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硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 摘要 本文以s - 萘普生为模板合成分子印迹聚合物。利用平衡结合实验、 s c a t c h a r d 模型、比表面测定等手段系统地探讨了功能单体、交联剂种类及用量 对印迹聚合物吸附性能的影响。结果显示以丙烯酰胺制备的聚合物吸附性能最 好，n 乙烯基吡咯烷酮和c 【甲基丙烯酸次之。随着交联度的增加，聚合物的吸 附性能下降。二乙烯基苯交联的聚合物的吸附性能明显优于7 , - - 醇二甲基丙烯 酸酯交联体系。利用紫外光度法研究了单体与模板的氢键作用，在机理上深入 解释了不同功能单体制各的聚合物吸附性能的差异。选择性评价实验表明聚合 物的识别能力随交联度的增大而增强。最后，将印迹聚合物用作薄层色谱的固 定相，对萘普生外消旋体进行拆分，收到了很好的手性分离效果，分离度达到 】6 7 。 关键词：分子印迹聚合物，功能单体，交联剂，交联度，吸附，识别能力，薄 层色谱 硕士论文s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 a b s t r a c t m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s w e r e p r e p a r e du s i n gs - n a p r o x e n a sa t e m p l a t em o l e c u l e t h ee f f e c to ft y p eo f f u n c t i o n a la n d c r o s s l i n k i n gm o n o m e r s ，a s w e l la sd e g r e eo fc r o s s l i n k i n go nt h eb i n d i n gc a p a c i t yo fp o l y m e r s ，h a sb e e ns t u d i e d b ye q u i l i b r i u mb i n d i n ga s s a y , s c a t c h a r dm o d e la n ds u r f a c ea r e aa n dp o r ea n a l y s i s ， t h er e s u l t si n d i c a t ep o l y m e r ss y n t h e s i z e db ya c r y l a m i d ey i e l d e dt h eh i g h e s t ， p o l y m e r ss y n t h e s i z e db ym e t h a c r y l i c a c i do rn v i n y l p y r r o l i d o n ey i e l d e dl o w e r a n d d i v i n y l b e n z e n ei sab e t t e rc h o i c ea st h ec r o s s l i n k e rc o m p a r e d w i t he t h y l e n eg l y c o l d i m e t h a c r y l a t e ，y i e l d i n gp o l y m e r sw i t hh i g h e ra n a l y t eb i n d i n g b i n d i n gi s o t h e r m s r e v e a l e db i n d i n gc a p a c i t yo fp o l y m e r sd e c r e a s ew i t ht h ed e g r e eo fc r o s s l i n k i n g i n t r a m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n db e t w e e nt e m p l a t em o l e c u l ea n df u n c t i o n a lm o n o m e r s w a ss t u d i e db yu v s p e c t r o s c o p y , w h i c hp r o v i d ea ne x p l a n a t i o nf o rt h ed i f f e r e n c e o fb i n d i n g c a p a c i t y o fp o l y m e r s p r e p a r e db y d i f f e r e n tf u n c t i o n a lm o n o m e r s e x p e r i m e n t so fs e l e c t i v i t y s h o wt h a tr e c o g n i t i o np r o p e r t i e so fp o l y m e r si n c r e a s e w i t ht h ed e g r e eo fc r