（预防兽医学专业论文）美国红鱼致病性弧菌分离鉴定与免疫防治技术研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 美国红鱼学名眼斑拟石首鱼( s c i a e n o p so c e l c a t u s ) 属鲈形目、石首鱼 科、拟石首鱼属，为浙江、福建主要养殖鱼类之一。近年来，随着养殖集 约化发展，美国红鱼病害频繁爆发，严重制约着其人工养殖业的发展，产 业的可持续发展急需对其病害进行免疫防治技术研究。本文分析了从患溃 烂症的美国红鱼体内分离到的优势菌株m 1 的致病性和分类学地位，并对 培养条件进行了优化，进一步研究了用该菌制备的灭活疫苗对美国红鱼的 免疫效果，最后又对中草药制剂对影响美国红鱼免疫的机能进行了探讨。 获得的结果如下： 1 、从患溃烂症的美国红鱼分离到优势菌株m 1 ，人工感染实验证实该 菌为美国红鱼的致病菌。对该细菌进行了形态学、生理生化特性分析，同 时测定了菌株m 1 的1 6 sr r n a 和h s p 6 0 基因序列，分析相关细菌相应序列 的同源性，构建了系统发育树。1 6 sr r n a 基因构建的系统发育树显示， 菌株m 1 与灿烂弧菌( a j 8 7 4 3 6 1 ) 的亲缘关系最近，具有9 6 1 的同源性； h s p 6 0 基因序列分析表明m 1 与弧菌( e u 6 5 3 8 8 3 ) 聚为一个分支。综合上述 结果，可鉴定菌株m 1 为灿烂弧菌，命名为灿烂弧菌m 1 菌株( v i b r i o s p l e n d i d u sm 1 ) 。药敏实验证实该菌株对菌必治、复方新诺明、先锋必 等9 种药物敏感。 2 、采用梯度法比较了培养时间、温度、盐度、初始p h 值、菌液起始 浓度等对灿烂弧菌m 1 菌株生长的影响；采用正交试验法对z o b e l l2 2 1 6e 培养基组分进行了优化。结果表明：m 1 菌株产最大活菌数的培养条件为： 培养时间4 8h 、温度3 2 、盐度4 0 、初始p h 值8 0 、菌液起始浓度为l x l 0 5 c f u m l ；最佳培养基成分为：蛋白胨7 5g l 、酵母浸出膏1 5g l 、c u s 0 4 0 0 7 5m g l 、c a c l 20 0 4g l 。 美国红鱼致病性弧菌分离鉴定与免疫防治技术研究 3 、制备灿烂弧菌福尔马林灭活疫苗。通过浸泡、注射和口服等3 种方 式接种美国红鱼，分别在接种免疫后第7 、1 4 、2 1 、2 8 、3 5d 采鱼血，检 测其血清抗体效价、溶菌酶活力和白细胞吞噬活性；第2 8d 用 1 0 1 0 8 c f u m l 的灿烂弧菌菌悬液进行攻毒试验来比较疫苗的免疫效果。 结果表明，各免疫组血清抗体效价在第2 1d 达到峰值，且浸泡组和注射组 的血清抗体效价高于口服组；在3 5d 实验期内，各免疫组的血清溶菌酶活 力有明显提高，各浸泡组和注射组于免疫接种后1 4d 显著高于对照组水平 ( p 0 0 5 ) ；除浸泡组3 外，其余各免疫组的白细胞吞噬百分比( p p ) 和 吞噬指数( p i ) 在免疫接种后1 4d 均较对照组有显著升高( p 0 0 5 ) ；各 组受免鱼对人工攻毒均具有保护作用，注射组2 的免疫保护率最高达7 7 8 。 4 、用分别含连翘、猪苓、黄芩、茯苓和黄连水提取物的配合饵料饲喂 美国红鱼，研究其对美国红鱼生长和免疫机能的影响。结果表明：投喂含 有黄芩和茯苓的药饵可使美国红鱼的体长增长率和相对增重率显著高于 对照组( p 0 0 5 ) ；投喂5 种含中草药的药饵后，美国红鱼血液白细胞的 吞噬活性有明显提高，投药后3d ，除茯苓组外，其余各组吞噬百分比( p p ) 比对照组极显著升高( p o 0 1 ) ；在投药后3d 或7d ，连翘、黄芩和黄连 组的吞噬指数( p i ) 与对照组相比有显著( p 0 0 5 ) 或极显著( p 0 0 1 ) 升高。在停投药饵后7d ，除茯苓组外，其余各组p p 、p i 与对照组相比仍 有显著差异( p 0 0 5 ) 。同时，美国红鱼血清溶菌酶活性也有显著提高， 投药后7d ，溶菌酶活性与对照组之间差异极显著( p 0 0 5 ) ；投药2 8d 后， 利用哈维氏弧菌人工感染美国红鱼，黄芩组的相对免疫保护率最高，达 8 8 9 ，连翘组次之，茯苓组最低。 关键词：灿烂弧菌；1 6 sr r n a 基因；h s p 6 0 基因；免疫效果 2 山东农业大学硕士学位论文 a bs t r a c t s t u d i e so ni s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n di m m u n o l o g y , p r e v e n t i o nt r e a t m e n tt e c h n o l o g ya g a i n s tp a t h o g e n i ch b r i o s c i e n t i f i cn a m es c i a e n o p so c e l l a t u s ，b e l