（化学工艺专业论文）木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究.pdf

木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 摘要 单细胞蛋白( s i n g l e c e l lp r o t e i n ，简称s c p ) 指的是单细胞菌体蛋白， 其蛋白含量高，营养丰富。在当今世界性饲料蛋白质资源严重不足情况 下，尤其是在我国，随着生活水平的不断提高，饲料蛋白已经远远不能 满足饲养业发展的需要，开发新的饲料蛋白资源成为我国饲料业的重要 课题。长期以来，已经成熟的s c p 的生产工艺成本高，制约了其发展。 探索出一条经济合理的生产工艺路线意义重大。本研究利用木薯淀粉副 产出的废渣为原料，固体发酵制取单细胞蛋白饲料，探索出具有工业化 应用潜力的工艺路线。主要研究内容如下： 1 选育出一株较好的产朊假丝酵母，并利用工业糖化酶进行酶解， 固体发酵，得到粗蛋白含量较高的s c p 饲料。 2 通过高压灭菌对木薯渣进行预处理，产物粗蛋白含量从生料发酵 的1 1 1 3 提高到1 7 6 2 ，增幅为5 7 。 3 产朊假丝酵母对尿素和硫酸铵都有较好的同化能力，尿素和硫酸 铵的较适合的添加浓度分别为：2 5 和5 。 4 通过单因素和正交实验，得到最佳工艺条件分别为：4 的工业糖 、化酶添加量、底物含水量为7 0 、发酵时间为7 2 h 、酵母接种量为1 0 。 四个因素对产品粗蛋白含量影响顺序为：底物含水量 发酵时间 糖化酶 添加量 接种量。 5 在优化条件下进行实验，发酵产物粗蛋白质含量由发酵前的 1 3 4 3 增加到2 8 6 8 ，提高率为1 1 3 5 。淀粉含量由发酵前的3 9 4 降至9 9 ，降解率为7 4 8 7 。 6 在粗蛋白增加量随时间变化的数据图中，插入最优化的“s ”型曲 线方程( l o g i s t i c 方程) ，利用曲线拟合导出了本实验条件下固态发酵生 产s c p 的动力学方程。 关键词：木薯淀粉渣工业糖化酶产朊假丝酵母单细胞蛋白 t h es t u d yo ns i n g l ec e l lp r o t e i nf e e df r o m c a s s k v as t a r c hr e s i d u a a b s t r a c t s c pm e a n st op r o t e i ni ns i n g l ec e l lb o d y i th a sh i g hp r o t e i na n dr i c h n u t r i e n t n o wt h e r ei s s e v e r e l y s h o r to fp r o t e i nr e s o u r c ei nt h ew o r l d ， e s p e c i a l l yi nc h i n a w i t ht h ei m p r o v e m e n to fl i v i n gs t a n d a r d ，t h er e s o u r c e s o fp r o t e i nf e e da r ef a rb e y o n ds a t i s f a c t i o ni nt h en e e do ff e e di n d u s t r y t h e d i s c o v e r yo fn e wp r o t e i nf e e dr e s o u r c e sh a sb e c o m ea ni m p o r t a n ts u b j e c ti n o u rc o u n t r y s c pp r o d u c t i o ni nt h em a t u r ep r o c e s sh a sd e v e l o p e dv e r y s l o w l ye v e rs i n c ef o ral o n gt i m ea g od u et oi t sh i g hc o s t s oi ti ss i g n i f i c a n t t oe x p l o r ea ne c o n o m i c a la n dr e a s o n a b l et e c h n i q u e i nt h i sp a p e r , s c pm a d e o fc a s s a v ar e s i d u ab ys o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e d at e c h n i q u et o h a v ea na p p l i c a t i o np o t e n t i a li ni n d u s t r i a l i z a t i o nw a se x p l o r e d t h em a i n p r o j e c t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ap r i m ec a n d i d au t i l i ss t r a i nw a ss