（环境工程专业论文）青岛沿海四株大型海藻代谢产物及其生物活性筛选的研究.pdf

青岛理工大学工学硕士学位论文 对苏云金芽孢杆菌( b t ) 的抑菌圈直径分别达1 9 5 m m 和2 0 7 m m ( 阳性对照为 2 4 0 r a m ) 。另外，四株海藻中以海黍子生物量最大，采集较方便。综合以上考虑， 选择海黍子作为后续研究对象。 2 海黍子次级代谢产物和初步的抑菌活性研究：干燥并粉碎的海黍子，经 过溶剂浸取、萃取，制成浸膏后，以常规的硅胶柱层析、凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 柱层析、制备薄层层析( p t l c ) 以及重结晶等分离手段，分离纯化得到单体化合物。 综合利用各种现代波谱技术以及与标准品和文献数据比对的方法，进行化合物及 结构鉴定。在分离纯化过程中，共获得5 个单体化合物，均为首次从该藻种中获 得。运用1 h n m r 、”c n m r 、d e p t 等现代波谱学技术，鉴定出其中3 个化合 物的结构。对海黍子1 7 个梯度洗脱组分进行了抑菌活性测定，得到的结论与初 次筛选实验中基本保持一致。对5 个单体化合物进行了抑菌活性测定，发现其对 供试真菌均没有抑制活性；在海洋细菌方面，化合物对金黄色葡萄球菌( s a ) 、 枯草芽孢杆菌( b s ) 和苏云金芽孢杆菌( b t ) 有微弱的抑制活性；化合物对枯草芽 孢杆菌( b s ) 有微弱的抑制活性；化合物v 对金黄色葡萄球菌( s a ) 有较强的抑制活 性，抑菌圈为1 4 5 m m ，对大肠埃希氏杆菌( e c ) 有微弱的抑制活性，对枯草芽孢 杆n ( b s ) 有中等程度的抑菌活性，抑菌圈为1 0 8 m m 。 关 建词海黍子；农业病原真菌；海洋细菌；抑菌活性；化学成分 1 1 a b s t r a c t m a n n eo r g a n l s m s c a np r o d u c ev a r i o u s s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s t h en o v e l s t r u c t u r e sa n du n i q u eb i o l o g i c a la c t i v i t i sm a k et h e mh i g h l yv a l u e d p 1 a n t p a t h o g e n p o s e sas e n o u st 1 1 r e a tf o ra g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n ；c h e m i c a lp e s t i c i d er e s i d u e ，h i 2 h d e v e l o p m e n tc o s ta sw e l la sm a r i n eb a c t e r i a lf o u l i n ga r ea l s ot ob es o l v e d s os e e k i n g f o re n v l r o n m e n t f r i e n d l yp e s t i c i d e sa n d n a t u r a la n t i f o u l i n gc o m p u n d si se s s e n t i a l 3 a g n s s u m k j e l l m a n i a n u m ，s a r g a s s u mt h u n b e r g i i ，d e s m n 陀s t i nv i r t d i sm d 彳忍咖五i 印s 如伽6 p ，扣瑚fa r ef o u rk i n d so fc o m m o na l g a e a l o n gt h ec o a s to fq i n g d a o ， s h a n d o n gp r o v i n c e ，c h i n a i nt h i sp a p e r , t h ef o u rk i n d so f a l g a ew e r er e s e a r c h e do n t h e i rc h e m i c a la n d b i o l o g i c a ls c r e e n i n g ，a st og e te n v i r o n m e n t f r i e n d l yp e s t i c i d e sa n d n a t u r a la n t i f o u l i n gm a t e r i a l s c h e m i c a li n v e s t i g a t i o no ft h ef o u rk i n d so fa l g a eo b t a i n e d c r d ee x t r a c t sb v c o m b i n a t i o no fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo ns i l i c ag e la n d t h