o n g e dt op e r c i f o r m e s ，s c i a e n i d a e ，r e d d r u mg e n u s ，i so n eo ft h em a i nk i n d sf i s hi nz h e j i a n ga n df u j i a n ，i nr e c e n ty e a r s ，w i t h a q u a c u l t u r ed e v e l o p m e n ti n t e n s i v e l y ，d i s e a s e so fs c i a e n o p so c e l c a t u so u t b r e a kf r e q u e n t l y ， s e r i o u s l yr e s t r i c t i n gt h ed e v e l o p m e n to fa r t i f i c i a lb r e e d i n gi n d u s t r y s oi no r d e rt o s u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n ti ni n d u s t r i e s ，i ti su r g e n tt or e s e a r c hi m m u n ep r e v e n t i o na n d c o n t r o lt e c h n o l o g yo fd i s e a s e s t h ep a t h o g e n i c i t y ，t a x o n o m i cs t a t u sa n d o p t i m i z a t i o no f c u l t u r ec o n d i t i o n so fs t r a i nm - 1w h i c hw a si s o l a t e df r o mt h ed i s e a s e ds c i a e n o p so c e l l a t u s w i t hu l c e r a t i o nw e r es t u d i e d ，f u r t h e rr e s e a r c h e dt h es c i a e n o p so c e l l a t u si m m u n e e f f i c a c y i n d u c e db yk i l l e ds t r a i nm - 1v a c c i n e ，f i n a l l yd i s c u s s e dt h ec h i n e s eh e r b sa n dt h ei m p a c t s o nt h ei m m u n ef u n c t i o no fs c i a e n o p so c e l l a t u s t h er e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 ab a c t e r i a ls t r a i nn a m e dm 一1w a si s o l a t e df r o mt h ed i s e a s e ds c i a e n o p so c e l l a m s w i t hu l c e r a t i o n a r t i f i c i a li n f e c t i o nt e s tw i t ht h o r a c i cc a v i t yi n j e c t i o n ( 0 2 m lp e rf i s h ) p r o v e dt h a ts t r a i nm - 1w a st h ec a u s a t i v ep a t h o g e na s s o c i a t e dw i t ht h ed i s e a s e s t r a i nm 1 w a si d e n t i f i e da sh b n os p l e n d i d uw i t hm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l m e t h o d s 1 6 sr r n ag e n ea n d6 0k uh e a ts h o c kp r o t e i n ( h s p 6 0 ) g e n es e q u e n c ef u r t h e r p r o v e dt h a ts t r a i nm 1n e a r e s tt ov s p l e n d i d u s g cc o n t e n to f1 6 sr r n ag e n eo fs t r a i n m - 1w a s5 3 。