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华中科技大学硕士学位论文 摘要 离效毛细管电泳饵p c e ) 因具有商效、快速和送祥量小等优点，在过去十几年 重高速发展，广泛应用到化学和生命科学等领域。c e 技术的广泛应用与深入发震 所面临的主要挑战是高灵敏度与多模式检测器的发展，检测是蕞细管电泳中的关 键问题。多光予激发荧光技术( m f e ) 具有激发体积小，光损伤和光毒性小，背景 低等特点，近年来奁细胞化学或像和氨基酸、神经递质等生命活性物质分析中的 应用整受重视。憋多光予激发荧光技术与毛细铃电泳联用，能开展疆多的应用研 究，毽暴贵熬飞秒锬模激光器限制了多光子激发荧光技术的推广。妇前国内还没 有将多凳子激发荧光用于毛缨管电泳检测熬擐道，图外的翊关研究采用基于飞秒 激光器翰多光子系统。本文建立了一套迄续兜多光予激发荧光一毛细鹜电泳 f m p e c e ) 原理系统，实现了连续光多光子荧光鹣激发，并爝连续光多光予激发荧 光实现了毛缅管电泳的检灏。 本文主要内容包括： 、1 ) 分析了光束通过毛细管时的光路变化，设计了一种最缅管电泳校后梭测方 式，并在现有多光予系统的基础上进行了m p e 。c e 的原理实验。分剐用柱上和柱 后检测方式对r h o d a m i n eb 实现了毛细管电泳检测，柱后检测方式的检出限为2 x 1 0 一m o l l ，比楗上方式的浓度检出限低3 个数潼级，结果表明柱后检测方式具有 更寒黪灵敏度。 2 ) 建立了套连续光m f e c e 原理系统。本系统采用共线型的激发和荧光采 集光路，焉光电倍攒营实现微弱信号的探测。使魍连续走傲光源实现了r h o d a m i n e b 瀚双兜子激发荧光，字 用连续光双光子激发炎光实瑰了r _ h o d a m i n eb 的毪细管 电泳检测。通道与飞移躲冲激发静迄泳结聚毙铰，涯器翅连续毙实理双光子荧龙 的激发需要一酉多倍予飞移脉冲光的麓量，进步 正实了连续先多光予激发荧光 的芷确性与可靠往。 华中科技大学硕士擘位论文 3 ) 利用r h o d a m i n e b 的连续光m p e c e 对原理系统进行了测试。考察了系统 的重现性并得到工作曲线，对丁基r h o d a m i n eb 和r h o d a m i n eb 进行了分析。结 果表明，7 x1 0 7 - - 8 x1 0 4 m o l l 的浓度范围是本系统测量r h o d a m i n eb 的线性工 作区域，浓度检出限为3 1 0 7 m 0 1 l 。 关键词：连续光，多光子，荧光，毛细管电泳，检测，r h o d a m i n e b 华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t h i 曲p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) t o o ka d v a n t a g e so v e rh i 曲 s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , s h o r ta n a l y s i st i m e s ，a n dl o ws a m p l e v o l u m e r e q u i r e m e n t s i nt h e p a s tt e n so fy e a r s ，i th a sb e e nw i d e l ya p p l i e dt ot h ef i e l d so fc h e m i s t r ya n d l i f es c i e n c e a t p r e s e n t t h ef u r t h e ra p p l i c a t i o na n dw i d e l ys p r e a do f c e t e c h n o l o g ye n c o u n t e rw i t h t h ec h a l l e n g eo ft h ed e v e l o p m e n to f h i 曲一s e n s i t i v ed e t e c t o r , w h i c hi st h ek e yp r o b l e m i nc e m u l t i - p h n t o n e x c i t a t i o n ( m p e ) h a sn i c ep r o p e r t i e so f i n h e r e n tt h r e ed i m e n s i o n a l e x c i t a t i o n ，r e d u c e dp h o t o d a m a g ea n dp h o t o b l e a c h i n g ，l o wb a c k g r o u n dn o i s ea n d s oo n r e c e n t l y , m p et e c h n i q u ei sap o w e r f u lt o o lf o rc