（发酵工程专业论文）新型启动子pq介导高温α淀粉酶表达的研究.pdf

摘要 摘要 高温0 【淀粉酶( b l a ) 是目前最重要的工业酶制剂之一，广泛应用于酿造、食品加 工、酒精等工业。实现b l a 的高效制备对进一步提升其工业应用价值具有重要意义。 本研究前期工作中，已围绕b l a 编码基因克隆与功能鉴定、b l a 高效表达载体及宿主 细胞等进行了较深入的研究。本研究对一种全新的启动子p q 介导b l a 的表达进行了研 究，分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中研究和鉴定了新型芽孢杆菌启动 子p q 的功能，证实了启动子p q 在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中具有高效介导b l a 表达的能力。 首先以丑l i c h e n i f o r m i sb 0 2 0 4 染色体d n a 为模板p c r 扩增获得含信号肽序列的 b l a 编码基因( a m y l ) ，克隆入载体p l a k r 中，构建成重组质粒p l a - a m y l ，再在a m y l 基因的上游插入人工合成的启动子p q ，获得重组质粒p l a g m 尸q a m y l 。在重组大肠 杆菌中，a m y l 基因能够在启动子p q 的介导下成功表达，重组菌表达的高温仅淀粉酶的 酶活力大小为1 6 1u m l 。表明启动子p q 能在大肠杆菌中有效介导b l a 的表达。 进一步比较研究了启动子p q 在枯草芽孢杆菌中介导基因表达的能力。分别用启动 子p q 和启动子p 4 3 构建了表达载体p u b p q - a m y l 和p u b p 4 3 - a m y l ，并转化入枯草芽 孢杆菌1 a 7 1 7 ( a a m y a ) 中。重组枯草芽孢杆菌在淀粉平板上的水解淀粉能力差异显著。 重组菌进行摇瓶发酵1 0 5h 后，测定b l a 酶活：丑s u b t i l i s ( p u b p q - a m y l ) 的最高酶 活为2 8 0u m l ；最s u b t i l i s ( p u b p 4 3 a m y l ) 的最高酶活为1 9 1u m l 。实验表明在枯草 芽孢杆菌中启动子p q 转录强度优于已鉴定的强启动子p 4 3 ，由启动子p q 介导的b l a 最高表达水平是启动子p 4 3 介导的最高表达水平的1 4 7 倍。表明启动子p q 能够更高强 度的介导b l a 在枯草芽孢杆菌中的表达。 进一步将p u b e q - a m y l 和p u b - p 4 3 a m y l 转化入地衣芽孢杆菌c b bd 3 0 2 ，获得重 组菌后进行摇瓶发酵测定b l a 酶活，丑l i c h e n i f o r m i sc b bd 3 0 2 ( p u b p q - a m y l ) 与宿 主菌丑l i c h e n i f o r m i sc b bd 3 0 2 相比产酶水平提高了6 1 ；丑l i c h e n i f o r m i sc b bd 3 0 2 ( p u b p 4 3 a m y l ) 的产酶水平提高了2 1 ；由启动子p q 介导的b l a 最高表达水平约 为启动子p 4 3 介导的最高表达水平的3 倍。表明启动子p q 在地衣芽孢杆菌中介导b l a 的表达能力优于已鉴定的强启动子p 4 3 。 关键词：启动子，高温仅淀粉酶，表达，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌 a b s t r a c t a b s t r a c t t h e r m o s a b l ea l p h a - a m y l a s e ( b l a ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n z y m e s ，w i d e l y a p p l i e di ns u g a ra n df e r m e n t a t i o ni n d u s t r y t h i ss t u d yh a si n v e s t i g a t e dan o v e lp r o m o t e rp q ， b yw h i c hm e d i a t e db l ai so v e r e x p r e s s e di ne s c h e r c h i ac o b ，b a c i l l u ss u b t i l i sa n db a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ad n a f r a g m e n tc o n t a i n i n g 仅- a m y l a s es t r u c t u r eg e n e ，a m y l t l li t so w ns i g n a lp e p t i d e s e q u e n c e sw a so b t a i n e db yp c rf r o mg e n o m i cd n ao f 最l i c h e n i f o r m i