（应用化学专业论文）脂肪酶固定化及其应用研究.pdf

摘要 脂肪酶固定化及其应用研究 s t u d yo n i m m o b i l i z a t i o no f l i p a s e a n di t sa p p l i c a t i o n 硕士研究生：虞英导师：蒋惠亮专业：应用化学 摘要 本论文主要对脂肪酶的固定化、有机相中固定化脂肪酶催化特性、固定化脂肪酶催 化合成棕榈酸异辛酯的应用进行了研究。其主要内容如下： 一脂肪酶的固定化：本文以d 3 1 1 离子交换树脂为载体，通过离子交换吸附法对 l i p o l a s ei o o l 脂肪酶进行了固定化。采用考马斯亮蓝法测定了酶蛋白在离子交换树脂上 的吸附率，考察并得到了酶固定化的最佳条件：在p i l l 0 缓冲液下，加酶液量为每克预 处理过的树脂加入1 5 m l ，吸附时间为l o h ，吸附温度为3 5 。脂肪酶在非水相系统中 具有水相反应所不具备的很多优点，将所得固定化酶用于催化合成月桂酸月桂酯，考察 了非水相中固定化脂肪酶催化酯化反应的特性，从反应温度、酶用量、最佳水含量、溶 剂、底物酸醇摩尔比等方面对反应进行了全面的研究。在月桂酸月桂酯合成反应中，酸 醇摩尔比为0 2 ：0 2 ( m 0 1 l ) ，最佳固定化酶初水含量为8 ，在最佳反应介质异辛烷中 固定化酶用量为2 0 0 m g ，反应时间为2 1 0 m i n ，5 5 的最佳反应温度条件下，酯合成反 应的转化率可达9 1 3 ，得到的固定化脂肪酶的催化反应活化能e a 为1 9 o o k j m o l 。反 应的最佳酸醇摩尔比为1 ：2 。将固定化酶在4 下放置2 个月，酶活损失很小，贮存稳 定性较好。 二固定化脂肪酶连续化催化性能研究：根据自制固定化脂肪酶及载体的特征，采 用简易的p b r 生物反应装置，实现了固定化脂肪酶对月桂酸月桂酯的连续化反应。考 察了底物进料速度、催化剂装载量对催化反应的影响。当月桂酸、月桂醇底物浓度均为 0 4 m o l l 时，得到的最佳流加速度为1 0 m l h ，最适装载量为6 9 。将固定化脂肪酶用于 催化月桂酸月桂酯反应的全过程，每次以反应平衡后再反应1 h 计，重复6 0 次，酶活力 还保留达8 9 8 2 。 三固定化脂肪酶催化合成棕榈酸异辛酯的应用：实验结果表明自制的固定化脂肪 酶l i p o l a s e 在最佳的棕榈酸和异辛醇的摩尔比为1 ：1 5 ，反应温度为4 0 的条件下，棕 i 江南大学硕士学位论文 榈酸异辛酯的合成反应能很好的实现。通过气相色谱分析，采用相对面积法，得到酯合 成的转化率为9 7 9 1 关键词：脂肪酶；固定化；离子交换树脂；酯化 a b s t r a c t a b s t r a c t 1 1 地i m m o b i l i z a t i o no fl i p a s e i t sc a t a l 蛳cc h a r a c t e r i s t i c si n o r g a i l i cs o l v e n t , t h e s y n t h e s i so f i s o o c t y lp a l m i t a t c ( 1 0 p ) b yi m m o b i l i z e dl i p a s ew e r es t u d i e d m a i np o i n t sa r ca sf o l l o w s ： 1 i m m o b i l i z a t i o no fl i p a s e ：1 1 1 ei m m o b i l i z a t i o no fl i p a s c ( l i p o l a s c1 0 0 l 1w i t hi o n e x c h a n g er e s i nb yi o ne x c h a n g ea d s o r p t i o nw a ss t u d i e d t h ea d s o r p t i o nc a p a c i t yo ft h e f f l l z y i i l e $ o nt h ei o ne x c h a n g e rw a sm e a s u l e db yb r a d f o r dm e t h o d t h ec o n d i t i o n sf o rt h e i m m o b i l i z a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o s to fe l l z y l l l ew a s i m m o b i l i z e dw h e nl 5 m l l i q u i dl i p a s ew a sa d d e d i n t oo n eg r a mo f p r e t r c a t e dr e s i n , s t i r r e df o r 1 0h o u r sa t3 5 ci nb u f f e ro f p i l l 0 t h e r ea t en 1 1 l 丑e r o l i sa d v a n t a g e so f c o n d u c t i n ge n z y m a t i cc o n v e r s i o n si no r g a