（环境工程专业论文）功能化多壁碳纳米管的细胞毒性研究.pdf

山东大学硕士学位论文 符号说明 c n t sc a r b o nn a n o t u b e s碳纳米管 m w n t sm u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s多壁碳纳米管 f m w n t s f u n c i 。n a l i z e dm u l i - w a l le dc a r b 。n 功能化多壁碳纳米管f m w n功能化多壁碳纳米管 n a n o t u b e s s w n t s t e m s i n g l e w a l l e dc a r b o nn n a n o t u b e s 单壁碳纳米管 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y透射电子显微镜 d m a c d i m e t h y l a c e t a m i d e e d t a 二甲基乙酰胺 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 r o sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e r p m r e v o l u t i o np e rm i n u t e h h o u r m i nm i n u t e m lm i l l i l i t e r 活性氧 磷酸盐缓冲液 每分钟转速 小时 分钟 毫升 7 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本入在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 函童：蓬 e t 期：塑星：量垫 关于学位论文使用授权的声明 + 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向犀家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：醢耋鱼导师签名： 山东大学硕士学位论文 目的 功能化多壁碳纳米管的细胞毒性研究 中文摘要 碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e s ，c n t s ) 是一种非常重要的一维 纳米材料，由于其独特的结构和物理化学性质，使得它在汽车制造、 平板显示器、生物医药等领域有广阔的应用前景。但是它对生态环 境、人类健康的影响目前还不是很清楚，有待于进一步研究。本课 题通过对本实验室设计、合成的功能化多壁碳纳米管库进行的细胞 毒性研究，发现了碳纳米管的表面修饰基团与细胞毒性之间的剂量 效应关系，筛选出生物相容性较好的碳纳米管。在此基础上，以毒 性差异较为显著的4 种功能化碳纳米管作为研究对象，对其细胞毒 性进行深入的探讨，为建立纳米材料的毒性数据库提供重要的参考 数据。 方法 本研究选择人正常皮肤成纤维细胞n h f b ( n o r m a lh u m a n f i b r o b l a s t s ) 和人肝癌细胞h e p g 2 作为毒性筛选模型用于功能化多 壁碳纳米管库( f u n c t i o n a l i z e dm u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e sl i b r a r y ， f - m w n t sl i b r a r y ) 的筛选，细胞密度是4 0 0 0 个细胞孔( 9 6 孔板) ， f - m w n t s 的浓度为2 0 0 i t g m l 。本实验首先通过相差显微镜观察细 胞形态变化和w s t 1 方法测定细胞活力，对f - m w n t s 库的细胞毒 性进行了初步筛选。根据初级筛选结果，选择碳纳米管库中的 m w n t s 0 0 2 、m w n t s 0 0 3 、m w n t s 0 0 4 和m w n t s 0 0 5 这4 种功 能化碳管进行以下几方面的研究：应用透射电子显微镜 ( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ，t e m ) 观察n h f b 细胞对 f m w n t s 的摄入及其在细胞内的定位情况；分析了f m w n t s 对细 胞内活性氧含量( r e a c t i v eo x y g e ns p e c ie s ，r o s ) 的影响；对细 山东大学硕士学位论文 胞周期( c e l lc y c l e ，c c ) 受阻滞的情况进行了研究。 