o s s l i n k i n g m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r so fs - n a p r o x e n w e r ep r e p a r e dt ou s ea sc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e si nt h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) ， a n dt h er e s u l t sr e v e a lt h a tt l cb a s e do nm i pc o u l ds u c c e e dt h ed i r e c ts e p a r a t i o no f e n a n t i o m e ro f n a p r o x e na sam e t h o do f s e p a r a t i o n r = 1 6 7 k e y w o r d s ：m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，b i n d i n gc a p a c i t y , c r o s s l i n k e r , d e g r e e o f c r o s s - l i n k i n g ，r e c o g n i t i o np r o p e r t i e s ，t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y e 一6 2 4 9 t s 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 q 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：坠鱼当 垆年7 月名日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 垒望鱼! 鱼 ”虹年) 月日 硕士论文 s 礤普生印迹聚合物材料的台成及性能研究 l 绪论 1 1 概述 1 9 4 0 年p a u l i n g 提出了抗体形成的“模板学说”，该理论认为抗原物质进入 抗体之后，蛋白质或多肽链以抗原为模板进行分予自组装和折叠形成抗体。尽 管该学说后来被“克隆选择”学说取代，但它激发了人们以抗原或其它待测物 质作为模板合成抗体模拟物的设想。分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g t e c h n i q u e ，m i t ) 正是这一设想的成功实践。 分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点土与某一分子( 模板分子) 完全匹配的材料的实验制备技术。1 9 7 3 年，w u l l f 等“1 利用酶和抗体具有分子形 状、空间结构选择性等特点，发展了用于色谱手性拆分的分子印迹聚合物 ( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p ) 。然而这项技术中可供选择的试验材料十 分有限，二十世纪九十年代以前一直很少有人问津。1 9 9 3 年m o s b a c h 等0 1 在 n a t l l r c 上发表了一篇有关茶碱分子印迹聚合物的报道，揭开了分子印迹技 术的新篇章。至此，分子印迹聚合物材料研究获得迅速发展，仅最近两三年各 类刊物上发表的相关论文就有千余篇“。 分子印迹聚合物材料之所以发展如此迅速，主要是因为分子印迹聚合物具 有预定选择性、专一识别性和高度稳定性( 耐热、耐有机溶剂、耐酸碱) ，而且 与天然抗体相比制各简单，可以重复使用，分子印迹聚合物作为一种新型分离 材料在手性分离、药物检测、环境分析、催化、传感器等领域的应用价值引起 了人们的普遍关注。目前，从事分子印迹聚合物材料研究工作的国家主要有瑞 典、日本、德国和美国，我国从1 9 9 6 年开始开展分子印迹聚合物作为手性分离 固定相的研究工作，尽管取得了一些研究成果，但总的来说还处于起步阶段。 1 2 分子印迹聚合物制备的基本理论 分子印迹聚合物材料的制各是使模板分子( 即目标分子) 与功能单体分子 按照一定的比例混合，借助两者之间的共价作用或非共价作用，形成功能单体 模板分子复合物( 也称为超分子复合物) ，再加入交联剂，通过聚合反应将单 体分子交联固定，最后洗脱模板分子，留下与原模板分子空间结构互补并具有 多重作用点的三维孔穴，见图1 2 1 。这个孔穴可以选择性地重新与模板分子结 合，从而对模板分子产生识别作用。理想的分子印迹聚合物应具备适当的刚性、 一定的机械稳定性和热稳定性。根据模板分子与功能单体之间结合方式的不同， 硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 通常将分子印迹聚合物的制备方法分为共价法( 预组装型) 和非共价法( 自组 装型) 。 图1 2 1 分子印迹聚合物材料的制备过程 1 2 1 共价法( 预组装型) 共价型分子印迹聚合物最初是由w u l l f 及其合作者提出的，聚合前模板分 子通过可逆性共价键与功能单体结合。