（材料学专业论文）HApColPLA生物可吸收储存式药物控释载体制备研究.pdf

武汉理工大学颂十学位论史 摘要 针对人体骨癌、骨结核等骨科疾病在临床治疗中，需使用确有疗效但毒 性较大或大量用后易产生肝肾功能损害等副作用的药物问题，研究制备了一。 种生物可吸收储存式靶向药物控释载体。该载体装填药物植入病患部位后应 仅对病患部位直接持续释放药物进行治疗，同时载体能在体内降解并能够参 与骨组织的形成与恢复，从而避免二次手术。 本文中首先采取酸溶法和碱提纯法自制了鼠尾i 型胶原，通过共沉淀 法、调制矿化法等方法体外模拟天然骨生物矿化和材料自组装机制制备出羟 基磷灰石胶原类骨仿生复合材料，并对制备方法进行了比较研究，在实验 基础上初步探讨了类骨仿生材料的合成机理。采用x 射线衍射分析、扫描电 镜分析、透射电镜分析、红外光谱分析、热分析对材料进行了结构、形貌和 成分的表征。结果表明羟基磷灰石胶原仿生复合材料具有类似于天然骨的 成分和纳米结构；羟基磷灰石与胶原纤维间存在化学相互作用，形成了羟基 磷灰石与胶原的紧密键合；材料中有机质的含量约2 2 ，无机成分羟基磷坎 石的含量约7 8 。 随后本文中再利用热致分相非溶剂抽提成孔技术进一步与聚乳酸复合 制备了三维多孔储存式药物控释载体并对材料的多孑l 形貌、密度、孔隙率， 力学性能等进行了表征，通过模型化合物溴百里酚蓝的体外释放实验研究了 其控释特性，同时根据实验结果依据一定的模型对释药过程动力学进行了初 步分析。结果显示羟基磷灰石胶原聚乳酸储存式载体均匀分布着内部连通 孑l ，孔壁厚实并存在贯通小孔，载体材料具有适合药物释放的孔径范围、孔 隙率和机械强度；模型药物的释放试验表明，载体在达到8 0 的释放率之前 可近似为零级释放，其释放特性达到了药物控制释放的要求，有望用于骨科 疾病的治疗中达到缓释治疗的目的。 关键词：生物可吸收，储存式，控释载体，自组装，热致分相 武汉理工大学硕上学位论文 a b s t r a c t p r e p a r a t i o no f ak i n do fa b r e s o r b a b l er e s e r v o i rt a r g e t e dc o n t r 0 1 r e l e a s e dd r u 2 c a r r i e rw a si n v e s t i g a t c df o rr e s o l u t i o nt ot h ep r o b l e mr e m a i n e di ne f f e c t i v ed r u g a d m i n i s t r a t i o nw h i c hi se i m e rt o x i co rr e a d vt or e s u l ti na d v e r s ei n n u e n c et ol i v e r a n dk i d n e yf o rt h et r e 砒m e mo fh u m a n sb o n ed i s e a s es u c ha so s t e o c a r c i n o m ao r b o n et u b e r c u l o s i s ，t h ed l g i n c o r p o r a t e dc a r r i e rm u s to n l yc o n s i s t e n t l yr e l e a s e d r u g t ot h ed e f e c t i v ep a r t s ，a i l di sa l s oi nv i v od e g r a d a b l ea sw e l la sa d v a n t a g e o u s t of o n n a t i o na i i dr e p a i r i n go fb o n et i s s u ef o ra v o i d a | 1 1 c eo f s e c o n ds u r g e r v i nm i s s t u d y ，t y p e ic o l l a g e nw a sp r e l i m i n a r i l yi s o l a t e df r o m r a t t a i lt e n d o n b ya c e t i ca c i dd i g e s t i o nf o l l o w e db ya l k a l i n ep u r i f i c a t i o n b i o m i m e t i cb o n e 1 i k e h a p c o lc o m p o s i t e 、珊sp r e p a r e db yc o p r e c i p i t a t i o no rm o d u l a t e d m i n e r a l i z a t i o n m e m o de t c t h r o u g hi nv i t r os i m u l a t i n gb i o m i n e r a l i z a t i o no rs e l f - o r 鼬n i z a t i o n p r o