结果 1 功能化多壁碳纳米管库的细胞毒性筛选 f m w n t s 对细胞存活率的影响呈现明显的剂量效应关系，而 细胞的存活率则随时间的延长而有所升高；表面修饰有不同官能团 的多壁碳纳米管的分散性有所不同，所表现出来的细胞毒性也存在 着差异；经过f - m w n t s 处理后，细胞存活率均在5o 以上。其中 以羧基化碳纳米管m w n t s 0 0 2 对两种细胞活力的影响最为明显， 对n h f b 细胞和h e p g 2 细胞的存活抑制率分别为4 7 和4 0 。 2 细胞形态观察 通过普通光学显微镜下的观察发现，经f m w n t s 处理的n h f b 细胞的形态发生了很大改变。正常情况下，细胞应该呈纤维状，细 胞的延展性较好，处理后细胞形态明显变得较为瘦弱，几乎呈丝状 分布，细胞的延展性、贴壁性能变差，细胞数目少于对照组。细胞 生长受到显著抑制，但没有表现出明显的死亡现象。 3 功能化多壁碳纳米管在细胞内的定位 m w n t s 0 0 2 、m w n t s 0 0 3 、m w n t s 0 0 4 和m w n t s 0 0 5 作用 于n h f b 细胞12 h 后，能够穿过细胞膜进入细胞质胞浆的空泡内， 并引起细胞一定程度的损伤，如细胞核皱缩、细胞膜破损、细胞有 凋亡小体出现、线粒体空泡化、细胞核内的常染色质减少等现象。 4 细胞内活性氧含量的测定 处理组细胞内活性氧含量有所升高，当f m w n t s 的作用浓度 大于50 9 9 m l 时，细胞内的活性氧含量显著提高，随处理时间的增 长，细胞内活性氧含量反而有所降低。f m w n t s 的处理对细胞内 2 山东大学硕士学位论文 活性氧的产生呈浓度依赖关系，但对处理时间则表现出负相关性。 5 细胞周期分布情况 不同浓度的羧基化m w n t s 作用h e p g 2 细胞1 2 h 后，细胞周期 分布情况出现轻微的改变，与对照组相比，g o g1 期细胞百分数有 所上升，g 2 m 期细胞百分数下降。其中，2 0 0 9 9 m lm w n t s - 0 0 2 作用于h e p g 2 细胞1 2h 后，g 0 g1 期细胞百分数为6 5 8 6 ，而对 照组为5 7 4 5 。 将m w n t s 0 0 2 、m w n t s 0 0 3 、m w n t s 0 0 4 和m w n t s 0 0 5 以 2 0 0 9 9 m l 的浓度分别作用h e p g 2 细胞6 h 、1 2 h 、2 4 h 和4 8 h ，与对 照组细胞相比，所引起的细胞周期在g 0 g1 期的阻滞以12 h 最为明 显。 结论 1 f - m w n t s 的细胞毒性与其表面修饰的化学官能团有关，并且具 有剂量依赖性； 2 f - m w n t s 的细胞毒性主要表现为抑制细胞增殖； 3 f m w n t s 能够穿过细胞膜进入细胞，分布在细胞质的空泡内， 并对细胞造成一定的损伤； 4 f m w n t s 可以引发细胞内活性氧含量的升高，这可能是抑制细 胞增殖的原因之一： 5 f m w n t s 诱导细胞周期阻滞在g 0 g 1 期，阻滞效果与碳纳米管 的表面修饰有关。 关键词：功能化多壁碳纳米管；细胞毒性；细胞周期；活性氧 o b j e c t i v e s ： 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h ep a s ty e a r s ，c a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) h a v eb e e ni n t e n s i v e l y i n v e s t i g a t e df o ri t sw i d ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n se s p e c i a l l yi n b i o m e d i c i n eb e c a u s eo ft h eu n i q u ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s h o w e v e r ，c a r b o nn a n o t u b e sh a v er a i s e ds e v e r a lq u e s t i o n sa b o u tt h e i r s a f e t ya n de n v i r o n m e n t a li m p a c t r e s e a r c ho nt h et o x i c i t yo fc a r b o n n a n o t u b e sh a sj u s tb e g u na n dt h ed a t aa r es t i l lf r a g m e n t a r ya n d s h b j e c tt oc r i t i c i s m s 。