sb 0 2 0 4 t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d ，p l a - a m y l ，w a sc o n s t r u c t e db yd i r e c t l yi n s e r t i n gt h ea m p l i f i e df r a g m e n t i n t ot h ec l o n i n gv e c t o rp l a k r t oi d e n t i f yt h ef u n c t i o no fa m y l ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p l a - g m 一尸q a m y lw a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gp r o m o t e rp qi n t op l a - a m y la n de x p r e s s e di n ec o l i t h ea - a m y l a s ea c t i v i t yw a sd e t e c t e dt o16 1u m l t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ea m y l g e n ec o u l db ee x p r e s s e di nec o l iu s i n gp r o m o t e rp qw i t l li t so w ns i g n a lp e p t i d ea n d 0 t - a m y l a s ee x p r e s s e dc o u l ds e c r e t ei n t ot h ec u l t u r em e d i u m n e x t ，t h ef u n c t i o na n ds t r e n g t ho fp r o m o t e rp qw e r ec o m p a r a t i v e l yi n v e s t i g a t e di n 丑 s u b t i l i s t h et w or e c o m b i n a n tp l a s m i d sh a r b o r i n ga m y l ，p u b - 尸q a m y la n dp u b p 4 3 一a m y l w e r ec o n s t r u c t e du s i n gp r o m o t e r sp qa n dp 4 3a n dt r a n s f o r m e di n t o 丑s u b t i l i s1a 717 ( a a m y a ) d i f f e r e n tt r a n s f o r m a n t sa n dc o n t r o lw e r es p o t t e do np l a t ec o n t a i n i n gs t a r c ha n dt h e f o r m i n g a r e a so ft h e s t a r c h - h y d r o l y z a t i o n w e r ed i f f e r e n t o b v i o u s l y b y s h a k e - f l a s k f e r m e n t a t i o n ，t h e s p e c i f i c a c t i v i t i e so fb l ab yt r a n s f o r m a n t so f丑s u b t i l i s 1a 717 ( p u b - p q - a m y l ) a n d 丑s u b t i l i s1a 717 ( p u b - p 4 3 a m y l ) w e r e2 8 0u m la n d191u m l ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e t h a ts y n t h e t i cp r o m o t e rp qm e d i a t e s1 4 7f o l d s p r o d u c t i o no fb l ac o m p a r i s o nt ot h a to ft h ep r o m o t e rp 4 3d e r i v i n gf r o mb s u b t i l i sw h e n u s i n ga m y la sar e p o r tg e n e t h ef u n c t i o na n ds t r e n g t ho fp r o m o t e rp qw e r ef u r t h e rd e t e r m i n e di n 且l i c h e n i f o r m i s t h et w or e c o m b i n a n tp l a s m i d sp u b - p q - - a m y la n dp u b - p 4 3 - - a m y lw e r et r a n s f o r m