c e s so fn a t u r eb o r l ea f l dt h ea d o p t e dm e t h o d sw e r ec o m p a r a t i v e l yi n v e s t i g a t e d b a s e do nt h e s ee x p e r i m e m st h es y n t h e s i sm e c h a l l i s mo fb i o m i m e t i cb o n e 1 i k e c o m p o s i t ew a si n i t i a l l yp r o b e d x r d ，s e m ，t e m ，t g a d s ca n df t i rt o a n a l y z ei t sc r y s t a l l i n es t n l c t u r e ，m o r p h 0 1 0 9 ya n dc o m p o n e n t sc h a r a c t c r i z e dt h e m 砒e r i a l s p e c i m e n t h ec h a r a c t e r i z a t i o n r e s u l t so ft h es p e c i m e ni n d i c a t e da p r o m i s i n gs i m i l a r i t yo f b o t l lc o m p o s i t i o na i l dn a n o m e t r i cc o n f i g u r a t i o nt on a t u r e b o n e ，f b m a t i o no fi n t i m a t eb o n d i n gb e t w e e nh y d r o x y a p a p t i t ea n dc o l l a g e na s w e ua sac o m p o s i t i o no f a 2 2 o 瑶| a n i c sa n d7 8 i l o n o r g a i l i c s t h cf o l l o w i n gw o r ki nm i ss t u d yi n c l u d e st h cf a b r i c a t i o no f3 一d p o r o u s r e s e r v o i rc o n t r o l r e l e a s e d d n l g ca 】t i e rw h i c hw a sf h r t h e rs v n t h e s i z e dw i t h p o l y l a c t i d eb yt h e m a l - i n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n n o n - s o l v e n te x t r a c t i o np o r e l e a c h i n gt e c h n i q u ea n dc h a r a c t e r i z a t i o no fp o r em o r p h o l o gy ，d e n s i t y p o r o s i t ya n d ，h a n i c a lp r o p e r t i e so f t h es p e c i m e n s i nv i t r or e l e a s et e s to fm o d e lc o m p o u i l d b t bw a sc a r r i e do u tt o s t u d y t h e c o n t r o l - r e l e a s i n gb e h a v i o r ， b a s e do n e x p e r i m e n t a ld a t at h er e l e a s i n gk i n e t i c si nl i n ew i t ha ne s t a b l i s h e dm o d e lw a s t e n t a t i v e l yp r o p o s e d r e s u l t ss h o wt l a ti n t e r - c o n n e c t i v ep o r e sd i s t r i b u t e de v e n l v i n h y d r o x y a p 印t i t e c o l l a g e “p o l y l a c t i d ed m g c a r r i e r谢t h c o n n e c t i v em i n i c h a 皿e l s t h r o u g h t h eb u x o mp o r e w a l l s ，t h ep o r es i z e r a n g e ，p o r o s i t y a i l d m e c h a n i c a ls t r c n g t l lo fm ec a r r i e