s u r f a c em o d i f i c a t i o no fc n t sh a sc o n s i d e r a b l e i m p a c to nt h e i rr e a c t i v i t y af u n c t i o n a l i z e dm u l t i - w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ( f - m w n t s ) l i b r a r yh a sb e e ns y n t h e s i z e df o rt h ef i r s tt i m e i no u rg r o u p 。i no r d e rt of i n do u tt h ed o s e r e s p o 稳s er e l a t i o n s h i p r e l e v a n tw i t ht h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fm w n t s ，s t u d yo n t h ec y t o t o x i c i t yo ft h ef o m w n t si nt h el i b r a r yw a sp e r f o r m e d 。f o u r k i n d so ff m w n t sw i t hd i f f e r e n tc y t o t o x i c i t y ( m w n t s 一0 0 2 ， m w n t s 一0 0 3 ，m w n t s 一0 0 4a n dm w n t s 一0 0 5 ) h a v eb e e ns e l e c t e df o r f u r t h e rr e s e a r c ha f t e rt h ep r i m a r yc y t o t o x i c i t ys c r e e n i n g 。 m e 譬嚣o d s ： t w oc e l ll i n e s ，n h f ba n dh e p g 2 ，h a v eb e e nc h o s e nf o rt h ep r i m a r y e y t o t o x i e i t ys c r e e n i n go ff - m w n t s ) i b r a r y ，t h ec o n c e n t r a t i o no f f - m w n t si s2 0 0 g m l i nt h ee x p e r i m e n t ，w eu s e dm i c r o s c o p yt o o b s e r v et h ec e l lm o r p h o l o g yc h a n g ea n dw s t 一1a s s a yt oe v a l u a t ec e l l s u r v i v a l m w n t s 一0 0 2 ，m w n t s 一0 0 3 ，m w n t s - 0 0 4a n dm w n t s - 0 0 5 w e r ec h o s e nf o rt h ef o l l o w i n gs t u d i e s 。f i r s t l y ，c e l lu p t a k ea n d i n t r a c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ff - m w n t sw a si m a g e db yt r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) s e c o n d l y ，c e l l u l a rr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ( r o s ) w a sd e t e r m i n e db yf l u o r o m e t r yw i t hd c f a st h e f l u o r e s c e n c ep r o b e f i n a ll y ，c e l lc y c l ea s s a yw a sp e r f o r m e dw i t h f l o wc y t o m e t r y 。 