（生物医学工程专业论文）乙烯二氨基三嗪N异丙基丙烯酰胺共聚物转基因载体.pdf

a b s t r a c t v i n y l d i a m i n o t r i a z i n e n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d ec o p o l y m e r s ( p v d t - c o p n i p a a m ) w e r e p r e p a r e d i n t h i sw o r k t h ec h a r a c t e r i s t i c so fp v d t c o p n i p a a m d n a c o m p l e x e sf o r m e dv i ac o m p l e m e n t a r yh y d r o g e nb o n da n dg e n et r a n s f e c t i o nm e d i a t e d b yt h i sn o n v i r a lv e c t o rw e r ei n v e s t i g a t e d t h e s ec o p o l y m e r sw e r es y n t h e s i z e dt h r o u g h c o n v e n t i o n a lr a d i c a lr a n d o mp o l y m e r i z a t i o n ，a n dw a t e r s o l u b l ef r a c t i o n sw e r ec o l l e c t e d t h ef o r m a t i o no ft h ec o p o l y m e r sw a sc o n f i r m e db yf t i r r e s u l t sf r o mg p cs h o w e d t h a tt h em o l e c u l a rw e i g h tw a sv e r yl o w t h em o l a rr a t i o so fc o p o l y m e r sa n dt h e c o n c e n t r a t i o n so fa n yv e c t o rs o l u t i o n sw e r ed e t e r m i n e dv i at h ea b sv a l u ea t2 6 0 n mo f t h ep o l y m e rs o l u t i o n s c o p o l y m e r v e c t o r p l a s m i dd n ac o m p l e x e sw i t hd i f f e r e n t w e i g h t r a t i o sw e r e p r e p a r e d t h ea g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s i n d i c a t e dt h a t p v d t c o - p n i p a a mv e c t o rw a sc a p a b l eo fc o n d e n s i n gd n ae f f i c i e n t l y a n dt h e e l e c t r o p h o r e s i sp a a e r na l s oe x h i b i t e dc h a r a c t e r i s t i c so fh y d r o g e nb o n d i n gt y p e i nt e m i m a g e s ，d e p e n d i n go n t h ec o m p l e x i n gr a t i o s ，t h em o r p h o l o g yo ft h ec o m p l e x e s a s s u m e dg l o b u l e so rl a r g es i z eo fa g g r e g a t e s ，w h i c hr e s e m b l e dd n ac o n d e n s a t i o n i n d u c e db yc a t i o n i c s i nv i t r ot r a n s f e c t i o nr e v e a l e dt h a tp v d t g o p n i p a a mv e c t o r s c o u l dt r a n s f e rp g l 3i n t oc o s 一1c e l ll i n e t h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fc o p o l y m e r v e c t o rw a s3 0 6 6t i m e sh i g h e rt h a nt h a to fn a k e dd n a ；w h i l eo n eo r d e rl o w