e l e c t e d ah i g h e rq u a l i t ys c p p r o d u c tw a sg o tb yh y d r o l y z i n gs t a r c hu s i n gi n d u s t r i a ls a c c h a r i d a s ea n d s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n 2 u s i n gh i g hp r e s s u r es t e r i l i z a t i o n t oc a s s a v ar e s i d u ai st h eb e s ti n p r e - t r e a t t h ec o n t e n to fc r u d ep r o t e i ni np r o d u c tr i s e s5 7 f r o m11 3 t o i 17 6 2 c o m p a r e dt on os t e r i l i z a t i o n 3 t h e r ei sag o o da s s i m i l a t i o no nb o t hu r e aa n ds u l f u r i ca m m o n i u mi n c a n d i d au t i l i s t h eb e t t e rc o n c e n t r a t i o n sa r e2 5 a n d5 r e s p e c t i v e l yi n u r e aa n ds u l f u r i ca m m o n i u m 4 u s i n gs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s t s ，t h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n s a r es a c c h a r i d a s ec o n c e n t r a t i o no f4 ，w a t e rc o n t e n to f7 0 ，f e r m e n t a t i o n t i m eo f7 2 h ，a n dt h ec o n t e n to fc a n d i d au t i l i s 10 ，r e s p e c t i v e l y t h e s e q u e n c eo fe f f e c to ff o u rf a c t o r st o c r u d ep r o t e i nc o n t e n ti np r o d u c ti s ： w a t e r f e r m e n t a t i o nt i m e s a c c h a r i d a s ec o n c e n t r a t i o n c a n d i d au t i l i s c o n t e n t 5 r e p e a t i n ge x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tu n d e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fc r u d ep r o t e i nw a s i n c r e a s e df r o m1 3 4 3 t o2 8 6 8 ，t h er a t eo fi n c r e a s ew a s11 3 5 ，a n dt h e c o n t e n to fs t a r c hw a sd e c r e a s e df r o m3 9 4 t o9 9 a n dt h er a t eo f d e c r e a s ew a s7 4 8 7 6 i nt h ed a t af i g u r eo fc h a n g eo fc r u d ep r o t e i ni n c r e m e n ts p e e dt ot i m e ， s l o g i s t i ce q u a t i o nw a su s e d k i n e t i ce q u a t i o no fs o l i d s t a t i o nf e r m e n t a t i o n b yf i t t e dc u r v e sw a so b t a i n e dy e ti nt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s 、k e yw o r d s ：c a s s a v as t a r c hr e s i d u a ；i n d u s t r i a ls a c c h a r i d a s e ；c a n d i d au t i l i s ； s i n g l e c e l lp r o t e i n i v 广两大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 1 1 概述 第一章绪论 随着人口的迅猛增长，能源危机、食物短缺、环境污染等问题目前严重地威胁着 整个世界。