r e s u l t s ： 4 山东大学硕士学位论文 1 c y t o t o x i c i t yr e s e a r c ho ff m w n t sl i b r a r y t h ee f f e c t so ff - m w n t sa p p e a r e dd o s ed e p e n d e n t ，b u tn o tt i m e d e p e n d e n t t h ed i s p e r s i b i l i t yo ff - m w n t sw i t hd i f f e r e n ts u r f a c e m o d i f i c a t i o ni sv e r yd i f f e r e n t ，a n dt h e i rc y t o t o x i c i t yi sa l s od i f f e r e n t c e l lv i a b i l i t ya f t e rt r e a t m e n tw i t hf - m w n t si sa b o u ta b o v e5 0 m w n t s - 0 0 2h a st h eg r e a t e s te f f e c to ne e l lv i a b i l i t yw i t h5 3 f o r n h f b ，a n d6 0 f o rh e p g 2 ，r e s p e c t i v e l y 2 c e l lm o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n c e l lm o r p h o l o g yc h a n g e dal o ta f t e rf m w n t st r e a t m e n t i nn o r m a l c o n d i t i o n s ，n h f bi sf i b r i f o r m ，b u tt h ec e l l se x p o s e dt of m w n t sa r e v e r yt h i n ，c e l lm o r p h o l o g yc h a n g e dt of i l i f o r m c e l la d h e s i o na n d s p r e a da b i l i t ya r ev e r yp o o r w i t hs m a l l e rc e l ln u m b e rc o m p a r e dt o c o n t r o lg r o u p ，f - m w n t si n h i b i tc e l lp r o l i f e r a t i o no b v i o u s l y 3 i n t r a c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ff m w n t s m w n t s 0 0 2 、m w n t s 0 0 3 、m w n t s 0 0 4a n dm w n t s 0 0 5l o c a t e w i t h i nt h ei n t r a c y t o p l a s m i cv a c u o l e s ，a n dd os o m ed a m a g et ot h e c e l l s f o re x a m p l e ，t h es t r u c t u r eo fc e l lm e m b r a n ew a sd e s t r o y e d ， e u c h r o m a t i nr e d u c e da n da p o p t o t i cb o d i e sw e r ep r o d u c e de t c 4 d e t e r m i n a t i o no fi n t r a c e l l u l a rr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) f - m w n t sc a ne n h a n c et h ei n t r a c e l l u l a rr o si nh e p g 2c e l l s t h i s r e s p o n s es h o w sad o s e d e p e n d e n tm a n n e r w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f f m w n t si sa b o v e5 0p g m l ，c e l l u l a rr o si n c r e a s e dn o t i c e a b l y h o w e v e r ，t h el e v e lo fc e l l u l a rr o sd e c r e a s e da l o n gw