i n1 a y e rc h r o m a t o g r a p h v 1 h ec r u d ee x t r a c t sw e r et e s t e d b yh p l c a n dt h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e sw e r es t u d i e d ( 5p l a n tp a t h o g e n f u n g a l s t r a i i n sa n d4m a r i n e b a c t e r i a s t r a i n s ) 娜z j s “聊 移2 l l m a n i a n u mw a sf o u n dr i c h e ri nc o m p o u n d sa n d b e t t e ri na n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s s ow ec h o o s es a g a s s u mk j e l l r n a n ：i a n u ma so u r f o l l o w u pr e s e a r c ho b je c t t h em a i n c o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 i h es c r e e n i n go ff o u rk i n d so f a l g a e ：d r ys e a w e e ds a m p l e sw e r eg r o u n di n t o s m a l lp i e c e sa n de x t r a c t e dw i t h9 5 e t h a n o la n d u l t r a s o n i cc l e a n e r t h ee x t r a c t sw e r e e v a p o r a t e du n d e rr e d u c e dp r e s s u r et oad a r ks e m i s o l i da n dd i s s o l v e di nd i s t i l l e dw a t e r 1 h ea q u e o u ss u s p e n s i o nw a sp a r t i t i o n e di n e t h y la c e t a t e t h ee t h y la c e t a t ee x t r a c t s w e r ee v 叩o r a t e dt od r y n e s si na r o t a r ye v a p o r a t o ra n dt h es e m i s o l i dw a ss 印a r a t e d b v c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo ns i li c ag e l t h ec r u d ee x t r a c t sw e r et e s t e db y h p l ca n d s c r e e n e df o rt h e i r a n t i m i c r c l b i a l a c t i v i t i e s ， a n dt h e r e s u l ts h o w e d勋艘s s “聊 杉已l l m a n i a n u 垅w a sr i c h e ri n c o m p o u n d st h a nt h eo t h e rt h r e ea l g a e ；s o m eo ft h e e x 打a c t so f s a g a s s u mk j e l l m a n i a n u mh a da n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s a g a i n s tt h e5d l a n t i i i p a 吐【o g e nf u n g i s t r a i n s ：f r 2s h o w e dt h es t r o n g e s t a c t i v i t i e s a g a i n s ts p h a c r a l e s g i b b p 陀i i 以z e a ea n da l t e r 玎口r i as o 肠，z i ，r e a c h i n gi n h i b i t i o nz o n e so f11 4 a n d11 3 m m o f a 1 11 h ef o u ra l g a e ，s a g a s s u mk j e l l m a n i a n u mh a dt h es t r o n g e s ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s ： f r 4r e a c h e da ni n h i b i t i o nz o n eo f17 5 m ma