ra r es u i t a b l ef o rd r u gc o n t r o lr e l e a s e m o d e l c o m p o u n dr e l e a s et e s tw i t ha i la p p r o x i m a t ez e r o o r d e rr e l e a s ep r i o rt oi t s8 0 r e l e a s er a t em e e tt l l e r e q u i r e m e n t s o fd n l gc o n t r o l _ r e l e a s e ，t h e r e f o r et h e p r e p a r e di 【m gc a r r i e ri se x p e c t e dt ob eu s e di nt h et r e a t m e n to fb o n ed i s e a s ef o r c o n n d lr e l e a s e k e y w o r d s ： b i o r e s o r b a b l e ，r e s e r v o i r ， c o n t r 0 1 r e l e a s e d c a r r i e r ， s e l f o r g 柚i z a t i o n ，t i p s 武汉理【大学硕十学位论文 第一章概论 1 1 给药系统与药物的控制释放 给药系统“3 是指药物以一定的给药方式经一定的给药途径较为精确地应用于 人体的技术体系，亦即药物从制剂制备到实际使用的整个过程。缓释、控释给药 系统就是一类可以克服峰谷现象，提供平稳、持久有效血药浓度的新型制剂。在 临床治疗中，不同的药物和给药方式对疾病有着不同的治疗机制和效果，药物的 选用以及通过有效的途径到达体内所需的部位，使药物与机体发生相互作用而产 生疗效，有效地发挥功能从而达到良好的治疗效果，因此给药方式在临床治疗中 。疋及挥药物疗效的一个重要因素。理想的缓、控释给药系统是：药物迅速在作用 部位( 受体) 达到理想有效浓度，并维持此浓度相当长时间，在机体其他部位则 无药物分布或药物浓度仅在最低范围( 如图卜1 ) ，一旦达到治疗目的，药物立 即从作用部位消除。 * * 雾 糯 廿 糕 崮 矮 茸 。，一、，k 2 ，、 ：| 、。 厂，4 ，7 ， l 图卜1 不同给药方式的血药浓度比较示意图 + 1 重复给药；2 最高安全浓度：3 控制释放；4 最低有效浓度：5 单次给药 狭义的缓释与控释给药系统，在药物释放速度方面含义是有区别的缓释给 药系统是指其中药物释放缓慢，常为一级过程，控释给药系统的释药速度为零级 或接近零级过程。广义的讲所有能够缓慢释放药物，能够维持较长安全、有效血 药浓度的制剂都可以称为缓释制剂。2 0 世纪7 0 年代以来，药物剂型和制荆研究 武汉理工大学硕士学位论文 已进入释放系统( d r u gd e l i v e r ys y s t e md d s ) 时代，药物控释系统是2 0 世 纪7 0 年代开始迅速发展起来的材料学、生物工程和药学多学科交叉的新领域， 肋s 研究的目标是使药物在需要的时间和需要的部位施以准确的有效剂量。新型 药物释放系统己成为药学领域的重要发展方向，当前药剂学研究的重点，按照给 药途径方式来分主要有。1 ：缓释长效制剂；靶向给药制剂；皮肤给药制剂： 粘膜给药制剂：智能型给药系统。新型给药系统研究方法目前仍处于不断发 展和完善之中，但它独特的给药途径，避免了传统给药方式造成的不足，对提高药 物的全身和局部作用，减少不良反应，取得最佳治疗效果，具有重大的临床应用价 值和广阔发展前景。 1 2 靶向式药物控制释放与骨科病的治疗 靶向给药系统的发展趋势是利用可生物降解的蛋白质、脂质体、聚合物作为 载体将药物包封或嵌入各种类型的胶体系统，靶向给药系统有被动靶向给药系 统、主动靶向给药系统和肠道靶向制剂等。目前治疗恶性肿瘤，除外科手术外，主 要使用化学药物、生物毒素及放射性核素等，但药物治疗存在选择性低、毒副作 。用大、抗肿瘤药物很快从作用部位消失等缺陷。高分壬包覆磁性微粒甩挂活然治 症成为二穗堕塑枣点释放新技求，该技术将抗癌药物包覆或修饰于具有生物可降 解性的磁性微粒上，并通过一个外加磁场将药物定位于病变部位，使化疗或放射 性治疗制剂集中于靶( 如肿瘤) 部位附近，而对周围其它正常组织毒副作用小。目 前人们已经可根据需要定向合成出表面具有亲水性、生物相容性、无毒及无免疫 原性的磁性微粒并用于癌症治疗中。但由于肿瘤部位不同，导致各种癌症在治疗 时需设计其特殊方案，使治疗难以进行标准化，例如对于骨科肿瘤，磁性微粒难 以通过坚硬的骨组织到达病患部位。另外由于微米级的磁性微粒不能通过毛细 管腔外渗，有关纳米级的磁性微粒在人体内的药代动力学及外磁场的定位均需做 进一步的研究。 在我国因为骨感染、骨结核、骨肿瘤等原因引起的骨疾病均属多发病，治疗 中通常采用手术切除病灶与传统的口服、静脉注射给药等方法相结合，防止术后 病灶的扩散和感染。