i t ht h e t r e a t m e n tt i m e 5 c e l lc y c l e ( c c ) f m w n t sc a ni n d u c eg 0 g1p h a s ea r r e s ts l ig h t l yi nh e p g 2c e l l s a f t e rt r e a t m e n tw i t hm w n t s 一0 0 2f o r12h c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l g r o u p ，t h er a t i oi ng 0 g 1 p h a s ei n c r e a s e ds l i g h t l y ，a n dt h er a t i oi n g 2 mp h a s ed e c r e a s e d a t2 0 0i _ t g m l ，t h er a t i oi ng 0 g1 p h a s ei s 6 5 8 6 ，w h i l ei nc o n t r o lg r o u p ，i ti s5 7 4 5 w h e nt h ec e l l se x p o s e d t of - m w n t sf o r12h ，g 0 g1p h a s ea r r e s tg o tt oav e r t e x c o n c l u s i o n s ： 山东大学硕士学位论文 1 t h ee f f e c t so ff - m w n t sa r ed o s ed e p e n d e n t b u tn o tt i m e d e p e n d e n t t h ec y t o t o x i cr e s p o n s eo fc e l l si nc u l t u r ei sd e p e n d e n t o nt h es u r f a c em o d i f i c a t i o no fm w n t s 2 f m w n t sc a ni n h i b i tc e l lp r o l i f e r a t i o n b u tn o ti n d u c ec e l ld e a t h 3 f m w n t sc a nc r o s sc e l lm e m b r a n e 1 0 c a t ei nv a c u o l e si n c y t o p l a s ma n dd a m a g et ot h ec e l l s 4 f m w n t sc a ni n c r e a s et h ec e l l u l a rr o s 5 f m w n t sc a ni n d u c eg g1 p h a s ea r r e s ts l i g h t l y k e yw o r d s ：f u n c t i o n a l i z e dc a r b o nn a n o t u b e s ；c y t o t o x i c i t y ； r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ；c e l lc y c l e ( c c ) 6 山东大学硕士学位论文 功能化多壁碳纳米管的细胞毒性研究 1 1 纳米材料简介 第一章绪论 随着现代科学技术的迅猛发展，人们认知能力的逐渐增强，对 微观世界的探索也越来越深入，物理学家费因曼“按人们的意志安 排一个个原子和分子”的设想已经在纳米技术的帮助下成为现实， 纳米科学逐渐进入人们的视野，成为21 世纪的主导学科。纳米材 料是一种介于分子和宏观常规材料之间的介观态材料，是指在三维 空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构成 的材料，包括零维、一维和二维纳米材料。目前所普遍接受的纳 米材料的定义是：粒径为1 10 0 n m 的纳米粉、纳米线、厚度为 1 10 0 n m 的纳米薄膜，并且出现纳米效应的材料【2 ，3 1 ，包括金属、 碳等多种材质，可有粒状、管状等多种形状，如半导体量子点 ( q u a n t u md o t s ，q d s ) 、纳米金、纳米银、磁性纳米颗粒( m a g n e t ic n a n o p a r t i c l e s ，m n p s ) 、碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e s ，c n t s ) 等等。 