g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，f r 2a n d f r 4 r e a ( 、h e di n h i b i t i o nz o n e so f19 5a n d 2 0 7 m ma g a i n s tb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s 2 c h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fs a g a s s u mk j e l l m a n i a n u m a n dt h ea n t i m i c r o b i a l a c t i v i t i e s ：t h es e p a r a t i o nw a sp e r f o r m e db yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y o ns i l i c ag e la n d 17c m d ee x t r a c t sw e r eo b t m n e d 5c o m p o u n d sw e r ei s o l a t e db yr e p e a t c o l u m n c h r o m a t o g r a p h yo ns i l i c ag e l ，s e p h a d e xl h 一2 0 ，p t l ca n dr e c r y s t a l l i z a t i o n ，w h i c h w e r eo b t a i n e da sn a t u r ep r o d u c t sf o rt h ef i r s tt i m e t h es t r u c t u r e so ft h ei s o l a t e d c o m d o u n d sw e r ee l u c i d a t e db ys p e c t r o s c o p i ca n a l y s i si n c l u d i n g1 h n m r ，c - n m r a n dd e p t 3c o m p o u n d sa n dt h e i rs t r u c t u r e sw e r ei d e n t i f i e d a l l o ft h e17c r u d e e x t r a c t sw e r et e s t e df o rt h e i ra n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e sa n d t h er e s u l t i n gw a sd e t e r m i n e d m a i n l vt h es a m ea ss c r e e n i n gt e s t h o w e v e r ，5c o m p o u n d sd i d n ts h o wa n ya n t i f u n g a l a c t i v i t y c o m p o u n d vs h o w e dm a r k e di n h i b i t i o na g a i n s ts t a p h y l o c o c c u s a u r e u s m o d e r a t ei n h i b i t i o na g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u ，r e a c h i n ga n i n h i b i t i o nz o n eo f 1 4 5 m m k c ! yw o r d s ：s a g a s s u mk j e l l m a n i a n u m ；p l a n tp a t h o g e nf u n g a l ；m a r i n e b a c t e r i a ； a n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s ；c h e m i c a lc o n s t i t u e n t s 青岛理工大学工学硕士学位论文 ! = ! ! = = ! = = ! = = = ! = = = = = = = ! = = ! = = = ! ! ! = ! = ! ! = ! ! ! = e ! ! = ! ! = = = ! = ! = ! = ! = = = ! = ! = = = = = = = ! = ! = ! = ! ! = ! ! ! ! 第一章绪论 海洋除蕴含着丰富的矿产资源和能源外，尚蕴藏着地球8 0 以上的生物资 源，是我们人类的巨大宝库。可是迄今为止被开发利用的大部分资源都来自陆地。 二十世纪八十年代以来，人类对海洋开发的关注逐年增长，特别是些海洋国家， 例如日本，由于陆上资源有限，特别重视对海洋的开发 i 。研究发现海洋生物的 种类远比陆上丰富，可达5 0 万种以上。