目前，利用这种方法已经获得一些糖类 及其衍生物、甘油酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、扁桃酸、芳香酮、二醛 类、三醛类、铁转移蛋白、联辅酶和甾类等化合物的分子印迹聚合物。然而， 一方面共价作用结合和解离的键合动态过程进行缓慢，对色谱分离不适用：另 一方面要找到易于解离和再结合的共价键相当困难。因此，共价型分子印迹聚 合物有很大的局限性。 1 2 2 非共价法( 自组装型) m o s b a c h 及其合作者“”首次将非共价型分子印迹聚合物引入分子印迹技 术。聚合前模板分子通过氢键、静电作用力及疏水作用等与功能单体结合形成 超分子复合物。关于这种类型分子印迹聚合物的制各和应用报道很多，包括一 些染料、二胺类、维生素、氨基酸及其衍生物、多肽、苄脒、激素、b 肾上腺 素阻滞剂等。制备非共价型分子印迹聚合物对模板分子和功能单体限制较少， 模板分子容易除去，而且选择性好。近年来，非共价型分子印迹聚合物已经成 为分子印迹聚合物材料的主要研究方向。 1 2 3 牺牲空间法 w h i t c o m b e 等人“”发展了牺牲空间法，即将分子自组装和分子预组装相结 合制备胆固醇分子印迹聚合物。他们用2 一乙烯苯基碳酸酯中的酯键与模板分子 2 硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的台成及性能研究 胆固醇相连( 相当于分子预组装) ，聚合后酯基很容易水解放出c 0 2 ，生成的非 共价的识别位点通过氢键与模板分子再结合( 相当于分子自组装) 。 1 3 分子印迹聚合物的制各方法 1 3 1 功能单体 分子印迹聚合物分为共价型和非共价型两种。由于共价型分子印迹聚合物 有较严格的解离后再结合条件，使得此类型功能单体的开发与使用受到限制。 目前常用的功能单体有含乙烯基的硼酸、醛、胺、酚和二醇以及含有硼酸酯的 硅烷化合物等。 非共价型分子印迹聚合物经常使用的功能单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、 甲基丙烯酸羟乙酯、三氟甲基丙烯酸、2 乙烯基吡啶、4 一乙烯基吡啶等“”3 ，在 这些化合物中以甲基丙烯酸为代表的羧酸类单体最为常用，这是因为甲基丙烯 酸的羧基能与许多官能团发生作用，如与羟基、醚、羧基、酰胺、脲等形成氢 键，或与氨基发生作用形成离子交换作用。a n d e r s s o n 等“8 1 还将甲基丙烯酸与 2 乙烯基吡啶混合使用，由于混合单体与印迹分子间形成复合物的作用力的种 类和数量增加，所以可能比仅使用一种功能单体制得的分子印迹聚合物的选择 性更高，但是这个过程的成功与否还取决于模板分子以及功能单体一模板分子复 合物的相对强度是否大于功能单体之间的作用。由于非共价型m i p 存在非特异 性结合的问题，而且当为了使平衡向着生成模板分子功能单体复合物方向移动 加入大大过量的功能单体时，这一问题就更为严重。因此，设计和合成能与模 板分子的某些功能基团形成更强作用的新功能单体已经成为m i p 研究的一个重 要课题。 1 3 2 交联剂 分子印迹聚合物的识别能力与交联剂的种类和用量有密切关系。对交联剂 的选择既要考虑其应具有适当的柔性以使孔穴有良好的可近性，又要有一定的 刚性和交联度以维持孔穴的形状，缩短结合平衡的时间。 常用的交联剂有：乙二醇= 甲基丙烯酸酯( e g d m a ) 、二乙烯基苯( d v b ) 、 三甲醇基丙烷三甲基丙烯酸酯( 喇m ) 等。目前e g d m a 使用最多，制各的 分子印迹聚合物选择性较高。关于t r i m 这种新的交联剂已有一些研究，与 e g d m a 聚合物相比，t r i m 交联的m i p 最大的优点是在h p l c 中的负载能力高 硕士论文s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 得多。将t r i m 应用于氨基酸衍生物的研究中，发现其制备的分子印迹聚合物 的负载能力增加到每克聚合物能分离l m gd a h m # b 消旋体，与大多数蛋白质手 性固定相相当。 1 3 3 反应溶剂 由于溶剂不仅对分子间作用力影响很大，而且还起到致孔剂的作用，决定 印迹聚合物的形态，因此选择合适的反应溶剂对分子印迹聚合物的制备和性能 非常重要。一般，溶剂的选择遵从以下几个原则：( 1 ) 对模板分子具有较高的溶 解能力，低浓度模板分子制备的印迹聚合物可能会出现非特异性吸附增加；( 2 ) 根据模板分子与功能单体之间作用力类型选择合适的反应溶剂。高极性溶剂会 降低模板分子与功能单体的结合，特别是干扰氢键的形成，影响印迹聚合物的 识别能力。应尽可能采用苯、甲苯、二甲苯和三氯甲烷等介电常数低的溶剂。 1 3 4 引发方式 分子印迹聚合物的制备通常借助热、光或辐射线来引发，一般以偶氮二异 丁腈( a i b n ) 或偶氮二异庚腈( a b v n ) 为引发剂。在光照、加热、加压和电 合成等多种引发方式中，以低温光引发应用最为普遍，它具有以下优点：( 1 ) 可 印迹热稳定性较差的化合物；( 2 ) 可稳定模板分子与功能单体形成的复合物；( 3 ) 可改善分子印迹聚合物的物理性能以提高其选择性。光引发中又以紫外光能量 适中应用最多。