7p e r c e n t ，d o s e dt ov i b r i o s p p h y l o g e n e t i ct r e eo fv i b r i o s pb a s e do n1 6 s r r n ag e n ea n dh s p 6 0g e n eb o t hi n d i c a t e dt h a ts t r a i nm - 1s h o w e dt h eh i g h e s tl e v e lo f s i m i l a r i t yt oe s p l e n d i d u s t h eo p t i m u mr a n g eo fs a l i n i t y ，t e m p e r a t u r ea n dp hw e r e3 0 - 5 0 ， 2 8 3 7 ，7 0 - 9 0r e s p e c t i v e l y t h er e s n i t so fs e n s i t i v i t yt o1 7k i n d so fa n t b a c t e r i a la g e n t s 3 美国红鱼致病性弧菌分离鉴定与免疫防治技术研究 s h o w e dt h a ts t r a i nm - 1w a ss e n s i t i v et oc e f t r i a x o n e ，t r i m e t h o p r i m - s u l f a m e t h o x a z o l ea n d c e f o b i de t c t h i sp a p e rr e v e a l e df o rt h ef i r s tt i m et h a tt h ec a u s a t i v ep a t h o g e nl e a d i n gt o t h em a s sm o r t a l i t yo fs c i a e n o p so c e l l a t u si nt h eg u l fo fy u e q i n g ，w h i c hw i l lb eh e l p f u li n t h ed i s e a s ec o n t r o la n dh e a l t hm a n a g e m e n td u r i n gs c i a e n o p so c e l l a t u sc u l t i v a t i o n 2 t h ee f f e c t so fc u l t u r et i m e ，t e m p e r a t u r e ，s a l i n i t y ，i n i t i a lp h ，i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n o nt h eg r o w t ho fs t r a i nm - 1w e r es t u d i e db yg r a d i e n tm e t h o d ；c o m p o s i t i o n so fz o b e l l 2 2 1 6ec u l t u r em e d i aw e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a ld e s i g n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h e o p t i m u mt i m e ，t e m p e r a t u r e ，s a l i n i t y ，i n i t i a lp ha n di n i t i a lc o n c e n t r a t i o nw e r e4 8h ，3 2 ， 4 0 ，8 0a n dl x l 0 5c f u m lr e s p e c t i v e l y ；i na d d i t i o n ，t h eo p t i m i z e de l e m e n t so fc u l t u r e m e d i aa r e p e p t o n e7 5g l ，y e a s te x t r a c t1 5g 以c u s 0 40 0 7 5m g la n dc a c l 20 0 4g l 3 s c i a e n o p so c e l l a t u sw e r ev a c c i n a t e dw i t haf o r m a l i n - k i l l e dh b r i os p l e n d i d u s v a c c i n ev i ai m m e r s i o n ，i n j e c t i o na n do r a lr o u t er e s p e c t i v e l y ，r e s p e c t i v e l y a n t i b o d y t i t e r s ，l y s o z y m e s ，l e u c o c y t ep h a g o c y t o s i sw e r ee x a m i n e do n7 t “，1 