海洋生物长期处于海洋这样一个特殊的 闭锁环境，其特点是：( 1 ) 温度较低，且没有急剧的温差变化；( 2 ) 高浓度的盐和 高水压；( 3 ) 生物体用整个机体来吸收稀薄的营养；( 7 4 ) 容易受到病原微生物的侵 袭【2 】。因此，海洋生物在其进化过程中产生了与陆地上生物不同的代谢系统和机 体系统，其形态、生态、性状和陆上生物不同，可以期望从海洋生物及其代谢产 物中开发出不同于陆上生物来源，具有特异、新颖、多种多样化学结构的新物质。 目前在国外己报道的仅有的不足3 0 0 0 种海洋生物化合物中，就发现近5 0 是陆 地生物所未见的或差异很大的天然产物。而海藻作为在海洋生物中占据重要地位 的一大类物质，也引起了人们的极大兴趣。 海藻在海洋生物资源中占有相当大的比重，文献上己经报道的种属超过2 4 ， 0 0 0 种【3j ，是海洋中最大的职位类群，是海洋生物链中能够通过光合作用合成自 身必要营养物质的主要自养生物类群，也是海洋生物食物链的基础。由于海藻在 其生命过程中需要光能，因此大部分海藻生长在潮间带或数十米的相对浅海水 域；也有- d , 部分海藻生长在海水清澈的较深海域【4 。 根据海藻中主要的光合色素类型可以把海藻分为褐藻、红藻和绿藻。本文以 青岛沿海常见大型海藻为研究对象，对其进行了次级代谢产物和初步生物活性研 究。 第一节海藻提取物在防治环境污染中的应用 由于其特殊的生物形态和生长环境，海藻中的代谢产物及其功能和活性研究 一直是人们关注的重要方向。海藻与陆地植物相比具有特殊的结构和成分：在结 构方面，海藻代谢产物的最大特点是多种结构中富含卤素；在功能方面，海藻代 青岛理工大学工学硕士学位论文 = = ! ! = ! = = ! = ! = = ! = = = = ! = = = = ! = ! ! ! = = ! ! = ! = = = = ! ! = ! = ! = = ! = ! = ! ! = = ! ! ! ! = = = ! ! = = = 谢产物的主要特点是拒食、抗微生物、抗附着和毒性。从海藻中可以筛选、提取 得到多种有抗肿瘤、抗氧化、抗细菌、抗真菌、抗病毒的活性物质 5 崩1 。研究表 明，海藻的主要成分包括：酸、生物碱、酶、红藻淀粉、葡萄糖、无机物质、脂 类、甾醇、脂肪酸、酚的化合物、植物激素、色素、蛋白质、氨基酸、维生素和 易挥发的成分及有毒的物质。海藻活性物质含量丰富，因此运用现代生物技术筛 选、提取并应用藻类活性物质正成为这一领域的主流。 然而近些年来，环境问题成为全球特别关注的问题之一。各种污染不仅给我 们生存的地球带来了严重的环境破坏、生态变化，而且给人类自身的健康带来了 很大的危害。海藻提取物因其天然、经济、产量丰富、二次污染小等优点，在环 境污染方面的应用也越来越受到人们的青睐和重视。 1 1 海藻在抑制化学农药污染方面的应用 我国是粮食蔬菜生产及输出大国，粮食蔬菜种植的产量和质量情况与人民的 健康及生活水平息息相关，而病害是制约作物生产可持续发展的重要因子，所以 防治病害是作物种植的一个重要方面【9 1 。化学农药作为一种重要的防害手段使用 范围非常广泛。近些年应用化学方法防治蔬果病害所带来环境污染以及耐药性等 问题也得到人们的高度关注，化学农药除了在生产过程中因“三废”的排放而污染 环：境外，尚在运输、贮藏、分装、销售过程中发生污染 】。更主要的是在农田 喷施化学农药时的污染。农田喷粉剂时，仅有1 0 的农药附在植物体上，其余部 分约有4 0 一5 0 漂浮于空气中。落于地面上的化学农药又会随降雨形成的地表 径流而流入水域，或下渗进入土壤。这样化学农药就会扩展到大气、水体及土壤 中而造成农业环境污染 1 1 。我国农业环境污染和农产品化学品残毒的现状令人担 忧，科学家发现有约9 6 万种化学品进入人类环境，其中有一些属于对人类危害 极大的有毒污染物，被列为“环境优先污染物”，它们具有如下特点：1 、在自然 界难以降解；2 、在环境中有一定的残留水平，具有生物累积性；3 、具有三致作 用，即致癌、致畸、致突变，或具有毒性；4 、对人体健康或生态环境有潜在威 胁。1 9 9 6 年美国公布环境优先污染物黑名单有1 2 9 种，我国有5 2 种，其中涉及 农业领域有6 种农药：西维因、除草醚、敌敌畏、对硫磷、艾氏剂、狄氏剂。欧 洲禁用的有机磷化合物仍为我国主要农药品种。有毒化学品通过进入动植物体 青岛理工大学工学硕士学位论文 内，再通过食物链进入人体。农药残毒对人体危害极大。例如有机氯杀虫剂有 6 0 渗透残留在稻米的白米部分；作为果树化学疏花剂的西维因7 8 残留在水果 果肉部分。 由此可见化学农药对环境的污染和人体健康的危害已经成为一个不容忽视 的问题。从环境保护和人类健康的角度考虑，从天然植物中寻找抗菌防害物质， 特别是有新型分子结构和作用机理的化合物成为了现代农药发展的一个新方向。 植物源农药低毒害、残留少、选择性好、成本低、不污染环境，所以研究开发植 物源农药慢慢成为防治植物病害的重要手段之一 1 2 】。“十五”期间，我国许多具 有自主知识产权的防治粮食蔬菜病害的新型生物药剂获得登记，为粮食蔬菜病害 的生物防治提供了广阔的选择空间 13 1 。有关植物源杀菌剂方面的研究报道也较 多 1 刚，但目前所登记的新药剂主要来源于陆源植物。如杨红兵等报道了六 种藜科植物提取物对植物病原菌的抑制活性，发现这六种植物的提取物对供试细 菌或真菌都有一定的抑制活性，有的抑制活性非常好。