e rt h a n t h a to fc o m m e r c i a lv e c t o re x g e n5 0 0 t h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yw a se n h a n c e dt o 1 7 4 5f o l d sv i aa l t e r i n gt h ec e l lc u l t u r et e m p e r a t u r ed u r i n gt r a n s f e c t i o na sc o m p a r e d w i t hc o n s t a n tt e m p e r a t u r ec u l t u r e 。m t te x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h ec o p o l y m e r v e c t o r sh a dv e r yl o wc y t o t o x i c i t y k e y w o r d s ：n i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ，v i n y l d i a m i n o t r i a z i n e ，h y d r o g e nb o n d ，g e n e t r a n s f e c t i o n ，n o n v i r a lv e c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：t f 少签字日期：价7 年 多月1 7 - 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权盘盗基堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 撇繇专慨 新虢汤1 羲唐 签字日期：z 町：7 年舌月j 1 - 日签字日期：司年占月f5 日 第一章绪论 1 1引言 第一章绪论 当今社会仍然有多种疾病人类无法治愈。人的疾病的发生，大多是人细胞本 身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的最后结果。为此， 早在1 9 6 6 年，科学家们就开始构思人类能否最终依靠人本身的或外源的遗传物 质来治疗疾病，纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭 病变的细胞，或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治病目的，这就是基 因治疗的含义。基因治疗的基本策略包括( 1 ) 基因矫正治疗：对突变基因进行 置换、修正，在功能上替换病态基因；( 2 ) 基因灭活治疗：如利用反义r n a 、 核酶、肽核酸或s i r n a 等抑制异常基因如恶性肿瘤中的癌基因的表达：( 3 ) 基因 修饰治疗：导入外源基因，修饰、改变细胞的功能或使原有的功能得到加强。( 4 ) 免疫调节( i m m u n ea d j u s t m e n t ) ：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内， 改变病人的免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的i 。基因治疗对于未来现代分 子医药应用的广阔前景，使得人们对此有无限憧憬。经过三十多年的研究，人们 已经在临床应用上取得了很大进步，但是基因治疗仍然面临着巨大挑战。随着人 类基因组计划的完成，基因治疗的作用有可能向医药领域里更多的方向拓展，但 是对于每一个基因的解码及研究基因间的相互作用，这项艰巨的任务才刚刚开 始，还远没有结束。 当然这并不是说在过去三十多年中，基因治疗没有取得什么进展。实际上， 病毒与非病毒转基因系统都已经在临床实验中有所应用，如治疗囊肿纤维化和某 些癌症等，随着世界范围的实验进展，人类对疾病实施成功的基因治疗也越来越 可行。病毒载体( v i r a lv e c t o r ) 由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄 生特性，已得到了广泛而有效地应用，现在约8 5 的基因治疗临床应用是采用 病毒载体。 但是，目前研究和应用的病毒载体仍存在许多不足，主要体现在免疫原性高、 毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等。故人们愈 来愈重视人工合成的非病毒载体的研究。相对而言，非病毒载体( n o n v i r a lv e c t o r ) 具有低毒、低免疫反应、无基因插入片段大小限制，以及使用简单、制备方便、 便于保存和检验等优势。一般来说，外源基因需克服一系列障碍才能转入细胞到 第一章绪论 达细胞核( 如图 茁k 警硝孰卿泸豆三互蕾 图l jt 1 病毒载体i ) n a 复合物在细胞内转运过程的示意图 12 非病毒载体 由于在不同的实验与治疗方面，非病毒载体系统表现出多种潜在的优越性， 越来越多的实验室选择非病毒载体基因递送系统作为研究方向。