1 1 1 纳米材料的特点及其应用 纳米材料由于其粒径比较小，处于原子簇和宏观粒子交界的过 渡区域，因而具有其结构的特殊性，表现出了奇异的特性：量子 尺寸效应( q u a n t u me f f e c t s ) ，当粒子尺寸降到某一值时，金属费 米能级附近的电子能级由准连续变为离散能级或者能隙变宽的现 象；小尺寸效应，当颗粒的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及 超导态的相干长度或透射深度等物理特征尺寸相当或更小时，晶体 周期性的边界条件将被破坏，非晶态纳米粒子的颗粒表面层附近的 原子密度减少，导致声、光、电、磁、热、力学等特性呈现新的物 理性质的变化称为小尺寸效应；表面效应，表面效应是指纳米颗 粒表面原子数与总原子数之比随粒径变小而急剧增大后引起的性 9 山东大学硕士学位论文 质上的变化。纳米粒子尺寸小，表面能高，表面原子占相当大的比 例；宏观量子隧道效应，微观粒子贯穿势垒的能力称为隧道效应。 磁化的纳米粒子具有隧道效应，它们可以穿越宏观系统的势垒而产 生变化，即宏观量子隧道效应。这些特性使得纳米材料具有特异的 力学、光学、电学、热学、化学、催化、超导特性，因此将被广泛 应用于诸如材料、机械、半导体、光学、环境保护、化妆品、家用 电器、化工、生物医学等各个领域。如纳米二氧化钛，作为成熟、 稳定、安全有效的新型抗茵介质，已经被世界所公认，这种新型的 商品化的纳米产品在杀菌、净化空气、除臭等方面有着广泛的应用 。目前，纳米材料在生物医学方面的应用己成为学术界关注的焦 点问题之一，研究发现，此类材料在生物传感器、疾病诊断、输送 载体等方面有着良好的应用前景【4 06 1 。 1 1 2 纳米材料毒理学研究现状 纳米材料的广泛应用，尤其在生物医学方面的应用，使得人们 通过各种途径接触纳米材料的可能性正在加大，随着各种纳米材料 的市场化，接触人群也将由小范围的研究开发人员扩大到整个社会 人群。然而正如科学技术是一把双刃剑，纳米科技也存在这样的问 题。从19 9 7 年研究人员发现防晒油遮光剂中的t i 0 2 z n o 纳米颗粒 对d n a 有损伤作用到2 0 0 4 年e v ao b e r d 6 r s t e r 向美国化学会提交 报告说富勒烯能够引起鱼体内的脑损伤和基因功能的变化【i7 1 ，越 来越多的研究结果已经表明，纳米材料对生物体有潜在的毒性效 应，它对生态环境和人类健康的负面效应也越来越引起人们的热切 关注。s c i e n c e 和n a t u r e 等著名杂志已相继发表论文呼吁纳米尺度 材料进行环境安全性评价的迫切性【1 8 - 2 2 1 。 其实纳米颗粒( 又称超微颗粒u l t r a f i n ep a r t i c u l a t e s ，u p s ) 在 空气中的存在早已经被证实，这种极细小的颗粒很容易经呼吸道和 皮肤接触进入人体内部，从而引发一些呼吸道疾病和肺部疾病等。 纳米颗粒的表面活性及可以穿透细胞膜的特性使得它们与较大颗 粒相区别开来，然而这些特点也会加剧它们的毒性，不能不引起人 1 0 山东大学硕士学位论文 们的关注 2 3 】。 任何攀物都不是孤立存在的，纳米材料在进入环境之后，会以 不同形式分散在大气、水或土壤环境中，并在这些体系中进行迁移 或转换。如果把纳米材料放在环境中考虑，由于其本身的结构特性， 它们会有下列污染特性f 2 4 】：与生物大分子的强烈结合性；生态系 统的潜在累积性；微赛面反应的错综复杂性；多种污染物的组合复 合性；扩散和迁移的传播广阔性等。这些特性无疑为纳米材料对生 态环境产生污染起到推波动澜的作用。 鉴于纳米颗粒对生态环境及生物体存在不确定性的风险，各国 在大力发展纳米科技的同时，也开始转向纳米材料的毒性研究。美 国联邦环境署目前正在搜集所有有关纳米颗粒各种风险和由它造 成的各种剐作用的数据；联邦教研部最近将启动“纳米应用对人体 健康风险计划”。纳米科技国际委员会( i c o n ) 和r i c e 大学生物与 环境纳米科技中心( c b e n ) 已经建立了纳米材料风险信息数据库， 这对于纳米材料的风险评价及对某些相关政策法规的制定将会起 到积极的影响。2 0 0 4 年美国国家环保局拨款4 0 0 万美元委托l2 所大 学开展纳米材料对环境和人体可能产生危害的研究。英国皇家学会 及皇家工程院高度评价了纳米颗粒对人类健康和环境产生不确定 性影响的研究和控制纳米颗粒暴露的立法。日本将制订一个为期3 年的计划，通过动物实验研究机体吸收纳米材料的状况和这类材料 是否存在毒性等。尽管市场对纳米材料的需求越来越旺盛，但其生 物安全性还是未知数，关于它对健康的影响也还没有成熟的分析方 法。有报告称，动物吸入纳米材料可能对多个脏器和中枢神经系统 产生不良影响。研究人员将致力于开发有针对性的方法以调查肺、 皮肤和肠道对纳米材料的吸收性以及这种材料排出体外的情况，并 分析纳米材料向大脑和胎儿移动的情况等。日本有关部门强调，着 手研究纳米材料的安全性，并不是因为纳米材料已经引发了什么安 全问题，丽是要为这种新材料广泛应用于日常生活作准备。