热引发也是一种常用的引发方式，但对热不稳定物质不适用。 1 3 5 制备方法 根据分析目的，常见的分子印迹聚合物的形态有块状、液珠、棒状、膜等， 采用的合成技术有封管聚合、原位聚合、悬浮聚合、多步溶胀以及成膜等。现 将几种主要制各方法的产物特性及其优缺点列于表1 3 5 1 中。 1 3 5 1 封管聚合 封管聚合就是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂等按一定配比溶解 在反应溶剂中，于玻璃安培管中制得整块的分子印迹聚合物，经粉碎、研磨、 过筛，获得适宜粒径的聚合物颗粒。封管聚合操作条件易于控制、实验装置简 单，是目前分子印迹聚合物主要的制备方法。但是，研磨过程中不可避免会产 硕士论文s 一萘普生印迹聚台物材料的合成及性能研究 生一些不规则粒予和大量的过细粒子，这些过细粒子需通过沉降除去。通常， 经过处理可使用的粒子仅占研磨后聚合物的4 0 - 6 0 ，产量较低。 表1 3 5 1 几种分子印迹聚合方法的比较 聚合方法复杂程度产物 优点缺点 1 3 5 2 原位聚合 原位聚合是直接在色谱柱中制备印迹聚合物，避免了封管聚合研磨过筛等 繁琐的处理过程，使实验过程大为简化。但为了获得良好的流动性质，制备时 必须选择合适的溶剂，聚合条件的优化成为决定色谱柱性能的关键。 1 3 5 3 悬浮聚合 近几年发展起来的悬浮聚合法是制备分子印迹聚合物微球最简便、最常用 的方法之一。由于通常使用的单体是疏水性的，所以连续相常用水或高极性的 有机溶剂，但是高极性溶剂会破坏功能单体与模板分子之间的相互作用，干扰 5 硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 聚合物对模板分子的识别。 为了克服水或高极性有机溶剂的干扰问题，人们提出以全氟烃为分散相的 悬浮聚合法。即在液态全氟烃中形成非共价印迹混合物乳液，采用氟化的表面 活性剂或含氟的表面活性聚合物作为分散剂，得到稳定的含有功能单体、模板 分子、交联剂、致孔剂的乳液液滴，可以直接制得聚合物微球，而且颗粒直径 分布相当窄。m a y e s 等“”在全氟烃液体中通过悬浮聚合制得分子印迹液滴，改 变聚合分散剂或乳液形成期间的实验条件时，液滴尺寸可以控制在5 5 0 p m ，而 且产率几乎达到1 0 0 。 1 3 5 4 多步溶胀 利用多步溶胀制备分子印迹聚合物是由h o s o y a 等。”首先提出的，他们将制 得的粒径为1 眦的聚苯乙烯微粒作为种子，把该种子制成的分散体系与活化剂、 引发剂、表面活性剂制备的微乳液混合，在一定的搅拌速度下进行第一步溶胀， 然后将溶胀后的分散体系加入到交联剂、功能单体或添加剂、致孔剂和稳定剂 组成的溶液中，在恒定搅拌速度下完成第二步溶胀，最后加入模板分子，在惰 性气体保护恒定搅速下聚合制得一定大小的球形印迹聚合物。他们以萘二胺位 置异构体作为模板分子合成了具有均匀尺寸分布的球形印迹聚合物，用作 h p l c 填料分离位置异构体，其选择因子为1 4 或1 5 。 1 3 5 5 表面印迹 表面印迹有两种制备方法，可分别识别金属离子和其它物质o 1 。识别金 属离子是以中孔的硅胶树脂为基质，将模板金属离子和功能单体形成的配合物 利用缩合聚合引入到硅胶表面，当金属离子除去后，在硅胶或聚合物表面留下 可再结合该金属离子的位点。p l u n k e t t 等。”将硅胶用3 ( 三甲硅氧基) 丙基甲 基丙酸酯活化，使其表面含有可聚合的乙烯，再将其与金属螯合单体n - ( 4 一乙 烯基苯甲基) 一亚氨基二乙酸酮( i i ) ，模板分子咪唑共聚，制得半径为1 0 1 x n a 的 球形分离介质。 表面印迹有以下优点：( 1 ) 由于该法主客体之间的相互作用是模板分予与金 属离子的配位键，故可以在水中聚合和识别：( 2 ) 结合位点位于分子印迹聚合物 的表面，一方面使模板分子易于洗脱，可提高结合容量，另一方丽再结合时模 板分子无需进入其刚性结构，大大加快结合动力学过程。但表面印迹对模板分 子与金属离子之间的配位常数要求较为严格，因为配位常数太大会导致模板分 子不易洗脱，太小会出现非特异性结合，影响分子印迹聚合物选择的专一性。 6 硕士论文 s - 萘普生印迹聚台物材料的合成及性能研究 1 4 分子印迹聚合物的应用 1 4 1 药物手性分离 拆分合成药物一直是制药工业中的难题，目前世界临床使用的合成药物中， 手性药物占4 0 ，而8 7 以上的手性药物是以外消旋体的形式出售的。随着对 手性药物药理活性研究的不断深入，人们已经开始重视手性药物对映体生理作 用和代谢过程的差别。尽管目前已有手性合成、酶拆分和其它一些分离技术， 但分子印迹聚合物在分离对映体方面有独到之处。 将m i p 用作色谱固定相进行手性拆分是m i p 早期研究的一个重点，也是 进展最大的领域，到目前为止已经成功分离了氨基酸衍生物、糖苷衍生物、镇 静药苯二氮、b 肾上腺素阻滞剂普萘洛尔、非甾体消炎镇痛药萘普生等手性对 映体的完全分离”“。人们通过对色谱手性分离过程的吸附热力学和动力学的 探讨，从理论上计算结合位点的种类、平衡离解常数以及熵、焓、吉布斯自 由能的变化。另外还建立一些模型尝试对印迹机理加以解释，其中以s e l l e r g r e n 的三点作用模型应用最广，该模型认为是模板分子与印迹聚合物之间的三种作 用位点实现识别和分离的。