（纺织化学与染整工程专业论文）尼龙亲和膜的制备及其在木瓜蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制剂纯化中的应用研究[纺织化学与染整工程专业优秀论文].pdf

摘要 近年来，亲和膜色谱技术在蛋白质的分离纯化中得到了快速发展， 与柱亲和色谱相比，亲和色谱具有许多优点，如流速高、分离速度快、 压降低和易于规模化生产等。 本文利用尼龙膜为基质，通过甲醛活化，然后键合亲水性的多聚 物壳聚糖对其进行改性。实验结果表明，尼龙膜的非特异性吸附大大 降低，键合的壳聚糖含量为8 9 6m g g 。 木瓜蛋白酶( e c 3 4 2 2 2 ) 主要存在于番木瓜的乳汁中，其应用广泛，包 括细胞分离、皮革、化妆品、纺织、洗涤剂、食品等行业，传统的分离方法 很难达到现代工业的纯化要求和活性，并很难规模化生产。本论文首次以染 料f 3 g a 为配基制各了一种新型的分离木瓜蛋白酶的材料，研究了其物理性 能和色谱性能。实验结果表明，染料f 3 g a 的键合量为1 4 6 1 肛m o l g ，染料 亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附量达到2 3 5 3m g g 。利用该亲和膜从粗酶中提取 木瓜蛋白酶，纯化倍数为4 6 5 倍。本文首次综合运用批量法和动态法以配 基染料f 3 g a 与木瓜蛋白酶之间亲和相互作用的热力学和动力学进行了深 入研究，结果表明，亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附行为满足f r e u n d l i c h 模 型，动力学分析适合p s e u d os e c o n d o r d e rk i n e t i c s 模型，热力学参数 g o ，月0 ，和酽分别为1 2 5 8k j t o o l ( 2 9 8k ) ，1 7 8 1k j t o o l ，和o 1 0 1k j ( m o lk ) ，显示木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的吸附行为是一个吸热过 程，负的自由能体现了木瓜蛋白酶倾向于从溶液中吸附到尼龙膜的表 面，是一个自发的过程。 另外，本论文将尼龙亲和膜纯化出的木瓜蛋白酶再次运用于亲和 色谱，即以木瓜蛋白酶为配基，用于从土豆汁中分离纯化半胱氨酸蛋 白酶抑制剂。 半胱氨酸蛋白酶抑制剂是广泛存在于动植物组织和体液中的蛋白 酶抑制剂，它能与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶形成有 力的、非共价结合的竞争性抑制，抑制他们的活性，从而保护蛋白质的 二硫键不被破坏，阻止蛋白的降解。有研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑 制剂具有很好的生物防御作用，能参与各种生理和病理的过程，如风湿 性关节炎、肾衰竭、骨质疏松症、肿瘤的侵袭和转移等。植物半胱氨酸蛋 白酶抑制剂可抑制致病真菌，如赤霉菌、稻瘟病菌等的生长。本论文 首次以平板尼龙膜为基质，将尼龙膜改性后键合上木瓜蛋白酶，对固 载化的条件进行了优化，并对其固载化的尼龙膜的性质进行了研究， 最后从土豆汁中纯化出了高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。通过实验， 可以看出经过壳聚糖改性的尼龙膜可以作为一种优良的亲和膜载体， 利用戊二醛作为交联剂共价连接木瓜蛋白酶的方法也是可行的，并且 得到的尼龙亲和膜具有较高的反应活性。在实验条件下，尼龙膜固定 木瓜蛋白酶的最佳固定化条件为：p h9 0 ，质量分数为0 5 的戊二醛， 反应温度为4 5 ，反应时间为6h ，酶用量为每0 3 5g 干载体固定9 0 m l ( 1 0m g m 1 ) 木瓜蛋白酶。利用制得的尼龙亲和膜从土豆汁中分离纯 化半胱氨酸蛋白酶抑制剂，纯化倍数达7 2 5 倍。 关键词：亲和膜色谱，尼龙膜，染料f 3 g a ，木瓜蛋白酶，半胱氨酸 蛋白酶抑制剂 a b s t r a c t i nr e c e n t y e a r s ，t h em e m b r a n ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y h a saf a s t d e v e l o p m e n ti n t h es e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n dr e c o v e r yo fp r o t e i n sa n d e n z y m e s c o m p a r e dw i t ht h ec l a s s i c a lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，t h ea f f i n i t y m e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h yp o s s e s s e san u m b e ro fa d v a