图1 - i 中显示的 就是非病毒载体和d n a 形成的复合物进入细胞的过程。通过图l l 可以看出作为 非病毒载体必须克服以下几个苛刻的条件n 】：l 其必须能缩合d n a ，形成稳定复 合物，避免细胞毒性及与其它细胞或带电分子( 如细胞外基质、蛋白特别是补体 蛋白) 的相互作用这在体内应用是根必要的：2 其必须能形成紧密稳定的小于 1 0 0 r i m 的复合物，这有利于其在血流内扩散和帘式内皮膜的外渗：3 其必须能够 调控特定的细胞识别并内在化，减小非特异的基因释放；4 其必须能够从内涵体 中逃逸出来并能够释放外源基因在细胞核内表达。成功的基园转运还需要保护 d n a 免受细胞内核酶的降解能从内吞小泡中释放d n a 或者复合物复合物扩 散通过胞质溶胶及d n a 进入细胞核内，同时复合物必须能够在某一阶段解离。 图l 一2 a 是一些常见的非病毒载体口】，除了病毒载体外，人工合成的载体如阳 离子聚台物，树枝状大分子，多肽，脂质体等也是研究的热点。图1 2 b 概括了未 来设计转基因载体的思路新型的基因载体不但要具备良好的生物相容性，高的 第一章绪论 转染效率，还要有能促进基因治疗的生物学话性。在下面的章节中，我们将对常 见的非病毒载体的研究现状和发展趋势作详细介绍，同时研究提高基因转染效率 的策略。 碜哮 b u m k c a n jh l o k - i r l l i * h , , l u p u l i h l e 主o c p 呻 l j p “”吣 i 、。太j i l i 1 e # i c a i m i i l i l h 母_ pi l ”“十、 图i - 2 ( a ) 常见的非病毒载体：( b ) 新型转基固载体设计思路 l2 l 脂质体 脂质体( g p o s o m e ) 是2 0 世纪6 0 年代英国学者b 粕曲a m 等将磷脂分散在水 中进行电镜观察时发现并命名的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每一层均 为脂质双分子层，囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4 n m ，这 种具有类似于生物膜结构的小囊称为脂质体。脂质体其介导d n a 进入细胞的研 究已有约2 0 年的历史，主要是利用脂质体能促进极性太分子穿透细胞膜的原理。 阳离子脂质体( c l 对。如商品化的l i p o f c c t a m i n e ，在体外应用较多。阳离子 脂质体由三个基本部分构成( 如图l - 3 ) ：带正电荷的极性头部、疏水锚着区和连 接极性与非极性区域的连接键 3 l 。 、弋 第一章绪论 曰 罩八犬二乏汶徽 l c a i i o l n i c _ l l j r i k l 一l j p i d _ j 图1 3 合成脂质体的一般结构 极性头部起着脂质体与d n a 相互结合的作用，同时有助于脂质体d n a 复合 物与细胞膜或细胞内其它组分的相互结合。头部基团除一种脂质含脒基外，其余 阳离子极性头部都包含胺类基团。在头部区域附加极性基团，如羟基基团，可以 显著提高体内的肺部转染率【4 】on a r a n g 等【5 j 考察了不同头基结构对阳离子脂质体 介导基因转染的影响，他们制备的由具有甲磺酰头基的阳离子脂质与中性脂质二 油酰磷脂酰乙醇胺( d o p e ) 构成的脂质体取得了高于商品化i 拘l i p o f e c t a m i n e 的 转染率。这是由于头基与质粒d n a 的氢键作用使得阳离子脂质体与质粒d n a 的 结合力增强，进而提高了转染效率。阳离子脂质体的疏水锚着区域不仅对转染有 显著影响，且与阳离子脂质体的细胞毒性有关，阳离子脂质体疏水锚着链长度对 转染率的影响仍在探讨中，其产生的影响很大程度上取决于另外两个区域的物化 特征。可以看出，阳离子脂质体问差异很大，微小的变动就可引起转染活力及细 胞毒性的显著差异。阳离子脂质体介导d n a 转染的成功依赖众多因素，这导致 脂质体介导转染时，尤其在体内基因转染中具有不确定性。脂质体介导基因转染 时遇到的毒性问题通常与阳离子脂质体核苷酸复合物的正电性及使用剂量成正 相关。 阳离子脂质体转导基因进入细胞的机制通常被认为是所形成的正电荷复合 物与带负电的细胞膜质膜融合的结果，使脂质体一d n a 复合物直接进入细胞质。 同时，细胞包吞作用也被认为参与了这一过程。实验表明氯喹可以提高阳离子脂 质体复合物的转基因效率，这是由于氯喹提高了内涵体的p h 值，并有效抑制了 内涵体与溶酶体的融合，促进复合物从内涵体中释放出来。同样，p k c 活性与转 染率的反向关系也暗示了胞吞作用参与了这一转导过程。多数阳离子脂质体中都 用到中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺( d o p e ) 。d o p e 在形成稳定的单脂双层阳 离子脂质体时是必不可少的，有利于细胞膜融合作用，增加内涵体膜的不稳定性， 促进复合物从内涵体中逃逸，并释放到胞浆。 