目前我 国中科院高能物理研究所已经建立了纳米生物效应实验室，这对于 我囡的纳米材料毒性研究将起到一定的促进作用 2 5 - 3 0 】。 山东大学硕士学位论文 1 2 碳纳米管及其细胞毒理学研究现状 1 2 1 碳纳米管简介 碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e s ，c n t s ) 是19 91 年由日本s u m i o i i j i m a 教授发现的一种碳结构。理想纳米碳管是由碳原子形成的石 墨烯片层卷成的无缝、中空的管体。石墨烯的片层一般可以从一层 到上百层，含有一层石墨烯片层的称为单壁碳纳米管( s i n g l e w a l l e d c a r b o nn a n o t u b e s ，s w n t s ) ，其直径在0 7 5n m 3n m ，长度在1 5 0 j z m ，又称为巴基管和富勒管，多于一层的则称为多壁碳纳米管 ( m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ，m w n t s ) ，直径在2 30n m ，长度 在o 1 5 0p m ，层间距约为o 3 4r i m 。由于c n t s 具有较大的长径比， 所以可以把其看成为准一维纳米材料。 自碳纳米管被发现以来，它就以它良好的导电、机械及半导体 性能而成为化学界的一颗新星。碳纳米管的抗拉强度达到5 0 2 0 0 g p a ，是钢的10 0 倍，密度却只有钢的l 6 ，至少比常规石墨纤维高 一个数量级。有人这么评价碳纳米管的机械强度：如果用碳纳米管 做成绳索，是迄今唯一可从月球挂到地球表面而不会被自身重量拉 折的绳索。正如加州伯克利a l e xz e t t l 教授所说的那样，如果就应 用前景把c 6 0 和纳米碳管作一个全面比较的话，c 6 0 可以用一页纸 进行概括，而纳米碳管则需要一本书来完成，这种变化是指数级的 变化。 目前，这种新型纳米材料已被应用到轮胎j 平板显示器和汽车 制造等领域。除此之外，碳纳米管在生物医学领域也显现出极大的 应用前景【31 1 。但未经修饰的碳纳米管在很多溶剂中的溶解性都较 差，在某些程度上限制了它们的应用。为了解决这一问题，通常会 通过物理吸附、静电作用及共价连接等手段对其进行表面修饰。据 文献报道，为实现其在生物医学领域的应用，通常需对碳纳米管进 行生物分子修饰，所采用的修饰基团包括：示踪性基团( t r a c k i n g l i g a n d ) 、靶向性基团( t a r g e t i n gl i g a n d ) 和治疗性基团( t h e r a p e u t i c 1 2 盘东大学磺士学位论文 l i g a n d ) 32 1 。目前的研究表明碳纳米管可以用作基因、多肽、蛋白 质及小分子药物的输送载体及生物传感器 3 3 - 3 7 ；研究还发现，碳 纳米管在近红外区域有荧光信号，而在这个区域细胞的本底荧光较 小，不会对碳管的荧光信号造成干扰，因诧可以用碳纳米管的近纽 外荧光特性实现对细胞表面低表达蛋白的灵敏检测，从而进行疾病 诊断并在缨胞水乎上对治疗效果进行评价3 引。然蔼，任何一种材 料在应用到人体这个复杂的微环境中时，都必须要考虑到它对人类 健康的影响。碳纳米管本身作为缡米材料的特殊性及其在制各过程 中引入的一些有害催化剂使得其生物学效应研究成为一个重要的 课题。 1 2 2 碳纳米管细胞毒理学研究现状 碳纳米管生产过程中加入铁、镍等金属催化剂、碳纳米管大的 表面积及其不能被生物降勰、不能被组织清除等因素迫使人们急需 对其生物学效应进行合理的评价1 3 2 1 ：与动物实验相比较，细胞水 平的实验更容易实施且实验耗费较低【39 1 ，尽管碳纳米管的细胞生 物学效应方面的磷究取得了一些进展，但其毒性研究的结果尚存在 许多有争议的地方，主要原因有以下几方面：第一，碳纳米管制备 和纯化方法的多样性；第二，样品分散方法的不一致；第三，纲臆 毒性评价方法的多样性；第四，所用细胞评价模型的多样性【4 0 1 。 对于近期碳纳米管细胞毒性的磅究结果，l e w i n s k i 等人在 c y t o t o x i c i t yo fn a n o p a r t i c l e s 一文中已经做了较为详细的总结，详 见表l 。l 帮表1 。2 3 9 1 。 1 3 n 碲 舜淋 窜前 漪汁慊淘廿慷高黟h 姗_1怔糯嶷磐*啐墨耸高麟生【39】 瞥寄弧 姗尉峦炼 蔼阿卡|匀蓠蔺v 将嚣斟j 虫 轴嗣耳 萄 f v 姗霹貅汩 u l r 3 瞥离 a c a t - q q 4 _ 田l ( 寸u r小9-crkal o c i l o p p i aloo一冀 暑o_o弓llago f i n 茄瓣茹秘茹嗣 oooh，旰藩淋潞 法潍5奎栅沿凿潞 辫辫 _-lo暑暮一督_蓦1 ，-uoo1000譬暑_l 藩冉鉴哥* 。