4 啪，2 1 “，2 8 “da f t e r f i r s t v a c c i n a t i o n ，ad o s a g eo f0 2m lo f v i b r i os p l e n d i d u s1 o x l 0 8 c f u m lw a s i n t r a p e r i t o n e a u yi n j e c t e dt ot h ev a c c i n a t e df i s ht oe v a l u a t et h ep r o t e c t i v ee f f i c i e n c yo ft h e v a c c i n e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ：t h ea n t i b o d yt i t e r so fa l li m m u n i z e dg r o u pw a st h e h i g h e s to n2 1 吼da n dt h a to fa l li m m e r s i o ng r o u pa n di n j e c t i o ng r o u pw e r eh i g h e rt h a na l l o r a lr o u t eg r o u p ；l y s o z y m eo fa l li m m u n i z a t i o ng r o u p sh a si n c r e a s e ，a n da l li m m e r s i o n g r o u pa n di n j e c t i o ng r o u ps h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) a f t e r1 4 t h - v a c c i n a t i o n ；t h ep h a g o c y t i cp e r c e n t a g e ( p p ) a n dp h a g o c y t i c i n d e x ( p i ) o fa l li m m u n i z a t i o ng r o u p se x c e p ti m m e r s i o ng r o u p3w e r es h o w e ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) a f t e r1 4 t h - v a c c i n a t i o n ，1 4 da f t e rc h a l l e n g e w i t hh b r i os p l e n d i d u s ，t h er e l a t i v ep e r c e n t a g es u r v i v a l ( r p s ) v a l u e ss h o w e dt h a tt h e v a c c i n a t i o no fi n j e c t i o ng r o u p2w a st h eb e s to fa 1 1 4 f i v es p e c i e so fc h i n e s eh e r b s ( d r y ) 一f r u c t u sf o r s y t h i a e ，p o l y p o r u s ，r a d i x 4 山东农业大学硕士学位论文 s c u t e l l a r i a e ，p o r i aa n dr h i z o m ac o p t i d i s - w e r ee m p l o y e d e a c hs p e c i e s ，a tt h ew e i g h t r a t i oo f2o ad i e t ，w a sd e c o c t e dt h r e et i m e sa n de v e r yt i m ef o r3 0m i n t h et h r e et i m e so f s o l u t i o nw e r ec o n c e n t r a t e d ，a n dm i x e dw i t ht h ed i e t s ( m i x e dd i e t s ) t h es c i a e n o p s o c e l l a t u sw e r ef e dw i t ht h em i x e dd i e t sr e s p e c t i v e l y ，f o r2 8da n dt h e ns t o p p e dt oe a t n o r m a ld i e t t h ei n u - f l u n ei n d e x ，s u c ha sl e u c o c y t ep h a g o c y t i cp e r c e n t ( p p ) ，p h a g o c y t i c i n d e x ( p i ) ，a c t i v