大，将使荧光光谱的s t o k e s 位移减少，而介电常数加大， 将使s t o k e s 位移加大，且荧光效应提高。这些过程包括振动松弛、激发态荧光体 偶极矩的改变所引起的周围溶剂分子中电子的重排、溶剂分子围绕激发态偶极的 重新定向和荧光体与溶剂分子间的特殊作用等。光的吸收过程极其迅速，约1 0 巧5 ， 这一瞬间，核间来不及发生有效的移动，但对于电子的重排却是足够的。 许多荧光体，尤其是那些在芳环上含有极性取代基的荧光体，它们的荧光光 谱易受溶剂的影响。溶剂的影响可以分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应，前 者指溶剂的折射率和介电常数的影响，后者指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化 学作用，如氢键的生成和配合作用。一般的溶剂效应是普遍存在的，而特殊的溶 剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊的溶剂效应所引起荧光光谱的移 动值，往往大于一般的溶剂效应所引起的【3 7 3 9 】。 2 p h 值对荧光的影晌 假如荧光物质是一种弱酸或弱碱，溶液的p h 值改变将对荧光强度产生很大的 影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳族化合物的荧光光谱，对于溶剂的p h 氢键 能力是非常敏感的。当分子由基态被激发到较高的电子激发态时，其偶极距也将 发生变化。由于激发态与基态两者的电荷分布情况不同，因而它们的化学性质也 会有所差别，溶液的p h 改变将会影响到基态分子或激发态分子的酸碱性质。具有 酸性或碱性发光团物质，由于其基团和酸性或碱性溶液相互作用，亦可能改变由发 光过程中竞争的非辐射跃迁过程的性质和速率，从而影响物质的荧光强度和光谱。 7 荧光探针的制备、性能研究及其在环境化学中的应用 3 荧光物质的稳定性对荧光的影响 在定量测定之前，须认真考察荧光物质的稳定性。在激发光的直接照射下， 有些荧光物质不稳定，当连续地用激发光照射时，因荧光物质的光分解或聚合， 会使荧光强度减弱。对于这些荧光强度不太稳定的成分应尽快测定，不要经常开 启光闸，使光分解现象尽量减少。生成荧光物质的反应速度和荧光物质的稳定性 及其化学结构有关，不同结构之间的差别较大。在定量测定之前，必须认真考察 荧光物质的稳定性。 4 共存物质对荧光的影响 在定量分析中，共存物质的干扰主要有以下几个方面：共存物的荧光猝灭作 用，共存物质产生背景荧光，共存物质与荧光物质发生反应、共存物质吸收激发 光或荧光使荧光强度减弱等。遇到这些情况必须采取相应的措施，消除其干扰。 共存物质的存在，会影响荧光分析的定量测定，实际工作中应认真分析其影响原 因，不可轻易放过。有时往往因此发现新类型的荧光反应。 1 5 荧光分析法的应用 荧光分析法的高灵敏度使其广泛应用于有机化合物及无机化合物的定量分 析，现就其应用作简要介绍： 1 5 1 有机化合物的荧光分析 有机化合物中脂肪族化合物的分子结构较简单，能发生荧光的为数不多。芳 香族及具有芳香结构的化合物，因有兀共轭体系容不得易吸收光能，其中结构庞 大而复杂的化合物，在紫外光照射下大多能发生荧光。有时为了提高测定方法的 灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物。 因此，荧光分析在有机物方面的测定为数很多。能用荧光法测定的有机物、生化 物质及药物等有2 0 0 多种，其中包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环 芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦 角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；抗生素如青霉素、 四环素等；维生素如维生素a 、b l 、b 2 、b 6 、b 1 2 、e 、抗坏酸、叶酸及烟酰胺等。 还有中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类都能产生 荧光，可用荧光法作初步鉴别及含量测定【4 2 枷】。这些试剂的应用如表1 1 所示。 