e di n t or l i c h e n i f o r m b zc b bd 3 0 2 b ys h a k e - f l a s kf e r m e n t a t i o n ，丑l i c h e n i f o r m i sc b bd 3 0 2 ( p u b - p q a m y l ) p r o d u c e d61 m o r eb l a t h a nt h a to fs t r a i nb 1 i c h e n i f o r m i sc b b d 3 0 2 ；b 1 i c h e n i f o r m i sc b bd 3 0 2 ( p u b p 4 3 一a m y l ) p r o d u c e d21 m o r eb l a t h er e s u l t ss h o wt h a t p r o m o t e rp qp r o d u c e sm o r eb l ac o m p a r i s o nt ot 1 1 a to ft h ep r o m o t e rp 4 3i n 最l i c h e n i f o r m i s k e yw o r d s ：p r o m o t e r , t h e r m o s t a b l e 伍- a m y l a s e ，e x p r e s s i o n ，e s c h e r i c h i ac o l i ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：堡1 3 ：窒 日 期： 幽二生二丝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：篷塑：嬖 导师签名： 日期： 劲吗一锌一 s 第一章前言 第一章前言 淀粉是由葡萄糖基组成的高分子物质，有直链淀粉和支链淀粉两类。直链淀粉含几 百个葡萄糖单元，支链淀粉含几千个葡萄糖单元。在天然淀粉中直链的约占2 2 - 2 6 ， 它是可溶性的，其余的则为支链淀粉。淀粉制成的食品如粉丝、粉条等可以直接食用。 淀粉作为原料可应用于方便面、火腿肠、冰淇淋等食品和可降解塑料制品中。作为发酵 原料用于淀粉糖、氨基酸、酒精、抗生素、味精等产品的生产。淀粉也可以加工成变性 淀粉，广泛应用于造纸、纺织、食品、铸造、医药、建筑、石油钻井、选矿等领域。工 业上使用的淀粉原料一般都为白色的微小颗粒，因来源不同，其直径为5 1 0 0p , m 不等， 常称为生淀粉。 1 1 仅淀粉酶的概述 淀粉加工用0 【一淀粉酶的分类，按酶学委员会的标准为e c 3 2 1 1 ，是指一类作用于 淀粉分子，从分子内部切开a 1 ，4 糖苷键生成糊精和还原糖的水解酶，产物的末端葡萄 糖残基c l 碳原子为0 【构型，故称0 【淀粉酶。通常分子量为4 5 6 0k d 左右。它液化淀粉 时，是从分子内部切开0 【1 ，4 糖苷键使淀粉分子量迅速降低，降解为水溶性的糊精并产 生少量麦芽糖和葡萄糖。 淀粉酶根据其应用最适温度不同，分为中温仅淀粉酶和高温a 淀粉酶两种。前者适 宜温度为7 0 - - , 8 5 ，如枯草芽孢杆菌b f 7 6 5 8 淀粉酶。后者适宜温度为9 5 1 0 0 ，如地 衣芽孢杆菌高温0 【淀粉酶( b l a ) 。 1 2 高温淀粉酶的应用 高温仅淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，广泛应用 于啤酒酿造、食品加工、酒精等工业。 1 2 1 在啤酒酿造中的应用 啤酒是最早用酶的酿造产品之一，在啤酒酿造中添加高温a 淀粉酶使其较快液化以 取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较 大的场合，使用a 淀粉酶和p 淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发 酵糖含量，提高麦汁率，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩 短了整体糊化时间。啤酒酿造中糊化时添加a 淀粉酶，在2 0 世纪7 0 年代主要用b f 7 6 5 8 0 【淀粉酶；8 0 年代用食品级枯草杆菌a 淀粉酶；8 0 年代末，我国无锡酶制剂厂首先生 产出高温0 【淀粉酶，可使副原料从原来的3 0 增加到4 0 以上，实现了无麦芽糊化，节 粮、节能显著，使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高【2 1 。 1 2 2 在淀粉工业中的应用 由于高温0 【- 淀粉酶尤其适合高温液化工艺，故在味精、葡萄糖工业中使用时，可使 液化更彻底，糖化更完全，糖化液葡萄糖值可达9 8 以上，提高出糖率，同时由于此酶 江南大学硕士学位论文 对于糊化淀粉具有很强的催化水解作用，因此可以迅速将淀粉水解成小分子，使其粘度 降低，流动性增高，有利于过滤，提高质量，降低成本【j j 。 1 2 3 在酒精工业中的应用 酒精生产应用高温i f , 淀粉酶，采用高温9 5 c 1 0 5 1 蒸煮，既可有效地杀死原料中 带来的杂菌，降低入池酸度和染菌机率，又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏，形成 焦糖或其它物质而损失，从而提高原料利用率1 4 j 。 