y t o c h e m i s t r yi m a g i n g ，f o ra n a l y z i n g t h ea c t i v a t e d l i v i n g s u b s t a n c eo fa m i n oa c i da n dn e u r o t r a n s m i t t e r t h e v e r s a t i l i t y c o m b i n e dm p e w i t hc et e c h n o l o g y - m a yp r o v i d eo p p o r t u n i t i e sf o rm o r e r e s e a r c hw o r k h o w e v e r , t h ec o s t l yf e m t o s e c o n dm o d e l o c k e dl a s e rr e s t r i c t st h e s p r e a d i n go f m p et e c h n o l o g y f u r t h e r m o r e ，i th a sn o ty e tb e e nr e p o r t e da b o u td o m e s t i c r e s e a r c ho f c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t i o nb a s e d o nm p e t e c h n o l o g y n e v e r t h e l e s s ， t h eo v e r s e a sr e s e a r c h g r o u pa d o p t e dm u l t i p h o t o ns y s t e m w i t hf e m t o s e c o n d m o d e l o c k e dl a s e r i nt h i st h e s i s ，w ea c c o m p l i s h e das e to fm p e c e p r i n c i p l es y s t e m b a s e do nc o n t i n u o u sw a v e ，i m p l e m e n t i n gt h ec o n t i n u o u sw a v e m u l t i p h o t o ne x c i t a t i o n a n da c h i e v i n gd e t e c t i o no f c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sw i t l lc o n t i n u o u sw a v em u l t i p h o t o n e x c i m t i o n t l l i s 也e s i sm a i n l yc o n t e n t s ： 1 ) b a s e do na n a l y z i n gt h et r a n s f o r m a t i o no fl i g h tw h e nt h el i g h tb e a mp a s s i n gt h e c a p i l l a r y , t h ee n d - c o l u m nd e t e c t i o nm e t h o df o rc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw a sd e s i g n e d a n dt h em p e c e p r i n c i p l ee x p e r i m e n tw a ss u c c e s s f u l l ya c c o m p l i s h e do n t h ea v a l l a b l e m p e s y s t e m t h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t i o no fr h o d a m i n eb w a sr e a l i z e d r e s p e c t i v e l y b y t h e m e a n s o f t h eo n - c o l u n m a n de n d c o l u m nd e t e c t i o n e n d c o l u m n h a s 1 1 i 华中科技大学硕士学位论文 y i e l d e d - 1 0 0 0 一f o l di m p r o v e m e n ti nd e t e c t i o nl i m i t fl o d e 2 1 0 一m o l l ) i ti sp r o v e d t h a te n d c o l u m nd e t e c t i o nh a sh i g h e rs e n s i t i v i t y 2 ) a s e to