（环境工程专业论文）厌氧兼氧好氧废水处理系统中水解酶的活性研究.pdf

。缝懋 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 厌氧一兼氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 摘要 在废水生物处理中，微生物对废水中污染物质的降解和转化都 是在酶的催化作用下进行的一系列复杂的生化反应过程，因此研究 废水处理系统中微生物酶活性及其作用对于深入反应系统机理，提 高废水处理效率等有着十分重要的意义。为研究酶的活性分布，环 境因素对酶活性的影响，氮盐、磷盐对酶活性的影响，酶的活性与 出水水质的关系以及各种酶活性的变化，本课题选取p 一葡萄糖苷 酶、碱性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶和脂肪酶四种水解胞外酶作为研 究对象，对厌氧一缺氧一好氧废水生物处理系统中上述酶的活性作 了较为深入的研究。 分析酶的活性分布试验表明，绝大部分胞外酶是与细胞相连或 固定在细胞外多聚基质里，而不是被微生物以自由、溶解状态释放到 溶液中。通过环境因素对酶的影响的研究得，p 一葡萄糖苷酶、碱性 磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶和脂肪酶在6 0 有最高酶活；偏碱性条件 ( p h = 8 9 ) 有利于酶促反应的进行；酶活随底物浓度的增加而增大； 通常抑制剂含量越大其抑制作用越强，但对各待测酶的抑制效果不 尽相同；p 一葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶和脂肪酶在抑制剂存在下 2 4 h 内活性下降最多，而磷酸酶却较稳定，其活性几乎不受抑制剂作 用时间的影响。超声波对酶促反应起加速作用，在超声作用功率为 0 w 4 8 0 w 的范围内，待测四种胞外水解酶的活性都随超声功率的增 强而升高，在超声作用时间为o 1 0 m i n 的时间内，酶活性随时间持 续增强。对氮、磷对酶活性的影响研究发现，对于d 一葡萄糖苷酶和 脂肪酶，较高浓度的n 0 2 、n 0 3 和p 0 4 孓( 浓度大于1 0 0 m g l ) 有助 于提高酶的活性；对于碱性磷酸酶，n 0 2 的存在抑制了碱性磷酸酶 的活性，n 0 3 对碱性磷酸酶的活性起激活作用，较高浓度的p 0 4 3 - 能 够提高酶促反应速度，增大酶的活性；对于亮氨酸氨基肽酶，较低 浓度的n 0 2 、n 0 3 - 和p 0 4 孓( 浓度小于1 0 0 m g l ) 有利于酶活性的发 。缝继 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 挥。由此得出控制相关作用条件可最大限度地发挥酶的作用性能， 提高微生物活性。 对酶的活性分析还发现，酶活性可以有效地反映微生物的活性， 可考虑用其代替m l s s 、m l v s s 或v s s s s 来表征微生物活性。b 一葡萄糖苷酶和脂酶的活性直接影响c o d 和t o c 的去除，1 3 一葡 萄糖苷酶的活性大小及其水解作用对废水中有机物的降解以及系统 c o d 去除性能至关重要。碱性磷酸酶活性越大，总磷的去除率越高， 反之亦然。碱性磷酸酶的活性与总磷去除率表现出了显著的相关性。 亮氨酸氨基肽酶的活性都随氨氮和总氮去除率的提高而增大。各反 应池中相对稳定的碱性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶和脂酶的活性大小 说明系统中酶的消耗与合成达到了一个动态平衡。 关键词：酶活性；厌氧一缺氧一好氧系统；酶分布；影响因素；废水 生物处理 o 麟 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 s t u d yo ne n z y 僵a t i ca c t i v i t i e si na n a n a e r o b i c a n o c a e r o b i cs y s t e m a b s t r a c t m i c r o b i a ld e g r a d a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o no fp o l l u t a n t si nw a s t e w a t e r sa r eas e r i e so f c o m p l i c a t e db i o c h e m i c a lr e a c t i o np r o c e s sa sc o n d u c t e db ye n z y m e i ti ss i g n i f i c a n tt h a ts t u d yo n e n z y m a t i ca c t i v i t i e si nw a s t e w a t e rb i o t r e a t m e n ts y s t e mc o n t r i b u t e st og o i n gd e e pi n t or e a c t i o n m e c h a n i s ma n di m p r o v i n gr e m o v a le f f i c i e n c y i no r d e rt ok o w nt h ed i s t r i b u t i o no fe n z y m a t i c a c t i v i t i e s ，t h ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r sa n dn 0 2 ，n 0 3 ，p 0 4 弘e f f e c to ne n z y m e 8 ，t h er e l a t i o n b e t w e e ne n z y m a t i ca c t i v i t i e sa n dt r e a t e dw a t e rq u a l i t ya n dc o m p a r a t i o no fe n z y m a t i ca c t i v i t i e s ， f o u re x t r a c e l l u l a rh y d r o l y s i se n z y m e sw e r es e l e c t e di nt h i ss t u d y , i e1 3 - g l u c o s i d a s e ，a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ，l e u c i n e - a m i n o p e p t i d a s ea n dl i p a s e ，t oi n v e s t i g a t et h e i ra c t i v i t i e sa n da c t i o ni na n a n a e r o b i c - a n o x i c a e r o b i cs y s t e m t h es t u d yo nt h ed i s t r i b u t i o no fe n z y m a t i ca c t i v i t i e ss h o w e dt h a tm o s to fe x t r a c e l l u l a r e n z y m e sw e r ea s s o c i a t e dw i t l lc e l l so ri m m o b i l i z e di ne x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t r a t e s r a t h e r t h a nr e l e a s i n gt ot h es o l u t i o na saf l e e ，s o l u b l es t a t e t h ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r se f f e c to n e n z y m e ss t u d ys h o w e dt h eh i g h e s te n z y m a t i ca c t i v i t ya p p e a r e da t6 0 e n z y m a t i ca c t i v i t i e s w e r ea c c e l e r a t e du n d e ra l k a l i n ec o n d i t i o n ( p h = 8 - 9 ) a n di n c r e a s e d 、历t l li n c r e a s eo fs u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n h i g h e ri n h i b i t o rc o n c e n t r a t i o ni n d u c e dt oab e t t e rp r o h i b i t i v ee f f e c t ，b u ti n h i b i t o r y e f f e c tw a sd i f f e r e n tf o re a c h b 豇l z y m e i n h i b i t o rd e c r e a s e dt h ee n z y m a t i c a c t i v i t i e so f p g l u c o s i d a s e ，l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s ea n dl i p a s ea f t e r2 4h o u r s h o w e v e r , t h ea c t i v i t yo f a l k a l i n ep h o s p h a t a s ew a so b s e r v e dt ob eq u i t es t a b l e u l t r a s o n i ci r r a d i a t i o na c c e l e r a t e dt h e e n z y m a t i cc a t a l y s e n z y m a t i ca c t i v i t i e si n c r e a s e d1 j l r i t hi n c r e a s eo fu l t r a s o n i cp o w e rw i t l l i l l 0 - - 4 8 0 w , a n di n c r e a s e dw i t hi n c r e a s eo fu l t r a s o n i cp r o c e s st i m ew i t h i no - l o m i n t h es t u d yo n e n z y m a t i cs t a b i l i t yf o u n dt h a tf o r1 3 - g l u c o s i d a s ea n dl i p a s e ，ah i g h e rn 0 2 ，n 0 3 一a n dp 0 4 。 