1 5 2 无机化合物的荧光分析【4 2 5 0 - 5 6 1 无机离子中除了铀盐等少数例外，一般不显示荧光，所以一般不能直接对无 机离子的荧光进行分析，无机化合物的荧光分析主要依赖于待测元素与有机试剂 所组成的配合物，它们在紫外光或荧光照射下发出各种不同波长的荧光，由荧光 8 硕士学位论文 强度可以测定该元素的含量。这种方法称为直接荧光测定法。自从1 8 6 8 年出现桑 色素与a l ”离子以来，用于荧光分析的试剂日益增多，其中较常采用有机试剂进 行荧光法测定的元素为铍、铝、硼、镓、镁、锌、镉及某些稀土元素等。 某些元素虽不与有机试剂组成会发生荧光的配合物，但可用荧光猝灭法进行 测定。这些元素的离子从发生荧光的其它多属离子有机试剂配合物中夺取该有机 试剂以组成难溶化合物，从而导致原溶液荧光强度的降低，由荧光强度降低的程 度来测定该元素的含量。较常采用荧光猝灭法测定的元素有氟、硫、铁、镍、铜、 钼等。 很多有机化合物可以和无机阳离子形成荧光络合物，这些有机化合物一般都 具有苯环结构以及二个以上能同金属离子络合的配位基团。常用的有机荧光试剂 如8 羟基喹啉、茜素紫酱r 、黄酮醇、二苯乙醇酮，这些试剂的应用如表1 2 所 示。 表1 1 常用有机化合物荧光测定法 a 1 3 +茜素紫酱r4 7 05 0 0 f 。 铝茜素紫酱r4 2 05 0 0 b 4 0 7二苯乙醇酮 c d 2 + 2 ( 邻羟基苯) 苯异嚼 唑 l i + 8 羟基喹啉 s 玎4 + 黄酮醇 z n 2 +二苯乙醇酮 3 7 0 3 6 5 4 5 0 蓝 3 7 05 8 0 4 0 04 7 0 绿 b e 、c oc r 、c u 、t h 、 z r 、f 、 n 0 2 。、 n i 、 p 0 4 弘 b e 、c 0 、c r 、c u 、f e 、 z r 、t h 、n i 、p 0 4 3 。 b e 、s b n h 3 m g f e 、z r 、p 0 4 3 b 、b e 、 s b 等 0 0 0 7 9 们 m o 2 m 加 吡 乞 m 仉 加 荧光探针的制备、性能研究及其在环境化学中的应用 在实际分析工作中，所遇到的分析对象往往结构复杂，如酶、毒物等，这就 需要将现有的荧光分析技术与色谱、萃取、电泳、沉淀、吸附等分离手段结合， 构造成综合测量体系来完成诸如此类的任务。随着其它多种学科的发展，荧光分 析法也将获得更新的发展，适用范围将不断扩大。 1 6 荧光分子探针 1 6 1 概述 荧光分子探针，荧光分子开关和荧光分子传感器是在荧光分子识别中经常使 用的概念。荧光分子探针是其中内涵最广的一个概念，一般凡是在一定体系内， 当某一种物质或体系的某一物理性质发生变化时该分子的荧光信号能发生相应的 改变的分子就可称为某一物质或某一物理性质的荧光分子探针；荧光分子开关是 指在识别过程中分子荧光信号有明显强弱变化的荧光分子探针：荧光分子传感器 是指在识别过程中分子荧光信号能够快速、可逆响应的荧光分子探针。所谓分子 识别是指分子之间( 主体与客体或称之为受体与底物) 靠非共价键力的选择性结合 并产生某种特定功能的过程。单纯的结合不是识别，识别是有目标的结合，它是 通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程。结合形成的超分 子体系是由它的稳定性和选择性，即形成过程中的能量和信息量来表征的 1 5 7 ，5 8 ，5 9 1 。分子识别是广泛存在的自然现象，特别是在生命过程中，分子识别起着 极其重要的作用。但分予识别作为分子之间发生的事件，人需要借助一定的技术 手段才能感知伴随分子事件发生所产生的物理信号。 荧光分子探针是超分子科学中最为引人入胜的领域之一，它的主要功能包括 分子识别和将识别信息转换成荧光信号两部分。识别是超分子化学的核心内容， 是分子存贮和超分子读取分子信息的过程。这种分子间识别是分子在更高的结构 层次上实现功能的基础，是分子间自组装的前提。但由于这种结合是由非共价键 完成的，通常形成的结构稳定性较低，给研究带来一定的困难。荧光分子探针能 够将这种分子结合信息转换成易检测的荧光信号，而且可在单分子水平上实现原 位、实时检测。因此，在化学走向超分子科学并与生命科学、材料利一学等学科 高度交叉的今天荧光分子探针得到各研究领域的广泛关注是非常自然的。 1 6 2 荧光基团和识别基团 荧光基团是荧光分子探针的最基本组成部分，作用是将分子识别信息表达为 荧光信号。前面阐述了多种将分子识别信息表达为荧光信号的光物理和化学机理 以及能够实现这些机理的典型分子结构。