世界蛋白质平均年产量在1 亿吨左右，由于2 0 0 6 年世界人口达6 5 亿，相当 于每人每天4 5 9 ，远低于世界粮农组织( f a o ) 规定的标准人均6 8 9 d ，而且消费差异很 大，在欧洲为人均1 0 0 9 d ，日本人均s 0 9 d ，中国为3 6 - 4 6 9 d ，而在发展中国家则有更 低的。蛋白质不足是婴幼儿发育不全、死亡率高的一个重要原因。人口将继续增长，要 确保充足的蛋白质供应将是一个相当严重的问题【l l 。 在我国，随着耕地的逐年减少，农业增产的余地与潜力越来越小，种植结构的调整 也面临着来自人口剧增的压力。我国饲料工业对蛋白饲料的需求每年近2 0 0 0 万吨l ”，存 在很大的缺口，除了用于外贸弥补外，行业内的节流开源是一条重要出路，如充分利用 油料种子等非常规饲料、鱼类加工下脚料、绿叶等。除此之外，微生物蛋白质s i n g l ec e l l p r o t e i n 成为一个令人瞩目的开发途径。因此，近年来，除发展以传统的水土为中心的“绿 色农业”和以海洋水域为主的“蓝色农业”外，还大力发展以微生物发酵为主的“白色 农业”。据科学测算，借助微生物发酵工程仅利用每年石油总产量的2 就能生产出 2 5 0 0 3 0 0 0 万吨的单细胞蛋白，可供2 0 亿人吃一年【2 】。又如我国每年约产农作物秸杆 和5 亿吨，如果把其中2 0 通过微生物发酵变成饲料，则可获得相当于0 4 亿吨的饲料 粮，相当于目前全国每年饲料用粮的一半。一座年产1 0 万吨单细胞蛋白的微生物工厂， 能生产出相当于1 8 0 万亩耕地生产的大豆蛋白或3 亿亩草地饲养的牛羊生产的动物蛋白 【3 】。 随着生产力水平的提高，轻工业迅猛发展，一方面，提供了丰富的产品，极大改善 人们的生活和物质条件；另一方面，这些工业也产生了大量的工业污染一“三废”， 对环境造成几乎不可挽回的损失，严重威胁着人类的生存。据估计，我国近年工业废渣 年排放量近1 0 亿吨，累计总量己达6 6 亿吨，利用率仅4 0 左右。而其中很多农产品下 脚料没有得到充分的利用，造成了极大的浪费和环境污染，利用这些下脚料发酵来生产 单细胞蛋白饲料是一个很好的解决方案，得到了人们的高度重视。本研究以具有广西资 源优势的木薯渣为唯一原料，通过微生物的转化作用，发酵成为蛋白饲料，对农产品下 广西大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 脚料的应用研究进行了有意义的探讨。 1 1 1 单细胞蛋白质及其特点 1 9 6 8 年，在马萨诸塞技术学院召开的一次会议上用“单细胞蛋白( s c p ) ”这个名 称取代了原有“微生物蛋白”和“石油蛋白”】。单细胞蛋白质( s i n g l ec e l l p r o t e i n ) 指细菌、酵母、霉菌和藻类等单细胞生物的细胞蛋白质。它具有以下的特点【6 】： 1 单细胞生物世代周期短，生长繁殖速度快。在适宜条件下，细菌和酵母的重量 倍增时问是2 0 1 2 0 分钟，霉菌和藻类是2 , - 6 小时。植物l 2 周，牛1 2 个月，猪4 “ 周。据估计，一头5 0 0 k g 的公牛每天生产蛋白质0 4 k g ，而5 0 0 k g 酵母至少生产蛋白质 5 0 0 k g 。 2 营养丰富。单细胞蛋白质中营养丰富，富含必须氨基酸，蛋白质含量可达 4 0 0 一8 0 ，比豆粉约高2 5 ，而且可利用的氮比大豆约高2 0 ，在有蛋氨酸添加时， 可利用氮甚至可高达9 5 以上。表1 1 列出了单细胞蛋白同几种食品蛋白含量和利用率 的比较川。 表1 - 1 单细胞蛋白同几种食品蛋白含量的比较 t a b l e l 一1t h ec o m p a r eo f s i n g l e - c e l lp r o t e i na n ds e v e r a lf o o dp r o t e i nc o n t e n t 3 具有多功能性。微生物菌体蛋白含量高，氨基酸组成齐全，还含有丰富的维生 素，并且有一些微生物在成长过程中还产生胞外酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和辅酶等 生物活性物质。所以，单细胞蛋白饲料不仅为动物提供了必要的蛋白质方面的营养物质， 而且可以防止疾病，提高动物群体的抵抗力，促进动物生长发育。单细胞蛋白也被称为 是安全、可靠、无公害的绿色食品和家畜的保健食品。表1 2 列出了微生物细胞的化学 2 广西大学硕士学位论文术薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 成分分析值i 引。 表1 - 2 微生物细胞的化学成分 t a b l e1 - 2t h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o no f m i c r o b ec e 4 劳动生产率高，培养条件容易控制。生产不受季节气候、土壤和自然灾害的影 响，易于人工控制，可连续生产，成功率高。同时由于在大型发酵罐中立体式培养占地 面积少。 5 原料来源丰富。