c o n c e n t r a t i o n ( m o r et h a n10 0 m g l ) c o n d u c e dt oi n c r e a s ee n z y m a t i ca c t i v i t i e s f o ra l k a l i n e p h o s p h a t a s e ，n 0 2 。i n h i b i t e di t sa c t i v i t y , b u tn 0 3 a d v a n c e di t sa c t i v i t y , h i g hp 0 4 j _ c o n c e n t r a t i o n ( m o r e t h a n10 0 m g l ) i n c r e a s e d e n z y m a t i ca c t i v i t y f o rl e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e ，l o w c o n c e n t r a t i o no fn 0 2 。，n 0 3 a n dp 0 4 一( 1 e s st h a nlo o m g l ) r e s u l t e di ni n c r e a s e so fe n z y m a t i c a c t i v i t i e s t h u s 。h i g he n z y m a t i ca c t i v i t i e sw e r ee x p e c t e dt oo b t a i nt h r o u g hc o n t r o l l i n gt h er e l a t e d c o n d i t i o n s t h es t u d yo ne n z y m a t i ca c t i v i t i e ss h o w e dt h a t ，t h ee n z y m a t i ca c t i v i t i e sc o u l db ea sa n i n d i c a t o rt or e f l e c tt h em i c r o b i a la c t i v i t yi n s t e a do fm l s s m l v s sa n dv s s s s t h ee n z y m a t i c a c t i v i t yo f1 3 - g l u c o s i d a s ea n dl i p a s ew e r ec o r r e l a t e dw i t hc o d ，t o cr e m o v a l ，a n do r g a n i c c o m p o u n dd e g r a d a t i o ni nt h es y s t e m ah i g h 盯a l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t y , ah i g h e rt pr e m o v a l w a go b t a i n e d ，v i c ev e r s a a l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t yw a sr e l a t e dt ot pr e m o v a ln o t a b l y s i m i l a rt oa l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，h i g h e rl e u c i n e a m i n o p e p t i d a s ea c t i v i t y , h i g h e rn h 3 na n dt n r e m o v a lw a so b t a i n e d ，v i c ev e r s a t h es t a b l ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s ea n d 。缝懋 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 l i p a s ea c t i v i t i e sw e r ef o u n di ne a c hr e a c t o rc o u l db ep r o p o s e dt h a ta ne q u i l i b r a t i o ne x i s t e d b e t w e e nb - m _ z y m ec o n s u m p t i o na n dp r o d u c t i o na ts t e a d ys t a t e l u oc u i ( e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db y 出 k e yw o r d s ： e n z y m a t i ca c t i v i t y ；a n a e r o b i c a n o x i c a e r o b i cs y s t e m ；d i s t r i b u t i o no f e n z y m e s ；e f f e c tf a c t o r ；w a s t e w a t e rb i o t r e a t m e n t 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 罗翠 l e t 期：2 川年；月f 口日 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 学位论文作者签名： 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密瓯 ， 多黎 1 日期：抄 年3 月l 矿日 指剥币躲爹苒 日期：潲锡月，锢 。