一般来说所有荧光化合物都可做荧光分 子探针的荧光发射团，通常芳香族化合物：例如稠环芳烃，以萘、葸、芘为主要 代表的稠环芳烃类都具有强而稳定的荧光。由于这些物质结构比较简单，常常进 1 0 硕士学位论文 行于基础理论的研究。另外它们易产生激基缔合物荧光【6 们，这一特性是其它种 类的荧光团不能够代替的。以荧光素和罗丹明为代表的这一类荧光化合物【6 1 ，6 2 】 是非常著名的荧光染料，经常被用于各类荧光分子探针的合成。菁类荧光染料是 近年来倍受青睐的生物大分子标记用荧光染料，特点是波长可调范围特别大，可 以进入近红外区，能有效避开生物体系的背景荧光，提高探针的灵敏性。吡咯甲 川类荧光团【6 3 ，6 4 】的特点是荧光量子效率高，随取代基变化其荧光波长可调范围 大，不易受环境p h 的影响，近年来的几个基于该荧光团合成的金属离子荧光分子 探针颇为引人注目。l ，8 萘酰亚胺也是一类重要的荧光化合物【6 5 6 6 1 ，特别是4 位 有强烈供电基团如氨基的衍生物都能够发射强荧光、光稳定性好、荧光发射波长 适中、s t o c k s 位移大，也经常被用于荧光分子探针的合成。 1 6 3 荧光分子探针的识别原理 1 光诱导电子转移p e t 【7 】 典型的p e t 体系是由包含电子给体的受体部分r ，通过一间隔基s ( 如c h 2 ) 和 荧光团f 相连而构建的。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所。受体部 分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构 成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。p e t 荧光探 针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作 用。因此在没有结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一旦受体与 客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射 出强荧光。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”，“开， 状态，这类探针又被称作荧光分子开关。 2 分子内共轭电荷转移i c t 【6 8 】 i c t 荧光分子探针是荧光团既接有推电子基团又接有吸电子基团，推电子基 团和吸电子基团由于在一个体系中，在光激发下会发生电子转移。i c t 荧光探针 的受体单元往往是推一拉电子体系整体中的一部分，当受体单元与客体结合时， 会对荧光团的推拉电子作用产生影响，从而使光谱发生红移或蓝移。 3 激发单体一激基缔合物【6 9 】 当两个相同的荧光团连接到一个受体分子的合适位置时，其中一个被激发的 荧光团( 单体) 会和另一个处于基态的荧光团形成分子内激基缔合物。它的发射光 谱不同于单体，表现为一个新的、强而宽、长波、无结构发射峰。由于形成这种 激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到“碰撞”距离，因此两个同种荧光团之 间的距离成为激基缔合物形成和破坏的关键。所以可利用各种超分子作用力改变 两个荧光团之间的距离，从而利用结合客体前后单体激基缔合物的荧光光谱变化 识别金属离子。 荧光探针的制备、性能研究及其在环境化学中的应用 4 荧光共振能量转移f r e 【7 0 ，7 1 】 当能量给体荧光团，与能量受体，相隔的距离远大于荧光团能量受体的碰撞 直径时，只要荧光团与受体的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者 说荧光团的发射光谱与能量受体的吸收光谱能有效重叠，可以发生从荧光团到能 量受体的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移。实际上荧光团能量受体发生 能量转移的条件是很苛刻的，两者除了光谱重叠外，还必须以适当的方式排列， 距离足够近。能量受体可以是荧光团，也可以是荧光猝灭团。对于前一种情形， 激发荧光团时，由于能量转移，将观察到能量受体的荧光发射。而后一种情形， 则只能观察到荧光团的荧光被淬灭。 1 6 4 荧光分子探针的研究现状 目前报道的荧光分子探针的被识别客体从最简单的质子到手性分子、蛋白寡 聚核