1 2 4 在柠檬酸及其他工业中的应用 将高温a 淀粉酶应用于柠檬酸工业的预处理，有利于防止杂菌污染，简化操作程序， 缩短糖化时间，完善糖化工型5 1 。此外，高温0 【淀粉酶在其他行业也有广泛用途。如在 造纸工业中，可用于生产涂布粘合用变性淀粉，调整施胶的粘度；在纺织工业中，用来 在染色前，把纺织物作高速高温退浆等1 6 。 1 3 高温洳淀粉酶生产茵的主要微生物类群 有实用价值的a 淀粉酶的产生菌为：枯草芽孢杆菌( 且s u b t i l i s ) 、地衣芽孢杆菌( 丑 l i c h e n i f o r m i s ) 、嗜热脂肪芽孢杆菌( 丑s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、凝结芽孢杆菌( 丑c o a g u l a n s ) 、 解淀粉芽孢杆菌( 丑a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 、嗜碱芽孢杆菌( b a l k a l o p h i l u s ) 等【_ 7 1 。其中， 高温a 淀粉酶的工业生产菌株为地衣芽孢杆菌( 丑l i c h e n i f o r m i s ) ；中温a - 淀粉酶的工业 生产菌株为解淀粉芽孢杆菌( 县a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 或枯草芽孢杆菌( 丑s u b t i l i s ) 。 1 4 高温淀粉酶生产菌的育种进展 目前高温0 c 淀粉酶工业化生产所使用的菌株大多是以野生菌株为出发菌株经过反 复诱变得到的突变株，在实际生产过程中存在着易污染、生产条件复杂且难以控制等技 术性难题。如何有效解决这些问题成为当前淀粉酶制剂工业面临的关键性问题【8 】。菌种 改良的具体措施很多，微生物的育种手段和技术从最早人们认为的微生物可“驯化 到 出现了“定向培育 技术；再到后来随着对遗传变异现象认识的深入，出现了诱变育种 技术。诱变育种技术经常选用紫外线( u v ) 、亚硝基胍( n t g ) 、甲基磺酸乙醋( e m s ) 等诱变方法。三种方法尽管可以获得酶活性较高的突变株，但其稳定性较差。由于菌种 的诱变选育是一个长期细致的工作，且诱变后正、负突变均同时存在，所以要获得酶活 性有很大提高的突变株，需进行大量、重复的诱变筛选工作，才有望获得理想的突变株。 该方法有很大的盲目性，基因变异的程度也有限，特别是经过长期的诱变处理，产量上 升变得越来越缓慢，甚至无法继续提高，在诱变育种过程中出现了平台效应【9 1 ，使进一 步提高酶活性受到了限制。2 0 世纪7 0 年代出现的基因工程给微生物育种带来了革命， 现代分子生物学技术的飞速发展，为菌种改良开辟了一条新途径。目前利用基因工程的 方法寻找编码b l a 的新基因，然后通过对菌株进行遗传改造来提高酶活力已成为当前 研究的热点。 1 4 1 高温洳淀粉酶的国内研究概况 2 第一章前言 我国从8 0 年代开始研究耐热i x 淀粉酶的生产，上海工业微生物研究所以地衣芽孢 杆菌为出发菌株，用n t g 、紫外线和丫射线反复处理，并结合热处理与自然分离得到 一株突变菌株，产酶能力由l 2u m l 提高到1 0 0u m l 。但是与一般的细菌0 【淀粉酶相 比，活性还很低。1 9 8 7 年任天明【lu j 完成了嗜热脂肪芽孢杆菌的高温0 c 淀粉酶基因在大 肠杆菌中的克隆和表达。1 9 8 9 年胡学智【l l 】从地衣芽孢杆菌中选育得到无孢子突变株 a 4 0 4 1 ，酶活力达到2 0 0u m l ，最适反应温度达到9 0 , - - 9 5 ，9 0 下处理1h 不失活。 其后，凌晨【1 2 j 用原生质体融合技术进行了a 4 0 4 1 e 菌种改良的研究，结果显示菌种改 良后酶活稳定提高了1 5 倍。1 9 9 0 年金凤燮【l3 】从曲中分离得到生产高温0 【淀粉酶的菌 种，经鉴定是b a c l l i u s 属中的新种，所产高温仅淀粉酶酶活力达到1 0 0 0u m l ，在8 0 8 5 下能保持3h 不失活，1 0 0 、1 0m i n 后有1 5 的残留酶活力。1 9 9 1 年孔显良等【1 4 】利用 地衣芽孢杆菌突变株产高温仪淀粉酶，所得酶液在不加c a 2 + 和无任何保护剂条件下于 9 0 处理6 0m i n ，9 5 处理2 0m i n 后，酶活力均能保留9 0 以上。1 9 9 7 年李瑶等【”】在 金凤燮的基础上进行诱变，使酶活力提高到2 9 4 0u m l 。1 9 9 8 年王磊等【l6 】在枯草杆菌中 扩增表达高温仅淀粉酶基因，在无任何选择压力的情况下，使酶活力达到2 2 0u m l 。 2 0 0 2 年卢涛等【1 7 j 在土壤中筛选到一株凝结芽孢杆菌，经诱变处理，酶活力达到1 0 0 u m l 。2 0 0 4 年潘风光等【l8 】报道了地衣芽孢杆菌高温0 【淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌 中的表达。2 0 0 6 年牛丹丹等【1 9 】报道了丑l i c h e n i f o r m i sc i c i mb 0 2 0 4 高温0 c 淀粉酶基因 的克隆及其启动子与信号肽的功能鉴定。