fc o n t i n u o u sw a v em p e c e p r i n c i p l es y s t e m h a sb e e ne s t a b l i s h e d t h i s s y s t e ma d o p t e dt h ec o p l a m i t ym o d ef o rt h e f l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o na n dc o l l e c t i o n ， r e a l i z i n gt h ef e e b l es i g n a lm e a s u r i n gb yp h o t o m u l f i p l i e r f u r t h e r m o r e ，t h et w o - p h o t o n f l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o na n dc ed e t e c t i o no fr h o d a m i n ebw e r eb o t ha c h i e v e db y c o n t i n u o u sw a v e c o m p a r i n gw i t ht h er e s u l to fc eb a s e do nf e m t o s e c o n dp u l s el a s e r e x c i t a t i o n ，i ti sf u r t h e ra p p r o v e dt h ev a l i d i t ya n dd e p e n d a b i l i t yo f t h ec o n t i n u o u sw a v e m p e c e s y s t e m 3 、t h e c o n t i n u o u sw a v em p e c e p r i n c i p l es y s t e m w a st e s t e d b y t h e e l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t i o n o fr h o d a m i n eb t h er e c u r r e n c eo ft h i s s y s t e ma n dt h e p e r f o r m a n c ec u r v e w e r eo b t a i n e ds u c c e s s f u l l y w ee v e nu s et h i ss y s t e mt oa n a l y z i n g b u t y lr h o d a m i n eb a n dr h o d a m i n eb i ti sp r e s e n t e dt h a tf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yh a s l i n e a rr e s p o n s e f r o m7 1 0 7 t o8 1 0 4 m o l l w i t h d e t e c t i o n l i m i t o f 3 1 0 一m o l l k e yw o r d s ：c o n t i n u o u sw a v e ，m u l t i p h o t o n , f l u o r e s c e n c e ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， d e t e c f i o n ，r h o d a m i n eb 华中科技大学硕士学位论文 1绪论 在过去十几年里，高效毛细管电泳( h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， h p c e ) 或称毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 作为一种新型的分离分析技 术得到迅速发展。毛细管电泳技术与其它分离技术相比，具有分离效率高、分 析时间短和进样量小等优点，且容易实现自动化，操作简便，受到分析化学界， 尤其是生物分析化学和医学分析化学界的极大关注。目前h p c e 已在生命科学、 生物技术、医学和环境保护等领域中显示了极其重要的作用，广泛用于多肽和蛋 白质、环境食品、d n a 序列分析和单细胞检测【2 l 。h p c e 中，由于电泳的有效体 积和进样量小，对检测器提出了更高要求。i - i p c e 发展初期，j o r g e n s o n 曾指出， c e 技术的广泛应用与深入发展所面临的主要挑战是高灵敏度与多模式检测器的 发展。缺乏高灵敏度的检测器已成为限制h p c e 发展的主要因素，检测技术成为 h p c e 发展的关键。目前应用较多的检测器有u v 吸收、激光诱导荧光 ( l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 、质谱( m s ) 和电化学检测器等【3 1 。 