除了陆源植物外，我国海 域辽阔，海洋资源也十分丰富。所以近些年来，越来越多的人们把目光投向了海 洋，希望从海洋植物或微生! 物中开发出新型的活性物质，用于植物病害的生物防 治。 关于海洋生物在植物病原菌抑制及代替化学农药方面的应用，国内研究者的 报道也逐渐多了起来。江红霞，郑怡等根据r o b l e s c e n t e n o 等【1 9 】与徐年军等 2 0 的报道，利用薄层层析法分类藻类样品，对4 种常见微藻的粗提物进行了分离纯 化，并研究了各组分对3 种植物病原菌的抑制活性，结果明确了4 种微藻对3 种植物病原菌都有抗菌活性，尤其是分离后的娇柔塔胞藻和铜绿聚球藻的苯洗脱 组分对瘟病菌的抑制活性最强；马桂珍等【2 1 1 报道了海洋放线菌对几种蔬菜病原 菌的抑制活性，筛选出7 个菌株对部分蔬菜病原菌有抑制作用。在大型海藻方面， 林熊平等2 2 3 研究了褐藻羊栖菜对植物病原菌的抑制活性，并对其化学成分进行 了分析。研究结果发现，羊栖菜脂溶性化合物的强极性脂具有较强的抗玉米大斑 病菌活性，而乙醇提取物也分别表现出不同的抑菌活性。另外他们还对褐舌藻和 铁钉菜进行了抑菌活性研究2 引。结果表明，羊栖菜、褐舌藻和铁钉菜的抗细菌 活性都好于抗真菌活性，而大部分薄层层析分离组分的抗菌活性要强于未分离前 的海藻粗提物。 青岛理工大学工学硕士学位论文 综上所述，海藻作为海洋生物中的一大类，廉价易得、产量丰富，且有的藻 类已被证实抑病原菌活性较好，有望成为新型植物源农药，从而达到减少化学农 药污染的目的。所以这类研究有较好的应用前景。 1 2 海藻在处理重金属废水方面的应用 重金属废水来源广泛，涉及金属冶炼加工、采矿业、电镀、农药、油漆等行 业。重金属污染源主要包括镉( c d ) 2 2 】、铅( p b ) 2 5 】、锌( z n ) 2 6 】、汞( h g ) 嘲等等。在 工业发展过程中，排放到环境中重金属废水量也逐年增加，对环境水体及土壤等 造成了极大的污染破坏。由于重金属废水毒性强，不可降解，随着食物链进入人 体，使人体慢性中毒而造成严重危害。日本“水俣病”是由汞中毒引起的，“痛痛 病，是由镉引起的，这都是重金属给人体带来危害的典型事例28 1 。重金属废水传 统的处理方法主要有：化学沉淀法、活性炭吸附法、电解法、离子交换树脂处理、 膜分离法等。这些方法各有缺点：费用太高、周期太长；产生二次污染；吸附量 不够大；处理过的污水达不到国家要求的排放标准等。而一些新型的处理方法如 纳米技术、基因工程等又因为不易操作成本较高等原因得不到广泛应用。利用生 物吸附剂来处理重金属废水是近十年发展起来的新方法。目前国内外出现了利用 生物材料如藻类、细菌、真菌等做吸附剂来吸附废水中重金属的方法，并取得良 好的处理效果 2 9 1 。 吸附重金属的海藻可分为多细胞藻和单细胞微藻，单细胞微藻需要人工培 养，成本高且产量低。而海边一些常见的大型海藻，成本低廉产量丰富，具有良 好的应用前景。目前有研究发现褐藻门中的鼠尾藻、马尾藻等对重金属离子的去 除效果较好，耐受性也较高。利用藻类来吸附重金属离子具有很多优点：原料来 源广、产量大，不会造成二次污染，反应条件温和，吸附速度快，选择性好去除 率i 高等等。 褐藻门中的鼠尾藻、马尾藻等已证明对废水中的重金属离子具有较高的耐受 性：和吸附性。王宪等3 0 1 以经预处理后的褐藻粉为吸附剂，对稀释后的福建新文 行灯饰有限公司的电镀废水进行处理，发现a u 2 上、a g + 、c u 2 + 、n i 2 + 在褐藻粉上 1 0 m i n 即达吸附平衡；随着n 寸l q 的推移，吸附量均略微增加。以褐藻粉为生物吸 附介质的生物吸附方法可用于处理高浓度的含a u 2 t 、a 矿、c u 2 十、n i 2 + 的电镀废 4 青岛理工大学工学硕士学位论文 水和回收废水中的贵重金属。r a t h i n a ma r a v i n d h a n 等3 1 1 利用大量的褐藻来去除 制革废水中的铬，研究结果表明马尾藻是最适合去除铬的材料。而负载了铬的海 藻可成功应用于b c s 的制备，所以海藻去除重金属不仅不会带来二次污染，而 且还可以将重金属回收利用，是极具前途的天然吸附剂。 1 3 海藻在治理赤潮方面的应用 由于沿海水域的富营养化，赤潮问题目前己成为全球性的环境问题。我国每 年都会因赤潮而引发沿海地区严重的环境、生态问题，造成的经济损失也很巨大。 在赤潮防治方面，有物理法、化学法、生物法等治理有害藻体的方法。物理法和 化学法只能暂时去除水体中的赤潮生物，而且添加外源物质可能对海水造成污 染，也会影响海洋生态系统。因此近年来添加海洋生物因子来抑制赤潮的发生成 为研究的热点。大型海藻作为易得量大的海洋生物来源也逐渐受到研究者的关 注。在水生生态系统中，大藻与微藻之间存在着拮抗关系，已经有研究表明，多 种大型海藻对赤潮有害藻体具有抑制作用【32 1 。大型海藻是海洋生态系统的初级 生产力，分布广泛，收集方便，有可能成为一类较好的生物抑藻剂或杀藻剂。 冯朝 33 发表了缘管浒苔、蜈蚣藻和鼠尾藻对东海原甲藻克生效应初步研究 的论文，得到如下结果：三种大型海藻的新鲜组织和干粉末对东海原甲藻的生长 均有强烈的抑制作用，证明了三种海藻对东海原甲藻具有克生效应且具有普遍 性。