n t a g e s ，s u c ha sh i g h e r f l o wr a t e ，f a s t e rb i n d i n gr a t e ，l o w e rp r e s s u r ed r o p ，h i g h e rp r o d u c t i v i t ya n de a s i e r s c a l e u p i no u rs t u d y , c o v a l e n tc o u p l i n go fc h i t o s a n ( c s ) t oa c t i v a t e dn y l o n m e m b r a n ew a sp e r f o r m e da f t e rt h er e a c t i o no ft h em i c r o p o r o u sn y l o nm e m b r a n e w i t h f o r m a l d e h y d e c o m p a r e d w i t h p l a i nn y l o nm e m b r a n e ，n o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o no nt h ec s c o a t e dn y l o nm e m b r a n ed e c r e a s e dg r e a t l y t h eq u a n t i t yo f c s - a t t a c h e dm e m b r a n e sw e r e8 9 6m g gn y l o nm e m b r a n e p a p a i n ( e c 3 4 2 2 2 ) i sam i n o rc o n s t i t u e n t ( a b o u t8 ) a m o n gt h ep a p a y a e n d o p e p t i d a s e s t h ee n z y m eh a sf o u n dm a n ya p p l i c a t i o ni nc e l li s o l a t i o n ，l e a t h e r , c o s m e t i c ，t e x t i l e s ，d e t e r g e n t s ，f o o da n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s p u r if i c a t i o no f p a p a i nf r o mp a p a y al a t e xh a st r a d i t i o n a l l yb e e na c h i e v e db yp r e c i p i t a t i o n m e t h o d s h o w e v e r , t h em e t h o d sc a nn o tm a t c ht h er e q u i r e m e n t so fp u r i t ya n d s c a l e i nt h i sp a p e r , t h ed y ec i b a c r o nb l u ef 3g a ( c bf 3 g a ) a sal i g a n dw a s c o v a l e n t l yi m m o b i l i z e do nt h ec s c o a t e dm e m b r a n e s p h y s i c a lp r o p e r t i e so ft h e c o m p o s i t em e m b r a n ea n di t sa p p l i c a t i o n si na f f i n i t ym e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h y w e r ee x a m i n e d t h ec o n t e n t so fc sa n dc bf 3g a a t t a c h e dm e m b r a n e sw e r e 8 9 6m g gn y l o nm e m b r a n ea n d14 6 ig m o l gn y l o nm e m b r a n e ，r e s p e c t i v e l y t h e s ec bf 3g a a t t a c h e dc o m p o s i t em e m b r a n e sw e r e u s e di nt h e p a p a i n a d s o r p t i o ns t u d i e s h i g h e rp a p a i na d s o r p t i o nc a p a c i t y , u pt o2 3 5 3m g ga f f i n i t y m e m b r a n e ，w a so b t a i n e d p a p a i nw a sp u r i f i e df r o mt h ec r u e dp a p