l i f 是所有检测方法中灵敏度最高的一种方法，现己达到单分子检测限，因 此l i f 成为h p c e 分析中的热点之一【4 j 。但大多数的生命物质在可见光区激光激 发下不能产生荧光，需要荧光探针衍生标记。虽然采用紫外激光可以使一些生命 活性物质产生天然荧光，但紫外光会使生命活性物质光降解，细胞产生光损伤和 光漂白，这非常不利于单细胞分析和在体分离检测。近年来，多光子激发荧光 ( m u l t i p h o t o ne x c i t a t i o n ，m p e ) 技术在细胞化学成像和氨基酸、蛋白质、神经递质 等生命活性物质分析中的应用倍受重视1 5 , 6 1 。多光子激发荧光技术具有激发体积 小，光损伤和光毒性小，背景低等特点m 】。将多光子激发荧光技术与毛细管电泳 联用，能发挥多光子激发荧光的优点，在分析化学和生命科学领域开展更多的应 用研究。但昂贵的飞秒锁模激光器限制了多光子激发荧光技术的推广。建立一套 连续光多光子激发荧光一毛细管电泳( m p e c e ) 原理系统，实现连续光多光子荧 光的激发，并用连续光多光子激发荧光实现毛细管电泳的检测是本文研究的主要 内容。作为研究背景，本章主要介绍高效毛细管电泳和多光子激发荧光的原理以 华中科技大学硕士学位论文 及多光子激发荧光用于毛细管电泳的研究现状。 1 1高效毛细管电泳及其特点 高效毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或 和分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳新技术。1 9 6 7 年，h j e r t e n 等利用 3 m 用内径的旋转石英毛细管在高电压下进行电泳分离，是现代电泳技术的雏形。 1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 等l9 j 获得突破性进展，采用7 5f 肼的石英毛细管获得4 0 万理 论塔板数，显示了毛细管电泳的高效分离，揭开了h p c e 发展的序幕。十几年来， 特别是自8 0 年代末至今，随着人们对h p c e 技术认识的加深，对c e 研究的投入 直线增长，使c e 技术进入了飞速发展的黄金时期。 从电学角度理解，c e 是一种由金属导线和填充有电解质溶液的毛细管共同构 成的导电回路。h p c e 最基本的仪器结构如图1 - 1 所示，其中主要包括毛细管、直 流高压电源、迸样机构、电极、电极槽以及检测系统。毛细管用作分离通道和电 流通路，直流高压电源用于驱动分离，进样机构能实现柱上直接进样并可随时改 图1 - 1 毛细管电泳系统的基本结构9 1 f i g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m p 】 变进样方向，电极与电极槽用于金属导线和毛细管的沟通。毛细管电泳主要的检 测方式为紫外吸收检测、激光诱导荧光检测、电化学检测、化学发光检测和质谱 检测等。其中最普遍采用的检测器为紫外吸收检测器，所有毛细管电泳商品仪器 都有配置。激光诱导荧光也已经商品化，由于激光诱导荧光方法具有极低的检测 2 华中科技大学硕士学位论文 限，对于d n a 序列分析、阵列毛细管电泳和芯片毛细管电泳，激光诱导荧光是理 想的检测方式，也是单细胞毛细管电泳分离检测的首选检测方法【1 0 1 。部分电化学 检测器也可以买到，电化学检测器是单个细胞内化学成分的毛细管电泳分离检测 的重要检测方法。化学发光分析法不用外加光源，因而背景低，可以极大提高信 噪比，获得很高的灵敏度，且仪器设备简单，其主要缺点是选择性差，限制了它 在实际分析中的应用。质谱仪( m s ) 是一种分离方法中广泛应用的选择性检测器，它 可提供混合物样品中未知组份的结构信息，具有很高的选择性和灵敏度。将毛细管 电泳和质谱联用在一次分析中可同时得到迁移时间、分子量和碎片特征等信息。 毛细管发电泳展出多种多样的分离模式，其中毛细管区带电泳( c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是毛细管电泳最主要的分离模式，毛细管和电极槽内充有相 同组分和相同浓度的背景电解质溶液( 缓冲溶液) 。样品从毛细管的一端( 称为进 样端) 导入，当毛细管两端加上一定的电压后，荷电溶质便朝与其电荷极性相反 的电极方向移动。单位电场下的电泳速度通常称为淌度或电迁移率。由于样品组 分间的淌度不同，他们的迁移速度不同，因而经过一定时间后，各组分将按其速 度( 或淌度) 大小顺序，依次到达检测器被检出，得到横坐标为电泳时间，纵坐 标为检测器强度的毛细管电泳谱图，与色谱图相似。这一过程可用图1 - 2 表示。 用谱峰的迁移时间，或类似于色谱的术语保留时间做定性分析，按其谱峰的高度 或峰面积做定量分析。 