许妍等 3 4 研究了包括海黍子在内的几种大型海藻对赤潮异弯藻( h e t e r o s i g m a a k a s h i w o ) 生长的抑制效应，实验得出结论：孔石莼和缘管浒苔对赤潮异弯藻的 抑制效应最强，石花菜次之；扇形拟伊藻、海黍子等也有抑制效应。 1 4 海藻在海洋防污方面的应用 海洋污损生物是指附着和生长在船舶和各种水下设施表面的动物、植物 和微生物【35 1 。船舶及海中设施因海洋污损生物生长造成的危害为生物污损。 全世界每年由生物污损造成的损失巨大，必须采取相应措施进行防污。对船 舶而言，外壳水下部位最有效的防污措施是涂装防污涂料。而传统防污涂料， 以有机锡和滴滴涕等有毒防污剂的毒杀方式达到防污目的，却对海洋环境造 成严重污染。因此，新型无毒环保型防污材料研究成为海洋防污技术研究的 青岛理工大学工学硕士学位论文 热点。其中，从生物体中分离提取防污活性物质是重要途径之一。 目前防污方法急待解决的问题是如何真正实现环保、高效、节能，未来 的防污材料必须是真正无毒，环境友好或可生物降解的新型无毒防污涂料。 国内外研究的无毒防污方式主要有：电解海水防污、硅酸盐防污涂料、仿生 防污涂料。其中仿生防污又包括低表面能、仿大型海洋哺乳动物表皮状态以 及提取天然生物防污活性物质。特别是天然防污活性物质，安全环保、对海 洋生物无毒副作用，是理想的环境友好型防污剂。 海洋天然产物防污研究始于1 9 世纪8 0 年代，但由于当时的提取分离及化 学合成水平有限，且对防污机理缺乏研究，防污成效不大。直到最近，随着各 面技术水平的提高，其独特的防污作用机理和高效的防污活性重新引起人们注 意。目前，人们已对多种海洋植物、海洋动物( 主要为海洋无脊椎动物) 和海 洋生物进行了研究，并获得了一系列具有防污活性的天然产物，包括有机酸、 无机酸、内酯、萜类、酚类、甾醇类和吲哚类等天然化合物【36 | 。这些物质具 有麻醉、排斥和防粘附的作用，并能很快地降解，不危害生物生命。人们将这 些活性物质加入涂料中，保持其活性，开发了既具有防污特性又不危害海洋生 物，有利于保持海洋生态平衡的防污涂料。 许多海洋褐藻中也含有天然防污活性物质。褐藻多酚是从褐藻中获得的 主要活性物质，l a u 等 3 7 1 发现其单体间苯三酚一种是极具防污潜力的物质。 w i s e s p o a g p a n d 等 3 8 发现圈扇藻( z 0 胛口r 施d z 鲫z 愕记咒“) 提取的3 种不同酰基侧链 的间苯三酚具有明显的抗菌效果。t o d d 等3 9 1 对大叶藻进行了研究，他们首次 从大叶藻中分离出p 一肉桂酸硫酸酯，一种能有效地抑制海洋细菌和纹藤壶附 着且安全无毒的活性物质。此外，他们还发现人工合成的酚酸硫酸酯类似物 与天然产物相比，具有相似的防污活性，其e c 为1 0 # g c m 2 左右，但不含有硫 酸基的化合物不具有防污作用。y a n n i c kv i a n o 等利用氯仿甲醇( 1 ：1 ) 混合溶 液从地中海网地藻( d e 砂o t as p ) 中得到活性物质，并经多步分离纯化，借助i r ， h r e s i m s ，1 d 、2 dn m r 波谱数据分析，得到了4 种新型环形二萜和几种已 知代谢物的分子结构。防污活性评价显示，化合物1 3 、1 4 、1 6 1 9 具有抑制海 洋细菌生物膜( p s e u d o a h e r o m o n a ss p d 4 1 ) 黏附的性能，其e c s o 分别为1 1 0 脚、 2 5 0 z m 、1 0 0 z m 、3 0 m 、2 3 0 a m 、3 3 0 a m 。g e r a l dc u l i o h 等 4 1 】从岩衣藻( 胁，f 西声 6 青岛理工大学工学硕士学位论文 肼均u o s a ) 的有机提取物( ：氯仿，甲醇混合溶剂) 中分离得到了9 种四烯基喹 啉类似物，防污测试显示，活性成分化合物2 2 、2 6 、2 9 能够有效抑制4 种细菌 生长( m i c 2 5 b t g m l ) 幂t l 藤壶金星幼虫的附着( e c l o o g g m l ) 。r e d o u a n em o k r i n i 掣4 2 1 从囊 叶藻( c y s t o s e i r ab a c c a t a ) e o 分离得到了7 种新型倍半萜烯和几种衍生物，2 d n m r 和m s 分析得到了它，f j 、 的分子结构，并经防污评价显示，化合物3 3 、3 4 、 3 6 能够抑制微藻和大型藻附着生长( m i c 均为1 t g m l ) ，影响贻贝酚氧化酶的 活性，但对海胆幼虫、牡蛎并没有毒性。m a r e c h a l 等 4 3 1 研究了不同月份的双 叉藻( b i f u r c a r i ab i f u r c a t e ) 天然提取物对纹藤壶金星幼虫附着的影响，发现在 相同浓度下5 、6 月的提取物较其他时期能更有效地干扰藤壶幼虫的附着。 2 1 海黍子简介 第二= 南海黍子研究现状 海黍子( s a r g a s s u mk j e l l m a n i a n u m ) ，隶属于褐藻门( p h a e o p h y t a ) 、无孢子纲 ( c y s t o s p o r e a e ) 、墨角藻目( f u c a l e s ) 、马尾藻科( s a r g a s s a c e a e ) 、马尾藻属 ( s a r g a s s u m ) 。