n i cs o l v e n t s o v e ri nw a t e r n l ec a t a l y t i cb e h a v i o r sw e ! l e i n v e s t i g a t e d , i n c l u d i n g t h ei n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r e ，t h ed o s a g eo f i m m o b i l i z e dl i p a s e ，w a t e rc o n f c n t ，o r g a n i cs o l v e n ta n dt h er a t i oo f l a u r i ca c i dt ol a u r y la l c o h 0 1 nw a sf o u n dt h a tt h ey i e l do f t h ee s t e rr e a c h e d9 1 3 w h e nt h e r a t i oo fl a u r i ca c i dt ol a u r y la l c o h o lw a s0 2 ：0 2 ( m o v l ) t h ed o s a g eo fi m m o b i l i z e dl i p a s e w 舔2 0 0 r a gi n5 0 m li s o o e l a l l ea t8 o fw a t e l c o n t e n ta n da t5 5 a f t e r2 1 0 r a i ni nw h i c h o b t a i n e de ai s1 9 o o k j m 0 1 t h eo p t i m a lr a t i oo fa c i dt oa j c o h o li s1 ：2 a f t e rt w om o n t h s r e s e r v e di n4 c ，t h er e s i d u a la c t i v i t yo f i m m o b i l i z e dl i p a s ew a ss t i l lh i 班 2 s t u d yo ft h ec o n t i n u e sc a t a l y t i cc h a r a c t e r i s t i c so fi m m o b i l i z e dl i p a s ei no r g a n i c s o l v e n t ：a c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e r i s t i c so f p r e p a r e di m m o b i l i z e dl i p a s ea n ds u p p o r t ，s i m p l e p b rb i o - r e a c t o rw a sa p p l i e di nc a t a l y s i so fe s t e r i f i c a t i o n s p e e do fs u b s t r a t ca n dc a t a l y s t o a a i n gw e l es t u d i e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s u - a t ew a so 4 m o l l t h eo p 缸l a ls p e e do f s u b s t r a t ca n dc a t a l y s tl o a d i n gw e r e1 0 m l ha n d6 9r e s p e c t i v e l y a f t e rb e i n gr e u s e df o r6 0 c y c l e s ，t h er e m a i n i n ga c t i v i t yo f i m m o b i l i z e dl i p a s ew a ss t i l la b o u t8 9 8 2 3 a p p l i c a t i o no fi m m o b i l i z e dl i p a s ei nt h ec o n t i n u e ss y n t h e s i so fi s o o c t y lp a l m i t a t e ： 皿er e s u l t ss h o w e dt h a ti tc a nb ea p p l i e ds u c c e s s f u li nt h es y n t h e s i so fi o pa tt h eo p t i m a l r a t i oo f a c i d t oa l c o h o l ( 1 ：1 5 ) a n dr e a c t i o n t e m p e r a t u r e a t 4 0 c t h e y i e l do f t h ee s t e fr e a c h e d 9 7 9 1 b yg a sc h r o m a t o g r a p h y k e yw o r d s ：l i p a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；i