2 0 0 8 年董晨等【2 0 】利用枯草杆菌c d d 基因的p 4 3 启动子在枯草芽孢杆菌中表达地衣芽孢杆菌高温o 【淀粉酶，表达水平为1 2 0u m l 。2 0 0 9 年牛丹丹等1 2 l 】构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温0 【淀粉酶编码基因a m y l 的整合性重组 质粒p b l a m y l ，转化入b l a 工业生产菌株b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sb 0 2 0 4 ，发现含2 5 倍 a m y l 拷贝数的重组菌的b l a 的合成水平与宿主菌相比提高了8 9 2 。 1 4 2 高温a 淀粉酶的国外研究概况 1 9 7 9 年n o m u r a 等【2 2 】将0 【淀粉酶基因伽克隆到枯草杆菌( 丑s u b t i l i s ) 中，得到的 转化株有淀粉酶活力。p a l y a 等t 2 3 j 把解淀粉芽孢杆菌( 丑a m y l o l i q u e f a c i e n s ) a 淀粉酶 基因克隆到枯草杆菌中，以p u b l l 0 作为载体，得到产0 【淀粉酶的活力是野生菌5 0 0 倍的 菌株。芬兰国立酒精公司研究实验室的v e h m a n a n p e r a 等【2 4 】将生产菌株丑 a m y l o l i q u e f a c i e n sa l k 0 8 9 的0 【淀粉酶基因克隆到重组菌株a l k 0 8 4 的多拷贝质粒 p u b l1 0 上，在实验规模上，重组菌的产酶能力是原来的2 倍。诺何诺德公司的j o r g e n s e n 等【2 5 】报道了pf u r i o s u s 胞外0 【淀粉酶基因的序列，并将该基因在大肠杆菌和枯草杆菌中 进行表达。s h a h h o s e i n i t 2 6 】把地衣芽孢杆菌耐热的0 c 淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中，发现 大肠杆菌可以利用t 7 启动子及基因自身的分泌信号使0 c 淀粉酶基因进行分泌表达。c a i 等【2 7 】将定点突变后的地衣芽孢杆菌0 淀粉酶基因插入s a c b 启动子后，先后用基因自身信 号肽和枯草杆菌s a c b 基因的信号肽在枯草杆菌中进行表达。p r i y a d h a r s h i n i 等【2 8 】对地衣芽 孢杆菌a 淀粉酶基因的c 2 + 结合位点进行突变，发现该位点对地衣芽孢杆菌a 淀粉酶热 稳定性，酶活力等影响显著。 江南大学硕士学位论文 1 5 大肠杆菌基因表达调控研究 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清晰、培养操 作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白 等优点【2 9 1 ，而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白 量甚至能超过细菌总蛋白量的3 0 ，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统 1 3 0 1 o 1 5 1 大肠杆菌表达系统的组成 在设计重组表达系统时，有许多主要的元件是必需的。对于一个完整的表达载体来 说，除了插入的基因片段外，还应该包括复制起点、选择性筛选标记、启动子以及转录 终止子1 3 i 】。目前已经构建了多种原核表达载体，通常对原核表达载体的要求是【3 2 】：( 1 ) 转录起始必需的启动子。目前大肠杆菌系统中使用的启动子多为可控制表达，主要包括 温度诱导和i p t g 诱导表达。常用的启动子有：n 、靠、p 切、凡。等，还有后来出 现的几种高效和特异性的启动子如：t 7 启动子、a r a 启动子、c a d a 启动子等【3 3 1 。( 2 ) 表 达载体应带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之相应的调控基因等。 ( 3 ) 翻译起始所必需的核糖体识别序列，一般认为其核心序y u s d 序列与外源基因起始 密码子之间间隔7 1 3b p 时翻译起始效率最高。( 4 ) 外源基因需要插入到载体合适的位 置上，所以表达载体要有合适的多克隆位点。( 5 ) 基因克隆及筛选的必备条件，包括载 体在细胞中复制必需的复制起始序列、抗性筛选标记等。 1 5 2 影响外源基因在大肠杆菌系统中表达的因素 目前人们运用基因工程技术已在大肠杆菌中成功地表达了许多重要的生物活性蛋 白基因，但是由于目的基因结构的多样性，及其与大肠杆菌基因的差异，不同的外源基 因在表达效率上有很大的差异。影响外源基因在ec o l i 中的表达效率因素主要包括：表 达载体( 启动子) ，m r n a 的稳定性，培养条件的控制和表达产物的后加工处理等。 1 5 2 1 表达载体的选择 表达系统的核心是表达载体。用来在大肠杆菌中表达外源基因的载体有很多种，一 般来说，这些载体应满足以下要求：( 1 ) 重组质粒拷贝数高，表达量高。( 2 ) 适用范围 广。( 3 ) 表达产物容易纯化。( 4 ) 在菌体内稳定性好。