然而药物经黏膜或肠道吸收进入血液( 静脉注射药物直接进 ，、，上液) 输送到体内需要部位的同时，也传输和扩散到身体的其他部位，所以在 选择用药方式和用药量时需要考虑避免当超过药物最高耐受量或低于最低有效 2 武汉理t 大学硕士学位论文 剂量时引起的人体血药波动或给人体带来副作用而起不到应有的疗效。如骨髓炎 建一种难以治疗的疾病，常用方法使用抗生素和外科手术。而要达到抗炎目的， 必须使用大剂量的抗生素。如在手术后植入药物释放体，能有效地防止感染，药 物在骨中直接释放，效果好，剂量少，常用的有非降解聚甲基丙烯酸甲酯一庆大 霉素体系。针对人体骨癌、骨结核等疾病在l 临床治疗中，需使用确有疗效但毒性 较大或大量用后易产生肝肾功能损害等副作用的药物问题，研究一种生物可吸收 靶向式药物控释载体十分必要，该载体装填药物并植入人体病变部位并用p l a 板 和骨钉固定后( 如图卜2 所示) ，应仅对病患部位直接持续释放药物进行治疗， 减少对其他部位的副作用，同时载体能在体内降解并能够参与骨组织的形成与恢 复，从而避免二次手术。 药物 t 篮泣 药物装填 + 岛 回 储存式载体 手术植入 日 矗；：撼 图l 一2 储存式药物载体植入体内骨病变组织示意图( 图中比例不代表实物状态) 1 3 生物可降解骨组织药物载体材料 控释材料在药物控释体系发展过程中起重要作用，在文献中对控释材料有多 种分类方法，从其作用机理的角度可分为三种：( 1 ) 扩散控释材料，是由药物 分子在聚合物相内的扩散作用产生的，扩散控释材料常见的有两种形式。1 ：储存 式，即药物集中于聚合物囊腔中心：共混式，即药物均匀分散在整个聚合物基质 中；( 2 ) 化学控释材料，化学控释材料有两种形式：是可生物降解性聚合基 质体系，其中药物溶解或分解于聚合物中：二是聚合物一药物( p 0 1 y m e r d r u g ) 武汉理工大学硕士学位论文 体系，药物分子以共价键连接在聚合物的主链或侧链上：( 3 ) 溶剂控释材料。 按材料本身降解性能可分为生物降解性控释材料和非生物降解性控释材料；按 材料来源可分为天然材料和合成材料；按作用途径分为植入材料、口服控释材 料、具粘膜粘附性的材料。 国内外以无机材料作为药物载体的有多孔陶瓷材料和多孔微晶材料，人工 合成羟基磷灰石生物陶瓷材料 h a p ：c a 。( p 0 ，) 。( 0 h ) ： 是一种能通过与活组织建立 生物化学键合结合到骨组织上的钙磷盐，由于与天然骨无机成分相近且具有良好 的生物相容性、生物可降解：骨传导性及无毒性已作为天然骨的替代物广泛应用 于医疗领域。目前常用的以羟基磷灰石为代表的生物陶瓷只能模仿天然骨基 质的无机成分，这种化学上的简单相似在临床应用时带来许多问题：一是由于 羟基磷灰石生物陶瓷脆性大、机械强度差使之难以应用于人体的承重部位”1 ；二 是传统羟基磷灰石等钙磷盐陶瓷成型过程中通常需要经过高温和或高压的作用 压制烧结成型，煅烧后陶瓷结晶度较高很难为机体降解。从成分上来讲，天然 骨除了含有羟基磷灰石无机成分外，还包含有胶原( c o l l a g e n ，c 0 1 ) 、糖蛋白、 糖胺聚糖等少量的有机成分( 无机物与有机物含量之比约为7 ：3 ，其中胶原占有 机质重量约9 0 ) 刚。从结构上来讲，骨是天然的复合材料，从微观到宏观组成多 级复杂结构，这种h a p 与胶原的混杂结构使骨具有独特的机械性能，因此模拟天 然骨的形成机制采用仿生的方法制各成分、结构与天然骨相似的羟基磷灰石胶 腺英骨材料，以取代传统的h a p ，生物陶瓷对于提高材料的生物力学性能和植入后 组织的再生十分重要。 天然高分子作为载体材料主要有葡聚糖、明胶、胶原、海藻酸钠等，天然 高分子材料的降解较快，不能较长时间释放药物。胶原是一类研究较深入的结 构蛋白，在动物组织和器官的构成中起着重要的作用。i 型胶原是天然骨基质 的主要有机成分，经过适当提取处理的胶原具有良好的生物相容性和生物降解 性，胶原作为生物材料具备以下优点：来源丰富，易于提取纯化：非抗原性；可 生物降解和生物重吸收；非毒性和生物相容性；与生物活性成分具有协同性； 有较高的可伸缩性和一定可挤压性，具有生物可塑性；促进凝血，有止血作用； 可制备成许多不同的形式；通过交联可调节生物降解性；利用其不同官能团， 可定向生产所需材料；与合成聚合物有相容性。以胶原为基质的药物释放系统 可制备成膜剂、片剂、海绵、微粒及注射剂等剂型，用于不同的给药部位和疾 病治疗。例如在用胶原膜作为基因药物的载体研究中，将重组人成骨蛋白b m p 一2 4 武汉理工大学硕十学位论文 胶原系统埋植于骨上，可产生骨诱导作用，促进骨的形成。将胶原制成长1 c m 和 直径1 姗的微柱是一种可注射植入的药物释放系统，这种系统已用于释放大分 子，如干扰素、血浆蛋白及d n a 等。虽然早在2 0 世纪5 0 年代胶原就被用作骨 组织替代物和药物缓释系统，但由于其物理性能差，难以满足一定强度要求限 制了其临床使用。 、 合成高分子作为载体材料的有聚羟基已酸、聚乳酸、聚已内酯等聚酯类， 人工合成脂肪族聚酯类聚合物如聚乳酸( p l a ) 、聚羟基乙酸( p g a ) 及其共聚物 ( p l g a ) 是能用于人类临床的少数合成聚合物中的几种，并获得了美国食品及药 品管理局( f d a ) 的临床应用认可，它们不仅具有生物相容性、生物可降解及易 加工性，而且其理化、机械及降解特性能满足一些特殊的应用如药物载体、骨组 织固定等，但合成高分子材料在降解过程中易产生自催化效应造成局部过酸， 形成无菌性炎症。