o ne x c h a n g er e s i n s ；e s t e r i f i c a t i o n i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：日期： d 7 年6 月易日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：二车垒叟导师签名：二趁 、 日期：p 年b 月寥日日期：p 夕年月汐日 驻 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 酶作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性。近十年来， 随着生物技术的发展，酶催化反应作为一种有效的手段越来越多地被有机化学家用于有 机合成，并应用于医药、农药、日用化学品等部门。 目前，有2 0 0 0 种以上的酶己被人们认识，其中2 0 0 多种已有市售。用于有机合成 中的酶大多数是脂肪酶和蛋白酶，尤以脂肪酶的应用更引人注目。 脂肪酶是一类糖蛋白，其分子量在1 0 ，0 0 0 1 0 0 ，0 0 0 左右，糖基部分约占分子量 的2 1 5 ，主要成分是甘露糖。一般认为，脂肪酶是两极性分子，这是脂肪酶区别 于其它酶的显著特点，该界面对脂肪酶具有界面活化作用o n t e r f a c i a la c t i v a t i o n ) 。近些年， 对脂肪酶结构，特别是对脂肪酶三维结构的研究，使人们对脂肪酶作用的理解取得了很 大的进展。 脂肪酶的天然底物是甘油酯类。然而研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合 物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、 聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体 的拆分【l 】和手性药物的合成 2 1 成为酶工程领域研究的新热点。因而脂肪酶及其改性制剂 在食品与营养、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的 合成以及药物合成等许多领域得到广泛应用。 1 2 应用于非水相脂肪酶酶促反应的固定化研究 非水酶学的诞生虽然只有十几年的历史，但在其理论研究方面已经取得了很大的进 展。非水相中酶促反应的研究，不仅为酶学研究注入了生机和活力，而且拓宽了酶的应 用范围和领域。近些年来，众多的研究报道和综合评述展示了非水相中的酶优于水相中 的酶的巨大应用潜力。但由于酶在溶剂中不溶解，在反应过程中容易结块，大大降低了 酶的利用率，如果将酶固定化在惰性载体上，则可以提高酶在溶剂中的扩散效果和热力 学稳定性，调节和控制酶的活性与选择性有利于酶的回收和连续化生产。 1 2 1 脂肪酶的固定化方法 目前对固定化酶在非水相中的应用已作了许多研究。几乎所有的固定化方法都可以 用来制备非水相酶促反应的固定化酶，但由于酶在溶剂中不同于水中，不存在脱落流失 问题，因此吸附法最为常用。吸附法通常有四种形式： 1 ) 水相固定化法。这是最常见的吸附固定化方法，即将脂肪酶溶解于缓冲液中， l 江南大学硕士学位论文 加入载体，振荡或搅拌一定时间后，抽滤、洗涤、冷冻干燥，得固定化酶。此法制得的 固定化酶活力一般都很低，绝大部分脂肪酶仍留在缓冲液中，随着载体疏水性的增强其 固载酶的能力有所增强。 2 ) 载体表面涂布法【3 朋。即将脂肪酶溶入少量缓冲液中，加入载体，混合均匀，冷 冻干燥，得固定化酶。此法相当于直接将酶涂布于载体上，避免了水相固定化中酶的大 量流失，所得固定化酶活性与载体性质有关，选择适当的载体可以获得较高的酶活，适 于非水相酶促催化反应。 3 ) 溶剂沉淀法【3 l 。即在低温下向含有载体的脂肪酶液中加入酶的有机沉淀剂( 如丙 酮) ，使酶析出，沉淀在载体表面。此法所得固定化酶酶活较高，载体性质与固定化无 明显影响，但酶在载体表面分布不均匀，在非水相中有碍于脂肪酶活力的正常发挥。 4 ) 游离固定化法【卯。即将具有一定亲水性的载体分散于疏水溶剂中，加入酶液( 酶 粉溶入少量缓冲液中) 。振荡或搅拌一定时间后，便得固定化酶【6 l 。其原理是：亲水性载 体可在其表面形成一层水膜，酶分子不溶于溶剂，只能存在于这层水膜中，因而可以完 全被固定化。这种方法不需要任何键合手段就可以将酶固定化在载体上，是一种在微水 环境中有效固定化方法。 以上所涉及到的固定化方式，都是直接将酶固定化到载体上，而也有研究报道采用 两种或两种以上固定化方法来固定化脂肪酶，效果也很明显。如m b a s i l 等人【7 j 将c a n d i d a r u g o s a 脂肪酶用单甲氧基聚乙二醇修饰后固定化到有机聚合珠上。在酶活力方面，修饰 酶比未修饰酶提高了3 倍，而固定化修饰酶则提高了1 8 4 倍。这是由于脂肪酶在修饰之 后，由亲水性变成了疏水性，而溶于疏水溶剂中，使酶在溶剂中有更好的伸展性。这不 仅增加了酶周围的底物浓度，而且也大大降低了底物进入酶活性中心的阻力。王芳芳等 人【8 i 以离子交换树脂作为固定化载体，戊二醛为交联剂，采用吸附交联相结合的方法制 各固定化酶。在流动过程分析中，此法得到的固定化酶与用吸附法制得的相比，具有更 好的热稳定性和耐冲刷性。 