除了煤炭、石油、天然气、烃及烃的衍生物以外，淀粉及其生 产过程的下脚料、废糖蜜、废酒糟水，某些工业废渣、味精厂废水，纸浆废水、粪便、 秸秆等均可做原料。 6 处理环境污染，实现可持续发展。为了降低生产成本，单细胞蛋白的生产原料 多采用价格低廉的工农业生产的副产品或废弃物下脚料，这样既解决了环境问题，又实 现了产品的增值，变废为宝，一举两得。 1 。1 2 单细胞蛋白研究方向的变化 ( 1 ) 生产原料从矿物产品转向可再生性生物资源。从6 0 年代起，英、美、日、意 等国家都在研究利用石油或石油副产品生产单细胞蛋白，但所生产的单细胞蛋白成本很 高1 9 , 1 0 1 。近十几年来单细胞蛋白又成为人们所关注的研究热点，是因为人们可利用再生 性生物资源生产单细胞蛋白。 ( 2 ) 从单纯生产单细胞蛋白提供饲料，转为消除环境污染、促进资源的多层次利用、 改善生态系统循环、提供新型蛋白质产品几个方面互相结合。单细胞蛋白能否成功地投 入使用其关键是成本问趔埘。 ( 3 ) 从现代技术高度集中的大型厂转向技术要求较低、生产流程和设备简化的中 小型工厂，适于向农村地区推广。例如用粗粮或甜菜、甘蔗、马铃薯等的渣粕进行固体 发酵，微生物繁殖后其蛋白质含量可提高到精饲料水平。原料可就地取材，产品也可就 地使用。 ( 4 ) 从单一生产蛋白饲料，转为生产食用蛋白，直接供人消费，减少畜牧业上物 3 广西大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 质转换的损失。 11 3 固态发酵技术概况 固态发酵( s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n , s s f ) 是指在底物呈固态，虽然含水丰富，但 没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程，底物是不溶于水的聚合 物，它不仅可以提供微生物所需的碳源、氮源、无机盐、水及其它营养物，还是微生物 生长的场所。微生物附着于固体底物颗粒的表面生长或菌丝体穿透固体颗粒基质，进入 颗粒深层生长。固体发酵的应用很广，历史悠久，是一项古老的技术。古代的人类应用 来制干酪食品、面包发酵、制曲酿酒、腌制食品、堆肥生产等方面。随着近代科学技术 的进步和工业生产日益扩大，液体深层发酵技术发展迅速，无论在生产规模和产量方面 都大大超过固体发酵。现代发酵技术的首要条件是纯种培养，不允许自然界的其它微生 物进入，造成杂菌污染，加上现代工业对大规模集约化生产的要求，使固态发酵的生产 应用处于停滞状态，几乎被排斥到现代工业之外。7 0 年代以来，随着世界性的能源危机 的出现和环境保护意识的增强，固体发酵领域的研究出现了翻天覆地的变化。9 0 年代以 来，大约有上千篇论文在国外不同的期刊上发表1 1 1 - 1 5 】，也不时出现一些关于固态发酵某 些特征的综述【1 6 1 。现代固态发酵工程在机质特性、染菌控制、水活度的控制、p h 的控 制、传质与传热等领域的研究取得了较大的进展。 固态发酵虽然有深层发酵不完全、易受杂菌污染、不易监控等缺点，但固体发酵简 化生产工艺，免去液体发酵需脱水、收集、干燥的麻烦程序，有高产、简易、低投资、 低能耗的优点。特别是应用于对废渣废料的处理，易干燥、低能耗、高回收，可把发酵 物包括菌体及其代谢产物和底物全部利用，既保留活性成份又没有废液污染之忧。加之 采用低值糠麸类和废渣粕类为原料，成本低、投资省、原料来源丰富，适合因地制宜发 展，因此近年来我国的固体发酵生产s c p 和m b p 发展很快，产品和数量都已大大超过 液体发酵。此外，由于微生物基因遗传技术的应用，优良菌株的发现和筛选，以及生产 工艺方面的改进，也促进了固体发酵技术的发展 1 7 - 2 0 1 。 固体发酵技术生产s c p 和m b p 的一般生产工艺流程1 2 1 】如图1 一l 所示； 固体发酵生产的主要的过程有：菌种扩大培养、原料预处理、接种发酵、成品包装。 固体发酵的固含物的量大，需要的发酵菌的数量大，一般要达到发酵原料的1 0 以上， 因此菌种需要由单菌培养逐级扩大培养为酵母，菌体的培养对发酵生产甚为重要，要求 4 广西大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 图i - 1 固体发酵的生产工艺流程 f i g i it e c h n o l o g i c a lp r o c e s so f s o l i d - f e r m e n t a t i o n 量大、活性好、抗杂菌能力强，原料经预处理后，调制混合，热蒸汽灭菌，添加无机氮 源、营养盐和某些助剂后，与菌母搅拌混合，进入发酵生产过程。固体发酵通常是需氧 发酵，物料的厚度要适当，要疏松以利通气，发酵过程中会产热，水份蒸发，因此需翻 动，控制通风和空气湿度。 1 2 单细胞蛋白饲料研究发展及概况 单细胞蛋白质的研究与生产起源于英国，1 8 7 9 年英国人就已经开始了面包酵母的培 养生产，这是最早的s c p 生产。二战期间，德国利用造纸废液和木材水解液来培养假丝 酵母以获得菌体蛋白。1 9 5 5 年，菌体蛋白的开发开始引起了联合国蛋白咨询组织的重视， 并制定了s c p 生产的指导性方针。8 0 年代以来，利用各种工农业废弃物生产s c p 的研 究和生产出现。