f i g 1 2s e p a r a t i o n p r o c e s so f a n a l y t e s 【9 】 由于毛细管容积小、侧面截面积比大，因而散热快，允许在毛细管两瑞加上 高至3 0 k v 的高电压，分离毛细管的纵向电场强度可达到4 0 0 v c m 以上，因而分 离操作可以在较短的时间内( 多数 8 0 ) ，杂散光透过率低( t 一 圣 晶 旦 宴 o 2 三 华中科技大学硕士学位论文 t i m e ( m i n ) 图3 8l o 。mr h o d a m i n eb 的连续光多光子激发荧光毛细管电泳图谱 电泳条件：硼砂缓冲溶液( 1 0 m m ，p h 9 o ) ；r h o d a m i n eb1 0 一m ：毛细管5 0 c m x7 5 a ni d ； 分离电压1 8 k v ：虹吸进样，高度1 0 c m ，8 s 。 f i g 3 8 c o n t i n u o u sw a v em p e - c ef l u o r e s c e n c ed e t e c t i o no f r h o d a m i n ebw i t h c o n c e n t r a t i o no f1 0 。m e l e c t r o p h o r e s i sc o n d i t i o n ：b u f f e rb o r a t e ( 1 0 m m ，p h 9 o ) ；r h o d a m m eb1 0 m ：c a p i l l a r y5 0 c i n 7 5 a ni d ：v o l t a g eo f s e p a r a t i o n1 8 k v ；s i p h o n i n ga t1 0 c mh e i g h tf o r8 s 3 4 4 3 连续光m p e c e 与飞秒脉冲光m p e c e 的比较 在第一章我们估算了连续光激发和飞秒脉冲光激发情况下两者激发功率的差 别。同样地，采用相同的激发功率，两者的荧光强度也差s = 以污硐倍。为了 进一步验证连续光多光子激发荧光与飞秒脉冲多光子激发荧光之间的关系，我们 用连续光和飞秒脉冲光分别作光源，利用r h o d a m i n eb 的电泳结果作定量分析。 t i ：s a p p h i r e 激光器在连续与锁模状态之间切换，飞秒脉冲光激发时需要在t s l 前 加入两片透过率分别为3 2 、1 0 的中性滤光片( 北京大恒光电研究所) ，目的 表3 - 5 连续光m p e - c e 与飞秒脉冲光m p e c e 的比较 c h a r t 3 ，5c o m p a r i s o nb e t w e e nc o n t i n u o u sw a v em p e - c ea n df e m t o s e c o n dp u l s em p e - c e 华中科技大学硕士学位论文 是减小激发光强度避免p m t 饱和。 r h o d a m i n eb 的连续光m p e c e 电泳谱图和飞秒脉冲m p e c e 电泳谱图分别 如图3 - 9 中a 、b 所示。表3 5 中列出了连续光m p e c e 的入射光功率( t s l 前) 、 电泳峰高，以及飞秒脉冲m p e c e 的入射光功率( t s l 前) 、脉冲宽度和电泳峰高。 根据1 - 3 式，利用入射功率和峰高度通过比较计算可以得到实际的暑值；飞秒激光 的脉冲重复频率是8 2 m h z ，通过计算可以得到g 的理论值( 激光脉冲宽度与锁模 激光的带宽成反比关系。根据激光器的操作手册，6 5 n m 的带宽对应的脉冲宽度 t i m e ( r a i n ) 圈3 - 9 连续光m p e c e 与飞秒脉冲光m p e c e 的电泳谱图。 a ) 连续光m p e c e ；b ) 飞秒脉冲光m p e - c e 电泳条件：硼砂缓冲溶液( i o m m ，p h 9 o ) ；r h o d a m i n eb1 0 一m i 毛细管5 0 c m 7 5 a n1 d ： 分离电压1 8 k v ：虹吸进样，高度1 0 e m ，8 s f i g 3 - 9e l e c t r o d i 瞎r a mo f c o n t i n u o u sw a v em p e c ea n df e m o t o s e c o n dp u l s em p e c e a ) c o n t i n u o u sw s v cm p f - c eb ) f e m o t o s e c o n dp u l s em p e c e e l e c l r o p h o r e s i sc o n d i t i o n ：b u f f e rb o r a t t o m m p h 9 0 ) ；r h o d a m i n ebl f f m ；c a p i l l a r y5 0 c m x 7 5 a ni d ；v o l t a g eo f s e p a r a t i o n1 8 k v ；s i p h o n i n ga t1 0 c mh e i g h tf o r8 s 【_)扫一翟鲁一廿苎u们203z v扫一兽粤cou口03s20：z 华中科技大学硕士学位论文 是8 3 f s 。