1 2 2 固定化酶的性质嗍 由于固定化也是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其 催化作用由均相变为异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配 效应等因素必然对酶的性质产生影响。 1 ) 固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。在同一测定条 件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：乱酶分子在固定化过程 中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；b 固定化后，酶分子空间自 2 第一章绪论 由度受到限制( 空间位阻) ，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；c 内扩散阻力使 底物分子与活性中心的接近受阻；d 包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不 能通过膜与酶接近。 不过也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶 得到化学修饰，或固定化过程提高了酶稳定性。 2 ) 固定化对酶稳定性的影响 在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加，表现在固定化酶的热稳定 性，对各种有机试剂及酶剂的稳定性，对不同p h 稳定性、贮存稳定性、操作稳定性都 有所提高。 j 固定化后酶稳定性提高的原因可能有以下几点：a 固定化后酶分子与载体多点连接， 可防止酶分子伸展变形；b 酶活力的缓慢释放；c 抑制酶的自降解，将酶与固态载体结 合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。 3 ) 固定化酶最适温度变化 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳 定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，陈盛等人【1 0 】用戊二 醛作交联剂，将碱性脂肪酶固定于壳聚糖上，研究结果表明原酶在常温下2 5 活力较大， 而固定化酶则在较高温度( 3 5 ) 下表现较大的活力，且在2 5 5 0 下，均有较高的酶 活力。这说明该碱性脂肪酶经壳聚糖固定化后理化性质得到改善，特别是热稳定性明显 优于原酶。 4 ) 固定化酶的最适p h 变化 酶固定化后，对底物作用的最适p n 和酶活力一p h 曲线常常发生偏移。偏移的原因 是微环境表面电荷性质的影响。一般说来，用带负电荷载体( 阴离子聚合物) 制备的固 定化酶，其最适p h 较游离酶偏高，这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中的阳离子， 包括旷，使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层矿浓度比周围的外部浓度高， 即偏酸，这样外部溶液中的p h 必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出酶 的最大活力。反之，使用带正电荷的载体其最适p h 向酸性偏移。 5 ) 固定化酶的米氏常数( k i n ) 变化 固定化酶的表观米氏常数k m 随载体的带电性能变化。当酶结合于电中性载体时， 由于扩散限制造成表观k m 上升。而酶与带电载体结合时，由于高级结构变化及载体影 响引起酶与底物亲和力变化，从而引起k i n 变化。如载体与底物相同，会造成固定化酶 的表观k i n 值显著增加。这种变化又受溶剂中离子强度的影响：离子强度升高，载体周 围的静电梯度逐渐缩小以至消失。 3 江南大学硕士学位论文 1 3 非水酶学 所谓非水酶反应或微水酶反应并没有严格的含义界定。广义的说，对于与水互溶的 反应介质而言，指的是反应体系中含有很少量的水；对非互溶性溶剂指的是水的存在没 有导致分层现象的出现【1 1 】；含水量很低的无溶剂( s o l v e n t - f r e e ) 反应体系【1 2 】以及不同于 传统介质的离子液( i o n i cl i q u i d ) 体系【1 3 】等都属于微水反应体系界定的范畴。传统意义 上的酶催化反应是以水为介质的，可是近来发现酶催化反应可以在有机溶剂、气体、超 临界流体等许多介质中进行。特别是k l i b a n o v 等人【1 4 1 研究开启了非水酶学研究的先河。 有机相中酶促反应成为研究的热点，除了具有水相中酶的催化优点外，还具有以下特点： 【1 5 1 6 】 乱使反应热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酯合成、肽合成、酯交换反 应等。 b 酶不溶于有机溶剂，容易回收再利用。 c 从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。 d 酶的热稳定性比水中要高。 