目前，世界单细胞蛋白质产量已经超过亿吨。 我国单细胞蛋白的研究与生产始于6 0 年代圈，但发展缓慢，产量小、水平低，尤 其作为蛋白质饲料的酵母严重不足，必将大大制约我国畜牧业、养殖业的发展。我国的 饲料工业起步于七十年代，改革开放以后，饲料工业得到了迅速发展，但都是以粮食为 主配方的高能、高价饲料，很少进行废物利用。饲料用粮已经超过粮食总量的l 3 田j 。 利用各种不同原料生产单细胞蛋白的研究报告很多，主要有： ( i ) 淀粉原料。以淀粉直接转化微生物蛋白受到世界各国重视。加拿大有用烟曲霉 液体发酵木薯原料( 4 5 ，p h 3 5 ，不灭菌2 0 h ) ，1 升4 木薯干可得到2 4 9 产品，含蛋白 3 7 1 2 4 1 。英国用2 - 5 的大麦粉加入无机盐培养米曲霉( p h 3 5 通气发酵1 2 2 4 h ) ，每k g 广西大学硕士学位论文术薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 大麦可得到0 5 1 k g 的蛋白产品，含蛋白质3 9 4 f 2 5 1 。瑞典的s o r i g o n a 公司用肋状拟内孢霉 和产朊假丝酵母混菌发酵马铃薯淀粉水，获得的产品中产朊假丝酵母占9 8 ，肋状拟内 孢霉占2 ，蛋白质平均含量4 7 ”“。法国也有用固体发酵法，以木薯为原料，不灭菌固 体培养黑曲霉，发酵3 0 h ，蛋白质含量由2 提高至u 2 0 【2 ”。我国已有不少单位研究并获得 成功。如广东微生物研究所开展研究较早分别以木薯淀粉渣和玉米淀粉渣为原料，采用 双菌协生配伍敞开式固体发酵技术生产4 3 2 0 菌体蛋白饲料，使蛋白质含量由6 8 提高到 1 8 - 2 4 ，得率8 0 左右。后来又研制出蛋白质含量高达3 8 - - 4 5 的第二代4 3 2 0 菌体蛋白 饲料。王立梅等【2 8 】利用淀粉副产物混合发酵使粗蛋白含量提高了8 一1 0 。吴南君 2 9 1 以木 薯为原料，发酵产品粗蛋白含量达到3 1 8 8 。赵建国1 利用玉米淀粉渣发酵，粗蛋白从 2 5 5 提高到3 8 2 。 ( 2 ) 糖蜜原料。糖蜜是甜菜制糖、甘蔗制糖的主要副产品。甜菜、甘蔗糖蜜中含有 多种可利用成分，其干物质含量在8 0 - 9 0 之间，其中糖类物质占5 0 左右，是综合利 用发酵生产酵母、酒精、核苷酸等副产品的宝贵资源，而且特别适用于生产单细胞蛋白。 国外对于这种资源的综合利用高度重视，糖蜜发酵生产单细胞蛋白在国外均已实现工业 化，而且生产设备大型化已成为一种趋势。以糖蜜为原料生产单细胞蛋白多采用液体深 层发酵，古巴马坦省的一家酵母工厂日产量4 0 吨，年产量可达1 2 万吨，台湾的酵母产生 厂家日产酵母也可达到4 0 吨，我国目前有容量约6 0 m 3 的流加发酵罐生产商品酵母。但 糖蜜原料目前主要用于生产价值较高的味精、柠檬酸、酒精等，由于价格及经济制约， 由糖蜜生产饲料酵母在成本上没有竞争力。 ( 3 ) 生产味精的废水。据报道，用此液培养产朊假丝酵母，3 0 下，l ：l 通气发酵 1 2 h 达l o g 1 左右，4 吨味精废液可制造1 吨酵母【3 】。 ( 4 ) 纸厂废水及废纸。k c i v a r s o n 等人以耐酸废纸水解生产单细胞蛋白，所得产 品粗蛋白含量为3 5 一4 9 左右。德州市环保监测中心。o 利用产朊假丝发酵亚硫酸造纸液 生产动物饲料添加剂。 ( 5 ) 纤维素原料。纤维素原料是巨大的资源，全世界的绿色植物每年固定的c 0 。大 约为3 3 x1 0 “k g ，所产的有机物大约是2 2 x1 0 9 吨【3 2 】利用植物纤维原料生产蛋白源最早 在1 9 1 0 年，德国h s c h o l l e r 和f b e r g i u s 利用酸水解木材生产饲料酵母嘲。刘坤利用 秸杆降解菌降解秸杆生产单细胞蛋白饲料。8 0 年代起，国内也开始有用拮杆等固体发酵 生产蛋白饲料的报道。钱俊青等p 4 】以树状假丝酵母为菌种，稻谷壳水解液为碳源，蛋白 质含量为6 2 8 。张冬艳等p 5 1 采用绿色木酶与产阮假丝酵母混合发酵生产纤维素酶和单 6 广西大学硕士学位论文术薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 细胞蛋白。还有以甘蔗渣 3 司为原料的研究。 ( 6 ) 果渣原料及罐头厂废料。具报道，日本以柑橘渣为原料，接入产朊假丝酵母固 体培养，蛋白质含量上升至1 8 5 l ”1 。常显波等嘲以鲜节果渣为原料，采用混菌发酵， 使得发酵产物纯蛋白增加了3 3 3 。也有用酶水解柑橘渣液培养酵母的报道。l o o k g h 橘 渣可得4 5 k g 酵母，蛋白质含量达3 0 一5 0 9 6 。b l o c k 曾介绍用橙汁、柑橘渣榨出液合成底物 生产蘑菇菌丝体。果渣等废料作为酵母发酵基质，其前途决定于所产产品的经济价值是 否高于当前的其他产品，另外还必须考虑饲养的效果及抑制因子诸如精油的脱除等问 题。 ( 7 ) 用玉米芯生产单细胞蛋白。我国玉米生产居世界第二，每年玉米收割后的副产 物玉米芯的产量在1 0 0 0 万吨左右，这些玉米芯大部分被弃于田间或直接焚烧。如何利用 可作为再生性资源的玉米芯已引起世界各国科学家的关注。利用玉米芯生产单细胞蛋白 具有很大的开发潜力。