表中脉冲宽度的结果可以由此关系推出) 。实际所得的s 值比理论值偏小， 我们推测在实验过程中，检测池的位置不变，而激光器在连续和脉冲状态之间切 换时，光路改变导致聚焦位置有微小变化，会直接影响飞秒脉冲激发时荧光的测 量结果。 为了验证我们的推测，重新调整检测池的位置，先记录飞秒脉冲m p e c e 的 电泳谱图，如图3 1 0 中a 所示，图中b 是r h o d a m i n e b 连续光m p e c e 的电泳谱 图，电泳结果见表中第二组数据，实测的占增大了，但仍比理论值偏小。按照这 一 蚤 磊 蠹 置 ： 兰 8 2 呈 匠 爹 专 要 g 8 矗 譬 2 呈 t i m e ( m i n ) 图3 一1 0 调整焦距后的连续光m p e - c e 与飞秒脉冲光m p e c e 的电泳谱图。 a ) 飞秒脉冲光m p e - c e ；b ) 连续光m p e - c e 电泳条件：硼砂缓冲溶液( 1 0 m m ，p h 9 0 ) ；r h o d a m i n e b l 0 - 5 m ：毛细管5 0 e r a 7 5 b u n i d ； 分离电压1 8 k v ：虹吸进样，高度1 0 e m ，8 s 。 f i g 3 1 0e l e c l r o d i a g r a mo fc o n t i n u o u sw a v em p e - c ea n df c m o t o s e c o n dp u l s em p e - c ea f t e r a d j u s t i n gt h ef o c u s a 1f e m o t o s e e o n dp u l s em p e - c e ；b ) c o n t i n u o u sw a v em p e - c e e l e c l r o p h o r e s i sc o n d i t i o n ：b u f f e r b o m t e ( 1 0 m m ，p h 9 0 ) ；r h o d a m i n eb1 0 。m ；e a p i l l a r y5 0 e m ( ，n a 1 2 5 的物镜对激光聚焦。光电倍增管的工作电压1 0 0 0 1 1 对1 0 4 m 的r h o d a m i n eb 进样分析，虹吸进样，进样高度l o c m ，进样时间缸。使用7 5 a n 内径的石英毛细管，毛细管长5 4 c m ，分离电压1 8 k v o 实验过程中对r h o d a m i n e b 重复进样，记录电泳谱图。图4 1 是8 次对r h o d a m i n e b 进样得到的连续光m p e c e 的电泳谱图。表4 - 1 列出了由这些电泳谱图得到的电泳峰高和峰面积。基线到峰 华中科技大学硕士学位论文 顶点的距离即为峰高度。峰面积的计算采取常用的简便近似方法，即a = h 一万， 由峰高h 和峰高0 6 0 7 1 1 处的半峰宽度a 决定4 9 1 。 8 静 li l 上。、 图4 一lr h o d a m i n eb 连续光m p e c e 的电泳谱图( n = 8 ) 。 电泳条件：硼砂缓冲溶液( 1 0 m m ，p h 9 o ) ；r h o d a m i n e b l 0 4 m ；毛细管5 4 c m 7 5 a n i d ； 分离电压1 8 k v ；虹吸进样，高度1 0 e r a ，8 s 。 f i g 4 2e l e c t r o p h o r e g r a mo f r h o d a m i n ebb yc o n t i n u o u sw a v em u l t i - p h o t o ne x c i t a t i o n ( n = 8 ) e l e c t r o p h o r e s i sc o n d i t i o n ：b u f f e rb o m t e ( 1 0 m m ，p h 9 0 ) ：r h o d a m i n eb1 0 m ；c a p i l l a r y5 4 e r a x 7 5 a n i d ；v o l t a g eo f s e p a r a t i o n l 8 k v s i p h o n i n ga t l o e m h e i g h t f o r 8 s 表4 - lr h o d a m i n ebm p e - - c e 的峰高和峰面积 c h a r t4 - 1p e a k h e i g h ta n dp e a k a r b ao f r h o d a m i n eb b y c o n t 血- m o u sw a v e m u l t i - p h o t o n e x c i t a t i o n 由以上结果计算得到，8 次电泳峰高的相对标准偏差是2 2 ，峰面积的相对 标准偏差是6 7 。每次电泳谱图的基线稳定而平直，而且检测的是单一样品，峰 高不受相邻峰部分交叠的影响，所以测量峰高的准确度较高。峰面积的误差较大， 可能是因为我们采用的是虹吸进样方式，每次的进样时间有微小差别；而且峰面 积的计算比峰高的计算复杂，会引入计算误差。