e 固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面，在无水介质中酶不易脱离吸附表面。 增加了非极性底物的溶解性，有利于高浓度底物连续生物转化。 g 抑制与水有关的副产物。 h 没有微生物污染。 i 有着广泛的底物专一性。 目前，不论出于学术还是工业考虑，由于其在食品、医药及油脂化学品方面的巨大 的应用潜力，有机介质中的生物催化研究都是值得关注的焦点【1 7 】。 对微水反应体系而言，除了酶本身外。水活度、酶固定化载体和溶剂的性质是影 响反应的最重要的因素。 1 3 1 系统含水量 在有机溶剂中的酶的催化活性与反应系统的含水量密切相关。系统含水量包括与酶 粉水合的结合水，溶于有机溶剂中的自由水以及固定载体和其它杂质的结合水。与酶结 合的水量是影响酶的活性、稳定性以及专一性的决定因素。要成功地应用非水介质中的 酶催化反应，控制酶结合的水量和水在酶分子中的位置是关键。在基本无水的有机溶剂 中，水对于酶催化活性构象的获得与保持是必须的。大量的研究表明：在有机溶剂中， 酶的催化活性与反应系统的含水量有着密切的联系。水直接或间接参与维持蛋白质结构 的氢键、疏水作用和范德华力【l ”。 在有机溶剂中对于酶的催化活性存在一最佳含水量，含水量低于最佳值时，酶的构 象过于“刚性”而无法表现催化活性；含水量高于最佳值时酶的结构柔性较大，酶的构象 4 第一章绪论 趋于疏水环境中的热力学稳定的状态变化，导致酶结构改变和失活。只有在最佳水含量 时蛋白质结构的动力学刚性( k i n e t i cr i g i d i t y ) 和热力学稳定性( t h e r m o d y n a m i cs t a b i l i t y ) 之 间达到最佳平衡点( 见图1 1 ) ，酶表现出最大活力。最佳含水量是保证酶的极性部分水 和表现活力所必需的“必需水”( e s s e n t i a lw a t e r ) ，是用于维持活性构象的柔性所必需的。 各种酶因其结构不同，维持酶具体活性构象所需的必需水量也是不同的【。例如：a 一 胰凝乳蛋白酶的每个分子需要十个水分子才能活化。少于或高于其必需水的含量都会造 成酶构象的变化，而影响酶的催化活性【1 9 1 。 有机溶剂体系中酶催化活性的高低与酶分子结合水的多少直接相关，而与体系中总 的水含量及所用溶剂无关，因此要以水活度( ) 为研究参数。水活度定义为：在一定温 度和压力下反应体系中水与纯水逸度之比，水的逸度在理想条件下可以用水的蒸汽压代 替，因此可以用体系中的水的蒸汽压与同等条件下纯水的蒸汽压之比来表示。水活 度的大小直接反映出酶分子上水分的多少，与体系的其他因素无关，且各相的水活度相 等嗍。 蕊 活 性 1 3 2 载体的影响 水量 热力学不稽定性 图1 1 有机溶剂中酶活性与酶含水量的关系 用于非水相的固定化载体的选择与水相有所不同，最重要的是：应该满足酶在非水 相反应中所需的最适微环境和有利于酶的扩散与稳定。载体对酶活的影响可归结为以下 三点： 1 ) 对酶分子结合水的影响。酶发挥催化功能所需的结构与构象必需是既“紧密”又有 “柔性”。“紧密”状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，“柔性”状态则取决于水分子与蛋 白质分子的功能团形成的分子间的氢键，它破坏了蛋白质分子内氢键，使蛋白质结构变 得松散呈一种“开启，状态。酶分子的“紧密”和“开启，这两种状态处于一种可动的平衡中， 江南大学硕士学位论文 表现出一定的柔性( 图1 2 ) 【2 l 】。亲水性强的载体，与水形成氢键的能力强，使图1 2 中的平衡向左移动，酶分子变得更紧密，如罩子一样将酶的活性中心罩在里边。酶活力 下降甚至失活。疏水性载体则相反，它可以很好地保持这种平衡，使酶在非水相中表现 出很高的活性。如我们用硅胶固定化的c a n d i d al i p o l y t i c a 脂肪酶合成月桂酸丙酯，在无 水体系中，酸转化率为5 5 而如果向反应体系添加一定量的水，酸转化率升至8 1 。这 些变化便是由硅胶较强的亲水性造成的。r e s l o h 脚。m a t t i a s s o n f 2 3 , u 和a d l e r c r e u t s 2 5 捌研 究了载体的亲水性对固定化酶在非水相中酶活性的影响，他们首次用分配到载体上的水 量与溶剂中的水量之比0 9 a q ) 代表载体的亲水性，研究了1 3 种载体的l g a q 值与这些载 体的固定化酶在非水相中催化活力的关系，并指出：低l g a q 值的载体有利于固定化酶 在非水相中催化活性的表现。 l g a q 值是固定化材料上水量与溶剂中水在标准条件下的比值。它不是一个真实的 分配值，因为它决定于载体材料，溶剂的种类和相对数量。高l g a q 值的载体是亲水性 的，具有争夺酶必需水的能力。酶活性一般在低l g a q 值载体上较高，如硅藻土。在研 究中还发现，即使向固定化酶中加入水，高l e , a q 值载体上的酶催化效果仍然不同，这 说明除了水在酶与载体上的分配外，还存在着其它作用 2 7 1 。实际上，在固定化过程中， 水的需要量由酶分子、载体、缓冲液及其它添加剂的吸水量决定。酶源不同，需要的水 量会有差别，例如在c t w 为0 1 2 时，m i e h e i rr 脂肪酶固定在阳离子树脂上，表现出其 最大活力的4 0 ，而h u m i c o l a 脂肪酶需要在c t w 为0 4 时达到相同的活力水平 2 8 】。 