i t i e so fl y s o z y m e ( l z m ) ，w e r er e s p e c t i v e l ym e a s u r e do nt h e0 , 3 r d , 尹，1 铲， 2 1 3 ：2 8 山da n dt h e7 t hda f t e rs t o p p e dt oe a tn o r m a ld i e t n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t e m l e n g t hg r o w t hr a t ea n dr e l a t i v eg r o w t hr a t eo ft h er a d i xs c u t e l l a r i a eg r o u pa n dp o r i a g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o l ( n o r m a ld i e t ) g r o u p f o rt h ef i v eg r o u p s ， t h ep h a g o c y t i ca c t i v i t i e so fw h i t eb l o o dc e l li ns c i a e n o p so c e l l a t u si n c r e a s e dn o t a b l y ， b e s i d e si n d i v i d u a lc o n d i t i o n ，t h ep h a g o c y t i cp e r c e n t a g e ( p p ) a n dp h a g o c y t i ci n d e x ( p i ) w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p 3da f t e rt h em i x e dd i e t sw e r ef e d ( p 0 0 5 ) a n de x t r e m e l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l7 da f t e rt h et r e a t m e n t 7d a f t e rt h ef i s hs t o p p e df e e d i n gt h em i x e dd i e t s ，t h ep pa n dp 1w e r eb o t hs i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nc o n t r o lt h a t ( p 0 0 5 ) t h er e l a t i v ep e r c e n t a g eo fs u r v i v a lo f r a d i xs c u t e l l a r i a eg r o u pw a sh i g h e s t ，r e a c h e d8 8 9p e r c e n ta f t e rf e e d i n gt h em i x e dd i e t s f o r2 8d ，w h e r e a sp o r i ag r o u pw a sl o w e s t k e yw o r d s ：h b r i os p l e n d i d u s ；1 6 sr r n ag e n e ；h s p 6 0g e n e ；i m m u n ee f f i c a c y 5 英文缩略及细菌英文名列表 1 缩略词列表 缩略符号中文含义 p c r b p r n a d n a h s p e b m l n m l l m c m f k c p b s p i p p l z m r p s h s g d 聚合酶链式反应 碱基对 核糖核苷酸 脱氧核糖核苷酸 热激蛋白 溴化乙锭 分钟 摄氏度 毫升 微升 微米 厘米 福尔马林灭活菌苗 磷酸缓冲液 吞噬指数 吞噬百分比 溶菌酶 相对免疫保护率 小时 秒 克 天 2 细菌名称列表 拉丁名 中文名 a e r o m o n a sh雨录乖酾涵一ydrophila 嗜水气早腮困 1 4 b ，i os p l e n d i d u s 灿烂弧菌 li b ，i dv u l n i f i c u s 创伤弧菌 以c ，d c c “5l y s o d e i k t i c u s溶壁微球菌 s t a p h y l o c d c c “5a u r r e u s 金黄色葡萄球菌 li b ，i d 口i g i n d l y a c u s溶藻弧菌 v i b r i oa n g u i l l a r u m 鳗弧菌 1 4 b ，i dh a r v e y i 哈氏弧茵 扫，f dp 口r 砒口塑里生! 垄竺 型鳖垒墨堕 _ = _ _ = - 。