林晓艳等【3 9 1 用康宁木霉和黑曲霉混合培养玉米芯酸水解渣，得至 蛋白质含量为2 5 的饲料。 ( 8 ) 其它原料。利用甲醇、乙醇、甲烷和多链烷烃生产单细胞蛋白。6 0 年代英、美、 苏、日相继对石油酵母开展研究和生产，到7 0 年代初转入大规模的生产。还有报道用酒 糟、泥炭原料、酒精厂废水，豆制品厂废水、石油和甜菜废渣等原料生产单细胞蛋白。 1 3 理论基础 1 3 1 糖化酶的作用机理及特点 糖化【4 0 】是利用糖化酶( 也称葡萄糖淀粉酶) 将淀粉液化产物糊精及低聚糖进一步水 解成葡萄糖的过程。糖化过程中葡萄糖含量不断增加，糖化酶对底物的作用是从非还原 性末端开始进行的，属于外酶，一个分子一个分子地切下葡萄糖单位，产生a 葡萄糖。 糖化酶对a 1 , 4 和a 1 ，6 糖苷键都能进行水解。 糖化速度与酶制剂的用量有关，糖化酶制剂用量决定于酶活力高低。酶活力高，则 用量少；液化液浓度高，加酶用量多。糖化初期，糖化进行速度快，葡萄糖值不断增加， 迅速达到9 5 ，以后糖化较慢，达到一定的时间后，葡萄糖值不在上升，接着就稍有下 降。因此，当葡萄糖值达到最高时，应当停止酶反应，否则葡萄糖值将由葡萄糖经a 1 ，6 7 广西大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 糖苷键起复合反应而降低。复合反应发生的程度与酶的浓度及底物的浓度有关。提高酶 的浓度，缩短糖化时间，最终葡萄糖值也高；但酶浓度过高反而能促使复合反应的发生， 导致筒萄糖值的降低。 糖化的温度和p h 值决定于所用糖化剂的性质。采用曲霉糖化酶，一般温度为6 0 c ， p h 值4 o 一5 0 。根霉糖化酶一般在5 5 ( 2 ，p h 值5 0 。在大生产中，根据酶的特性，尽量选 用较高的温度糖化，这样糖化速度快些，也可减少杂茵污染的可能性。采用较低的p h 值 可使糖化液颜色浅，便于脱色。本研究采用的工业糖化酶的最佳糖化温度为6 0 。c 。 采用酶法糖化，糖化液的质量比酸法糖化己大大提高，但由于糖化酶对a 1 。6 糖苷键 的水解速度慢，对葡萄糖的复合反应有催化作用，致使糖化生成的葡萄糖又经a 1 ，6 糖苷 键结合为异麦芽糖等，影响葡萄糖的得率。为了解决这个问题，国外曾报道，在糖化过 程中加入能水解a 1 ，6 糖苷键的葡萄糖苷酶，与糖化酶一起糖化，并选用较高的糖化口h 值( 6 0 6 2 ) ，抑制糖化酶催化复合反应的作用，可提高葡萄糖的产率，所得糖化液含 葡萄糖可达9 9 。而单独采用糖化酶时糖化液含葡萄糖一般都不超过9 6 。 1 3 2 产朊假丝酵母的性质 本研究所用的是一株产朊假丝酵母 4 1 l c a n d i d au t i l i so e 衄e b ) l e tk r e g e rv k 】又 叫产朊园酵母，分类学上属真菌门，半知菌亚门，芽孢纲，隐球酵母目，隐球酵母科， 假丝酵母属。产朊假丝酵母无性繁殖为多边牙殖，细胞圆形、卵圆形或腊肠形，大小约 3 钳5 7 - 1 3 微米，无有性孢子，不产生色素，菌落为乳白色，有或无光泽，边缘整齐 或菌丝状。产朊假丝酵母对葡萄糖、蔗糖、棉子糖能发酵，但不发酵麦牙糖、半乳糖和 蜜二糖。它不能分解脂肪，但能同化硝酸盐。它能够在不需要任何生长因子、只需要少 量氮源的情况下利用造纸工业的亚硫酸盐废液，还能利用木薯淀粉渣、糖蜜渣、土豆淀 粉废液、木材水解液来生产人、畜食用的蛋白。图1 2 是产朊假丝酵母的显微镜下形态 图。 8 广西大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 化 。qo 心0 o 力o0q 0 吣q 伴玲 a p 峪t 1 营养细胞；2 伪菌丝 1 n u t r i e n tc e l l , 2 f a k em y c e l i u m 图1 - 2 产朊假丝酵母的形态图 f i g 1 - 2 t h es h a p e o f c a n d i d a u t i l i s 表1 3 列出了产朊假丝酵母菌体组成 表l - 3 产朊假丝酵母茵体组成 ：! ! ! ! ! ! ：211 1 塑尘p ! ! e i 竺垡! 磐! ! 塑坐i ! i ! 圭垂盛坌! 堑! 堡生耋! 堡墨玺!堑薹壁! 坐g 玺! 水分 5 8 0硫胺素5 3 0精氨酸 3 8 0蛋氨酸o 8 0 灰分9 1 0核黄素 4 5 0胱氨酸o 7 0苏氨酸 2 0 0 磷 1 9 0 呲哆酚 3 3 4 0甘氨酸 o 2 0色氨酸0 7 0 钙0 8 5泛酸3 7 2 0组氨酸 1 3 0缬氨酸2 9 0 粗蛋白4 7 4 0 生物素4 1 7 3 0异亮氨酸 3 7 0苯丙氨酸2 4 0 粗脂肪 4 8 0叶酸2 1 5 0亮氨酸 3 6 0谷氨酸6 9 0 粗纤维0 8 0 赖氨酸4 1 1 1 4 木薯渣的理化性质及利用情况 木薯又名树薯、树翻薯，是世界三大薯类( 木薯、甘薯、马铃薯) 之一，誉称地下 粮食、淀粉之王，主要产于热带地区。在我国主要产于广东、广西、福建等省。在中 国木薯淀粉生产区中，广西的产量居第一，约占二分之一以上，每年广西产量大概为四 十万吨。木薯渣是木薯被提取了淀粉以后的下脚料的混合物，按现在的生产水平测定， 我国每年可产9 2 5 万吨左右的木薯渣( 干物质计) 。 