2 ) 对底物和产物在非水相和微环境中分配的影响。载体的亲水性对底物和产物在 非水相和酶微环境中的分配有很大影响。如图l 一3 当底物的疏水性较强时，疏水性载体 通过疏水作用使底物顺利地进入微环境，增大与酶接触的机会，有利于酶催化活力的充 分表达；当底物亲水性较强时，应对载体的琉水性进行优化，在保持酶较高催化活力的 前提下，提高载体的亲水性，以减小底物在载体上的扩散阻力。如曹淑桂等人【1 6 】合成了 具有双亲分子( 聚乙烯亚胺) 的海藻酸钙固定化载体，该载体固定化的e x p a n s i o n p e n i c i l l i u m 脂肪酶在非水相中催化酯合成和酯交换的活力比其未固定化的酶粉分别提高 了2 0 和“倍。 尺 = = = 自冉 蛋自质分子内氢键 置自质分予问玺键 一表示氢键 图1 2 蛋白质分子内氢键和分子间氢键 6 第一章绪论 嬖水桕 图1 3 固定化酶的微环境 霉 农 船 3 ) 载体对脂肪酶酶促反应动力学的影响。酶被固定化到载体上之后，一方面，提 高了酶的扩散效果；另一方面，酶与载体发生了相互的作用，使酶的构象发生了变化， 同时对酶产生了立体障碍和微扰效应，相应地改变了酶反应的动力学。如寇秀芬和徐家 立p 埔山梨醇和油酸合成山梨醇油酸酯时脂肪酶在固定化前，几乎不发生酯化反应，而 固定化之后，则表现出很高的酯化活力。m a n f r e dt r e e t z 等人【那将脂肪酶包埋固定化酶 后，酯化活力提高了8 8 倍。另外，载体还能提高酶的选择性，如m a h i r a nb a s i l 等人口l 】 将c a n d i d ar u g o s a 脂肪酶固定化在三种不同的载体上之后，变表现出对不同链长的脂肪 酶、醇的选择性。 对固定化载体的选择，除上述三方面因素外，还要考虑诸如载颗粒大小、表面积、 孔径等因素【3 2 】。 1 3 3 有机溶剂的影响 理论上，酶催化活力与体系中总的水含量及有机溶剂性质等因素无关，但事实上， 由于体系中的水会在溶剂、酶、底物及产物之间进行分配郾】，因而体系中溶剂的性质对 结合于酶分子的水量有直接影响。 疏水性强的溶剂是较好的酶反应介质，由于疏水作用，使其所需较低水量即可满足 酶对水分的需求，它不易争夺水，最有利于保持酶分子的必需水，使酶维持天然构象， 而亲永性越强的溶剂越容易争夺水，夺走酶蛋白周围的水合层，故要求较高的水含量， 以防止酶脱水、维持酶活力。 人们一直试图找到一个能够将酶的催化反应活性与溶剂的性质相关联的参数，然而 至今没有一个单一的参数能够适用于所有的酶反应体系。事实上某一反应体系最适溶剂 的选择还是主要依赖于经验。有机溶剂中酶的催化活性与有机溶剂的亲水性呈负相关性 嗍，添加微量水到含酶的疏水性有机溶剂中或用其他方法提高体系的水活度，可使酶的 7 江南大学硕士学位论文 催化活性升高，但是因为酶的溶剂化作用，a w 不能准确预测极性有机溶剂对酶活性的 影响。为了衡量酶与有机溶剂分子的兼容性，寻找能使酶发挥最高活性的有机溶剂，最 常采用、最可靠的表达溶剂性质的参数是分配系数的对数值1 妒，l g p 是描述有机溶剂极 性大小的参数，p 值是溶剂在正辛醇和水中的分配系数比，1 9 p 越大，溶剂的疏水性就 越强。l 醇值在0 3 的溶剂不宜作为酶催化反应的非水介质溶剂，一般认为，酶在疏水 性的介质中反应活性高，因此酶催化反应在非极性或与水不混溶的疏水性有机溶剂中更 易进行。实验表明，无论是酵母脂肪酶自由酶还是固定化酶，随着l g p 值的增大，酶促 反应的初速度也增大；并且只有在l g p 值较大的溶剂中，反应才进行得较为完全。i a i m c 等p 剐提出了一条利用溶剂的l o gp 值预测酶活性的简单规则。一般而言，酶在l o gp 值 电的亲水溶剂中反应活性较低；在2 l o gp 4 时反应活性较 高。j 目l l m c 等认为。亲水性的溶剂的溶剂化作用较强，能够剥离维持酶活性的必需水； 疏水性的溶剂不能产生较强的溶剂化作用，因而酶结合的必需水得以维持。 脂肪酶对于溶剂性质的敏感性取决于不同得来源。水分子与猪胰脂肪酶结合得非常 牢，亲水性溶剂很难将它的结合水夺走；而“必需水”与酵母脂肪酶结合的非常松，很容 易进入到与水混溶的溶剂中而使酶的活性大大降低。因此，有机溶剂与酶的结合水之间 的相互作用比溶剂与酶本身的相互作用更为重要。 在非水相酶催化反应中，溶剂对底物的溶解和产物的下游工程也有很大影响。对于 某些酶促酯化反应，疏水性溶剂对亲水性底物很难溶解，不利于酶与底物的接触，影响 了酶活性的正常发挥；而亲水性较强的溶剂虽然能溶解底物，但酶在其中的活性却很低。 此时采用一般的溶剂相反应很难达到理想的效果，必须重新构筑反应体系，通常还有另 外两种体系：( 1 ) 混合溶剂体系。一般由疏水性的主溶剂和亲水性的助溶剂组成，助溶 剂起增溶底物的作用，而主溶剂起维持反应体系疏水环境的作用。( 2 ) 无溶剂体系。即 不采用溶剂，直接转化底物。在食品。医药等行业，有时对产物纯度的要求很高，为避 免溶剂残留或由溶剂带入有害杂质，便可采用无溶剂体系。 1 4 有机溶剂中脂肪酶催化反应的应用 脂肪酶在有机相中可催化的酶催反应有：酯合成、酯交换、肽合成、酯聚合、酰化 等( 见表1 1 ) 。其中有些己广泛的应用于精细化工、医药、食品、新材料的研制与生产 中。