聚乳酸是组织工程及其他医疗领域研究得最为广泛的生物降 解聚合物”1 1 ，但聚乳酸的弹性模量较低且降解成酸性产物。 近年来复合材料的研究得到重视，复合材料兼具各组分材料的性能优点。 将羟基磷灰石与聚乳酸复合使二者取长补短：一是获得羟基磷灰石和聚乳酸相互 补强的功能；二是通过羟基磷灰石的琏壁塑星垩b 壁鲍璧丝隆鲤芒塑扫互虫邳? 消 除酸性环境引起的组织炎症反应；另外材料植入后，可获得x 射线显影，便于临 床观察。目前，已有合成羟基磷灰石聚乳酸复合物的研究报道且主要用作骨替 代材料o 。1 “。 1 4 生物矿化、自组装技术与羟基磷灰石胶原复合材料的仿 生合成 骨组织主要由矿物质、水和胶原基质组成，湿皮质骨由2 2 有机质( 其中 9 0 9 6 为胶原) 、6 9 矿物质以及9 水构成“。目前，多数治疗用骨替代材料都 集中于制备一些h a p 和聚合物的机械混合物，但由于这种h a p 聚合物复合材料是 简单的物理混合物，难以与天然骨相类似“”。因此模拟天然骨的形成机制采用仿 生的方法制各成分、结构与天然骨相似的羟基磷灰石胶原类骨材料代替常用的 羟基磷灰石生物陶瓷，再生骨的生物学和力学性能显得十分必要。天然骨的形成 是一个缓慢的生物矿化过程，骨矿化时胶原基质的侧链基团成为矿物相成核生长 位点( 如图卜3 ) 。生物矿化是指在生物体内形成矿物的过程。生物矿化区别于 武汉理_ 1 ：大学硕士学位论文 一般矿化的显著特点是，它通过有机大分子和无机物离子在界面处的相互作用， 从分子水平控制无机矿物相的析出从而使生物矿物具有特殊的多级结构和组装 方式。生物矿化中，由细胞分泌的自组装有机物对无机物的形成起模板作用，使 无机矿物组装成具有一定的形状、尺寸和结构。有机物和无机物之间通过静电 m 三作用及立体化学配位使生物矿物获得独特的形貌、尺寸及晶体取向，生物有 机物上的官能团及其预组装物可成为生物矿物特殊的成核位荠使之获得择优取 向1 。 协、 图卜3 骨矿化时矿物相在胶原基质上成核生长的模式图 近年来，自组装合成技术作为一种代替以往采用高温高压等恶劣条件来合成 材料的有效方法获得了广泛的关注。自组装过程中，原子、分子及微粒在系统能 态的驱动下自动排稚到精巧的功能性结构中。自组装生物材料一般具有三个重要 的共性：一是材料在所有尺度范围内是高度自组装的，它们不仅保持活体组织 功能的合适形状或型式，而且还具有小到原子水平的精巧结构；二是材料在室温 和稀释营养液的条件下合成；三是材料的合成由自组装功能分子介导控制。自组 装过程被生物系统广泛采用，比较突出的例子是动物硬组织中的骨，骨是包括多 种构型的有机一无机复合材料，并具有多种外形以发挥不同的生物功能。骨中胶 原的结构性蛋白微纤维及水溶胀性阴离子多糖形成韧性基质并通过薄片状羟基 磷灰石增强，薄片状羟基磷灰石通过彼此平行排列使增强相获得高体积比 ( 2 0 一5 0 ) 。其机理如图卜3 所示，胶原有机质通过侧链基团与自由钙磷离子结 合形成了薄片羟基磷灰石的临时成核位，成核时矿物晶体不连续地受控生长，这 些晶体几乎是单分散并具有纳米尺度。通过扫描电镜可观察到致密的钙磷晶体在 6 武汉理_ l ：人学硕十学位论文 胶原微纤维内部周期性排列，由于晶体受空间结构的限制，它具有确定的结构、 形状和取向“。 1 5 热致分相技术与羟基磷灰石胶原聚乳酸载体材料的制 备 药物控释制剂是将药物以物理方式结合在聚合物基质中通过扩散作用达到 控制释放的目的，这要求基质材料具备多孔结构。人们开发了多种方法用于制备 多孔聚合物材料，如浇铸沥滤致孔法“2 “，乳液冷冻干燥法“，气体发泡法”“2 ， 纤维粘结法”，分相法”，三维印刷法52 。1 等： ( 1 ) 浇铸沥滤致孑l 法，其基本过程为将聚合物溶于二氯甲烷、三氯甲烷或丙 酮等有机溶剂中，制成聚合物均质溶液后加入成孔剂如盐。2 ”1 ，糖。，明胶。“， 冰粒3 ，石蜡。等，混合均匀后浇铸入模，溶剂干燥后用能溶解成孔剂而不溶 解聚合物的溶剂析出成孔颗粒& 口在聚合物中留下了孔结构。水溶性盐或碳水化合 物成孔剂如糖、明胶等通常用蒸馏水析孔，石蜡可用正己烷等有机溶剂析孔。 ( 2 ) 纤维联结法，这种方法将聚合物溶液浇铸在聚合物多孔织物上，利用溶液 的相变和织物的支撑作用制各有一定机械性能的多孔膜。通常将p l a 溶解在二氯 甲烷及乙酸乙酯混合溶剂中，再浇铸并用手术刀片铺展到聚乙交酯( p g a ) 网上， 于室温在空气中挥发成孔，真空干燥除去残余溶剂，此法可在p l a 膜的表面和内 层成孔，但材料缺乏结构稳定性。可将这种单层膜通过热压模多层叠加制成三维 多孔材料。 ( 3 ) 乳液冷冻干燥法。3 ，该方法包括三步：聚合物溶液和水均化成乳液，水作 为分散相，聚合物溶液作为连续相( 油包水型) ；乳液快速冷却锁定液态结构； 旭赳冷冻干燥除去溶剂和水形成多孔结构。 ( 4 ) 气体发泡法，很多聚合物采用气体介质作成孔剂以产生高气孔率。由于挥 发性液体，气体或超临界介质很容易从聚合物基质中逸出，因而常用作成孔剂。 目前开发了一种采用超临界c 0 。