新鲜藻体呈暗褐色，高5 0 1 0 0 c m ，有的可达2 3 m 。固着器为盘 状，直径1 c m 左右。主干圆柱状，单条或分枝一次，高2 3 c m 。气囊生在次生 枝与三生小枝上，越靠近枝的末端越多，幼囊为纺锤形或长椭圆形，成熟时为亚 球形或倒梨形，顶端圆滑。多生长在低潮带石沼中以至大干潮线下4 米深处的岩 石上，且多在背浪的地方。海黍子是我国黄、渤海沿岸比较常见的种类，为北太 平洋西部特有的暖温带性海藻。除我国外，还分布在千岛群岛和日本沿岸 4 4 1 。 其生物量大、易于采集，并含有丰富的生物活性成分，开发潜力巨大。有大量研 究表明其具有抗肿瘤、免疫调节、抗凝血等作用，也因具有软坚散结、利尿消肿、 消热化痰之功效，己被收藏于中国海洋药物辞典，主治淋巴结核、淋病、甲 状腺肿大、心绞痛等症。 虽然海黍子作为天然药物的研究较多，但是在环境保护方面的研究却不多 见，本文初步筛选了海黍子对植物病原菌和常见致病细菌的抗菌效果，并对其化 学成分进行了分离纯化，为海黍子在环境防污、作为一种植物源农药治理化学农 青岛理工大学工学硕士学位论文 药污染方面的应用提供了资料。 2 2 海黍子主要应用现状 海黍子最初被作为肥料使用，后来也发展为制造褐藻胶的原料之一【45 1 。随 着研究深入，海黍子目前的应用也开始涉入到抗氧化、抗肿瘤、抑制细菌、处理 重金属废水等药物及环保方面。 2 21 海黍子抗氧化活性 多不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸，它具有多种生理功能，参与人体多种生 命活动，维持人体正常生长发育。在正常生理情况下，脂质过氧化物含量较低， 即使有少量存在也会及时被体内自由基清除剂转化成无害物质，但在病理情况 下，外源性( 如毒物、辐照) 物质可间接引发脂质氧化，内源性( 如活性氧) 物 质增多，以及机体内抗脂质氧化能力下降时，都能引起脂质过氧化反应的发生或 加强，进而对机体造成伤害。研究表明，脂质的过氧化与心脏病、癌症、炎症及 衰老等有关【4 6 】。因此，寻找天然抗氧化成分并研究防止脂质氧化越来越受到人 们的重视。近年来研究发现海藻提取物，如多酚类物质，很多都具有很高的抗氧 化性能，且表现出比人工合成氧化剂更良好的特性及安全性。 s n l i n 等 4 7 研究了海黍子提取物的抗氧化活性，发现其甲醇粗提物在r b c 抗溶血和抑制脂质过氧化实验中均表现出很强的活性；于广利，薛长湖等t 4 8 1 币0 用自由基引发氧化体系对青岛2 4 种海藻进行了抗氧化活性筛选，发现海黍子具 有较强的抗氧化活性，又对海黍子提取物进行了初步研究，表明其f r 2 组分抗氧 化活性较高，在一定浓度时效果优于b h t 和维生素e 。 2 2 2 海黍子抗菌活性 近几年兴起的海洋药物中抗菌活性物质的分离纯化成为的一个重要部分，并 且越来越受到人们的重视。上个世纪六十年代以来，人们从几百种海藻中筛选出 了许多种抗细菌和抗真菌的海藻。近些年来，国外海藻抗菌活性的筛选的研究报 道已经有很多4 9 规 ，也有报道从海藻中分离出了许多具有抗菌活性的化合物【5 3 。 青岛理工大学工学硕士学位论文 同时，这些具有抗菌活性的海藻中的有效成分已经逐渐被确定，主要包括萜烯、 脂肪酸、溴酚、氢醌、间苯三酚以及脂环或含硫杂环化合物等。随着科技的进展， 一些新的生物活性检测和筛选方法如琼脂平板法等的建立，海藻活性成分的抗菌 生物活性研究领域已经取得很：大的成果。目前海黍子在抗菌活性方面也有一些研 究发现，但其研究不多且多集中在抑制细菌方面，用于真菌抑制方面的研究几乎 没有，本论文会针对海黍子的抗真菌活性做一些研究。 徐年军，范晓等 5 4 研究了海黍子多酚的抗菌活性，结果显示海黍子的三个 层析带都有抗金黄色葡萄球菌活性且较强。师然新，徐祖洪 5 5 3 研究了青岛沿海 常见的9 种海藻的抗菌能力。结果表明海黍子的提取物对大肠杆菌和枯草杆菌均 有一定的抑制作用。 2 2 3 海黍子抗肿瘤活性 关于海藻的抗肿瘤活性研究，从5 0 年代起就有记录。由于海藻的生物多样 性、多变的生态环境和原始的进化地位而使其拥有许多结构独特的活性物质。8 0 年代初美国科学家开始系统的筛选蓝藻及其他藻类的抗肿瘤活性，发现了许多新 的化合物，如从伪枝藻中提取的s c y t o p h y c i nb 已进入临床阶段，从松香藻中分 离的h a l o m o n 目前也进入临床前药理评估阶段。从藻类中分离出来的其他抗肿 瘤物质如c r y p t o p h y c i n 等作用机理及药理效应已弄清楚，m a l y n g a m i d e s 等的结 构已经清楚，毒理实验也已经完成 5 6 。g u v e n 掣5 7 】手旨出了1 4 种绿藻、2 3 种褐藻 和7 种红藻具有抗肿瘤活性。现在的科学研究表明，具有抗肿瘤活性的海藻种类 不下四五十种，其中就包括海洋褐藻海黍子。 方玉春，宋瑾等【5 剐在对海黍子、裙带菜等1 8 种海洋生物进行抗肿瘤活性筛 选的研究中发现，海黍子的甲醇提取物具有很好的抗肿瘤活性，后续研究还发现 了海黍子的水溶性物质是其主要的抗肿瘤活性物质。 