一一一 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、：帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日 期：! 1 2 ：f 0 毁纷 础肇 美国红鱼致病性弧菌分离鉴定与免疫防治技术研究 己i 吉 丁i 仁l 海水养殖动物的弧菌病( m b r i o ) 是一种流行范围广，危害严重的传染性 疾病。据报道，由致病性弧菌引起的疾病可危害野生和人工养殖的鱼类、 甲壳类和瓣鳃类等多种水生动物，能对水产养殖业造成巨大的经济损失 ( r u c h e r , 1 9 5 9 ；h a s t e i n & h o l t ，1 9 7 2 ；h o r n e ，1 9 8 2 ；c o l w e u ，1 9 8 4 ；s m i t h ，1 9 8 8 ；a l a m ，1 9 9 6 ；殷战等，1 9 9 5 ；陈梅，1 9 9 9 ；俞开康，2 0 0 0 ；胡超群和陶保华，2 0 0 0 ； 钱云霞等，2 0 0 1 ；郑天伦等，2 0 0 2 ) 。因此，对水产动物弧菌病的研究一 直受到国内、外研究者的重视，也是海、淡水养殖动物病害的主要研究对 象之一。本文对水产动物弧菌病及其免疫防治方面的研究状况作简要综 述。 1 弧菌及弧菌病 弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于近岸、河口海 区的海水和生物体中，其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合 因素的影响较大，是一类条件致病菌。近年来，由于养殖水域生态变化， 弧菌已成为海水养殖动物的主要病原菌之一。因此，该类疾病一直备受国 内外研究工作者的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。 弧菌病是最早发现的鱼类细菌性疾病之一。引发弧菌病的病原性弧菌 最早是从患病的欧洲鳗鲡( a n g u i l na n g u i l 肠) 中分离到的，当时这种致病菌 被命名为鳗杆菌( b a c i l l u sa n g u i l l a ) ( c o n e s t r i n i ，1 8 9 3 ) ，b e r g m a n ( 1 9 0 9 ) 再次从患病欧洲鳗鲡中分离到致病性弧菌，在对其进行了比较详细的理化 特性鉴定后，将其更名为鳗弧菌( v r b r i oa n g u i l l a r u m ) 。从此对病原性弧菌 的研究成为研究水生动物病原菌的热点。迄今为止，作为病原菌分离报道 的致病性弧菌己达数十种之多，其危害的对象广泛( 详见表1 ) 6 山东农业大学硕士学位论文 表1 致病弧菌及其危害对象 t a b 1 p a t h o g e n i cv i b r i oa n di t sh o s tr a n g e 为控制弧菌病的爆发，国内外学者已经开展了大量流行病学的调查。 调查发现弧菌病的分布区域几乎为世界性的，其发生没有宿主的种属选择 性和地理上的差异，也无具体的季节和时间上的区分，在一年四季以及育 苗、养成和越冬等各个阶段都有发生，夏秋两季为多发季节，其流行适宜 温度为2 5 3 2 ，尤其在2 8 以上时流行极为迅速，几天之内即可造成养 殖动物的大量死亡。弧茵病多在高盐度的水体中流行。同时，弧菌病的暴 发还与养殖动物机体的机能状态有着重要关系。如种质条件较差( 因近亲 繁殖等) ，在养殖过程中，水体中的氨氮、硫化氢含量显著升高，养殖水 体溶氧显著下降，在恶劣的气候条件如夏季闷热无风或突降暴雨，引起盐 度和p h 值的急剧变化，以及养殖动物受到其他疾病如病毒、真菌、寄生 虫的感染等条件下，极易引起养殖动物的机能下降，病原弧菌乘机大量侵 入，从而引起弧菌病的暴发( 胡超群和陶保华，2 0 0 0 ；何义进，2 0 0 2 ；z h a n g e ta l ，2 0 0 3 ；r a j a n n ae ta l ，2 0 0 3 ) 。 此外，吴定虎和曾华伟( 1 9 9 1 ) 对养殖水体、底泥中弧菌的数量及温 7 美国红鱼致病性弧菌分离鉴定与免疫防治技术研究 度、溶氧等环境因子对弧菌的影响也进行了大量的研究。对弧菌的可能传 播途径和感染模式也进行了探索，尤其对经喂饲感染、浸浴感染等方式做 了大量的工作，这为弧菌病的防治研究提供了重要依据( l i g h t n e r l e w i s ，1 9 7 5 ；e g i d i u s ，1 9 8 7 ；王国良和薛良义等，2 0 0 0 ) 。 2 弧菌病的防治 弧菌对水产养殖业的危害已得到公认，目前，其病害防治主要有药物 防治、免疫预防和生态预防( 中草药制剂、微生态制剂) 等方法。传统的药 物防治是化学消毒剂及抗生素的大量使用，虽然具有方法简便、可控性好 等优点，但潜在的风险较大，药物残留问题引起的耐药性反应、变态反应、 中毒反应等对环境和人类健康的潜在威胁己初露端倪，加之该类细菌对常 规抗生素的耐药性日渐增强( 陈会波等，1 9 9 2 ) ，因此免疫防治被认为是 目前治疗弧菌病的最有效措施之一。