a i nb yt h ed y e a f f i n i t ym e m b r a n e ，a n dt h ep u r i f yr a t i oi s4 6 5 m o r e o v e r , t h ea d s o r p t i o no f p a p a i no nt h ed y ea f f i n i t ym e m b r a n e s ，t h ec i b a c r o nb l u ef 3 g aa sal i g a n da n dt h e c h i t o s a n c o a t e d n y l o n m e m b r a n ea sab a s e ，u n d e rb a t c h e q u i l i b r i u m e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sa t2 7 7 ，2 9 8 ，3 10kw a si n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a l d a t aw a sa n a l y z e du s i n gt w oa d s o r p t i o nk i n e t i cm o d e l s ：t h ep s e u d of i r s t o r d e r l a g e r g r e na n dt h ep s e u d os e c o n d o r d e rk i n e t i c s t h ep s e u d os e c o n d o r d e r k i n e t i cm o d e lp r o v i d e dt h eb e t t e rc o r r e l a t i o nt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s t u d i e s s h o w e dt h a tt h ea d s o r p t i o no fp a p a i no nd y ea f f i n i t ym e m b r a n e sc o u l db e d e s c r i b e d b yt h e f r e u n d l i c hi s o t h e r m t h e t h e r m o d y n a m i c c o n s t a n t so f a d s o r p t i o np h e n o m e n a ：a g o ，穿，a n d 心w e r ef o u n da s 一1 2 5 8k j m o l ( a t2 9 8 k ) ，17 81k j m o l ，a n d0 10 1k j ( t o o lk ) ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l ts h o w st h a tt h e a d s o r p t i o no fp a p a i no nt h ed y ea f f i n i t ym e m b r a n e sw a se n d o t h e r m i ca n d s p o n t a n e o u s a c c o r d i n gt h ea b o v em e t h o d ，t h ep a p a i np u r i f i e db yt h ed y ea f f i n i t y m e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h yw a su s e di n a f f i n i t ym e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h y a g a i n ，w h i c ht h ep a p a i nw a su s e da s a n o t h e rl i g a n do nt h en y l o na f f i n i t y m e m b r a n et op u r i f yc y s t a t i nf r o mp o t a t oj u i c e c y s t e i n ep r o t e a s ei n h i b i t o ri sak i n do fp r o t e i n a s ei n h i b i t o r sw h i c hi s w i d e s p r e a di n t h ea n i m a la n dp l a n tt i s s u e sa n db o d yf l u i d s i tc a nf o r ma n e f f e c t i v e ，n o n c o v a l e n tc o m b i n a t i o no fc o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n w i t hp a p a i n ， c