但是也有学者认为有些情况下模板分子与印迹聚合 物间只有一种或两种作用位点，而且保留情况不仅与作用位点有关，还会受空 间构造的影响啪1 。因此，要从理论上解释印迹机理，尚有待进一步的研究。 随着合成技术的发展，人们将m i p 制成单分散液珠的形式或者直接原位 合成m 口作为固定相以提高分离的效果。然而，尽管已有十几年的发展历史， 以m i p 作为手性固定相的色谱还未投入商业使用。这是因为商业固定相分离效 果好、使用范围广，发展已经相当成熟。笔者认为以m i p 作为薄层色谱的固定 相o ”以其价格低廉、操作简单等优势有可能成为商品投入实际应用。s u e d e e 及 其合作者o “以( 一) 一假麻黄碱和( 一) 一降麻黄碱为模板，制得m i p 作为薄层色谱的 手性固定相，不仅实现了对相应模板分子的识别，而且还能分离些结构上相 关的手性化合物如麻黄碱和副肾碱。 1 4 2 固相萃取 分子印迹聚合物是一类很有开发潜力的固相萃取( s p e ) 材料。与传统的 分离材料比，m i p 比c 1 8 、离子交换树脂或其它分离材料选择性好，而且对目 标分子的保留类似于基于抗体技术制备的亲和色谱介质。而m i p 比生物亲合材 料稳定、价廉，制各简单。由于m i p 对目标分子的保留是亲和性的，m i p 的固 硕士论文 s - 萘普生印遮聚含物材料的舍成及性能研究 相萃取过程实际上是一种o n - o f f 型亲和分离过程：( 1 ) 上样，使目标分子保留在 装有m i p 的s p e 柱上；( 2 ) 使用不破坏这种亲和作用的溶剂冲洗s p e 柱，以除 去杂质；( 3 ) 用破坏这种亲和作用的溶剂将目标分子洗脱下来。由于m i p s p e 是基于亲和色谱分离机制，因此不存在分离因子小的问题。而且，可以利用 m i p 在一定条件下存在的“交叉反应性”( c r o s s r e a c t i v i t y ) ，将结构类似物从某 种复杂体系中有效地萃取出来。 m i p s p e 用于环境样品和农用化学品的富集是十分有效的，如萃取硝基酚、 芳香硝基化合物、苯达松除草剂、莠去津除草剂等，富集倍数通常在1 0 0 以上， 并可在线连接h p l c 直接进行测定o “。m i p s p e 在对药物的富集中也表现出较 好的性能，目前已经实现了他莫昔芬、普萘洛尔、尼古丁等的富集测定。固相 苯取已被认为是分子印迹技术最有应用前景的领域。3 删。 但随着研究的不断深入人们也发现该技术还存在以下几个问题：( 1 ) 印迹聚 合物的非特异性吸附问题，这对分离工作十分不利，m a r t i n 等。6 1 采用加入三乙 基胺( t e a ) 等离子修饰物的方法来克服这一困难，但对洗脱条件的要求相当苛 刻，给实际应用带来不便：( 2 ) 生物样品基质组分对测定会产生影响；( 3 ) m i p 中残余的印迹分子难以除尽，这不仅会降低柱容量，而且残余的印迹分子在使 用过程中会缓慢地释放出来，影响分析结果，对痕量分析尤为不利。 尽管m i p s p e 的研究工作还处于起步阶段，尚有许多不尽人意的地方，但 与传统的样品前处理方法相比，其应用前景是勿庸置疑的。最近，z a n d e r 等人 “7 1 以尼古丁为模板制备m i p ，在分析口香糖中尼古丁及其氧化物时得到了相当 高的回收率和良好的重现性，制得的m i p 在选择性上优于c 1 8 柱和未经印迹的 同种聚合物，而且没有可检出的模扳残留。目前，欧盟已经制定了m i c a 计划 支持欧盟各国科学家进行m i p 作为s p e 材料的合作研究工作。 1 4 3 临床药物测定 将m i p 作为抗体模拟物代替抗体或受体建立竞争分析法，称为分子印迹吸 附测定法( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d s o r b e n ta s s a y , m i a ) 。m o s b a c h 等“”首先利用 m i p 提供的分子专一性测定血清中药物，以茶碱和安定作为模板分子，与m a a 和e g d m a 在氯仿中聚合制得m i p 用于放射标记配基结合测定人体的血清。 m i p 首先与放射标记的药物混合，加入待测的血清样品，若样品中含有这种药 物，就会和放射标记的药物竞争结合位点。释放出来的放射标记的药物量反过 来就与血清中的药物浓度成正比。结果发现，用m i p 得到的分析结果与用多酶 免疫测定技术测得的结果相当，两种方法的线性相关系数达到0 9 8 。目前，已 建立了茶碱、吗啡、安定、普萘洛尔、1 7 d 一雌二醇等的m i a 1 ”。 8 硕士论文 s - 蔡普生印迹聚台物材料的合成及性能研究 1 4 4 传感器 近年来生物传感器以突出的灵敏度和特异性引起了广泛关注，但生物传感 器以酶、受体、抗体等生物物质作为敏感材料，这些物质通常稳定性差，不易 长期保存，还面临恶劣化学环境耐受性等问题，限制了生物传感器的应用发展。 与生物物质相比，分子印迹聚合物兼具免疫吸附材料的高选择性和常规理化材 料的稳定性，耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂等条件，容易保存。 