作成孔剂制备高孔隙率聚合物基质材料的方法， 避免了使用高温和有机溶剂，粉状聚合物在高压c 0 ：环境下平衡后，玻璃化温度 降低，压力骤降时，c 砚的溶解度急剧降低，处于c o 。临界压力和临界温度下的饱 和聚合物相在大气环境条件下变成过饱和，气体试图逸出聚合物相时气泡成核， 同时被超临界流体塑化的聚合物开始固化，聚合物玻璃化温度升高，锁定气体成 武汉理l 大学硕士学位论文 核过程产生的多孔结构而形成微孔材料。 ( 5 ) 三维印刷法，在制备过程中将计算机模拟的二维切片造型通过合适的粘接 剂依次逐层沉积印刷到聚合物粉体新鲜层上，直至完成整个模型。这样各切片造 型体通过印刷的粘合剂联结起来了，再将未粘结的粉体除去并通过适当的后续工 序处理就制备了多孔聚合物泡孔材料。“。 ( 6 ) 分相是指控制聚合物溶液分为两相：一相为高浓度聚合物相，一相为无聚 合物相即溶剂相，分相后去除溶齐q 相即形成多孔结构。通常有几种方法分相。1 ： 热致分相，聚合物溶液浇铸分相，气相沉积分相，浸渍聚沉分相。 热致分相( t h e m a li n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ，t i p s ) 当前常用来制备多 孔材料。该技术所依据的原理是单一聚合物均质溶液降温时，通过热能转移转变 为两分相区，即高浓度聚合物相和溶剂相，分相后冷冻干燥除去溶剂相形成多孔 结构。聚合物一溶剂体系的温度与组成二元相图如图卜4 所示“1 ，聚合物的多孔形 貌取决于热骤冷聚合物溶液的最终热力学状态，根据骤冷终点是位于双节线与旋 图卜4 聚合物溶液的二元相图 节线之间的亚稳区还是旋节线下的不稳定区，可获得两种不同的形貌：一是通过 成核和生长机制形成的连通性较差的须状结构，二是通过旋节分解机制形成的连 通良好的开孔结构。多孔材料的孔径分布及其内部连通性取决于能否精确平衡各 参数，这些参数包括聚合物浓度、冷却路径、冷却程度、溶剂非溶剂的组成、 添加剂等，另外液一液分相中的长成和聚合效应对决定粗化过程形成的最终泡孔 形貌超重要作用，这一效应是由两分相区之间分化的界面张力而形成的。粗化过 武汉理工大学硕士学位论文 程主要通过o s t w a l d 长成聚结或流体力学机制增大孔径，因此粗化过程应作为控 制泡孔形貌的动力学参数认真加以对待。 上述这些成孔技术或多或少都存在一些缺点，如普遍使用有毒有机溶剂，费 工费时，聚合物基质中的残余相去除不完全，重复性差，孔的形状不规则，孔联 通性差，结构单薄，形状不易控制等。利用热致分相法成孔原理，并对其重要工 艺步骤进行改进，以制各孔道连通具有复杂形状的多孔材料是本课题的研究重 点。 1 6 本课题的研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 通过以上分析，本课题将应用材料自组装技术合成纳米羟基磷灰石胶原仿生 复合材料：利用热至分相法制备羟基磷灰石胶原聚乳酸药物控释载体。其研究 内容包括： ( 1 )自组装纳米羟基磷灰石胶原仿生复合材料的制各研究； ( 2 ) 羟基磷灰石胶原复合材料的表征： ( 3 ) 热致分相法制各羟基磷灰石胶原聚乳酸复合材料的研究； ( 4 ) 羟基磷灰石胶原一聚乳酸复合材料的组分与结构性能研究： ( 5 ) 确定热致分相法制备储存式控释载体的成型工艺及参数的研究： ( 6 ) 储存式载体的体外控制释放研究。 拟解决的关键问题有：建立制各纳米羟基磷荻石胶原仿生复合材料的方法： 确立用热致分相法制备羟基磷灰石，胶原一聚乳酸复合材料的工艺参数和方法。 9 武汉理_ 【= 大学硕士学位论文 第二章i 型胶原的提取及结构表征 2 1 i 型胶原的结构性能 胶原是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，约占其蛋白总量的1 4 一l 3 。同 时胶原也是细胞外基质的主要成分，它的高强度和高韧性有助于组织保持其结构 的完整性。目前已知的胶原有近2 0 种，它们在结构上有一些共同的特征( 如图 2 1 所示) ：胶原分子是由3 条q 链组成的螺旋结构，每一条n 链是由g 1 y x y ，呐譬构单元重复而成，其中g 】y 为甘氨酸，约占胶原中氨基酸总量的1 3 ；x 和y 通常是脯氨酸和羟脯氨酸。i 型胶原是哺乳动物体内分布最广，含量最多的胶原， 是骨骼，皮肤，肌腱等的主要成分。i 型胶原分子的三条n 链均为左手螺旋，有 两条( ( i ) ) 具有相同的氨基酸序列，每条各有1 0 5 6 个氨基酸残基，而另 一条n 链( 。( i ) ) 含有1 0 2 9 个氨基酸残基。在胶原分子中，9 5 的氨基酸具 有g l y x y 的重复序列和三螺旋结构，在两端约5 的氨基酸由于不具有g l y x y 序列而不是三股螺旋结构。从动物中提取的胶原具有与人体胶原相近的氨基酸序 列，因而人体对其具有很低的排异性。研究还发现，i 型胶原的免疫原性比i i i 型、型、v 型胶原都要低得多，这也是i 型胶原应用最广的原因之一。值得 注意的是，胶原的主要免疫原性位点是在分子的c 、n 末端区域，这两个区域是由 短的、非螺旋氨基酸序列所组成，又叫“端肽( t e l o p e p t i d e s ) ”：它可在提取胶原 时，被选择性的水解或去除而失活：仅在胶原分子三股螺旋内保留微弱的免疫原 性，不足以引起明显的排异反应，因而，在制各可溶性胶原医用产品时，廑险去胶 匾曲端毯。