a t h e p s i np r o t e i n a s ea n dr e s t r a i nt h e i ra c t i v i t y ，t h e r e b y , p r o t e c t i n gt h a tt h e p r o t e i n sd i s u l f i d eb o n d si sn o td a m a g e d ，s t o p p i n gt h ed e g r a d a t i o no fp r o t e i n s s t u d i e si n d i c a t et h a tc y s t e i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r sh a v eg o o db i o l o g i c a ld e f e n s e r o l ep a r t i c i p a t i n gi nv a r i o u sp h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a lp r o c e s s e s ，s u c ha s r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ，k i d n e yf a i l u r e ，o s t e o p o r o s i sa n dt u m o ri n v a s i o na n d m e t a s t a s i s p l a n tc y s t e i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r sc a ni n h i b i tp a t h o g e n i cf u n g is u c ha s f u s a r i u m ，b l a s tc h e m o h e t e r o t r o t hg r o w t h i nt h i st h e s i s ，f l a tn y l o nm e m b r a n e w a sf i r s tu s e da sab a s e ，p a p a i nw a sc o u p l e da sal i g a n do nm o d i f i e dn y l o n m e m b r a n ew i t hc h i t o s a n ，t h ec o n d i t i o n so fp r e p a r i n gn y l o na f f i n i t ym e m b r a n e s w a so p t i m i z e d ，a n dp h y s i c a lp r o p e r t i e so ft h ec o m p o s i t em e m b r a n ea n di t s a p p l i c a t i o n si na f f i n i t ym e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h yw e r ee x a m i n e d t h ec y s t e i n e p r o t e a s ei n h i b i t o r sw i t hh i g hp u r i t yw e r eo b t a i n e df r o mp o t a t oj u i c e t h r o u g ht h e e x p e r i m e n t ，i tc a nb ec o n c l u d e dt h a tm o d i f i e dn y l o nm e m b r a n ew i t hc h i t o s a n c a nb ew e l lu s e da sat y p eo fa f f i n i t ym e m b r a n ec a r r i e r t h em e t h o do fu s i n g g l u t a r a l d e h y d ea sac r o s s l i n k i n ga g e n ti sf e a s i b l e t h en y l o nm e m b r a n ew i t h h i g hr e a c t i v i t yw a sf i n a l l yo b t a i n e da c c o r d i n gt ot h i sm e t h o d t h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n so ft h ep a p a i ni m m o b i l i z a t i o no nn y l o nm e m b r a n ei sa sf o l l o w s ：p h 9 0 ，0 5 g l u t a r a l d e h y d es o l u t i o n ，t h el o a d i n gc a p a c i t yo fp a