各类分子印迹聚合物传感器中研究最早的是电化学传感器“，p i l e t s k y 等“”使用甲基丙烯酸和丙烯酸低聚氨基甲酸酯两种单体混合物制备莠去津的印 迹聚合物薄膜，结果显示该膜不仅稳定性高，而且响应时间短，仅需6 1 0 m i n ， 该传感器对莠去津的检测限达到5 n m o l l 。目前，研究较热的是电位型分子印 迹聚合物传感器，因为与电导、电流、电容等传感器不同，电位型传感器的选 择性不仅与印迹聚合物的性质有关，而且还可通过改变电位进一步提高。k r o g e r 等人“”将制备的分子印迹聚合物涂敷于丝网印制电极表面，研制出检测2 , 4 一二 氯苯氧乙酸的电位型传感器。其测定时间短，无需进行长时间平衡建立背景电 流，一次扫描仅需1 5 s ，而且对没有电活性或不易标记的分析物也适用。 除了电化学传感器外，还有光学和质量型分子印迹聚合物传感器。光学传 感器的突出优点是灵敏度较高，根据所选光学元件和检测器材的不同，可分为 分光光度型、荧光型、磷光型和表面等离子体共振型。n a g a o k a 等“”将l 谷氨 酸酯与过氧化聚吡咯通过电合成方式在金电极上制备分子印迹聚合物膜，除去 模板分子后用荧光检测吸附在电极上的l 一谷氨酸酯的量，结果表面印迹聚合物 结合的l 谷氨酸酯的量是d 一谷氨酸酯的3 0 倍，显示出很好的选择性。对于质 量型传感器，目前报道最多的是将分子印迹技术与石英微量天平( q c m ) 与表 面声波( s a w ) 相结合“”，将m i p 薄膜粘附在电极上，当分析物被聚合物吸附 时电极质量增加，这是质量型传感器用q c m 进行压电微重量分析定量的基础。 l4 5 模拟酶催化 长期以来，化学家们梦想着生产酶模拟物或人工酶作为新型的催化剂，但 进展甚微。分子印迹聚合物材料的出现使这一情况大为改观。1 9 8 7 年l e o n h a r d t 等“”将以硝基苯一甲基磷酸酯作为模板制得的分子印迹聚合物用于对硝基苯乙 酸酯的水解，结果表明分子印迹聚合物加速了水解过程。最近还发现分子印迹 聚合物可以催化四氯噻吩与马来酸酐之间的d i e l s a l d e r 反应，而且至今还没有 一种天然酶能催化这个反应。 硕士论文s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 m i p 模拟酶催化剂，一般是以反应底物、过渡态的类似物为模板或以能对 反应起辅助作用的化合物为模板的m i p 用在化学反应催化中。m i p 模拟酶是非 常稳定的，可在恶劣的条件( 如将污染了杀虫剂的土壤或水脱毒化) 代替天然酶 使用，而且其所诱导的化学反应选择性是非常可观的。但m i p 在这一方面的发 展还比较缓慢，m i p 模拟酶研究需要解决的一个挑战性的问题即如何有效地模 拟天然酶体系中存在的“诱导嵌合”机制。由于目前制备的多数m i p 识别位点 刚性较强柔性较弱，造成模拟酶效果较差。研究制备“识别位点一构形可调” 的m i p 是今后模拟酶研究的必然发展方向。目前，已采纳的加快m i p 模拟酶发 展的一种研究趋势是用组合化学方法优化m i p 的合成。另外，减小m i p 粒子的 大小以获得识别位点均一的“可溶性”m i p 模拟酶催化剂的技术也正在研究中。 1 5 论文的选题依据和研究思路 纵观分子印迹聚合物的研究历史，从液相色谱固定相、选择性催化剂到人 工受体、传感器敏感材料、固相萃取固定相，这个过程反映出分子印迹技术是 高分子合成、分子设计、生物和医药等众多学科领域交叉的边缘性课题。尽管 对于分子印迹聚合物材料的研究已有几十年的历史，并且取得了很大的进展。 但离人们的期望还相差很远，还有许多问题有待进一步研究。笔者认为分子印 迹聚合物材料未来可能的发展方向主要有以下几个方面：从分子水平上认识印 迹和识别机理，实现分子印迹和识别过程的定量描述；合成更多更有效的功能 单体和交联剂，以满足分子印迹和识别的需要；将分子印迹和识别过程从有机 相转入水相，以便能够达到与天然分子识别系统相媲美的完美境地；使药物的 手性分离和固相萃取步入商业化阶段：将模板分子从氨基酸、药物等小分子、 超分子过渡到核苷酸、多肽、蛋白质的生物大分子，甚至生物活体细胞。 笔者拟在以下几个方面开展研究工作： ( 1 ) 选用非甾体药物s 萘普生作为模板分子合成分子印迹聚合物，通过紫外 光谱、红外光谱、比表面仪、s c a t c h a r d 分析、平衡结合法、选择性评价等多种 手段，系统地探讨了分子印迹聚合物吸附行为和识别能力，揭示了聚合物的印 迹机理，为进一步开拓分子印迹聚合物的应用研究提供了理论和实验基础； ( 2 ) 利用平衡结合实验，比较功能单体、交联剂的种类及用量等因素对于分 子印迹聚合物吸附能力的影响； ( 3 ) 利用选择性评价实验，探讨由丙烯酰胺和n - 乙烯基吡咯烷酮两种功能单 体制备的印迹聚合物的对s 萘普生及其结构类似物阿司匹林的识别能力； ( 4 ) 将分子印迹聚合物用于薄层色谱固定相材料，研究了其对萘普生对映体 的手性拆分性能，对印迹聚合物的实际应用进行初探。 o 硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 2 分子印迹聚合物的合成及性能研究 本课题选用非甾体药物s 萘普生作为模板，利用封管聚合方法制各分子印 迹聚合物。目前已有几篇关于s 一萘普生分子印迹聚合物的报道，但是基本上都 是从分析化学的角度对印迹聚合物在液相色谱上的应用进行探讨，而对印迹聚 合物本身的研究还不够深入。