目前成功的例子很多，如： ( 1 ) 生物燃料在传统工业中将蔬菜油( 向日葵油、菜籽油、豆油) 在酒精中加热 至1 0 0 2 0 0 c 发生醇解制得。但由于回收甘油困难，且要移走盐的残余物，因此过程耗 能高。而利用酶催化生物合成特殊位点的烷基酯，甘油容易回收，_ k n 肪酶可将其他功 能基团引入烷基进一步提高最终生物燃料的冷却温度；而且此项技术也适用于润滑油。 因此在工业上应用脂肪酶合成脂肪酸烷基酯越来越有吸引力一由于乙醇可以大规模的生 产，且比甲醇的毒性小，适于用于燃料的底物。因此目前广泛合成乙基酯作为生物燃料 第一章绪论 【3 5 】。 ( 2 ) c a n d i aa n t a r c t i c a 和h u m i c o l a 脂肪酶可以催化酯的氨解反应生成相应的酰胺 【3 q 。因此在非水相中可以使甘油三酸酯或脂肪酸酯在酶的作用下发生氩解反应生成酰 胺。由于这些氨基酸酯、酰胺具有良好的乳化、生物可溶性、抗微生物的能力，因此广 泛应用于化妆品、生活用品、食品和药品上，还可作为工业上的去垢剂、家庭用的清洗 剂等；由于它们是利用可再生的廉价原料并且能快速完全的生物降解，对环境无害。另 外可以通过氨基酸结构的差异控制表面活性剂的功能性质，以满足特殊的使用要求，因 此用天然油脂获得表面活性剂产品受到人们的重视。 ( 3 ) 利用酯交换反应，将廉价的油脂改良为具有特殊功能性质的高品位油脂。棕 榈油是当今世界产量第二的植物油，其产量稳定、价格便宜。但品位较低，主要用作油 炸食品用油。，其中熔点物p o m f 的主要成分是l ，3 二棕榈酰一2 油酰甘油酯( p o p ) ，在 1 ，3 位专一性的r h i z o p u sd e d e m a r 脂肪酶的作用下与硬脂酸或其甲酯进行酯交换，产物 以p o s 和s o s 为主，分提后得到的油脂的组成和性质与天然可可酯极为相似p 7 i 。这是 无溶剂体系酶催化对油脂进行改良的最成功的应用。 表1 1 脂肪酶在非水相中制备有机物质的重要应用 1 5 立题依据和主要研究设想 脂肪酶能在油一水界面上催化酯水解或醇解，酯合成，酯交换，内酯合成，多肽合 成，高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前被重点研究的酶催化剂。虽 9 江南大学硕士学位论文 然游离的脂肪酶催化技术成熟，但酶不能重复使用，难以实现过程的连续化，因此脂肪 酶的催化技术的工业化很大程度上取决于酶的固定化。固定化技术使生物催化剂具有与 其游离状态下完全不同的特点：生物催化剂可以回收或循环使用；生物催化剂的稳定性 大大的提高；产物分离方便；反应过程可以严格的控制等，这些优点使价格昂贵的生物催 化剂的成本大大的降低，从而使其在工业化生产中得到应用成为可能。 目前固定化酶的方法很多，但在非水相酶促反应中酶在溶剂中不同于在水中，不存 在脱落流失问题，因此吸附法最为常用。此法具有操作简单、条件温和、固定化载体可 重复使用、酶活力高、酶对底物专一性不发生变化等优点。 自1 9 7 8 年就有离子交换树脂作为载体的相关报道。由于离子交换树脂是工业生产 中大量使用的材料，其价格低廉，机械强度好，物化性能稳定，容易再生，作为固定化 载体使用有广阔的应用前景 4 2 , 4 3 。 本课题主要采用阴离子交换树脂对l i p o l a s e 碱性脂肪酶进行固定化，重点研究其最 优固定化条件和固定化酶的催化性能，并将其应用于固定床催化反应棕榈酸异辛酯的合 成。 1 0 第二章离子交换树脂固定化脂肪酶 2 1 引言 第二章离子交换树脂固定化脂肪酶 近年来，随着绿色化学的兴起和对节能环保的重视，有机相酶催化在有机合成中的 应用越来越受到人们的青睐。脂肪酶是一种重要的生物催化剂，在食品、皮革、医药和 洗涤剂等许多工业领域中均有广泛应用 4 4 , 4 5 1 。利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以 合成许多高附加值产品。李瑞等【蛔研究了有机相脂肪酶催化合成共轭亚油酸b 谷甾醇酯 的工艺条件，用高效液相色谱测定脂肪酶催化合成甾醇酯的酯化率，最高可达7 2 6 3 。 赵庆节等【4 7 】在有机相中用大孔吸附树脂固定化脂肪酶拆分消旋萘普生，利用固定化脂肪 酶在有机相中能有效地选择性催化s 一萘普生与正辛醇发生酯化反应，实现消旋萘普生 的拆分。 酶催化反应具有条件温和、能耗低、催化效率高、质量好等优点。但由于脂肪酶是 水溶性的，在有机相中只能得到分散，不易回收重复使用，将脂肪酶固定于离子交换树 脂上，可克服这些缺点i 蜘。又由于离子交换树脂是工业生产中大量使用的材料，其价格 低廉，机械强度好，物化性能稳定，容易再生，作为固定化载体使用有广阔的应用前景。 此法处理条件温和，酶活力损失少，载体与酶分子的结合力较物理吸附法牢固【4 9 1 。本章 采用d 3 1 1 弱碱性阴离子交换树脂进行脂肪酶的固定化，并采用由此法得到的固定化酶 为催化剂合成了月桂酸月桂醇酯。实验结果表明，吸附法固定脂肪酶方法简便，酶活损 失少，催化效率高，便于回收利用。 