目前脂质体d n a 复合物已经广泛临床应用，如通过气雾胶法转染肺或鼻粘 膜的上皮细胞，通过动脉内皮的导管术，脑和肿瘤的直接注射和局部组织给药 等方式进行基因治疗。 4 第一章绪论 1 2 2 聚乙烯亚胺 聚乙烯亚胺( p e i ) 主要有线性以及支化两种结构形式( 如图卜4 ) 。在支化 p e i 中，伯胺、仲胺和叔胺氮的含量分别为2 5 、5 0 和2 5 ，三种形式的氨基 都可能被质子化。和聚赖氨酸相比，p e i 在几乎整个p h 值范围内都有很强的缓 冲能力。带正电的p e i 很容易与d n a 带负电的磷酸基团相互作用，并有效缩合 d n a ，形成p e i d n a 复合物。复合程度的好坏可通过调节p e i 与d n a 的复合比 例，经凝胶电泳分析得出。 为了能利于d n a 跨膜递送到细胞溶胶，人们使用了多种辅助分子，这其中 包括复制缺陷腺病毒、氯喹、甘油及融合肽等，特别是当聚赖氨酸作为d n a 的 载体时。相比较而言，p e i 不需要另外使用助剂也能很有效率。对p e i 的高转染 效率的经典解释是p e i 自身具有强大的p h 缓冲能力，在内涵体中的时候，随着 氯离子流入引起大量的质子积累，产生渗透溶胀或内涵体破裂，使内涵体中的物 质得以逃逸出来。这一解释的化学基础是：考虑至r j p e i 的氨基基团的p k 值，以 及细胞外与溶酶体内p h 值的差异，p e i 中被质子化的氮原子比例将从2 0 增加 到4 5 。大量质子的接收，提高了内涵体的p h 值，影响到内涵体内蛋白的折叠， 造成酶降解失活，为d n a 的逃逸争取到了时间( d n a 降解延缓) 和空间( 内 涵体溶胀破裂) 。 i - i ，c - c i - t 2 n 卜_ f c h y - c h 2 - n h f c h 2 - c h 2 - n + ，吣妻乒f 7 r 0 产 p n i a a m 1 1 p n i a a m g1 1 ( 这里1 3 ，1 2 代表异丙基丙烯酰胺与丙烯胺的加料摩尔 比) 。温度升高对于l c s t 相对较低的1 1 系列聚合物的复合效果影响较为明显， 这与分子内部链段的塌陷使复合物变得更加密实有关。 斗字一朗凳q 争斗字一r 声 h 3 c c h c h 3h 3 c c h c h 3 = = n h 图1 - 8p n i a a m 中氨基的胍基化反应式 1 2 第一章绪论 在体外的转染实验中，p n i a a g g1 - 3 共聚物载体成功地将p g l 3 质粒转入 c o s 1 细胞内，转染率比裸d n a 高1 0 0 - 4 0 0 倍，比p e i 高卜5 倍。具备良好 的耐血清能力，血清条件下转染甚至优于无血清情况。有望通过调控l c s t 进 一步提高其体外转染率。 1 3 2 光敏性载体 n a g a s a k i 4 4 j 等人合成一种新型的水溶性末端为l 赖氨酸的聚偶氮苯的树状 高分子，通过光散射实验和凝胶渗透色谱实验发现该高聚物和质粒d n a 形成的 复合物的尺寸是紫外光( u v ) 和可见光可调节的。初步的体外转染实验显示u v 照射有利于进入胞浆中的复合物的解离，并使转染效率提高5 0 左右。同时 n a g a s a k i 等1 4 5 j 人还研究了一种含有光异构偶氮苯结构和赖氨酸残基的脂质体作 为基因载体的可能性，转染实验结果证实其在u v 照射下的转染效率高于 l i p o f e c t i n 的转染效率。 r o t e l l o 等m j 制备了阳离子纳米金粒，这些金粒能与d n a 以强静电方式结合。 体外实验证实，即便在t 7r n a 聚合酶存在下，纳米金粒能有有效阻止d n a 转录。 这些纳米金粒还能有效转染哺乳动物细胞。为了进一步在时间和空间上控制 d n a 从载体中的释放，他们【47 】对这些阳离子纳米金粒进行了修饰，使这些粒子 具有了一个对光敏感的邻硝基苯脂键，如图1 9 所示。这些制得的阳离子光解纳 米粒子( n p p c ) 先通过静电作用与d n a 复合，然后在近紫外光( 3 5 0 n m ) 照 射下，硝基苯基团连接键断裂，释放出带正电荷的烷基胺，同时金粒上只剩下带 负电荷的羧基集团( n p c o o h ) 。正负电荷的逆转，使得d n a 从金粒上被有效 的释放出来，d n a 体外实验中转录水平得到了恢复。进一步，这种n p p c 能够有 效地将d n a 运送到细胞核转染细胞。他们的工作为光调节生物活性大分子用于 药物递送提供了很好的思路。 1 3 3p h 敏感性载体 非病毒载体d n a 复合物从内涵体有效的释放出来是将d n a 地送到细胞核 的重要步骤。s z o k a 等【4 8 - 5 0 等设计了基于g a l a 的多肽，这类多肽的构象在酸性 环境下，能够从带负电荷，无规的线团转变成憎水的两亲性0 t 螺旋结构。这种结 构的转变有助于在内涵体中的多肽插入到磷脂双分子层膜，并在膜上形成孔从而 逃逸出来。当g a l a 的多肽添加到载体d n a 复合物中时，能够大幅提高转染效 率。 