由于胶原分子内和分子问较强的相互作用，中性条件下胶原纤维既不 溶于水也不溶于有机溶剂。 2 2 i 型胶原的提取 制备h a p c 0 1 复合材料，原材料i 型胶原的提取是一个重要方面。i 型胶原 广泛存在于脊椎动物的骨、真皮、肌腱、韧带等组织中，例如牛肌腱或牛皮、鼠 尾肌腱中含有丰富的i 型胶原。采用酸溶法可以从鼠尾肌腱中提取质量很高的i 型胶原“1 ，制备胶原时可加入适量胃蛋白酶以去除胶原分子的端肽并去抗原m ， 1 0 武汉理工大学硕_ ：学位论文 胶原溶液浓度可用2 3 0 n i u v 吸收法或改进的l o w r y s 法测定“。 2 2 1 实验步骤 图2 1 胶原的结构 图2 2 无端肽i 型胶原的扫描电镜照片 2 2 1 1 材料与设备： 大白鼠鼠尾，冰醋酸，胃蛋白酶( 1 ：1 0 0 0 0 ，s i g m a ) ，p b s 缓冲液( p h = 7 4 ) ， 手术剪，止血剪，镊子。n a 0 h ，l r h _ 1 5 0 b 生化培养箱，l g j 一1 0 冷冻干燥机，8 0 0 武汉理工大学硕十学位论文 型离心分离机。 2 2 1 2 鼠尾胶原的制备与提纯： 鼠尾胶原的制备取冷冻的大白鼠鼠尾5 支，用p b s 溶液解冻，分别用剪刀剪 开鼠尾毛皮，用止血剪夹住向尾端牵拉剥离。用镊子央住白色肌腱纤维，并用手 术剪剪开肌肉组织将肌腱肌肉与其它组织分开，再用力拉出肌腱束，必要时单根 剪出。取肌腱用7 0 酒精溶液洗尽，再用去离子水漂洗后，用剪刀剪碎( 越细越 好) ，浸泡在1 5 0 0 m 1 浓度o 5 m 醋酸溶液中在4 培养箱中放3 4 天，肌腱溶解， 离心分离除去未溶解的杂质得透明溶液，加入胃蛋白酶去抗原。加入 2 5 0 m 1 0 1 m 0 1 几的n a 0 h 得胶原沉淀，再用离心机按4 0 0 0 r m i n 离心分离出纯净胶 原沉淀，用冷冻干燥机直接冻干或放于低温冰箱中慢慢冻干。冻干品放入4 培 养箱中备用。 t 取胶原冻干品少许，与溴化钾混合压片，用n i c o l e t6 0 s x b f t i r 傅立叶变换 红外光谱仪进行结构基团分析，测量范围4 0 0 一4 0 0 0 c m _ 1 。 2 3 i 型胶原的f t l r 分析 红外光谱( f t i r ) 是进行结构基团分析的重要工具，通过f t i r 分析可以 了解酰胺键的振动源以及某些酰胺带对胶原的构象影响，从而可能判断特定胶原 螺旋结构或延伸构象上的酰胺带的结构信息。图2 3 为采用上述酸溶法并经提纯 制得的鼠尾胶原的红外光谱分析图。从图中可看出，图中的i ，i i ，i 峰为蛋白 质中酰胺键的3 个特征峰，酰胺i 对应c = o 的伸展振动在1 6 0 0 1 7 0 0 c m - 1 ，酰胺 】i 峰是酰胺键中n h 面内弯曲振动和c - h 伸展振动的合峰，位于1 5 0 0 一1 5 5 0 c m _ 1 ，i 峰是酰胺键中c n 伸展振动和n h 面内弯曲振动的合峰，位于1 2 0 0 1 3 0 0 c m - 1 。通常情况下，酰胺i 峰强，酰胺i i 较弱，酰胺i i i 强度中等。胶原蛋白 质基团的特征频率与指认见表2 一l “。 提取胶原的方法成功与否关键在于该方法是否能使所提取胶原的三股螺旋 结构保持完整，从而使胶原不致过度水解成为明胶而失去作为生物医学材料所需 的机械强度。从图2 4 可以看出，与胶原三股螺旋结构相关的酰胺i 羰基在1 6 3 5 c m 。和酰胺i i 的羰基在1 5 5 4c m - 1 处的特征吸收峰完整保留，而明胶的羰基仅在 1 5 9 0c m _ 1 处有单峰，表明胶原的三螺旋结构存在。按表2 一l 可从图2 5 中找到相 武汉理工大学硕士学位论文 关基团的指认波峰：在3 4 4 2 c m _ 1 的强吸收峰为氨基和羟基的伸展振动吸收峰 2 8 3 6 c m - ，2 8 8 0 一2 9 7 7 c m 。1 附近分别为v 。( c 呦和v 。( c h 。) 伸缩振动吸收峰。 4 0 3 5 0 03 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 01 0 0 05 0 0 w a v e n u m b e 倦( c m 。1 ) 图2 3鼠尾i 型胶原的红外光谱图波数( 5 0 0 4 0 0 0 c m l ) 表2 1 胶原蛋白f t i r 波段分布及波峰指认 从鼠尾提取i 型胶原是一种比较成熟的方法，业已证明经过碱沉淀法提纯的 7 舣原纯度可达到9 0 以上，通过f t i r 的结构基团分析，作者认为所提取的胶原为 ：5 ； ：8 两 ， ooc饵芝e啦cej_术 武汉理t 大学硕士学位论文 i 型胶原，并能用于下步羟基磷灰石胶原( h a p ，c 0 1 ) 类骨仿生复合材料的合成。 