缝懋 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 1 1 引言 1 绪论 废水的处理方法有物理方法，化学方法，生物方法，对生活废水的生物法 处理是去除废水中有机污染物最为经济、最具环境效益的处理方法。目前，对 生物法研究较多集中在如何提高废水处理系统的处理效率，如何优化废水处理 工艺的运行条件，新工艺的开发与应用等技术问题和应用问题。而对活性污泥 中酶的研究还很少，尚未形成一套完整成熟的理论。国内有关活性污泥中的酶 对废水处理的作用等的研究少见报导。在废水生物处理中，微生物对废水中污 染物质的分解和转化过程实质上都是在酶的催化下进行的一系列复杂的生化反 应过程。可见，活性污泥中微生物基团分泌的酶在有机物降解的整个生化反应 中起着关键的作用。因此，对污泥中的酶的研究对于提高污水处理的效率有着 十分重要的意义。 本课题的目的将力求弄清活性污泥中微生物酶的位置及分布，研究影响酶 活性的各种因素，了解氮盐、磷盐对酶活性的影响，探究酶的活性与出水水质 的关系，比较各酶活性变化，对活性污泥中的酶有更深入的理解，以期从酶学 方面探索提高废水处理效率的有效途径。 酶( e n z y m e ) 是活细胞的成分，由活细胞自身合成的，并能在细胞内或细 胞外起催化作用的一种催化剂，故又称为生物催化剂。酶主要是由酶蛋白构成， 一些具有特殊功能的酶还包括一些辅助物，如金属离子，细胞色素氧化酶就含 有铁离子。 酶是生物催化剂，有着与化学催化剂所不同的性质，具体有如下一些催化 特性1 捌： 1 ) 酶积极参与生化反应，加速反应速度，缩短反应时间，但不改变反应的 平衡点，本身在反应前后没有结构和性质上的改变； 2 ) 酶的催化作用具有专一性，对所作用的底物有严格的选择性； 3 ) 酶在常温、常压和近中性的水溶液中就可以催化反应的进行； 4 ) 酶对温度、p h 值、金属离子、紫外线等环境条件极为敏感； 5 ) 酶的催化效率比无机催化剂的催化效率高几千倍至百亿倍。 1 、酶的作用机理 目前学术界对于酶的作用原理还没有一个统一的看法，比较成熟的理论有 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 三种： 1 ) 分子活化能学说 分子活化能学说认为，酶的作用就在于降低反应活化能阈，使反应沿着活 化能阈较低的途径迅速进行。 2 ) 中间产物学说 中间产物学说认为，酶在催化某一反应时，首先是酶与底物结合成一个不 稳定的中间产物，也称为中间络合物，然后中间产物再分解成产物，并释放出 原来的酶。 3 ) 诱导契合学说 诱导契合学说认为，酶与底物结合时，酶的活性中心结构与底物结构并非 恰巧相互吻合，只有当底物分子与酶分子相接触时，可诱导酶的活性中心结构 发生构象改变，从而与底物结构吻合，然后结合成中间产物，进而引起底物发 生相应的化学反应。 。 其中中间产物学说被大多数学者所接受，是比较主流的理论。 2 、酶促反应动力学 酶促反应动力学是研究酶的反应速度以及决定反应速度的各种因素。酶促 反应动力学中所指的速度是反应的初速度，即酶作用于底物开始不久的一段时 间内所测得的酶促反应速度。酶所催化的生化反应速度与底物浓度、酶分子浓 度等有关，并由最大反应速度和最小反应速度决定。酶促反应速度与酶分子浓 度成正比，酶分子越多，底物转化的速度就越快。另一方面，酶促反应速度与 底物浓度成正比，酶分子与底物分子结合成中间产物。一个连续进行的动态酶 促反应过程的最大可能是所有酶分子都与底物分子形成中间产物，这时，能影 响反应速度的底物浓度的最大值为酶分子浓度值，也就是说超过这个值的底物 浓度对增加反应速度没有意义，过量的底物浓度反而会对反应速度产生抑制作 用【3 1 。 酶促反应受环境温度的影响，具有最低温度、最高温度和最适温度，且会 随酶的不同而不同。p h 值对酶促反应的影响也有类似的关系。一些抑制剂可对 酶促反应产生抑制作用，如一些重金属、一氧化碳、表面活性剂等以及一些与 底物结构类似的物质均可成为酶促反应的抑制剂，使酶的活性降低。酶的活性 可通过浓度、生理或激素、共加修饰、酶原的活化、抑制剂、反馈、金属离子 和其它小分子化合物来调节【4 】。 3 、酶活性的测定方法 目前，测定酶活性的技术方法有以下几种： 1 ) 量气法 在封闭的反应系统中如有气体变化，通过测量变化后的气体体积或压力很 容易计算出气体变化量，这是量气法的基本原理。曾在检验科广泛应用的 2 。缝缫 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 v a n - s l y k e 测二氧化碳结合力的方法就是量气法的一个典型例子。但此法操作烦 琐，技术要求高而且灵敏度低，常规中很少使用。 2 ) 比色法 在上半个世纪建立了一些适用于常规工作的测酶活性浓度的方法，如测定 淀粉酶的s o m o g y i 法，碱性磷酸酶的b o d a n s k y 法、k i n g 法等等应用的都是比 色法。这些方法都是在酶和底物作用一段时间后停止酶反应，加入各种化学试 剂与产物或基质反应呈色，用比色计在可见光处比色，同时将被测物质作标准 管或标准曲线，比较后计算出在此段时间内产物生成量或底物消耗量，从而求 得反应速率v 。 