p a i nw a s9m l ( 10 m g m lp a p a i ns o l u t i o n ) p e ro 3 5gc a r t i e r , t h er e a c t i o nt i m ei s6ha t4 5 ( 2 u n d e r t h ea b o v eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ec y s t e i n e p r o t e a s ei n h i b i t o r sw a sp u r i f i e d f r o mt h ep o t a t oj u i c e t h ep u r i f i c a t i o nr a t i oi s7 2 5 h u a l in i e ( t e x t i l ec h e m i s t r ya n dd y e i n ga n df i n i s h i n ge n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db yp r o f e s s o rl i - m i nz h u k e y w o r d ：a f f i n i t ym e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h y , n y l o nm e m b r a n e ，d y ef 3 g a ， p a p a i n ，c y s t e i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r s 图索引 图1 1 亲和膜分离过程示意图 图1 2 纤维素的分子结构一一5 图1 3 平板亲和膜模型图一1 1 图1 4 实验流程示意图一 图2 1 尼龙膜的甲醛法活化原理一3 9 图2 2 尼龙膜的壳聚糖改性处理一4 0 图2 3 尼龙膜改性前后的电镜照片 图2 - 4 改性尼龙膜的非特异性吸附性能4 5 图3 1 膜桥一一一一4 9 图3 2 尼龙亲和膜的制备一4 9 图3 3 染料f 3g a 结构式一5 0 图3 - 4 亲和吸附的突破曲线一5 5 图3 5 原始尼龙膜和染料亲和膜电镜照片5 7 图3 - 6 红外光谱图一一5 9 图3 7 木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的等温吸附线一一6 0 图3 8 木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的动力学分析一6 2 图3 - 9 木瓜蛋白酶吸附到尼龙亲和膜上的v a i l th o f f 图 6 3 图3 1 0 吸附时间对吸附量的影响一一6 5 图3 1lp h 值对吸附量的影响一一6 6 图3 1 2 离子强度对吸附量的影响一 6 7 图3 1 3 亲和膜的非特异性吸附一6 8 图3 1 4 离子强度对酶活的影响一一6 9 图3 1 5p h 值对酶活的影响一 图3 1 6 转速流速的线性关系 图3 1 7 不同洗脱液对洗脱效果的影响一一7 2 图3 1 8 上样速度对吸附沈脱效果的影响一一7 3 图3 1 9 洗脱液p h 值对沈脱效果的影响 图3 。2 0 洗脱液离子强度对洗脱效果的影响一一一 图3 2 1 洗脱速度对洗脱效果的影响一 图3 2 2 木瓜蛋白酶的吸附洗脱曲线 7 4 7 5 7 6 图3 2 3 亲和膜色谱纯化的木瓜蛋白酶s d s p a g e 电泳图7 8 图4 1 亲和膜的制备原理图 图4 2 交联剂戊二醛用量对固定化酶酶活的影响一一8 8 图4 3p h 值对固定化酶酶活的影响一一8 9 图4 - 4 温度对固定化酶酶活的影响一一 8 9 图4 5 反应时间对固定化酶酶活的影响9 0 图4 ，6 酶用量对固定化酶酶活的影响9 1 图4 7 催化温度对自由酶和固定化酶活力的影响一9 2 图4 8 热稳定性的比较9 3 图4 9p h 值对自由酶和固定化酶活力的影响一9 4 图4 1 0 表观米氏常数的测定一一- 图4 1 1 洗脱液对脱附效果的影响一9 6 图4 1 2 不同上样速度对吸附影响 图4 ，1 3 不同洗脱速度对脱附影响一9 8 图4 1 4 亲和膜色谱法纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂- - 一 一1 0 9 图4 1 5 半胱氨酸蛋白酶抑制剂s d s p a g e 电泳图一1 0 1 表索引 表1 1 通用型配基及其目标蛋白一8 表1 2 亲和膜色谱应用于生物大分子的分离一一1 0 表1 3 亲和色谱法纯化木瓜蛋白酶17 表1 4 分离纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究情况一2 2 表2 1 原料与试剂 表2 2 主要仪器一一3 9 表2 3h c l 浓度对尼龙膜性能的影响一4 1 表2 4 水解时间对尼龙膜性能的影响一4 2 表2 5 水解温度对尼龙膜性能的影响一一4 3 表2 - 6 改性尼龙膜的物理性能一一4 4 表3 1 原料与试剂一一4 8 表3 2 主要仪器 表3 