本文结合紫外、红外、比表面等多种分析手段对 功能单体、交联剂、交联程度等因素对印迹聚合物吸附分离性能的影响进行了 系统的研究，从高分子材料学角度对产生影响的原因进行诠释，希望藉此丰富 分子印迹聚合物材料的基本理论。 另一方面，萘普生是一种芳基烷酸类非甾体消炎药“”具有高效、低毒的消 炎、镇痛和解热作用，主要适用于类风湿性关节炎，骨关节炎、强直型脊椎炎、 痛风等症状，由于其副作用比阿司匹林和吲哚美辛都少，临床使用广泛。随着 药物学研究的发展和临床医药分析要求的提高，药物检测已经成为该领域的一 个热点。由于生化样品的基质通常比较复杂，对分析结果影响较大，如何快速 有效地将待测药物分离出来成为药物检测的关键，本课题希望通过制备具有高 度专一吸附性能的分子印迹聚合物为解决这个问题开辟一条道路。 2 1 实验部分 2 1 1 试剂与仪器 2 1 1 1 试剂 名称 s 一萘普生 阿司匹林 甲基丙烯酸 丙烯酰胺 n 乙烯基吡咯烷酮 偶氮二异丁腈 乙二醇二甲基丙烯酸酯 二乙烯基苯 三氯甲烷、乙腈 纯度 光学纯 分析纯 化学纯 化学纯 分析纯 化学纯 工业纯 分析纯 分析纯 生产厂家 浙江天新药物化工有限公司 南京制药厂 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 m e r c k 公司 上海试四赫维化工有限公司 苏卅i 安利化学品公司 f l u c k 公司 上海凌峰化学试剂有限公司 硕士论文 s 萘普生印迹聚台物材料的合成及性能研究 冰醋酸、甲醇、无水乙醇化学纯 上海实值化学试剂有限公司 2 1 1 2 仪器 名称型号 紫外分光光度计u v l 2 0 1 型 恒温水浴振荡器s h a b 型 超级恒温水浴5 0 1 型 球磨机q m 一4 h 型 比表面、孔径分析仪s a 3 1 0 0 型 傅立叶变换红外光谱仪t e n s o r 型 5 0 m l 玻璃安培管自行设计定做。 2 1 2 分子印迹聚合物的制备 2 1 2 1 原料的精制 生产厂家 北京瑞利分析仪器有限公司 常州国华电器有限公司 上海实验仪器厂 南京桑力电子设备厂 c o u l t e r 公司 b r u k e r 公司 乙二醇二甲基丙烯酸酯的精制：先用1 0 n a o h 和1 0 n a c l 混合液洗涤至 无色，再用5 n a o h 和1 0 n a c i 混合液洗至p h 值为8 左右，用1 0 n a c l 洗 至中性，最后用蒸馏水洗涤两次，加入无水硫酸钠干燥，过滤后低温避光保存 备用。 2 1 2 2 分子印迹聚合物的制备 称取0 4 6 9 ( 2 m m 0 1 ) 的模板s 一萘普生和一定量的功能单体溶于2 5 m l 三氯甲 烷中，于振荡器中室温下振荡l o m i n ，使单体与萦普生充分作用。再依次加入 交联荆和o 1 9 的偶氮二异丁腈，将该混合液转移至5 0 m l 安培管中，通氮除氧， 用酒精喷灯封管。将其置于5 0 的恒温水浴中反应2 4 h ，所得块状聚合物经粉 碎、球磨后过筛，粒径控制在4 5 7 5 1 x r n ，用乙酸甲醇溶液( 1 ：9 ，v v ) 的洗涤，直 到在紫外分光光度计上无模板分子检出为止，再用乙腈洗涤一次，真空干燥至 恒重，即得到分子印迹聚合物。为了比较聚合条件对聚合物性质的影响，在合 成时分别采用不同的功能单体、交联剂以及使用不同的交联度合成分子印迹聚 合物，其组成及合成条件见表2 1 2 2 1 。 空白聚合物( n o n - i m p r i n t e d p o l y m e r s ) 的制各除不加模板分子s 一萘普生外， 1 2 硕士论文 s 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 其余与上述制备方法相同，记为n p i n p l 5 。 表2 1 2 2 1 分子印迹聚合物合成配方 2 1 3 分子印迹聚合物结构表征 2 1 3 1 红外表征 采用k b r 压片，用t e n s o r 型傅立叶变换红外光谱仪在4 0 0 0 5 0 0 c m l 扫 描，得到分子印迹聚合物的红外光谱图。 2 1 3 2 比表面、孔容、孔径分析 s a 3 1 0 0 型比表面仪，脱气温度为2 0 0 。c ，脱气时间为6 0 m i n ，利用b e t 法测得分子印迹聚合物颗粒的比表面、孔径、孔容。 1 3 硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 2 1 4 平衡结合实验 称取分子印迹聚合物5 0 m g 放在磨口锥形瓶中，加入5 0 m l 已知浓度s 一萘 普生的乙腈溶液( 0 1 4 m m o l l ) ，置于2 0 恒温水浴振荡器中振荡2 4 h ，然后 将该混合液转入高速离心机中离心1 5 m i n ，取适量的离心液用乙腈稀释至一定 体积，用紫外分光光度计于3 3 2 n m 处测定萘普生的吸光度，并根据用标准溶液 绘制的工作曲线( 标准曲线) 测定结合前后溶液中底物浓度的变化，利用公式 ( 2 1 4 1 ) 计算聚合物对底物的平衡结合量q ( g m 0 1 ) 。吸附底物后的模板聚合 物按照模板分子的方法洗去底物，真空干燥后可再使用。 