自上世纪初期开始，日本和欧洲学者 在弧菌病的免疫预防方面就投入了大量的工作，并己取得了一些重要进 展，预防某些种类弧菌病的菌苗也已开始商品化生产。在开发菌苗的同时， 一些学者也对中草药、寡聚糖、左旋咪唑和维生素c 等免疫激活剂产生了 兴趣，分别研究了它们在预防弧菌病中的功效。 2 1 弧菌病的免疫防治 2 1 1 弧菌疫苗 接种疫苗是目前控制细菌性鱼病最有效的方法，弧菌疫苗是研究和开 发的最早、最成功的鱼用疫苗之- - o o h n s o n ，1 9 8 0 ；k a w a i & k u s u d a ，1 9 8 3 ；陈 辉和杨先乐，2 0 0 3 ) 。在国外，从上世纪7 0 年代v a n g u i l l a r u m 疫苗、病 海鱼弧菌( v o r d a l i i ) 疫苗问世以来，己陆续有杀鲑弧菌( v s a l m o n i c i d a ) 疫 苗、v p a r a h a e m o l y t i c u s 疫苗等投放市场( 徐德海等，1 9 9 2 ；杨坚等，1 9 9 8 ； 夏春，2 0 0 0 ；陈超然和陈昌福，2 0 0 1 ) 。近年来，国内也有不少研究单位 和学者开展了弧菌疫苗的研究工作，已开发的有石斑鱼的v v u l n i p c u s 疫 苗、河流弧菌( v f l u v i a l i s ) 疫苗、对虾弧菌疫苗、v a n g u i l l a r u m 口服胶囊疫 苗等( 秦启伟等，1 9 9 6 ；李太武和丁明进，1 9 9 7 ；丁橘等，1 9 9 9 ；陶保华等， 8 山东农业大学硕士学位论文 2 0 0 0 ：余俊红等，2 0 0 1 ：莫照兰等，2 0 0 2 ) ，但是，这些疫苗均处于试验 阶段，尚未商品化生产，主要障碍就在于各种弧菌的血清型存在多样性， 对弧菌的共同保护性抗原还不清楚。此外，养殖中大量使用疫苗是否经济， 也是制约弧菌疫苗开发和应用的重要因素。目前己商品化的弧菌疫苗均为 灭活全菌苗，关于菌体成分亚单位疫苗、减毒活疫苗、d n a 疫苗、合成 肽疫苗( 又称表位疫苗) 的报道还比较少见( m u n n ，1 9 9 4 ) 。 2 1 2 免疫途径 对鱼类实施免疫接种的途径有别于其他动物之处，其基本免疫方法共 有5 种：即注射法、浸泡法、口服法、喷雾法、插管法等( 陈奖励等，1 9 9 3 ； 陈怀青，1 9 9 5 a , 1 9 9 5 b ) 。各种免疫方法的特点如表2 所示。 2 1 2 1 注射法 注射免疫接种根据接种部位不同，又可以分为皮下注射接种、肌肉注 射接种和腹腔注射接种等3 种。其中腹腔注射接种是弧菌菌苗免疫接种最 常用的方法，也是进行鱼类免疫最有效的方法，如在上世纪的7 0 、8 0 年 代，美国和北欧地区就是采用该法对鲑( s a l m os a l a r ) 进行免疫接种的，并 取得了较好的效果( s m i t h ，1 9 8 8 ) 。 注射免疫能有效地利用抗原，保证适量的抗原准确进入受免鱼体，使 其获得较高的免疫效果，并能利用佐剂的作用，提高和延长免疫应答反应， 对某些疫苗，它是唯一有效的给予方式。但该方法也存在一定的弊端，会 因注射操作而使鱼体受伤，且需较多的劳动力，对较小的鱼注射也很不方 便( e v e l y m & k e t c h e s o n ，1 9 8 0 ；a m e n d & j o h n s o n ，1 9 8 1 ；a g u i se ta l ，1 9 8 3 ) ( 参 见表2 ) 。 2 1 2 2 浸泡法 a m e n d & f r e n d e r ( 1 9 7 6 ) 将虹鳟( s a l m og a i r d e n e r i ) 进行高渗处理后用牛 血清白蛋i 刍( b s a ) 浸浴，并采用组织切片法证实了b s a 已经进入鱼体，从 而开创了浸泡免疫的先河。随后，c r o y a m e n d ( 1 9 7 7 ) 用稀释的弧菌菌苗 直接浸泡免疫大麻哈鱼又获成功。在使用过程中，这种方法己经被证明对 多种鱼类疾病的免疫预防是有效的，也是目前弧菌免疫在应用得较多的免 疫接种途径。 9 美国红鱼致病性弧菌分离鉴定与免疫防治技术研究 表2 鱼类各种免疫方法的比较 t a b 2t h ec o m p a r eo fi m m u n i c a t i o nm e t h o df o rf i s h a u s t i n ( 1 9 8 3 ) 采用浸泡接种免疫预防日本鳗鲡的弧菌病获得成功。a o k i 等( 1 9 8 7 ) 用此法把养殖香鱼先放在5 2 3 的盐水中浸泡2 m i n ，然后放在福 尔马林灭活的ka n g u i l l a r u m 中浸泡3 m i n ，饲养一个月以后，进行攻毒试 验，肯定了其预防效果。但是，高渗溶液对香鱼幼鱼的影响很大，在浸渍 处理后2 3d 内观察到很多鱼死亡。他们考虑到这一点，进一步改良，使 用精制的冷冻干燥死菌，在饲养水体中，每升水加入0 9 4 9 该种菌苗，把 鱼放入其中饲养，处理后的第1 1 3d 还观察到免疫效果，据此他们认为对 鱼类进行浸泡免疫接种也不一定要高渗处理。