3 亲和膜的物理性能一5 8 表3 - 4l a n g m u i r 和f r e u n d l i c h 常数 表3 5 木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的动力学常数一6 2 表3 - 6 木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的热力学参数一6 4 表4 1 原料与试剂一一 表4 - 2 主要仪器一 ：8 2 8 2 表4 3 尼龙亲和膜上沈脱速度对脱附的影响一9 9 表4 - 4 土豆汁中纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂 1 0 0 i g g f 3 g a h s a c o i l a h i g g i g m l c y s t e i n e c e q e q q m g g o 骨 符号说明 免疫球蛋白g 活性蓝染料c i b a c r o nb l u ef 3 g a 人血清白蛋白 蛋白质a 人免疫球蛋白g 免疫球蛋白m l 半胱氨酸 平衡浓度 平衡吸附量 饱和吸附量 时间t 时蛋白质在尼龙膜上的吸附量 吉向斯自由能 焓变 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的 学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的 成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本 人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 学位论文作者签名：强华丽 日期：方伸7 年，。月，承目 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密。 学位论文作者签名：聂华丽 指导教师签名 日期：j 叩年r 。月，文日 日期叼产徊月f 2 - - e t 东华大学博士论文 第一章绪论 1 1 亲和膜色谱的发展历史及研究现状 1 1 1 亲和膜色谱技术产生的背景 近年来，随着生命科学、生物技术、药学以及医疗技术的日益发 展，对于多肽、蛋白质、酶、核苷等生物大分子的分离、提取和精制 的要求也越来越高。因为不论自然界存在的，还是通过发酵、培养、 合成等人工手段制取的上述物质，在初始阶段总是由多种物质组成的 混合物，不能直接在医药、食品等行业应用，必须经过分离纯化，提 取出一种或几种真正有用的物质，而将那些无用，甚至有害的物质加 以剔除才能使用，因此许多发达国家在生物工程中的投资总额约有 7 0 是用在目标产品的纯化分离上。这些具有活性的生物大分子，一 旦脱离了它们原来的生理环境、与某些金属或载体相接触，其分子构 象很容易被改变，并失去其固有的生物活性。它们的热稳定性也较差， 常常有的需在特定温度( 如体温) 才不变性，有的需在低温( 如4 ) 才能 保持其活性【】。而以往基于生物大分子的理化性质进行分离的手段如 盐析法、有机溶剂分级沉淀法、液液双水相抽提法、离子交换层析、 凝胶过滤等，这些方法都存在着工艺繁琐、活性回收率低、纯化效果 有时不理想等问题，尤其是当要从大体积的稀溶液中提取出少量的生 物活性物质时，更有诸多不理想之处【2 j 。 膜分离是2 0 世纪6 0 年代以来发展较快的一项分离技术，它具有操 作条件温和、无污染、无相变等特点，膜分离过程设备简单、易于放 大、成本低、分离速度快、可连续操作，在许多领域都得到了应用， 像微滤、超滤已应用于生物化工和医药行业中。膜分离是根据分子大 小不同来实现分离的，一般相对分子质量相差1o 倍以上的物系才具有 分离作用，而某些生物大分子往往分子质量相差不大，仅结构、构像 或亲和性有差异，因此它还远远不能满足生化分离的需要【3 】。 东华大学博j ：论文 亲和色谱技术部分解决了这些问题，它是根据生物大分子与特定 的固载化配基之间的亲和力，即特异性的可逆结合和解离而使生物大 分子得到分离。所谓亲和力是指范德华力、疏水力、静电力、氢键等 作用力的综合表现。酶与底物、抗原与抗体、激素与激素受体等分子 之间的结合力就是亲和力。传统亲和色谱采用多孔粒状填料如琼脂糖、 葡聚糖凝胶等，该类填料特异性( 即分离材料与目标蛋白间的选择性结 合力) 高，纯化倍数( 单位蛋白质的活力) 高，但分离速度受粒间扩散和 低的轴向速率限制，压降大，分离时间长，处理量小，不能使用高的 加料速度l 引。 上世纪8 0 年代末出现了亲和膜色谱技术，把膜分离与亲和分离结 合起来，使之兼具膜分离与亲和分离的特点。亲和膜色谱与传统的膜 分离、亲和柱色谱相比，不仅具有纯化倍数高、压降小，分析时间短、 生物大分子在分离过程中变性几率小，允许较快的加料速度等特点， 而且比柱亲和柱色谱更易实现规模化纯化分离【5 娟】。 最近几年，利用亲和膜色谱已经纯化出溶菌酶【7 母】、木瓜蛋白酶抑 制剂【10 1 、a 干扰素f 1 1 1 、伴刀豆球蛋白“1 2 1 等生物医药制品。g t i l a y 8 】 在这方面做的研究比较多，利用配基染料g r e e n1 9 从鸡蛋白中提取了 溶菌酶，纯化倍数可达到2 5 4 倍。