1 7 0 01 6 5 01 o1 5 5 01 5 0 01 4 5 01 4 0 01 3 5 01 3 0 01 2 5 01 2 0 0 w a v e n u m b e r s ( c m - 1 ) 图2 4 鼠尾i 型胶原的红外光谱图( 波数1 2 0 0 一1 7 0 0 c m l ) 3 8 0 03 4 0 03 2 0 03 0 0 02 8 0 02 6 0 0 w a v e n u m b e r s ( c m 一1 ) 图2 5鼠尾i 型胶原的红外光谱图( 波数2 5 0 0 一3 7 0 0 c m l ) 奄幅确硎芑、溺融 1 4 8仁再#一ecej_享 鲇 舌； ：8 弛 ， 8c啊釜碑c巴l摹 武汉理一r ：大学硕士学位论文 第三章 羟基磷灰石月交原( h a - p c 0 1 ) 仿生复合材料的制 备及表征 从结构上来讲，人体硬组织包含的矿物晶体分布在有机基质中，骨是天然的 复合材料，从微观到宏观组成多级复杂结构。通过研究生物自然复合材料的精细 结构，采用其从生物多糖到各种蛋白质、无机物和矿物质的原始组分可人工合成 出高性能复合材料“。由于骨实际上是主要由纳米羟基磷灰石和胶原纤维组成的 细胞外基质，了解骨的有机和无机相的组成和结构，在微观尺度上理解骨是磷灰 石胶原复合材料是制备生物活性陶瓷聚合物类骨仿生复合材料的基础“3 。 目前大多数磷酸钙胶原复合物实际上是两者的机械混合物，通常是将烧结 的粉状h a p 与c 0 1 凝胶液按一定比例尽可能均匀地混合并加入交联剂得混合沉淀 物，常温或冷冻干燥。4 “。d b a k o s 等“”采用直接共混制得h a p c o l 复合材料， 扫描电镜观察h a p 在复合物内结合良好，胶原纤维连接成网状膜将h a p 覆盖，h a p 颗粒与c o l 基质紧密结合。但这种方法合成的h a p c 0 1 复合材料由于是机械性混 合，难以形成无机物和有机物在分子水平上的紧密键合只能从成分上而不能从结 构上进行仿生。f e n g 等3 用蒸馏水配制1 5 倍离子浓度的模拟体液，溶液p h 值 用( c h ，o h ) 。c n h 。和0 o lm o l lh c l 混合液在3 7 0 5 的温度下调至7 4 ，将胶原 膜置于该模拟体液中于3 7 o 5 浸泡几天制各出h a p c 0 1 复合膜材。a b i g i 等 “”将脱钙肌腱( 主要成分是i 型胶原) 于室温、p h 为7 4 的钙磷盐过饱和溶液 中浸泡获得矿化的组织材料，沉积物为结晶度较低的h a p 晶体。利用生物系统在 分子水平上储存和加工信息的功能，在体外模拟天然骨生物矿化和自组装机制可 制备出羟基磷灰石胶原类骨仿生材料。从临床应用的角度来看，要求材料在体 液环境中保持良好的粘结性和形状稳定性，制备h a p c o l 时加入交联剂有助于调 节材料的机械性质和生物可吸收性从而保持了与取代的新生骨相匹配的形状和 强度。通常有两种方法对胶原进行交联：物理交联和化学交联。物理交联包括热 脱水处理和紫外照射，化学方法则是加入化学交联剂如戊二醛、透明质酸等进行 处理。 武汉理上人学硕士学位论文 3 1 原理 3 1 1 天然骨的微结构及其形成过程 骨主要由胶原结构蛋白纤维及亚微观非化学计量的羟基磷灰石晶体h a p 构成 多级结构，通常可考虑为二级结构：一是骨磷灰石增强胶原形成的n 到um 尺 度的单一片晶，h a p 晶体呈2 0 一4 0 n m 长1 5 3 n m 厚的薄针片状，纳米 l a p 在基质 中以其晶格c 轴沿胶原微纤维彼此平行排列；二是um 到珊尺度的增强间质骨“。 总的来说，天然骨形成时，起初由细胞产生并释放c 0 1 分子。i 型胶原分子 约3 0 0 n m 长，直径约1 4 1 5 n m ，出两支p r o 一( i ) 链和一支p r o p ( i ) 链 组成三螺旋结构。胶原分子通过自组装构成胶原微纤维，数百万个胶原分子通过 首尾相连和链侧相互作用形成胶原微纤维，其直径约2 0 5 0 0 n m “1 “1 。骨组织中胶 原的自组装是以单元长度d 约为6 4 n m 交错排列形式进行的，在此排列中，4 4 d 长的大分子被0 6 d ( 约4 0 衄) 孔隙区分隔，各单分子通过作用于o 4 d 重叠区的 化学键联结在一起“3 。孔隙区构成了含有自由矿物离子( c a 2 + ，p o 。”) 和结构性、 ，勘性侧链基团( 胺基、磷酸基、羟基) 的微环境，有机无机间的分子识别使 磷酸盐在该微环境中定向成核并长大“，骨的h a p c 0 1 混杂结构可在微观区域通 过成骨细胞调节原位形成，在此区域成骨的原材料可同时组装成规则的纳米结构 。“。骨中胶原纤维的矿化首先从纤维之间的空隙处开始逐步发展到胶原微纤维重 叠区，最终h a p 晶体按其c 轴与胶原微纤维轴向平行的择优取向沿胶原微纤维沉 积8 “。矿化的微纤维在细胞的参与下组装成多级结构，一根胶原纤维包含几百根 胶原微纤维且方向不同，胶原纤维组装成胶原纤维束，于是在细胞外形成了骨这 种细胞处基质。 3 1 2 骨的体内形成与体外仿生合成的机理 骨形成中的自组装过程可以理解为两个概念：一是胶原基质多级结构的自组 装，i 型胶原的自组装包括形成临界纤维亚单元及微纤维束，亚单元的宽度约 4 n m ，胶原分子以连续的4 n m 步幅从侧部融合生长并通过赖氨酸衍生交联纵向长 成微纤维1 ，二是钙磷盐离子以胶原为模板通过分