2 2 实验药品及主要实验仪器 2 2 1 实验药品 药品名称 液体脂肪酶l i p o l a s e1 0 0 l d 3 1 1 离子交换树脂 氢氧化钠 盐酸 甘氨酸 考马斯亮蓝g 2 5 0 规格生产厂家 1 0 万u n i l n o v o z y m e s 公司惠赠 江苏苏青水处理工程集团有限公司惠赠 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 国药集团化学试剂有限公司 a r国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 江南大学硕士学位论文 9 5 乙醇 浓磷酸 异辛烷 月桂酸 十二醇 正己烷 环己烷 苯 酚酞 2 2 2 主要实验仪器 国药集团化学试剂有限公司 a r 国药集团化学试剂有限公司 a r 国药集团化学试剂有限公司 c p中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 c p 国药集团化学试剂有限公司 a r国药集团化学试剂有限公司 a r无锡市东风化工厂出品 a r 国药集团化学试剂有限公司 设备和仪器名称 f a l 6 0 4 电子天平 m 【9 0 2 定时恒温磁力搅拌器 s h z 一2 2 水浴恒温振荡器 t u 一9 0 1 双光束紫外可见分光光度计 w 2 0 1 b 恒温水浴锅 g s l 2 2 电子恒速搅拌器 循环水多用真空泵 d z f 6 0 3 0 a 真空干燥箱 2 3 实验方法 2 3 1 离子交换树脂的预处型删 生产厂家 上海精科实业有限公司 上海浦江分析仪器厂制造 太仓市医疗器械厂 北京普析通用仪器有限责任公司 上海申顺生物科技有限公司 上海医械专机厂 巩义市英峪华中仪器厂 上海一恒科学仪器有限公司 离子交换树脂先用去离子水浸泡胀润，去杂，然后用4 n a 0 h 和4 h c i 交替在磁 力搅拌器下搅拌浸泡2 小时，并分别用去离子水冲洗至中性，最后用2 倍体积以上去离 子水浸泡于4 c 冰箱中保存备用。 原因：新树脂会存在一些杂质。一方面生产设备腐蚀、包装容器的损坏、外界物的 混入等带来机械杂质，如铁锈、沙粒、包装材料碎片等。另一方面，生产过程中可能残 留一些化工原料，如不能聚合的或低分子聚合的有机物、各种有机物反应未除尽的化工 原料等。因为新树脂的离子形态不纯。为了除去树脂中残留的有机化工原料，树脂生产 的最后一步工序一般用自来水洗涤树脂，显然在洗涤过程中也发生了离子交换反应。树 脂基团中所带的离子和自来水的成分有关，各厂自来水水质不同，因此各厂产品树脂的 离子形态不同。因此，在测定前或使用离子交换树脂前，都要对新树脂样品进行预处理， 除去残留化工原料和各种杂质离子，使树脂结构稳定并处于已知的离子形态。 第二章离子交换树脂固定化脂肪酶 2 3 2 脂肪酶的固定化 称取1 0 9 经预处理再真空抽滤后的树脂( 湿基) 于5 0 m l 三角烧瓶中，加入含有一 定量酶的缓冲液5 m l ，控制温度恒定，转速1 1 0r p m ，在恒温振荡器中吸附固定。固定 完成后，移取一定量的上清液，测定酶的吸附率。抽滤，用5 c 的去离子水洗涤，得到 初始固定化酶。 2 3 3 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量【5 ”。 原理：以考马斯亮蓝为染色剂，染色剂与蛋白质通过范德华力结合，在一定的蛋白 质浓度范围内蛋白质的染色符合比耳定律。 考马斯亮蓝液的配制方法：准确称取l o o m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，溶于5 0 m l9 5 乙醇中，加入8 5 的正磷酸l o o m l ，用去离子水定容至1 0 0 0 m l 最后用滤纸过滤，备用。 标准溶液的配制：准确移取l o m l 原酶液( 1 0 万i i n i ，) ，溶于去离子水当中，定容 至1 0 0 0 m l ，配成1 0 0 0 it m i 的标准溶液，再稀释成0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ，6 0 0 ，8 0 0 ，1 0 0 0 ir 恤i ， 的系列标准液。 蛋白质标准曲线的制作：准确移取1 o r a l0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ，6 0 0 ，8 0 0 ，1 0 0 0 i t m i ， 的标准液，置于各试管中，再分别向各试管中加入5 0m l 考马斯亮蓝溶液，摇匀，放 置2 分钟后用l c m 的比色皿，在5 9 5 n m 处测定溶液的吸光度，并以吸光度为纵坐标， 蛋白质含量为横坐标，作图得标准曲线。 待测样品中蛋白质含量的测定：估计样品中的蛋白质含量，将其稀释至o l 0 0 0 u m l 浓度范围，准确移取1 0m l 待测液，加入5 m l 考马斯亮蓝溶液，同前测定其在5 9 5 n m 处的吸光度，t u 一9 0 l 双光束紫外可见分光光度计系统自动从标准曲线中读出浓度值， 然后乘以稀释倍数即为样品中的蛋白质含量。 吸附率= ( 加入的酶蛋白量一上清液中游离酶蛋白量) 加入的酶蛋白量x 1 0 0 2 3 4 固定化酶水含量的确定 将经过吸附、真空抽滤得到的初始固定化酶，放入真空干燥器中，3 0 c 真空干燥至 恒重，再根据水含量的百分比加入相应的去离子水。 2 3 5 固定化酶催化酯化试验 在l o o m l 的三颈烧瓶中，加入含有月桂酸0 2 m o l l 和十二醇0 2 m o l l 的有机溶剂 5 0 m l ，加入一定量的固定化酶，一定的温度下，搅拌开始反应。定时吸取l m l 反应液 于