w o l m a n t l 3 】利用r e dh e 3 b 染料配基 从牛乳中纯化乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白在亲和膜上的最大吸附量 达到1 1 1 0m g m l ，远远高于在琼脂糖凝胶柱的吸附量9 3m g m l ；并分 别以染料亲和膜和染料琼脂糖凝胶，从牛初乳中纯化乳铁传递蛋白， 回收率分别为9 1 和5 6 ，仅仅通过亲和膜这一步纯化，蛋白质的纯 度可达9 4 。z u w e i 】利用新型的静电纺丝技术制备出聚砜膜，然后 键合配基f 3 g a ，亲和膜对b s a 的吸附量达到2 2m g g ，截留率达到8 0 ， 虽然其突破曲线不是很完美，但是为静电纺丝技术在亲和膜上的应用 奠定了一定的基础。c r i s t i a n a l l 5 】利用纤维素膜纯化出血凝素，并研究 了不同配基对于血凝素的吸附行为。 正是由于亲和膜色谱所具备的分离能力与产品分离纯度，使得它 已经成为膜分离技术研究的新热点【i 弘b j 。 2 东华大学博士论文 1 1 2 亲和膜分离的基本原理 亲和膜分离过程采用的设备与膜分离所用的类似，也是在膜组件 如中空纤维组件、平板式组件等中进行，而其操作过程则类似于亲和 色谱，如图1 1 所示，分离过程首先用缓冲液冲洗和平衡膜组件，再将 样品混合物缓慢地通过膜，使其中与亲和配基有特异性相互作用的分 子和配基产生耦合，生成相应的配合物，经洗涤除去死体积中的蛋白 及未结合的杂蛋白，再通过改变条件，如洗脱液组成、p h 值、离子强 度、温度等，使已和配基产生相互作用的目标分子有选择地解离，将 其收集起来，再将膜进行洗涤、再生和平衡，如此循环。用亲和膜技 术纯化大分子时，使用的缓冲液、p h 值和离子强度，以及操作时的加 料速度、温度、洗脱方式、洗脱液的组成和性质是影响目的产物纯度 的关键因素。特异性洗脱是在洗脱液中加入对配基有更强亲和力的物 质，将目标蛋白质换下来。改变p h 值、离子强度、温度、加入变性剂 等属于非特异性洗脱，较为经济，但会导致纯度下降。使用特异性比 较低的配基时，要特别注意纯化条件和洗脱方式的选择。 i m m o b i l i z e d l i g a n d p r o d u c tt o b ep u r i f i e d 骱卜一卜 0 p r o d u c ta d s o r b e do n p r o d u c tt ob ee l u t e d i m m o b i l i z e dl i g a n d 图1 1 亲和膜分离过程示意图 f i g 1 1p r o c e s so fa f f i n i t ym e m b r a n es e p a r a t i o n l 。1 3 亲和膜色谱的制备方法 1 1 3 1 亲和膜基质材料 膜基质材料在亲和膜的制各中具有重要的作用，因为它不但决定 着所键合的间隔臂和配基种类，而且还直接决定着分离的效果。理想 0 口 + 口 狱巍纷矽 东华人学博i j 论义 的亲和膜材料应该具有的特征是：高的孔隙率，大的内外表面积，高 的化学、生物、机械稳定性，一定的亲水性，低的非特异性吸附，存 在可化学反应的基团，耐溶剂冲洗，成本低，重复性好等。 要制备亲和膜色谱，首先要合成或选用合适的膜材料，膜基质上 要含有可与配基进行共价结合的活性官能团，如羟基( 一o h ) ，氨基 ( n h 2 ) ，巯基( 一s h ) ，羧基( c o o h ) 等。若原始膜上无可直接可用于反 应的基团，则首先要选用合适的化学试剂对膜进行化学改性，使膜上 其它相应的基团转化为上述可以反应的活泼基团。这样的膜材料往往 可由带有上述基团的单体进行共聚或均聚，然后用所合成的高分子材 料经特殊加工成型而得。但是，这些带有活性官能团的单体较难合成， 聚合手段也比较复杂( 如离子聚合) ，再加上在成型过程中官能团容 易失活或脱落，往往达不到预期的效果。因此，对一些通用的商品膜 进行修饰不失为一种行之有效的途径。近年来，已有一些围绕商品膜 的化学修饰的文献研究 1 6 - 18 1 。 一般来讲，亲和膜基质材料可以分为天然高分子和合成高分子两 大类。 ( 一) 天然高分子 天然高分子具有良好的亲水性和生物相容性，具有较多的可反应 基团，但是由于其机械和耐化学溶剂性能等方面的缺陷极大的限制了 其单独作为亲和膜基质材料的应用。如何解决天然高分子机械性能以 及耐化学溶剂性能差的问题是当前以天然高分子为基质的亲和膜材料 的研究重点。下面对其中两种主要的天然高分子做简单介绍： ( 1 ) 纤维素膜 纤维素是自然界中含量最多的天然高分子，也是最早用于亲和分 离的介质之一。纤维素由葡萄糖单元组成，如图1 2 所示， 东华人学博1 ：论文 oh ch2 0 h 图1 2 纤维素的分子结构 f i g 1 2c h e m i c a ls t r u c t u r eo fc e l l u l o s e 由于纤维素分子含有大量的o h ，从而赋予纤维素良好的亲水性、 生物相容性和可反应性。但是纤维素孔径分布不均，有大量短纤维存 在，这对分离生物大分子不利。近年来，将纤维素运用于生化分离中 越来越引起人们的广泛注意。