这些因素将导致峰面积测量的准 p譬8u曲o-oj t | 华中科技大学硕士学位论文 确度降低，但是峰高和峰面积的相对标准偏差都是在误差允许的范围之内。这8 次的电泳结果表明，连续光m p e c e 原理系统运行稳定，通过控制电泳过程中的 操作参数，具有较好的重现性，能够用于毛细管电泳的检测并且定性和定量分析 的精度较高。 4 1 2 工作曲线 实验装置如图3 - 5 所示。r o d a m i n eb 的浓度分别为1 0 一，1 0 一，5 1 0 4 ，1 0 4 ， 5 1 0 一，1 0 一，5 1 0 石，1 0 石，5 1 0 一，1 0 m ，取1 0 2 m 的母液，用1 0 m m 的硼 砂缓冲溶液稀释到上述浓度。对不同浓度的r h o d a m i n eb 进样，记录电泳谱图。 图4 2 是1 0 击m 的r h o d a m i n eb 的电泳谱图。 t i m e ( m i n ) 图4 - 2l o _ 6 mr h o d a m i n eb 的连续光m p e - - c e 的电泳谱图。 电泳条件：硼砂缓冲溶液( 1 0 m m p h 9 0 ) ：r h o d a m i n e b1 0 1 m ；毛细管6 5 c m 7 5 o n f d ； 分离电压1 8 k v ：虹吸进样，高度1 0 c m ，8 s f i g 4 - 2e l e g t r o p h o t c g r a m o f r h o d a m i n ebb yc o n t i n u o u sw a v e m u l t i - p h o t o ne x c i t a t i o n e l e c t r o p h o r e s i sc o n d i t i o n ：b u f f e rb o r a t e ( 1 0 m m p h 9 0 ) ；r h o d a m i n eb1 0 6 m ；c a p i l l a r y6 5 c m 7 5 a ni d ；v o l t a g eo f s e p a r a t i o n1 8 k v ；s i p h o n i n g a t1 0 c m h e i g h tf o r8 s 得到一系列的电泳谱图后，将浓度和峰高信号分别取自然对数的数值作为x 、 y 轴，我们得到了最大峰高处的输出信号与浓度的关系曲线。连续光m p e c e 原 理系统的工作曲线如图4 2 所示。 一般地，在高浓度区，检测器的响应趋于饱和，而在低浓度区，由于检测信 号的降低，输出信号最终会趋于噪声水平，所以输出信号只能在某一样品浓度范 一v扫一sil3cou口uu们20三 华中科技大学硕士学位论文 围内具有线性或接近于线性的关系，向两端延伸，就会越来越偏离线性关系，最 武 = 芒 岂 一 口 葛 2 o j o _ f o 一 图4 3r h o d a m i n eb 的荧光强度与浓度的关系曲线 f i g 4 - 3t h e r e l a t i o nb e t w e e nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dc o n c e n t r a t i o no f r h o d a m i n eb 后到达输出信号与样品浓度无关的区域。连续光多光子激发荧光检测器也表现出 相似的特性。当r h o d a r n i n eb 的浓度小于5 1 0 。7 m 时，因连续光多光子激发荧光 的强度减小，信噪比降低，几乎检测不到电泳峰值。当r h o d a m i n eb 的浓度大于 lo 3 m 时，电泳峰高不再与浓度成线性关系，趋于饱和。但是测量1 0 2 mr h o d a m i n e b 的荧光强度时，光电倍增管的输出信号并没有饱和。由第三章对光电倍增管的 测试结果可知，光电倍增管在这种工作条件下，输出信号与入射光信号成良好的 线性关系，可见这种高浓度区域的饱和并非由光电倍增管对信号的探测引起的。 我们推测这种现象是由荧光的猝灭效应( q u e n c h i n ge f f e c t ) 引起的。荧光分子浓度 增加会发生自身猝灭，当荧光物质的浓度增加到1 0 q m 以上时，分子之间的距离 小于1 0 n m 以内，分子间产生能量的非辐射共振转移，结果使原来被激发的荧光 分子将能量转移给其他分子，荧光则猝灭或减弱【5 “。当我们对1 0 。m r h o d a m i n eb 进样分析时，由于荧光分子的浓度高，溶液的粘滞性增加，产生荧光猝灭现象， 探测到的荧光强度不再与浓度成线性关系。 由r _ h o d a m i n eb 的荧光强度与浓度的关系瞳线，我们得到在7 1 0 一8 1 0 q m o l l 的浓度范围内是连续光多光子激发荧光用于毛细管电泳检测的线性工作 华中科技大学硕士学位论文 区域。连续光m p e c e 原理系统的检出限可达3 1 0 m o l l 。 4 2 丁基r h o d a m i n eb 与r h o d a m i n eb 的分离 为了进一步验证连续光m p e c e 原理系统对复杂样品的分离能力，我们利用 丁基r h o d a m i n eb 进行实验。