目前已知的应用较广的大肠杆菌 表达载体有非融合表达载体、融合表达载体、分泌型表达载体和表面呈现表达载体等。 目前，有许多启动子被应用于重组蛋白的表达，启动子的选择需要从启动子强度、漏表 达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。在胞内表达中，常采用t 7 、凡等强启动子，表 达水平可达到菌体总蛋白的1 0 7 0 。 1 5 2 2m r n a 稳定性的影响 外源蛋白的m r n a 稳定性，也是影响表达效率的一个很重要的条件。o s e g g e 等【3 4 l 研究发现i f n b 的表达量与m r n a 的半衰期成正比例关系。最长的半衰期为4 5m i n 。 w o o d 等【3 5 】在表达b 半乳糖苷酶时发现，诱导表达后，m r n a 的合成速度提高了4 2 倍， 4 第一章前言 稳定存在的m r n a 量仅提高了4 倍。可见，大部分m r n a 被迅速降解。 1 5 2 3 培养条件的控制与表达产物的后加工处理 培养条件包括培养液成分、温度的选择、诱导以及培养时间的长短等。适用营养丰 富的培养液，易于细菌的生长和表达。在大肠杆菌表达系统中，理想的条件是含有适量 的m g + 、k + 、高浓度的c a 2 + 和多胺类，以及充足的a t p 和g t p 可以显著降低蛋白质合 成中的错读。温度的影响也很重要，大肠杆菌的最适生长温度为3 7 ，温度较低对包涵 体表达有利，但不适于菌体的生长；而在最适温度下，菌体生长良好，但因能量过多地 用于菌体生长，反而对包涵体的表达不利，最佳诱导温度随产物不同而异。一般来说， 在2 5 至3 7 诱导，外源蛋白易于以活性存在，在3 7 以上诱导，则易形成包含体【3 6 】。 要选择适当的诱导时间来诱导表达，细菌在对数生长期时，生长状况良好，易于诱导而 合成外源蛋白。提前诱导，菌体太少，外源蛋白产量低；诱导太迟，细菌过老，也不利 于基因表达。因此，必须结合外源蛋白的性质及表达载体的特点，选择出恰当的表达条 件。另外，表达产物的后加工虽不涉及到外源基因的表达，但是采取适当的方法从包含 体得到活性蛋白，可以提高产物的回收率。 总之，研究提高外源基因在ec o l i 中表达效率的工作已进行的十分广泛，被发现的 影响表达效率的因素也很多，它们之间有很大的相关性，单单改进其中一个方面往往不 能取得明显的效果，有时还存在一定的机遇性。但是，认识到各因素的产生和作用的方 式，就能够提出改进表达效率的方法。这方面工作的深入研究有很深远的理论意义和应 用价值。 1 6 芽孢杆菌基因表达调控研究 芽孢杆菌表达系统是在7 0 年代从枯草芽孢杆菌开始，逐步扩展至其它种的。枯草杆 菌是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，作为革兰氏阳性细菌的典型代表，对于其 生理、生化、遗传及分子生物学的研究已有4 0 多年的历史p 。随着对枯草芽孢杆菌研究 的深入，外源蛋白在芽孢杆菌系统中的表达引起了广泛的关注。 1 6 1 芽孢杆菌表达系统的宿主细菌 1 6 1 1 枯草芽孢杆菌宿主菌株 枯草芽孢杆菌的遗传物质是双链环状d n a ，全基因组有4 2 1 4 8 1 0 个碱基，g + c 含 量约4 3 5 ，g ，a ，c ，t 分别占2 4 ，3 0 ，2 0 ，2 6 。整个基因组还包括1 0 个原 噬菌体插入区域，这些区域在基因的水平传递过程中起了很重要的作用。从转录、翻译 水平来看，枯草芽孢杆菌全基因组包含蛋白编码序列( c d s s ) 的总量介于4 0 0 0 , - - 4 1 0 0 个，平均长度约8 9 0b p ，覆盖了全基因组8 7 的区域。在这些蛋白编码序列中，7 8 是 由a t g ，1 3 由t t g ，9 f hg t g 启动，还有另外1 5 个基因由御盯，c t g 启动【3 引。通 过序列的同源性分析比较，枯草芽孢杆菌中约有5 6 的基因( 1 8 0 0 个) 功能已经明确【3 9 1 。 将携有外源基因的重组载体导人宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。 由于大肠杆菌的氯化钙转化方法对枯草杆菌无效，所以枯草杆菌基因工程表达系统中的 江南大学硕士学位论文 宿主菌株用得最广泛的就是在d n a 重组技术发明之前就可进行感受态转化m 】的1 6 8 菌 株及其突变体。这些突变体包括各式各样的营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、 重组缺陷、限制修饰系统缺陷、转座子插入等方面的突变体。其中大多数可从美国俄亥 俄州立大学“芽孢杆菌遗传保藏中心”( b g s c ) 获得。随着非感受态转化方法，如原生 质体转化和电转化等方法的建立，再加上转导、转染和接合( c o n j u g a t o i n ) 转移基因， 枯草杆菌宿主菌株就相应地扩大了范围，在没有发现感受态转化菌株中也进行了异源基 因表达，但文献中报道的绝大多数宿主菌株仍为可感受态转化菌株。 1 6 1 2 地衣芽孢杆菌宿主菌株 地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性的腐生性微生物，广泛分布于土壤和其它自然环 境，具有耐热、酶系丰富，产酶量更高，安全等诸多优良特性，被认为是较理想的工业 生产菌株。