t a t n e r h o m e ( 1 9 8 3 ) 也对 1 0 山东农业大学硕士学位论文 影响浸泡免疫的因素作过研究，发现浸泡时间超过1 0s ，疫苗的吸收量并 不增加；高渗对吸收效果不显著：疫苗的吸收量与温度和鱼的大小有关。 2 1 2 3 口服法 口服接种法是用来对大批量的鱼类进行免疫接种的有效方法之一 ( f r y e re ta l ，1 9 7 6 ) 。尽管口服免疫存在着免疫效果较差，疫苗消耗量大等 缺点，但因它实施方便，不受时间地点和鱼的大小限制，对鱼无损伤，仍 引起了人们的高度重视。目前仅有少量的关于弧菌病疫苗、疖疮病疫苗苗、 类结节症疫苗等口服免疫成功的报导。 对于口服免疫接种的效果，研究者们的结论并不相同，有入的结论是 有效，而另一些研究的结论则刚好相反。m u r o g a 等( 1 9 6 9 ) 用 v a n g u i l l a r u m p b 1 5 菌株的活菌和经0 0 1 硫柳汞灭活菌苗拌饵对日本鳗 鲡每日投喂1 次，连喂4 个月后，用活菌对受免和对照日本鳗鲡进行注射 攻毒，结果表明只有投喂活菌的日本鳗鲡显示了较弱的免疫保护力。 2 1 2 4 喷雾法 对鱼类采用喷雾法进行免疫接种始于1 9 7 8 年，g o u l d 等( 1 9 7 8 ) 用福尔 马林灭活的菌苗对银大麻哈鱼( o n c o r p h y n c h u sk i s u t c h ) 和虹蹲进行喷雾接 种，预防2 种鱼的弧菌病获得了成功。具体操作方法是从濒死的病鱼上分 离得到v a n g u i l l a r u m ，经0 3 福尔马林灭活后，离心制成每克载体中分 别含有0 0 0 1 m g 、0 0 1 m g 、o 1 m g 、l m g 、1 0 m g 、1 0 0 m g 和0 m g 湿重菌的 悬液，在6 3 7 0 k g c m 2 的压力下，与鱼相距2 0 2 5 c m 的距离，对鱼均匀喷 雾5 1 0s 同时还用一种压力近似为零的喷雾器做同样试验，接种后2 8 4 5 d ，分别用含致病的v a n g u i l l a r u m 攻击，并检查血清凝集效价。结果表明： 除0 0 0 1 m g 组外，其它各组均产生了抗体，对照组死亡率为7 2 8 0 ， 免疫组未发现因v a n g u i l l a r u m 而引起的死亡。 随后，i t a m i 等( 1 9 8 0 ) 用喷雾接种途径对香鱼的弧菌病进行了免疫预防 研究，证明了喷雾接种途径具有和口服免疫接种相同的效果。 2 1 2 5 插管法 j o h n s o n & a m e n d ( 1 9 8 3 ) 分别采用口服和肛门插管法将v a n g u i l l a r u m 菌苗接种大菱鲆( s c o p h t h a l m u sm a x i m u s ) ，经过2 8d 和5 9d 后，采用 v a n g u i l l a r u m 活菌攻毒，结果表明，无论是2 8d 还是5 9d 后攻毒的成活 美国红鱼致病性弧菌分离鉴定与免疫防治技术研究 率均是肛门插管法优于口服法。但是迄今为止，采用此法对鱼类进行免疫 接种的报道还较为少见。但这发现为口服免疫开拓了广阔的前景他们 认为若用某种胶囊包被疫苗，使其避免消化道分泌物( 胃液或胆汁) 对抗 原的破坏，那么只需较少的抗原就可获得较理想的免疫效果。 2 2 免疫激活剂 免疫激活剂是通过激活机体的非特异性防御机制来增强水产动物的 免疫能力和抗病能力的，近年来，关于这方面的研究已有不少报道 ( r o b e r t s e n ，1 9 9 0 ；h a r d i e e ta l ，1 9 9 1 ；r a ae ta l ，1 9 9 2 ；m a t s u o ，1 9 9 3 ；s u n ge t a l ， 1 9 9 4 ；s a k a i ，1 9 9 9 ；刘栋辉等，2 0 0 2 ) 。 2 2 1 中草药制剂 随着水产集约化程度的不断发展，水产动物疾病逐步呈现多发性、复 杂化、高危害的特点，养殖水环境的恶化也造成鱼类免疫力下降。为应对 鱼类疾病蔓延趋势，大量渔用杀虫药的泼洒施用，多种抗生素的滥用和外 用杀菌消毒药物泼洒等，虽然对疾病有一定的控制作用，但往往造成致病 微生物的耐药性、药物残留，甚至造成整个水体生态环境平衡破坏( 齐子 鑫，2 0 0 7 ) 。目前在提倡健康、无公害水产品生产的要求下，从水产品生 产的各个环节把关，力求水产生产中使用的药物具有低毒性、低残留、药 效持久、绿色健康的共同特点。而中草药具有天然性、无抗药性、无残留、 无副作用、无环境污染、不引发药源性疾病等特点，其作用不仅对病原微 生物有直接的抑制和杀灭作用，更重要的是对鱼类的免疫系统进行调整， 提高水产动物的抗应激能力和免疫机能( 候金全，1 9 9 1 ；武瑞，2 0 0 1 ) 。 因此，中草药作为疾病防治药物或饵料添加剂，尤其适用于当前水产养殖 业的集约化、规模化生产的需要，便于进行养殖鱼类病害的群体防治。而 且应用中草药防治鱼病完