小2备思a嚣札i 巴藿芋。垦纛。 o-7u磊lill：一胥_譬m卢l暑暑一 孓ttoq_2。o磊ml1将离一 心协磊暑l-inqqn42-5) 。0认暑薯只_一种_-5 ii墨 j=o1_il) ：l-2岔磊om-公督14iim， 育_ 售一 知藩簿 蓄一。毫ote暑寸一暑 藩必耸离* 誊l c r | o 咎r r a v pi藩冉瞥爵* 1。_。 _ n a a 1 o 协莹耳耕i舌坍心。苓_。莹 耳。甜舌栅泮no零 a l i j舌甜i舌懈爿幂 。2a暑g蜀ll日寸。耕i舌坍汁落 泞6 5 摹 磐嚣蹴藻喀窗爿弓l融莉霹瞥离姗醉岫邕脚耳画窝洛琳 汛_冲魂|u5琴麟田舔斟 。一潜 冲知蚶抖霹 。3磊cm-2耳臣洱排霹 u0a磊量2耳雎渴莉歹e 【4 _ 一 。o 厶 【4 一 o 。u 【4 u 一 。o a a a n 。 4 u n o o a r 4 a 1 o o 认 暑湃汁姆巅件嗨禽酪持 釉oat一el 镰奉心_心峪 隧鼹瞥爵 篱嗽 王哪乔 认a 心 z刃uu。ua嗨 互一o-2_ 籀辚蒸躐 鲁onyl_(ouh 03n聱辫一no邑。 piro警一o f l o 落踟蕹翱 藩辩落黜 钳耸id60；豫誊l- 。孥_g磊ml二零时善麓 认o o l l i i 镰。器譬ll二一警14基一 协-lo。磊邑。蒂12墨。 育_oo譬誉1l 吣5，_。uo嚣誊l- 婪寄蕊穗谢 黼霹邀潞骆澎褂5呶嚣。 奢7 1 心o o 协 zf-kb舔舔赙箨蘧 ， 游斟弓|密蕊鼹豁藩滋济凿剐 _ 。2 4 。4 8 【4 8 】 n 8 孰 瞥署麟露簿啡洛露赛瞄溉譬 茁nlivedn整 籼4 升吾列每 1 t 墨一st。r口h ，i 互勺 _o。黾銎辩溉q。济趣_， | - 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2 喜 瞥茜滗蠢愤v。蒜蹴耳， 5 0 苓 2 4 。缸吣 a a y 茜口一 稽o o 西 游ps漆翟+整爱澄j盏潞器 f 6 2 心0 6 蛰高遂过盏壶 ， 2 4 冲磐鑫蒲南 。-2磊呈毒磐罨蘸酱罱赢叫 2 4 _ 9 m u：瀑嚣窝熬娑酶净溺墨 耸寄裁蘧胬辫寨 a a 酱器警痔盏排蛾蛩毫盛 苌_ 一 心o o af 6 2 i 心o o 小f 6 u 一心0 0 a 山东大学硕士学位论文 1 2 2 1 碳纳米管细胞毒性的影响因素 物质有没有毒性关键在于一个剂量的问题，除了这个控制要素 外，材料本身的物理化学性质也起着决定性的作用。研究表明，碳 纳米管对细胞产生明显毒性的浓度一般在微克级，同时，碳纳米管 的细胞毒性与其表面修饰基团及在溶液中的分散性等物理化学性 质有着极为密切的关系 6 4 1 。 表面化学修饰 碳纳米管表面的化学修饰可以改变碳管与细胞之间的作用， s a y e s 等人探讨了不同程度功能化s w n t s 的细胞毒性，发现碳纳米 管的细胞毒性与功能化密度有关。所用的碳管包括 s w n t p h e n y l - s o 3h 、s w n t - p h e n y l s o3 n a ( 碳和功能团的比率即 c f g 有1 8 ，4 1 和8 0 三种) 、s w n t p h e n y l - ( c o o h ) 2 ( c f c 为2 3 ) 及经过表面活性剂分散的未衍生化碳管。c f g 的值越大表明功能化 密度越小。同一类型的碳管，c f g 越小，经过相同的处理之后，细 胞死亡率也较低，用表面活性剂分散的未衍生化碳管的毒性最大 4 9 1 。 分散性 碳纳米管的分散性一直是一个难以解决的问题，目前主要有以 下几种方法进行分散：加入一定浓度的表面活性剂，对其表面进行 衍生化或直接加入含血清的培养基经过超声分散。不同分散程度的 碳纳米管的细胞毒性不同。w i c k 等人详细研究了不同团聚状态的碳 管的细胞毒性，结果发现结块的碳管细胞毒性要比分散性较好的碳 管的细胞毒性大1 5 ”。除此以外，碳管的尺寸、比表面积等也是影 响细胞毒性的重要因素。因此在探讨碳纳米管毒性的时候，对其进 行全面的表征是非常必要的。 化学组分 1 5 山东大学硕士学位论文 碳纳米管的生产过程中会使用一些金属催化剂，如铁、镍等， 当这些物质进入细胞之后可能会引发氧化还原反应，产生过氧化氢 及自由基等活性氧，最终对细胞造成损伤。p u l s k a m p 等人的研究 表明，未经纯化的商品化碳管可造成细胞内活性氧升高和线粒体膜 电位降低，而经过酸化处理、含有较少金属催化剂的碳管则没有这 一现象，因此他们推断碳管中含有的金属催化剂是产生一系列生物 学效应的原因【52 1 。自由基能够对d n a 造成损伤，为了保持基因的 完整性，细胞本身会启动一些保护机制，如可以激活p 53 蛋白和细 胞周期检验点，导致细胞周期