我国对于亲和膜的研究也始于纤维素膜 的研究，中科院大连物化所商振华研究组【1 9 1 在这方面进行了大量的研 究工作，他们利用纤维素为基质，通过对纤维素膜进行不同的改性， 制各了金属螯合物亲和膜，对内毒素的去除率达9 0 以上。江南大学 的张亚辉2 0 1 以纤维素滤纸为载体，通过环氧氯丙烷交联活化、亚氨基 二乙酸偶联、金属离子螯合制备得到亲和膜。应用该膜进行的蛋清蛋 白纯化试验，结果表明，c u 2 + 亲和膜具有较好的吸附性能和纯化效果， 只需采用两步洗脱的方式即可得到具有明显纯化效果的蛋清转铁蛋白 和溶菌酶。 ( 2 ) 壳聚糖膜 自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然高分子就是甲壳素。因 为甲壳素不溶于一般溶剂，所以人们很难对它进行利用。但是甲壳素 的脱乙酰产物壳聚糖却可以溶解在稀酸里，这就为制备壳聚糖亲和膜 提供了便利。如z e n g f 2 1 】利用壳聚糖通过相转变的方法制得壳聚糖膜， 然后键合染料f 3 g a 为配基，得到壳聚糖亲和膜成功分离出人血清清 蛋白h s a 。 东华大学博士论文 ( 二) 合成高分子 合成高分子是亲和膜色谱材料中的最大的一类，由于其成膜性能 好，有较好的机械性能和耐化学溶剂性，所以在亲和膜的发展过程中 受到研究者的青睐。但是合成高分子也有着自身的缺陷如亲水性差、 可反应的基团少、生物相容性差等。所以对于合成高分子的改性多集 中在提高其亲水性、生物相容性和增加其表面可反应的基团等。 ( 1 ) 聚酰胺膜 聚酰胺具有良好的成膜性能，耐酸、碱及多种有机溶剂，有良好 的机械和化学稳定性，亲和膜研究中多使用尼龙6 、6 6 膜。尼龙膜上有 末端基氨基，一般对其上的氨基进行活化，但含量较低，每克膜上约 含2 01 t m o l 氨基，对蛋白质有强烈的非特异性吸附【2 2 1 。文献采用如下 方法增加膜上可反应基团数及其亲水性，降低膜上的非特异性吸附： ( a )酸水解：k l e i n 等 2 3 】将尼龙6 在p h 值3 0 水解后，膜上氨基数 分别由3 6 和4 4 肛m o l - n h 2 g 增加至1 7 8 和2 3 4g m o l n h 2 g 膜， 但酸水解也会降低膜的强度。 ( b )亲水改性：键合水溶性的低聚物或含丰富多羟基的多糖类物质 如葡聚糖、纤维素、淀粉等形成亲水表面层，扩大膜上可反应 基团的数目，屏蔽离子交换位点以减少非特异性吸附。 ( 2 ) 聚砜膜 聚砜是憎水性膜，对水不浸润，若直接使用易使生物活性物质变 性失活，必须加以改性才适宜做亲和介质。聚砜膜的特点是：生物惰 性、耐热、且耐氧化性、p h 值范围宽、易引入取代基。但聚砜膜不 耐酸性和极性溶剂。k l e i n t 2 4 1 等人在聚砜膜的末端酚羟基与l ，2 亚乙 基二醇甘油醚反应产生末端环氧基，然后键合羟乙基纤维素，再用 1 ，2 亚乙基二醇甘油醚活化后键合上乙二胺做间隔臂，然后键合蛋白 质a 做为配基，用于免疫球蛋白g 的分离。 6 东华大学博士论文 ( 3 ) 聚烯烃 对聚烯烃多采用辐射诱导接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯的方法增加 其亲水性。瞿亮2 5 】等采用预辐射接枝法在聚丙烯基膜( p p ) 上接枝甲基 丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) ，再将配基辛巴蓝( c b d ) n 载于g m a 聚合 链上制备了一种亲和膜，用红外光谱( f t i r ) 和扫描电镜( s e m ) 分析和观 察了该亲和膜的表面形貌特征。在3 7 和6 0m g l 的胆红素溶液中 对该亲和膜进行静态吸附平衡实验，结果表明，经2 5h 吸附达到平衡， 其吸附容量可达5 0m g g 。 1 1 3 2 间隔臂 为了减少空间位阻，增大亲和容量，往往需要在基质与配基间插 一长分子做间隔臂，尤其当配基是小分子而纯化对象是大分子时。当 然并不是所有的亲和介质均需要间隔臂。是否使用间隔臂依赖于配基、 样品、活化方法。间隔臂的作用是使配基远离基质，从而使生物大分 子易接近配基的活性位。间隔臂过长或过短都不好，间隔臂分子过长 时会通过封闭膜上相邻活性位而引起空间位阻。间隔臂的适宜长度可 通过实验确定，通常可先用6 个碳原子的长度实验。如果配基是小分子， 样品分子也是小分子时间隔臂应短些，而样品分子是大分子时则间隔 臂应长些；如果配基是大分子时，则无论样品分子大或小，均可不使 用间隔臂。常用间隔臂物质为二胺类：h 2 n ( c h 2 ) 。n h 2 ( n = i ，5 ) 、对苯二 胺等。 1 1 3 3 配基 配基与目标蛋白的结合是一可逆过程，可表示如下： e ( 底物) + l ( 配基) he - l ( 复合物) k d = 1 k a - e 】【l i e e l 】 解离平衡常数k d 是配基与蛋白质亲和作用的一个重要参数。若 解离常数过大，蛋白质不能有效结合；若过小，蛋白质洗脱困难。一 般认为比较合适的k d 值应在1 0 1 0 。8 之间。 东华大学博士论文 配基是指底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物或其他任何能 特异并可逆地与目标蛋白质或大分子物质发生相互作用的分子。在亲