实验装置如图3 5 所示。实验用丁基r h o d a m i n eb 购自上海化学试剂公司，丁基r h o d a m i n eb 溶液的配制与r h o d a m i n eb 相似，详 见3 4 2 节。 记录的电泳谱图见图4 4 中a 所示，对丁基r h o d a m i n eb 的电泳得到了两个 峰。由于丁基r h o d a m i n eb 是由r h o d a m i n eb 进一步合成得到的。具体的合成方 法是在3 0 克干燥的r h o d a m i n e b 中倒入5 4 毫升正丁基溴和2 0 0 毫升丁醇，在1 2 0 0 c 油浴上，在装有回流冷凝管的烧瓶中加热1 0 一1 2 小时，其流程图如图4 5 所示【5 ”。 因此我们估计，样品中除了含有丁基r h o d a m i n eb 之外还含有r h o d a m i n eb 。为 了验证我们的推测，我们进行了下一步实验，对1 0 4 m 的r h o d a m i n eb 进样，记 录电泳谱图，结果见图4 4 中b ；再对浓度分别是1 0 。m 丁基r h o d a m i n e b 和l o 4 m r h o d a m i n eb 的混合样品进样，记录电泳谱图，结果见图4 4 中c 。b 图中的 r h o d a m i n eb 的出峰时间与a 图中第二个电泳峰的出峰时间相同。c 图表明，第一 个电泳峰与a 图中的第一个电泳峰的出峰时间和峰高相同，第二个电泳峰的出峰 时间与b 图相同，且第二个电泳峰的峰高增大。通过对峰面积的计算可知，a 图中 第二个峰的峰面积是4 2 6 v m b 图的峰面积是2 4 7 v s ，c 图第二个峰的峰面积是 6 5 8 v s ，c 图的峰面积比a 、b 图中峰面积之和略小。所以可以断定，c 图第二个 电泳峰的升高肯定是由于样品中r h o d a m i n eb 浓度升高所致。这说明国产试剂的 丁基r h o d a m i n eb 纯度不够，其中含有r h o d a m i n eb 。 华中科技大学硕士学位论文 图4 - 4 丁基r h o d a m i n eb 和r h o d a m i n eb 的分离。a ) 1 0 。m 丁基p h o d a m i n eb 的电泳谱图b ) 1 0 - 4 m r h o d a m i n eb 的电泳谱图：c ) 混合样品的分离。 电泳条件：硼砂缓冲溶液( 1 0 m m ，p h 9 0 ) ；丁基r h o d a m i n ebl 旷m 。t m o d a m i n ebi o * m ；毛细 管6 5 c m x 7 5 珊i d ；分离电压1 8 k v ：虹吸进样，高度1 0 c m ，1 0 s 。 f i g 4 _ 4s e p a r a t i o no f b u t y lr h o d a m i n e ba n dr h o d a m i n eb 。小e l e c t r o p h o r e g r a mo f1 0 mb u t y l p h o d a m i n eb ：b ) e l e c t r o p h o r e g r a mo f1 0 4 mr h o d a m i n eb ；c ) s e p a r a d o no f m i x e ds a m p l e e l e c t l o p h o r e s i sc o n d i d o n ：b u f f e rb o r a t e ( 1 0 m m ，p h 9 0 ) ；b u t y lr h o d a m i n ebi o m ，r h o d a m i n eb 1 0 * m ；c a p i l l a r y 6 5 c r u x 7 5 o n i d ：v o l t a g e o f s e p a r a f i o n l 8 k v ；s i p h o n i n ga t l o c m h e i g h t f 0 r 1 0 s 一一茸兽尝一g甚髫呈i山 一一占!蹿尝lv哥u霉呈一阻 一一占；罂粤li!柚司冀l一!王 华中科技大学硕士学位论文 ( c 2 h 5 ) 2 “ 二! 9 纱( c 2 ”5 卧) c i - 。? r 2 图4 - 5 由r h o d a m i n eb 合成丁基r h o d a m m e b 。 f i g 4 5s y n t h e s i z eo f b u t y l r h o d a m i n ebf r o mr h o d a m i n eb 4 3 连续光m p e c e 原理系统的灵敏度 2 h 5 k 检测器的响应和噪声共同决定了检测器的灵敏度，要想提高检测器的灵敏度 必须增大输出信号并减小噪声。除了激光器、激发和收集光学系统、检测池以及 光电探测器对检测灵敏度有重大影响外，光路的准直、检测窗口的清洁程度等对 检测灵敏度也有重要的影响。提高连续光多光子激发荧光强