木薯渣蛋白质含量低，粗纤维含量较高，还含有少量的氢氰酸，营养价值低，适1 ：3 9 广西大学硕士学位论文 术薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 其中无氮浸出物中含有的残余淀粉量为5 0 左右。由于木薯渣蛋白含量低，粗纤维 含量较高，目前除极少量废渣直接用作饲料和生产酒精外，绝大部分废渣没有得到利用。 这样不仅造成极大的浪费，而且导致严重的环境污染。 目前木薯渣的主要利用方式如下： 1 木薯渣直接做饲料喂猪。我国现在很多都是将湿木薯渣直接卖给农民或养殖户 当作饲料。木薯渣的主要成分是淀粉和纤维素，少量的蛋白质，养殖户把木薯渣与一些 饲料混合来煮熟后喂猪，但单纯用木薯渣来喂猪或把木薯渣与饲料混煮来喂猪，不仅劳 累费钱，仅能填饱肚子而已，不仅对木薯渣本身的营养消化吸收率极低，且猪不爱吃、 生长缓慢，毛长，得不偿失。特别是许多的养殖户对木薯渣不会贮存，只是堆积在外面 用薄膜简单盖一些，木薯渣在一两天内就变成黄色、黑色( 黄曲霉素污染) ，饲喂动物 后经常引起中毒、发病频繁。 2 用于发酵生产酒精。近年来，国外已研究出利用木薯废渣加工制成酒精，作为 汽油燃料的添加剂，减少污染，效果很好。国内也很多淀粉企业尝试过用木薯渣发酵酒 精，但效益较差，且酒渣又成为二次污染，很多木薯淀粉企业只好放弃。 3 利用生物技术，用单菌种或多菌种采用固态发酵生产单细胞蛋白饲料。这种方 法是现在利用和研究的热门和趋势h 孓4 7 】。 4 木薯渣经化学变性处理后，得到用于石油钻井作降失水剂产品。这对木薯渣的 利用量很小。 5 以木薯渣为原料固态发酵产植酸酶h 8 “9 1 。 6 用于发酵生产柠檬酸。 7 用于蘑菇栽培。 i o 广西大学硕七学位论文木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 1 5 本课题的提出及主要研究的内容 15 1 课题的提出 综上所述，课题的提出有以下几点依据： 1 由于受人多地少、人增地减的基本国情制约，蛋白饲料短缺将成为我国畜牧业 面临的严峻课题，因此迫切需要开发非粮食类的饲料资源。 2 木薯是世界三大薯类之一，全球年产亿吨以上的七大作物之一。它也是我国南 方地区的重要经济作物。木薯产业是广西乃至南宁市的重点支柱产业。我国每年可产9 2 5 万吨左右的木薯渣，木薯淀粉渣中仍残留大量淀粉和纤维，淀粉渣中的淀粉含量达 3 5 4 5 。通过微生物发酵将其转化为蛋白饲料，既可以减少环境污染，还可以变废 为宝，增加收益。 1 5 2 课题的研究内容 本课题包括以下几个方面的研究内容： 1 发酵菌株的筛选。 从淀粉分解菌黑曲霉、工业糖化酶及产朊假丝酵母和白地霉中筛选出适合发酵木薯 渣的组合，作为下面进一步研究的菌株。 2 发酵底物的研究 利用工业糖化酶及产朊假丝酵母组合发酵经过不同方式预处理的木薯渣，得到最佳 的木薯渣预处理方式。底物中分别加入尿素、硫酸铵两种无机氮进行发酵，对发酵产物 粗蛋白含量进行分析，最后确定合理无机氮的添加量。 3 发酵工艺条件的研究 进行了工业糖化酶量、糖化时间、底物含水量、发酵时间、接种量的实验。确定最 佳的发酵工艺条件。 4 研究木薯渣固态发酵动力学。 广西大学硕士学位论文木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 2 1 引言 第二章菌种筛选 菌种的筛选是木薯渣发酵生产蛋白饲料能否成功的关键因素。发酵产品的周期、最 终产品粗蛋白含量的高低和木薯渣的转化利用率最终取决于所选菌种的性能。菌种的筛 选原则除了使用传统的发酵菌株外，所选菌种还必须符合下列条件：( 1 ) 能较好地分解 和利用木薯渣，能以木薯渣为底物进行较好的生长、繁殖。( 2 ) 繁殖速度快，菌体蛋白 含量高。( 3 ) 无毒性和无致病性。( 4 ) 菌种性能稳定。 由于本实验研究作为原料的木薯渣( 干渣) 的含淀粉高达3 9 9 ，而蛋白质含量仅 有2 4 8 ，鉴于木薯渣的成分特点，本研究可行性的关键是必须筛选出淀粉同化能力强 的菌株，先将淀粉糖化分解为葡萄糖。前人的研究表明【3 l ，黑曲霉具有较强的淀粉同化 能力，在木薯渣发酵生产酒精时糖化步骤选用工业糖化霉有较好的效果。在本研究中糖 化步骤选用黑曲霉和工业糖化酶进行筛选，酵母发酵步骤选用购于广东微生物研究所的 白地霉和产朊假丝酵母，经过组合发酵，选出较佳的组合是，用工业糖化酶糖化淀粉， 用产朊假丝酵母发酵。 2 2 实验材料和方法 2 2 1 实验材料 1 菌种：黑曲霉、白地霉本实验室保藏。产朊假丝酵母购于广东微生物研究所。 工业糖化酶由河南洛神生化公司生产，淀粉酶活力为每毫升9 6 万个单位。 2 木薯渣：广西明阳生物股份有限公司提供。 3 培养基： ( 1 ) 黑曲霉斜面培养基 马铃薯斜面培养基：2 0 马铃薯汁l 升，葡萄糖2 0 9 ，k h 2 p 0 43 9 ，m g s o , 7 r t 。01 5 9 ， 硫胺素8 m g ，琼j 旨2 0 9 。 ( 2 ) 酵母培养基 斜面培养基：5 。b e 麦芽汁，琼脂2 ，p h 值自然，1 1 2 k p a 灭菌2 0 m i n 。 广西大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 种子液培养基：5 5 。