2 2 4 海黍子在废水处理中的应用 在重金属废水处理方面，第一节中已有详细介绍。除了第一节中所提到的褐 藻对重金属铬的吸附，还有：很多海黍子对其它重金属的吸附研究。 常秀莲等 5 9 】采用廉价的多细胞褐藻海黍子对重金属镉进行吸附研究，得出 9 青岛理工大学工学硕士学位论文 结论，海黍子极易脱色及溶解出其它可溶性组分，而且不会给吸附体系带来二次 污染；吸附适宜的p h 范围较广，为3 v 6 。冯咏梅等 6 0 】采用海黍子对重金属镍离 子进行吸附研究，并做了动力学实验得到了海黍子吸附镍的动力学方程。且得出 结论海黍子对镍离子的最大吸附量为o 8 2 8 3 m m o l g ，高于文献中其它藻类对镍 的吸附量。吸附等温线可以很好的用l a n g m u i r 方程来拟合。 除了在重金属废水处理方面的应用，还有研究发现海黍子可作为一种生物吸 附剂来处理染料废水。r u b i n 等6 1 1 发现海黍子可以作为生物吸附器去除水溶液中 的亚甲基蓝( m e t h y l e n eb l u e ) 。 由于海黍子不需特殊预处理对环境部造成污染，并且成本低廉产量丰富，故 有望成为处理废水的新型生物吸附剂。 2 3 海黍子主要化学成分 有关海黍子化学成分的系统报道不多，有一些国内外学者对海黍子进行过针 对性的活性物质及营养成分研究。 一般来说，海藻生物活性物质大致可以分为两类：一类是难以被消化吸收的 细胞间的粘性多糖，主要包括褐藻中藻酸、褐藻糖胶，红藻中琼胶、卡拉胶等； 另一类是分子量较小，吸收后能直接或间接影响体内代谢物质，主要包括卤族化 合物，萜类化合物，溴酚类化合物，对苯二酚，海藻单宁，昆布氨酸等 62 l 。研 究发现褐藻中含有多种活性物质【6 引。 综合国内外对海黍子进行过的各方面研究发现，海黍子马尾藻中所含的活性 物质主要为褐藻多酚、褐藻胶、不饱和脂肪酸、甾醇类等，同时还含有氨基酸、 维生素和矿物质等营养成分。本文第三章将系统研究海黍子的化学成分。 2 3 1 褐藻多酚化合物 褐藻多酚是仅存在与褐藻中的一类天然产物，是一组分子量分布复杂的化合 物，其结构单元是间苯三酚。在中国常见的褐藻中，如海带、海黍子、羊栖菜、 鼠尾藻等，均含数量不等的多酚，其中海黍子多酚含量最高，达干重的2 8 6 4 1 。 褐藻多酚具有多种生物活性：络合金属离子，抑制微生物生长，抑制附生藻类生 长等等，褐藻多酚还具有脱臭作用6 邹。因此在环境方面有广阔的应用前景。国 1 0 青岛理： 大学工学硕士学位论文 外学者对黑海划6 6 1 和空茎昆布6 7 1 等海藻中多酚类物质的提取方法、含量、抗氧 化性能等都有一定研究。对于多酚化合物的活性研究多见于抗氧化活性，除此之 外抑菌活性也逐渐引起了人们的关注。 吕志华，于广利等6 8 垮彩用萃取硅胶柱层析分离技术，从海黍子( s a r g a s s “m k j l l m a n i a n u m ) 中分离获得4 种海藻多酚类物质，用油溶性自由基引发齐i j ( a m v n ) 引发氧化亚油酸甲酯( m e t h l i n o l e n a t e ，m l ) ，用h p l c 测定亚油酸甲酯氢过氧化物 ( m l o o h ) 含量，以b h t 为对照，评价了海黍子多酚类物质的抗氧化能力。结 果显示4 种海藻多酚对亚油酸甲酯氧化都有抑制效果但效果大小不尽相同，这可 能与多酚结构有关；而海黍子多酚对m l 氧化的抑制作用均比b h t 好。 褐藻多酚还是一类电化学活性物质，可作为工业脱硫剂来源，对无机硫有机 硫都很有效。将多酚制成多酚一金属盐络合物，可以有效吸附硫化氢、硫醇和氨 气，用来去除异味净化室内空气 6 9 1 。 林超、于曙光等 7 0 】研究了马尾藻鼠尾藻中多酚化合物对几种细菌的抑制效 果。在一定浓度下，鼠尾藻的褐藻多酚化合物对大部分供试菌种都有明显的抑菌 活性，对金黄色葡萄球菌和两种海洋细菌的抑制效果尤其明显。由此推测海黍子 多酚也可能含有对此类菌种的i i 印制活性物质。本论文将对海黍子提取物抑菌活性 做详细研究。 2 3 2 褐藻胶 海黍子内多糖类物质含量很高，可达5 0 以上 7 1 ，其中褐藻胶已经工业化 生产。褐藻胶是褐藻所特有的种细胞间质，是一种粘性多糖【7 2 1 。其分子常由 d 一半乳糖、3 , 6 一内醚，l 半乳糖、d 一木糖、d 一甘露醇、d 葡萄糖及褐藻糖等构成。 商品褐藻胶通常是指褐藻酸钠，由于其能溶解二j 二水，形成粘稠的水溶液，在 临床上可作血浆代用品使用。；褐藻胶对p b 、s r 等金属还有阻吸作用，并有助于 对这些重金属的排泄与清除。临床应用的藻酸双酯钠( p 0 1 y s a c c h 撕d es u l f a e ，p s s l 是在褐藻酸钠分子的羟基及羧基上分别引入磺酰基及丙二醇基而形成的双酯钠 盐，它有明显的抗凝血、降血压、降血脂、降低血粘度与扩张血管以及改善微循 环的作用，可用于治疗高脂血症和缺血性心、脑血管疾病。p s s 的换代产品甘糖 酯( p r o p y l e n eg l y c o lm a n n u r a t es u l f a t e ，p g m s ) ，对治疗急性脑梗塞也有显著的疗 效。其他的同类