第一章绪论 扣移州 + 图1 - 9 光敏感性纳米金粒在光照下表面转化示意图 虽然这些多肽能够有效促进基因转染，但它们可能有潜在的免疫原性，再加 上它们造价昂贵、不够稳定，研究者把注意力逐渐转移到了人工合成的p h 敏感 性的聚合物上。t i r r e l l 冬f 1 5 1 , 5 2 1 揭示了p h 敏感性的聚乙基丙烯酸( p e a a ) 使膜紊 乱的机制。在此基础上，h o f f m a n 等t 5 3 】合成了p h 敏感性的聚丙基丙烯酸( p p a a ) ， 并将其用于转基因研究，如图1 1 0 所示。他们将阳离子脂质体d o p e ，p c m v1 3 质粒d n a ，p p a a = 者以物理方法混合起来，得到了p p a a 增强的脂质d n a 复合 物。在对3 t 3 纤维原细胞的转染实验中，他们发现，这种复合物的基因转染效 率比起脂质d n a 复合物有大幅度提高。同时，这种复合物具有很好的耐血清能 力，甚至在血清浓度为5 0 时，仍然能够保持很高的转染效率。 c h 3 甲o o hl 芝p h i o h z l 叶一 o l 1 2 h 譬 o - 1 2 c h 2 l c h 3c h 3 图1 1 0 聚丙基丙烯酸化学结构 1 3 4 氧化还原敏感性载体 在非病毒载体中阳离子型两亲高分子由于其具有一系列有点，已经有临床应 用。然而，这些两亲高分子的基因转染效率不高。l u o 5 卅等设计并合成了一种功 1 4 笫一章绪沦 能性两亲高分子用干基凶转染它在细胞内能从【午| 离子型转变为阴离子型，这 转变明显提高了基冈转染效率。这种电荷逆转的两亲高分子在基冈转染。p 扮演两 个角色：首先，它复合并释放d n a ；同时，它作为阴离子型多电荷两亲高分子， 能够使双分子层膜紊乱。所以在基因转染巾，两亲高分子经历了以下反应：首 先- 与d n a 作用形成两亲高分子- d n a 超分子复台物；一旦复合物进入细胞( 如 通过胞吞作用) r 酯酶使两亲高分子末端的脂键水解，产生阴离子型两亲高分子； 最终，阴离子型两亲高分子通过静电作用排斥d n a ，同时破坏复合物的脂质双 分子层，使d n a 有效的从复合物中释放出柬。图i 川简要的描述了这一过程。 口 黛。帮 图1 - t 1 电荷逆转两亲性高丹子释放d n a 机制 作青设| 十的两亲性高分子如图l - 1 2 - l 的化台物1 ，具有三个部分：阳高了氨 基头部用来缩台d n a ；亲油性烷基链用来形成双分子层膜；烷基链末端的苯基 酯是酯酶将要水解的部分。为了验证这三个部分的作用，作者同时使用图i 1 2 其余四种化合物进行对照，在c h o 细胞中介导了p v a x l a c z i 质粒的转染，结 果只有三个部分齐备的两亲高分子1 取得了最高的转染效率。 谷胱甘肚( g s h ) 是细胞中含量最大的巯基化台物，也是生物化学反应中的 一种重要还原剂，这就使在活细胞中原位释放成为了可能。细胞内的谷胱胺肚浓 度为1 - 1 0 r a m ，远远大于细胞外的浓度( 如血浆中只有2 jj | m ) ，这提供了一种选择 性胞内释放的机制。 a m i j i t 圳等将硫基化的b 型明胶表面p e g 化。井用其包裹d n a ，形成纳米粒 子( p e g s h g e l ) ，并将其用于转基因研究。这是一种响应细胞内谷胱甘肽浓度 的载体。使用编码绿色荧光蛋白的质粒e g f p - n i 为报告基因。体外改变谷胱甘肽 的浓度( 在磷酸盐缓冲溶液中，g s h 至5 r a m ) 可以检测到被包裹的d n a 被释放 出来。琼脂糖凝胶电泳表明，这种包裹d n a 的纳米粒子具有很好的稳定性。作 者最后以n i h 3 t 3 细胞为宿主细胞，进行了转染研究，结果p e g s h g e l 取得了最 高转染效率。其转染机制如图i 1 3 所示。 第一章绪论 、 辞 ， 4 2 ，d o t a p 图l 1 2 用于基因转染的两亲性高分子 p e i 是常见的基因转染载体，k i s s e l 等【5 6 j 使用氨基活性的交联剂二硫代二丙 酸二琥珀酰胺酯( d s p ) 交联p e i ，使p e i 获得了生物可降解的双硫键。他们采用 两种方法制备p e i d n a 复合物，使交联化p e i 与d n a 复合或将p e i d n a 复合物交 联。反应过程如图1 1 4 所示。结果他们发现，只有高分子量p e i d n a 复合物的交 联物显现正电荷，并且尺寸在1 0 0 3 0 0 n m ，。也只有这种方式产生的复合物能够 增强抵抗聚阴离子的交换作用或是高离子强度。再用原子力显微镜a f m 观察时， 这类复合物的形貌没有发生明显变化，同时用锯齿力观察这类复合物，它们的机 械稳定性得到了提高。同时与血液中成分如白蛋白的作用明显减弱。这一类载体 很有希望应用于体内基因释放研究。 醐m l n - o m m ae n 一嗍删 眦髓哪暂s y s 蛔帖g e l ；) f o r r c a a l o no f 翻h 娜d c r o u l l n l m r 科知嘲b no lo h m k g _ o m a i n l m n dd n r e “黼 图1 1 3 巯基化明胶纳米粒子在细胞内较高谷胱酰胺浓度下递送载体机制 1 6 第一章绪论 争k s j o 一护o + n h z - - p e ! - - n h ；， 图1 1 4p e h f l 氨基被二硫代二丙酸二琥珀酰胺酯( d s p ) 交联反应示意图 类似的，s h e n 掣5 7j 也合成了谷胱胺肽敏感性交联聚乙烯基亚胺c l p e t 5 0 。 