b e 麦芽汁，p h 值自然，1 1 2 k p a 灭菌2 0 r a i n 。 ( 3 ) 木薯渣发酵底物：尿素1 ，( n h 4 ) 2 s 0 4 2 ，木薯渣：7 k = l ：2 ，p h i l 然，1 2 1 。c 下灭菌2 0 m i n 。 4 实验设备 ( 1 ) 电热恒温培养箱 ( 2 ) 无菌接种箱 ( 3 ) 恒温水浴锅 ( 4 ) 高压灭菌锅 ( 5 ) 电热恒温鼓风干燥箱 ( 6 ) 柜式恒温摇床 ( 7 ) 凯氏定氮仪 5 试剂 尿素、硫酸铵、c u s 0 4 、k 2 s 0 4 、h c i 、h 2 s 0 4 、n a o h 、硼酸、葡萄糖、琼脂粉。 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 实验方案 选择一株淀粉分解菌和一株发酵菌株组合在相同的培养条件下发酵木薯渣底物，测 定发酵产品粗蛋白含量选择出最佳的发酵菌株组合。 表2 1 发酵菌株筛选方案 ：! ! ! ! ! ! ：! ! ! 竺! 塑! ! ! ! 壁垒磐! ! 型竺型! ! 2 2 2 2 工艺流程 采用黑曲霉分解淀粉时：在木薯渣发酵底物中接入l 的斜面黑曲霉孢子液，1 0 的 酵母种子液拌匀，在3 0 的培养箱中培养3 天，放6 0 烘箱中低温干燥，分析粗蛋白含 量。 采用工业糖化酶糖化时的工艺流程图2 1 ： 图2 - 1 发酵工艺流程图 f i g 2 lt e c h n o l o g i c a lp r o c e s so f f e r m c m m f i o n 2 2 2 3 测定方法 1 蛋白质的测定采用微量凯式定氮法【5 0 l 。具体步骤见附录1 2 淀粉含量的测定瞪o 】。具体步骤见附录3 2 3 结果与讨论 按照2 2 2 2 i 艺流程进行实验，结果见表2 - 2 表2 - 2 不同组合发酵菌株的影响 f i 晷2 - 2t h ee f f e c to f d i f f e r e mc o m b i n a t i o n a lf e r m e n t a t i o n 组合a 黑曲霉+ 白地 b 黑曲霉+ 产朊 c 工业糖化酶d 工业糖化酶+ 产 霉假丝酵母 + 白地霉朊假丝酵母 粗蛋白含量 1 3 1 4 8 0“2 0 1 8 5 0 从表中可以看出采用工业糖化酶糖化，产朊假丝酵母发酵粗蛋白含量最高，而其它三个 组合发酵效果不好。因此在后面的实验中选用这个组合发酵。 2 4 本章小结 本章选用了本实验室保藏的淀粉分解菌黑曲霉、工业糖化酶、白地霉和产朊假丝酵 广西大学硕士学位论文木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 母进行组合发酵，通过测定发酵产物的粗蛋白含量来确定最佳的发酵木薯淀粉渣的菌株 组合为：工业糖化酶糖化分解淀粉为葡萄糖为产朊假丝酵母提供营养源。后面的实验都 是采用这个组合菌株发酵。 广西大学硕士学位论文 木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 3 1 前言 第三章原料预处理及初步实验条件探讨 本实验所采用的木薯淀粉渣原料来源于广西明阳淀粉生化股份有限公司。晒干后， 经分析测定，粗蛋白含量为2 4 8 ，淀粉含量为3 9 9 。 底物是微生物赖以生长的能量来源，也是木薯渣微生物发酵生产蛋白饲料是否具有 市场竞争力( 质优价廉) 的关键因素，在以木薯渣为主要原料的前提下，尽量满足以上 两项基本要求是本研究进行配方筛选的基本依据。 微生物生长需要碳源、氮源和微量元素成分。木薯渣微生物发酵生产蛋白饲料所需 的氮源，一是原料中少量的含氮物，原料中的氮多为化合态，需要由微生物分解后才能 被利用；二是所加入的无机氮源，添加无机氮源是生产饲料蛋白的重要手段。 以前文献中多强调碳源和氮源的比例，即c n 的意义，但近来的研究表明，由于发 酵过程的复杂性和微生物种类的多样性，c 瓜没有一个固定的值，但有一点共识，当发 酵产物要求提高含氮化合物时，必须相应增加底物的氮源。j c s e n e z 曾报道，固体发酵 木薯强化蛋白时，尿素和硫酸铵的用量折成硫酸铵高达1 4 4 。墨西哥报道，生产类似 产品时，两种氮源的用量折成硫酸铵高达1 8 2 ，广东微生物研究所研究的4 3 2 0 两种 氮源的用量折成硫酸铵为9 3 1 。其目的都是让微生物在高氮浓度环境中尽可能地利用 碳氮物合成蛋白质。 很多文献【3 】在研究产朊假丝酵母对不同氮源的利用能力实验研究时发现，产朊假丝 酵母对尿素和硫酸铵有很强的同化能力，本章将分别研究适合产朊假丝酵母发酵木薯渣 的尿素和硫酸铵的添加量。以发酵产品中粗蛋白质含量为指标。 3 2 实验材料和方法 3 2 1 实验材料 1 菌株：产朊假丝酵母。 2 酶：工业糖化酶。 3 氮源：尿素，硫酸铵。 1 6 广西大学硕士学位论文木薯淀粉渣制取单细胞蛋白饲料的实验研究 4 底物：木薯渣1 0 0 ，料：水= l ：2 ( 重量比) ，氮源。 3 2 2 实验方法 木薯渣预处理糖化( 3 0 m i n ) + 固体发酵( 3 d ) 烘干卜测粗蛋白 3 3 结果及讨论 3 3 1 木薯渣预处理方式的确定 将木薯渣底物采用生料、