q = ( c 0 一c ) 矿 ( 2 1 4 1 ) 式中c n 为被吸附溶液中萘普生的初始浓度( m m o l l ) ： c 为达到吸附平衡以后的溶液中萘普生的浓度( m m o l l ) ； v 为被吸附溶液的体积( i i l l ) 。 2 1 5 功能单体与模板分子相互作用研究 选用甲基丙烯酸、丙烯酰胺、n 一乙烯基吡咯烷酮三种功能单体，s 一萘普生 乙腈溶液的浓度固定为c 0 = 0 5 m m o l l ，加入不同量的功能单体，使得功能单体 与模板分子的摩尔比分别为0 、2 ：1 、4 ：1 和8 ：1 ，在2 0 c 恒温水浴振荡器中振荡 1 2 h ，使模板分子与功能单体充分作用，用相应浓度的功能单体溶液作为参比， 在2 0 0 - - 4 0 0 n m 波长范围内检测功能单体与模板分子在不同摩尔比时紫外吸收光 谱的变化。 选用甲基丙烯酸、丙烯酰胺、n 乙烯基吡咯烷酮三种功能单体，s 一萘普生 乙腈溶液的浓度固定为c o = o 5 m m o l l ，加入一定量的功能单体，使得功能单体 与模板分子的摩尔比为4 ：1 。将超级恒温水浴与紫外分光光度计的恒温系统相 连，维持样品池温度恒定。分别在0 。c 和5 0 两个温度条件下，在2 0 0 - 4 0 0 n m 波长范围内测定模板分子与功能单体混合溶液的紫外吸收情况。 2 1 6 分子结构模拟及氢键强度的计算 由于现代计算方法还难以模拟高度交联的分子印迹聚合物结构，目前主要 着重于印迹聚合物合成的第一步，即模拟模板分子与功能单体形成的复合物。 采用c sc h e m 3 dp r o 软件经过能量优化模拟模板分子s 一萘普生分别与甲基丙烯 酸、丙烯酰胺、n 乙烯基毗咯烷酮三种功能单体形成的复合物，并利用p m 3 半 1 4 硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 经验计算方法计算氢键的强度。 2 1 7 选择性评价实验 称取分子印迹聚合物5 0 m g 放在磨口锥形瓶中，分别加入5 0 m 1 0 1 m m 0 1 l 的s - 萘普生及其结构类似物阿司匹林的乙腈溶液，嚣于2 0 。c 恒温水浴振荡器中 振荡2 4 h ，然后将该混合液转入塑料离心管中，放入高速离心机中1 5 0 0 0 r m i n 转速下离心1 5 m i n ，取适量的离心液用乙腈稀释至一定体积，分别用紫外分光 光度计于3 3 2 n m 和2 2 9 n m 处测定萘普生和阿司匹林的吸光度，并根据用标准溶 液绘制的工作曲线( 标准曲线) 测定两种物质的平衡浓度。根据公式( 2 1 7 ，1 ) 计算底物在聚合物和溶液两相中的分配系数k 。 k = c p q ( 2 1 7 1 ) 式中c 。为聚合物结合底物的浓度( 1 a m o l g ) ； c 。为溶液中底物的平衡浓度( 1 a m o l m 1 ) 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 分子印迹聚合物的合成 2 2 1 1 合成原理 在分子印迹聚合物的合成中，功能单体和模板分子相互作用形成复合物， 交联后在聚合物中形成了处于特定位置的结合位点。在洗脱模板分子后，这些 结合位点对于模板分子具有选择性的亲和作用。在合成中可以采用的功能单体 和模板分子之间的结合方式有两种：共价结合和非共价结合。由于非共价结合 具有对模板分子和功能单体限制较少以及除去模板分子相对容易的特点，是目 前普遍使用的方法。印迹聚合物对于模板分子的亲和作用的强弱程度取决于作 用力的类型、结合位点的数量及在聚合溶液中功能单体和模板分子结合的稳定 程度。在文献所报道的非共价型分子印迹聚合物的研究工作中，大都以离子键 和氨键相结合的协同作用作为印迹聚合物和底物( 模板分子) 的亲和作用力。但 是能够与功能单体同时形成离子键和氢键作用的模板分子毕竟少数，而如果单 纯依靠氢键来进行印迹和识别，对于模板分子而言就有很大的选择空间。正是 出于这个考虑，本课题研究了单纯氢键作用的分予印迹聚合物体系，希望藉此 为分子印迹聚合物材料开拓更为广阔的应用领域。 硕士论文 s - 萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究 本文采用的模板分子是s 一萘普生，使用的功能单体有甲基丙烯酸、丙烯酰 胺、n 一乙烯基吡咯烷酮三种。从分子结构上分析，模板分子与功能单体之间的 结合方式是非共价结合，氢键是聚合中形成模板分子功能单体配合物的主要作 用力，氢键作用的强弱很大程度上决定了模板分子功能单体复合物的稳定程 度，进而影响到分子印迹聚合物对模板分子的亲和作用。印迹聚合物的合成原 理如图2 2 1 1 1 2 2 1 1 3 所示。 “9 ( 1 印凡。+ “一c c h 2 ， 亡h 1 q ! 一； 壁墨牡 k 人j l c 。一。、o ”矿c h ； 以甲基丙烯酸为功能单体制备分子印迹聚合物示意图 c h c h 2 + “量盼“ 型莎、，l 舱“。 图2 2 1 1 2 以n 乙烯基吡咯烷酮为功能单体制备分子印迹聚合物示意图 硕士论文s - 萘普生印迹聚台物材料的合成及性能研究 “拍弧，k + o 乒一c h c h 一“3 q 。，l 音 洗脱模扳 一、n r 。 一o c c _ c h 2 图2 2 1 1 3 以丙烯酰胺为功能单体制各分子印迹