他们以二甲基二硫代二丙酸二盐酸盐为交联剂，与分子量1 8 0 0 d a 的p e i 反应，制 得了交联物。酸式滴定该交联物c l p e t 5 0 ，发现其还具有强大的质子海绵缓冲 能力。作者使用原子力显微镜a f m 幂i 动态光散射d l s 考察了c l p e t 5 0 。, d n a 复合 物的性质，d n a 被该交联物缩合成球形粒子，在p h 值分别为6 0 和7 4 时，复合物 粒径分别为1 5 0 n m 和2 6 0 n m 。当c l p e t 5 0 d n a 复合物n p 比为1 0 ：l 时，复合物 在谷胱胺肽浓度3 m m 条件下解包装，释放出d n a ，这一体外模拟浓度与细胞内 谷胱胺肽浓度相吻合。细胞毒性实验表明，c l p e t 5 0 的毒性比起分子量2 5 k d a 的p e i 降低很多。以上数据表明c l p e t 5 0 是一种很有应用价值的非病毒载体。 1 4 基于氢键与d n a 作用的非病毒载体 随着近年来非病毒载体，特别是阳离子型载体的深入研究，科学家发现阳离 子载体并不一定对基因转染起到正面作用。阳离子载体容易与血液成分和非靶向 组织相互作用，导致在血液中循环能力差，低的靶向性，甚至是细胞毒性。同时 又有报道称聚电解质复合物包载d n a 过于紧密以至于复合物进入细胞后d n a 不能顺利的逃逸出来，导致低的转染效率1 4 2 | 。基于这些阳离子转基因载体的缺 陷，近几年萌发了设计并合成基于非静电作用的转基因载体的新思路，即抛弃传 统的类阳离子载体的电荷作用复合d n a 机制，设计新型的非电荷作用的转基因 载体。关于这方面的研究与阳离子载体进展相比相对较少【5 引。 1 7 们 一 。蚤。 第一章绪论 4l 裂皱菌多糖( s p g ) 转基因载体 迄今为止，在非电荷作用转基因载体领域中蛙为熏要的尝试是采用裂皱菌多 糖( s p g ) p 蚰”作为聚核苷酸的载体( 见图1 1 5 ) 。通过表征s p g 在水中呈现 三螺旋结构，而在_ 甲基亚砜中螺旋解开单链( p s p g ) 呈无规线团结构。研 究表明，s _ s p g 可以与p o l y ( c ) ，p o l y ( a ) ，p o l y ( u ) ，p o l y ( d a ) 和p o l y ( d n 等d n a 链 通过氯键形成大分子复台物阻“i 。利用这些性质，单链裂皱菌多糖( 争s p g ) m i 和侧链修饰的s s p g l 6 5 嘲成功的将反义寡聚核苷酸转入了细胞。但是s p g 有着其 固有的缺陷，即不能与双链d n a ( d s d n a ) 形成氢键，因此无法用于d s d n a 的 转染中。为了拓展裂皱菌在转基因中的应用，n a g a s a k i 等采用阳离子修饰的s p g 来复合耿链质粒d n a ，但这里面的d n a 复合机制是基于电荷作用的| 6 ”。a n a d a 等在编码有s i r n a 的双链d n a 两端引入环状p o l y ( d a ) 8 0 来模拟病毒的基因 组。并用转移活化蛋白修饰过的s p g 与环状p o l y ( d a ) 8 0 复台，并有效的提高了 r n a 干扰效应【6 。这里面的复台机制是电荷作用与氢键作用协同进行。 i 黔掣吼 1 l 蟛鸡盥嚣 + 1 i ；= ；一 图l _ 1 5 ( a ) 裂皱茼多糖( s p g ) 及其( b ) 三蝶旋结构 4 2 大环结构糖类转基因载体 第一章绪论 1 a ：x = r ：i t h 2 ) 1 c h 鼎0 馏o h b 缸o h 萝” 他：，n h2 h 气。b o 气hohno - _ r 勺- 丫 1 c ：x 2 n h 2 2n m 图1 1 6 大环糖类结构 4n m 另一项重要的尝试来自于对具有大环结构糖类纳米粒子的探索，其结构如图 卜1 6 所示，研究表明，这一类粒子在水中形成糖一磷酸氢键作用6 9 , 7 0 1 ，并可以牢 牢复合双链d n a 。这些纳米粒子可以有效的将质粒d n a 沉淀为类病毒的，紧 密包裹的粒子。具有单核结构，良好的电荷屏蔽作用，并成功的转染t h e l a 细胞 【删和h c p g 2 细胞。事实上，这是真正意义上基于非电荷作用的基因转染的开 端。 i 4 3 论文工作的提出 d n a 碱基中富含氢键供体和受体，可有效的通过氢键作用识别并作用于目 标分子。这一特性启发我们设计一种新型非病毒转基因载体，该载体通过非电荷 作用( 氢键作用) 与d n a 的碱基对结合，达到复合d n a 的目的。k o m i y a m a 等报 道聚( 2 - 乙烯基_ 4 ，6 - 二氨基1 ，3 ，5 - 三嗪) ( p v d t ) 可在水中有效识别核酸 碱基及其衍生物：v d t 单体可与屎嘧啶和胸腺嘧啶形成三氢键作用，与腺嘌呤形 成二氢键，与鸟嘌呤形成单氢键作用。