与枯草芽孢杆菌相比，地衣芽孢杆菌生长温度高，不仅能节省生产能源，而 且也使某些酶对结合在胞壁上的蛋白酶的敏感性降低；其次，其生长速率相对较慢，容 易使刚跨膜的未合适折叠的蛋白充分折叠。地衣芽孢杆菌还用于生产0 【淀粉酶以及典型 抗生素，具有良好的工业应用前景。地衣芽孢杆菌对于工业生产异源蛋白非常重要，并 且在酶产量方面比枯草芽孢杆菌更具优势，有成为工业生产工业用酶宿主菌的巨大潜 力。 1 6 1 _ 3 可作为宿主的其他种 已报道用作宿主表达克隆基因的有【4 l 】：短短小芽孢杆菌( b r e v i b a c l l i u sb r e v i s ) 、嗜 热脂肪芽孢杆菌( as t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、凝结芽孢杆菌( 丑c o a g u l a n s ) 、解淀粉芽孢杆 菌( 丑a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 、嗜碱芽孢杆菌( 丑a l k a l o p h i l u s ) 、巨大芽孢杆菌( 丑m e g a t r i u m ) 、 短小芽孢杆菌( 丑p u m i l u s ) 、球形芽孢杆菌( 最s p h a e r i c u s ) 、苏云金芽孢杆菌( 最 t h u r i n g i e n s i s ) 以及病原菌炭疽芽孢杆菌( 且a n t h r a c i s ) 。 迄今，已经在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核 和真核基因，其中有的己应用于工业化生产，取得了不少成绩。其基因工程菌产品，特 别是工业酶制剂如a 淀粉酶，碱性磷酸酶等，已经占据了世界工业酶制剂产量的一半以 上。 1 6 2 启动子元件对a 淀粉酶基因在芽孢杆菌系统中表达的影响 为了更好地利用芽孢杆菌表达外源蛋白，应该对系统本身进行更为详尽的研究，即 对操纵元的研究要加强。因此对未知基因，特别是一些转录和翻译的调控因子的探索， 是今后研究的重点。位于转录单位开始位置上的d n a 序列，称为启动子( p r o m o t e r ) 。 启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子 与受体细胞之间的合理匹配对异源基因在宿主细胞中的表达起着重要的作用。要使克隆 的基因能够在寄主细胞中表达，其编码结构应该处于寄主启动子的有效控制之下。同时， 出于高水平表达的要求，这种启动子最好是强启动子，并具有良好的调节控制系统，如 枯草杆菌c d d 基因的启动子p 4 3 等。通过对启动子元件的选择，构建高效表达载体，可 以实现外源基因的有效表达。然而，在实际研究中发现，由于目的基因不同，表达载体 6 第一章前言 系统不同，为了提高外源蛋白的表达量，应试用不同的启动子，如果能对某一工业酶制 剂的启动子进行系统研究，择优选之，将有利于提高启动子的应用价值。因此，寻找高 效调控编码基因的强启动子可以从根本上解决异源蛋白的表达量，这将对高效重组蛋白 的生产有重要影响。 1 7 本课题的立题意义与研究内容 地衣芽孢杆菌仅淀粉酶( b l a ) 是目前工业上最重要的酶制剂之一，由于其具有众 多优点及应用范围广泛，且有重要商业价值，致使人们积极研究高效b l a 生产菌种， 或者用基因工程的方法寻找编码该酶的新基因，然后通过对菌株进行遗传改造来提高酶 活力。我国b l a 工业生产技术来源于国际技术引进，对b l a 生产菌种的研究在近几年 才有较大的进展。 启动子是基因表达调控的重要顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件， 适宜启动子的选择是重组蛋白高效表达的关键因素之一。随着启动子改造方面研究的逐 渐深入，有很多启动子已被开发并应用于a 淀粉酶基因的表达。蔡恒等【4 2 l 利用s a c b 基 因启动子在枯草杆菌中进行b l a 的表达，董晨等【2 0 】利用枯草杆菌c d d 基因的启动子p 4 3 在枯草杆菌中进行b l a 的表达，但是表达量都不高，要实现大规模工业生产，还需要 进一步提高启动子的转录强度。所以，寻找合适的强启动子以提高目的基因在芽孢杆菌 中的表达水平，具有重要的科学意义和应用价值。 本文首先在大肠杆菌中验证了人工合成的启动子p q 具有介导0 【淀粉酶基因表达的 功能，并通过介导表达地衣芽孢杆菌高温a 淀粉酶，分析和评价启动子p q 在枯草芽孢 杆菌和地衣芽孢杆菌中介导基因表达的能力和强度。 主要研究内容包括： ( 1 ) 启动子p q 在大肠杆菌中的功能鉴定； ( 2 ) 启动子p q 在枯草芽孢杆菌中介导b l a 表达的强度分析； ( 3 ) 启动子p q 在地衣芽孢杆菌中介导b l a 表达的强度分析。 7 江南大学硕士学位论文 2 1 菌株与质粒 第二章材料与方法 e s c h e r c h i ac o l ix l 。