用v d t 制备的聚合物可以增大水中的非极 性微环境。有利于氢键的形成m l 。近年来，p v d t 被用于高分子印记领域，研究 表明v d t 残基和d n a 的腺嘌畸一胸腺嘧啶( a t ) 碱基对形成三氢键作用( 如图 m 潜 势1 瓣 e m 第一章绪论 1 1 7 所示) 【7 5 】。 ) n v d t l n 公n h n 人n 火n h a d c n i n cl h v m i n e 图l - 1 7v d t 单体与d n a 的腺嘌呤一胸腺嘧啶( a t ) 碱基对形成三氢键作用 最近，刘文广等1 7 6 j 在世界上首次将p v d t 用于转基冈载体研究。通过无规自 由基聚合的方式成功的制备了水溶性p v d t 基聚合物。v d t 链段可通过氢键作 用与d n a 的碱基对结合使d n a 复合。复合物的凝胶电泳呈现典型非电荷作用 ( 氢键作用) 条带图样。在e b 置换实验中p v d t 可将9 0 与d n a 结合的e b 置 换出来，增j j i d n a 刚性，使之进入更为密实的状态。透射电镜( t e m ) 下观察 到缩合的d n a 呈现球状、环状或大尺寸聚集物，与阳离子载体缩合d n a 类似。 p v d t 基复合物可有效保护d n a 免受d n a s ei 的降解，并在b s a 下仍具有较好 的稳定性。p v d t 基载体可成功介导荧光素酶和加强绿色荧光蛋白质粒体外转 染c o s 1 细胞，具有满意的转染效率( 转染率高于商品化e x g e n5 0 0 ) ，和很低 的细胞毒性( 与l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 相当，低于e x g e n5 0 0 ) 。所有这些结果表明， p v d t 基载体优于传统阳离子载体，并有希望成功用于体内转染中。 鉴于p v d t 能有效体外转染细胞，为了进一步提高其转染效率，本论文工作 从以下几个方面确定研究方向： 1 由于p v d t 较难溶于水，要将其作为转基因载体首先要改善其水溶性。首 先将n 一异丙基丙烯酰胺与v d t 共聚，制备具有一定水溶性的乙烯二氨基 2 0 第一章绪论 三嗪n 异丙基丙烯酰胺共聚物p v d t c o p n i p a a m ，并对其进行表征。 通过多种物理化学方法探究p v d t c o p n i p a a m 载体d n a 复合物的形 成和演变，如最佳复合比，p v d t 对d n a 的作用，复合物形态、尺寸、 稳定性，对d n a 的保护作用等。 将p v d t c o p n i p a a m 载体d n a 复合物用于对c o s 1 细胞的转染中( 采 用荧光素酶l u c i f e r a s e 报告基因p g l 3 ) 。考察转染效率及细胞毒性。考察 改变转染时细胞培养温度对转染效率的影响。 2 l 第二章乙烯二氨基二嗪n 异丙基丙烯酰胺共聚物制备与表征 第二章乙烯二氨基三嗪小一异丙基丙烯酰胺共聚物制备与表征 2 1 引言 本章主要制备了具有一定水溶性的温度敏感性p v d t 基非病毒转基因载体， 具体来讲，以n 异丙基丙烯酰胺( n i p a a m ) 为共聚单体与) t 通过自由基无规 共聚方法合成高分子共聚物，以使共聚物获得温敏性，同时增力i p v d t 的亲水性。 为了便于比较，亦合成了水溶性p v d t 和p n i p a a m 均聚物。 2 2 实验部分 2 2 1 实验药品 2 - 乙烯基一4 ，6 - 二氨基- 1 ，3 ，5 - 三嗪( v d t ) ：t o k y ok a s e ik o g y o 公司 n 异丙基丙烯酰胺( n i p a a m ) ：s i g m a 公司 偶氮二异丁睛( a i b n ) ：f i u k a 公司 二甲基亚砜( d m s o ) ：分析纯，天津大学科威试剂公司 四氢呋喃( t h f ) ：分析纯，天津大学科威试剂公司 无水乙醚：分析纯，天津大学科威公司 三蒸水 2 2 2p v d t 基转基因载体的制备 采用典型的无规自由基聚合反应，以a i b n 为引发剂合成均聚p v d t 、均聚 p n i p a a m 和不同投料比的p v d t c o p n i p a a m 共聚物。具体实施方法如下： 2 2 2 1 合成均聚p v d t 取0 9 0 8 克v d t 单体溶7 ：3 0 毫歹 - d m s o 中，磁力搅拌1 0 分钟使之完全溶 解，将其加入到1 0 0 毫升的三口烧瓶中。通氮气3 0 分钟排除反应体系的空气， 水浴加热至l j 7 0 ，j j i a 7 6 1 毫克a i b n ，在氮气保护下反应3 0 分钟，反应产物用 水稀释，透析5 天( 截留分子量为3 5 0 0 ) ，过滤，冻干得到最终可溶产物。 第二章乙烯二氨基二嗪n 一异丙基丙烯酰胺共聚物制备与表征 2 2 2 2 合成均聚p n i p a a m 取1 0 克异丙基丙烯酰胺溶解于2 5 毫升四氢呋喃中，磁力搅拌2 0 分钟使之完 全溶解，将其加入到1 0 0 m l 的三口烧瓶中，加入引发齐u a i b n 0 0 2 克，通氮气3 0 m i n 排除反应体系的空气，水浴加热至l j 7 0 。c ，在氮气保护下反应8 h ，以乙醚沉淀产物， 洗涤产物三次，蒸馏水溶解产物，透析5 天( 截留分子量为3 5 0 0 ) ，冻干备用。 2 2 2 3 合成p v d t c o p n i p a a m 共聚物 合成不同摩尔投料比的共聚物，引发剂的量为共聚单体总摩尔量的1 3 。 以摩尔投料l l 6 ：l 为例( v d t ：n i p a a m ，m o h m 0 1 ) ，取3 6 3 5 克v d t 单体和0 5 克n i p a a m 溶于4 0 毫升d m s o 中，磁力搅拌2 0 分钟使之完全溶解，将其加入 到1 0 0 毫升的三口烧瓶中。通氮气3 0 分钟排除反应体系的空气，水浴加热到7 0 ，加6 6 0 毫克a i b n ，在氮气保护下反应8 小时，反应产物用水稀释，透析5 天 ( 截留分子量为3 5 0 0 ) ，过滤，冻干得最终可溶产物。同时，类似地制备v d t ： n i p a a m 摩尔投料比为4 ：1 的共聚物。 后面如无特别说明，分别以v d t n i4l ，v d t n i 6 1 表示v d t ：n i p a a m 摩 尔投料比为4 ：l ，6 ：l 时制备得到的共聚物。 2 2 3p v d t 基转基因载体的表征 2 2 3 1 傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 将p n l p a a m ，p v d t 均聚物及p v d t - c o p n l p a a m 共聚物样品于研钵中同 k b r 混合并研碎，在b i o r a df t s 6 0 0 0 傅立叶红外光谱仪上测定样品红外光谱。 2 2 3 2 凝胶渗透色谱( g p c ) 以0 1 m o l l 的n a n 0 3 纯水溶液( 经过超声波处理) 为流动相，流速0 5 m l m i n ， 聚丙烯酸( p a a ) 为标准物，在g p c 5 1 5s y s t e m ( 美 w a t e r s 公司) 凝胶渗透色谱 上检测p v d t c o p n i p a a m 共聚物分子量及分布。 2 2 3 3 紫外分光光度计定量p v d t 基聚合物浓度 用紫外分光光度计( b i o p h o t o m e t e r ，e p p e n d o r f ) ，测量不同浓度 v d t 单 体，p v d t c o p n i p a a m 共聚物2 6 0 纳米处的吸光度。作不同样品浓度一吸光度 曲线，线性拟合得到样品的消光系数，计算样品摩尔共聚比。 第二章乙烯二氨基三嗪爪异丙基丙烯酰胺共聚物制备与表征 2 3 结果与讨论 2 3 1 均聚p v d t 及p v d t p n i p a a m 共聚物的制备 在合成均聚p v d t 时，由于反应是非均相体系，在加入a i b n 芒j i 发剂之后很快 生成白色不溶物p v d t ，p v d t 难溶于水及有机溶剂，故过滤取得水溶部分产率 较低，所以后续采用紫外分光光度计来定量p v d t 均聚物浓度。在引入n i p a a m 共聚组分后，共聚物的产率有明显的提高，而且p n i p a a m 所占比例越大，水溶 性的共聚物产率越高。然而，考虑到共聚物中与d n a 复合的有效部分是p v d t ， 而p n i p a a m 所占比例太大会降低共聚物与d n a 的复合效率，影响转染。故以下 的表征集中在可溶性p v d t 、摩尔投料比4 ：1 和6 ：l ( v d t ：n i p a a m ，m o l ：m 0 1 ) 的共聚物上。 n h 2 抖r h i n l i n h ：c h 3 c h c h 。 图2 1p v d t - c o - p n i p a a m 共聚物结构式 2 3 2p v d t 均聚物及p v d t c o p n i p a a m 共聚物的表征 2 3 2 1 傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 检测 2 4 第二章乙烯- 二氨基二嗪腻一异丙基丙烯酰胺共聚物制备与表征 一n 飞广穗一 w a v e l e n g t h ( c m 1 ) 图2 2 样品p n i p a a m 、p v d t 、v d t n i - 4 1 、v d t n i6l 红外谱图 图2 2 中p n i p a a m 红外特征谱带归属如下，1 6 5 0 和1 5 3 8 c m 。为酰胺i 及酰胺 i i 的特征峰；3 3 0 8 - - - 3 4 2 9 c m 叫为n - 一h 伸缩振动；2 8 7 4 、2 9 3 l 及2 9 6 6 c m 。1 为c h 的伸缩振动；1 4 5 8 c m 。1 处为c h 3 的不对称弯曲振动峰；1 3 8 5 及1 3 6 5 c m 。为异丙 基上双甲基由于对称变形振动耦合分裂成的双峰，与文献报道一致【7 丌。对于 p v