1 、ec o l ij m l 0 9 、ec o l ij m l 0 9 ( p l a k r ) 、b a c i l l u ss u b t i l i s1 a 7 1 7 ( a a m y a ) 、b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sc i c i mb 0 2 0 4 、丑l i c h e n i f o r m i sc b bd 3 0 2 和p u b 110 由江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心( h t t p ：h e i e i m - c u j i a n g n a n e d u o n ) 提供。 质粒p h y - p 4 3 、p m d - g m - p q 和p u b 一匕吼- a m y l 为本实验室前期构建。其中，p m d g m - 尸q 含有启动子p q 。启动子p q 的核心序列为：5 - a 1 a r a g g g a a a a t g g t a c a l l ：a t t a a a a a t t c gg t g t a t a a t a c a a t a t c a t a t g t t t c a c 3 ，通过人工合成获得。 2 2 工具酶与试剂 2 2 1 酶与试剂盒 实验中用的各种d n a 限制性内切酶e c o r i 、s m a i 、b a m h i 、n c o i 为f e r m e n t a s 产品， 购自深圳晶美生物工程有限公司或上海生工生物工程技术服务有限公司。t 4d n a 连接 酶和e f t , d n a 聚合酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。p c r 产物( 小量) 纯 化试剂盒、胶回收试剂盒均为q i a g e n 公司产品。 2 2 2 质粒提取与纯化试剂 溶液i ：5 0m m o l l 葡萄糖，2 5m m o l lt r i s h c i ( p h8 0 ) ，1 0m m o l le d t a 。 溶液i i ：o 2m o l ln a o h ，1 s d s 。 溶液i i h5m o l lk a c6 0m l ，c h 3 c o o h1 1 5m l ，h 2 02 8 5m l ，混匀。 t e ：1 0m m o l l i r i s - h c i ，1m m o l le d t a ，p h8 0 。 s t e ：o 1m o l ln a c i ，1 0m m o l lt r i s h c l ，1m m o l le d t a ，p h8 0 。 c t a b n a c l 溶液：10 c t a b 0 7m o l ln a c i 。 r n a 酶溶液：r n a s e5m g ，于1m l 生理盐水中充分溶解，沸水浴1 0m i n ，缓慢冷 却后分装，2 0 保藏。 2 2 3 蛋白电泳试剂 蛋白电泳试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、蛋白质分子量标准为上海生工公司产 品。 丙烯酰胺储备液( 3 0 丙烯酰胺，0 8 甲叉双丙烯酰胺) ：丙烯酰胺( 分析纯) 2 9 2 g ，甲叉双丙烯酰胺o 8g ，加蒸馏水至1 0 0m l ，用滤纸过滤后于棕色瓶中4 c 存放。 分离胶缓冲液( 1 5m o l l ，p h8 8 ) ：1 8 1 5gt r i s ( 分析纯) ，用1m o l lh c i 调节 p h 至8 8 ，加水至1 0 0 m l ，4 存放。 浓缩胶缓冲液( 0 5m o l l ，p h6 8 ) ：6g i r i s ，用1m o l l l h c i 调节p h 至6 8 ，加水 至1 0 0m l ，4 c 存放。 8 第二章材料与方法 t r i s - 甘氨酸电泳缓冲液：6gt r i s ，2 8 8g 甘氨酸，2gs d s ，加水至2l 。 1 0 s d s 溶液：1 0gs d s ，加水定容至1 0 0m l ，完全溶解后室温存放。 1 0 过硫酸铵溶液：0 1g 过硫酸铵( 分析纯) ，加lm l 蒸馏水溶解。 5 样品缓冲液：0 6m ll m o l l i r i s h c l 缓冲液( p h6 8 ) 、5m l5 0 ( v v ) 甘油、 2m l1 0 s d s 、0 5m l 1 3 - 巯基乙醇、lm l1 ( w v ) 溴酚蓝、0 9m l 蒸馏水。4 c 存 放。 1 2 分离胶的配制：蒸馏水3 5m l ，3 0 丙烯酰胺储备液4m l ，分离胶缓冲液2 5 m l ，1 0 s d s0 1m l ，1 0 过硫酸铵0 0 4m l ，t e m e d0 0 0 4m l 。 5 浓缩胶的配制：蒸馏水2 3m l ，3 0 丙烯酰胺储备液o 6 7m l ，浓缩胶缓冲液1 0 m l ，1 0 s d s0 0 4m l ，1 0 过硫酸铵0 0 3m l ，t e m e d0 0 0 5m l 。 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝r - 2 5 01g ，甲醇4 5 0m l ，冰醋酸1 0 0m l ，蒸馏水 4 5 0m l 。 固定液：2 0 ( w v ) 三氯乙酸。 脱色液：甲醇2 0 0m l ，冰醋酸2 0 0m l ，蒸馏水1 6 0 0m l 。 其他试剂药品皆为国产或进口