3 ) 分光光度法 比色法从5 0 年代起逐步被分光光度法所取代。这是因为分光光度法有以下 几个显著优点：一是测定范围不只局限在可见光，还可扩展到紫外和红外部分。 这就为扩大测定酶范围提供了可能性。二是提供了寻找一类不需停止酶反应就 可直接测定产物生成量或底物消耗量方法的可能性。三是不需要如比色法那样， 作标准管或标准曲线，因为分光光度计使用近似单色光的光源，在此条件下， 某一特定物质的吸光度为常数，即人们所熟悉的摩尔吸光度( m o l a ra b s o r b a n c e ) 。 根据此值从吸光度t 不难计算出酶催化反应速度v 。分光光度法的技术多 样化，设计得当可用于各种酶的测定。 分光光度计的这些简便、准确等特点使它在近年来已逐步取代比色法而成 为目前最流行的方法。其缺点是需要精确带恒温装置的分光光度计，在经济不 发达地区尚难推广。此后在分光光度法的发展过程中又导入了酶偶联技术，它 是利用一些酶的底物或产物可以直接监测的原理，将该酶作为试剂加入到待测 的酶促反应体系中，使本来不易直接测定的反应转化为可以直接监测的系列反 应。使得分光光度法几乎能测定所有的酶。 4 ) 荧光法 分光光度法有一个缺点，即灵敏度较低。有些标本中酶浓度很低时往往测 不出来。此时可考虑改用荧光法，可将测定灵敏度提高2 3 个数量级【5 】。如科学 家合成了一系列甲基伞形酮的衍生物，可取代对硝基酚衍生物做为一些水解酶 的底物，由于水解产物甲基伞形酮有强烈荧光，大大提高测定的灵敏度，就是 分光光度法中最常用的n a d ( p ) h 反应系统，也可改用荧光法，在3 4 0 n m 紫外 线激发下n a d ( p ) h 产生强烈的蓝色荧光，而n a d ( p ) 不被激发。此外，还可使 用在荧光法基础上发展起来的时间分辨荧光法，例如北京医院就曾利用此种灵 敏度极高方法测定很难用其它方法检测的脑脊液中微量的烯醇化酶。荧光法不 易掌握，对所用的试剂、容器和仪器都要求很高，否则易产生非特异荧光干扰 测定，或者引起荧光的淬灭使测定不准，故此种方法多用于研究实验室，少用 于常规实验室。 3 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 5 ) i 司位素法 为提高灵敏度，还可使用同位素标记的底物进行酶测定，例如，有人以c 1 2 标记的乙酰胆碱为底物测定胆碱酯酶，在酶作用后以离子交换法分离出含c 1 4 的乙酸。同位素方法由于对人体有害，操作麻烦，目前已很少使用。 6 ) 其他方法 离子选择电极法：当酶反应牵涉到有酸碱变化时，很容易用p h 仪直接观察酶 反应过程中h + 的变化。直接用p h 仪测酶反应有两个缺点：一是随p h 变化， 会偏离酶作用的最适p h 值，不可避免地引起酶反应速度变慢。其二是如测定 的标本不是纯酶时标本中其他蛋白质其它有缓衡能力的物质将会影响所测p h 变化的程度：此时如改用电位滴定仪则更为适合。此仪器可在酶反应过程中不 断向反应体系中加入酸或碱以维持反应体系p h 的恒定，而加入的酸碱量只与 体系中h + 变化量相关，和反应体系中缓衡能力无关。同样如酶反应中有0 2 变 化，可使用氧电极来监测酶反应过程，这可用来测定葡萄糖氧化酶活性，c h a p p e l l 还成功地将此技术用于测线粒体的氧化能力。还曾有人尝试用二氧化碳和氨电 极测酶，由于这些电极反应时间较慢，不利于检测酶反应速度。旋光法：有些 酶的反应物为光学异构体，则可根据旋光度变化来追踪酶反应【6 】。某些反应物 如羟基酸本身虽无旋光性，但与钼结合后产生很高的旋光性。根据此特性建立 了测定延胡索酸水合酶的方法。还有个别酶的测定使用了极谱法、高效液相色 谱法等。 比较以上几种方法，目前使用最多的是分光光度法，因其检测方法简单易 行，所以被大量地采用于实验研究中。 对于b 一葡萄糖苷酶的活性的测定方法有：a b a r u s h 和s w i a i n 法：它以水杨 苷作底物，酶解产物用4 氨基安替比林作显色剂，使释放出来的水杨醇显色， 再用分光光度法比色测定。反应易受干扰，且检测灵敏度不高【_ 7 1 。b 荧光法：利 用伞形酮( 7 轻基香豆素) 与4 甲基伞形酮具强烈荧光的特点，将它们生为无荧光 的底物，以此测定【8 】。c 分光光度法：以对硝基苯基d d 葡糖苷( p n p g ) 作为底 物进行酶解，底物水解后释放出来的配基对硝基苯酚可直接在4 0 0 4 2 0 n m 之间 测定。微生物中b 一葡萄糖苷酶活性检测普遍采用以对硝基苯基一p d 葡糖苷为酶 底物的比色法 9 , 1 0 l 。因此本试验采用分光光度法测定1 3 一葡萄糖苷酶的活性。 检测脂肪酶活力的方法有很多种，所使用的底物也很多，一般根据目的的 不同选择合适的底物和方法。三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄榄油是常用的 检测脂肪酶活力的底物，反应快终结时添加乙醇、丙酮来终止反应，通过检测 反应释放的脂肪酸或甘油来检测酶活力。还有人用乙酸对硝基苯酚酯和辛酸对 硝基苯酚酯作为测活底物，利用水解产生的具有颜色的对硝基苯酚检测酶活力。 另一方法是在整个反应过程中，对脂肪酸的释放进行连续监测，用p h 稳定剂传 到自动滴定管来连续滴定并记录该法的优点是反应起始速率可测知，但必须保 4 。缝懋 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 证释出的脂肪酸在测定条件下完全离子化，因此p h 必须在7 5 以上【1 1 1 。 4 、影响酶活性的环境因素 1 ) p h p h 值是酶催化反应的重要环境条件，酶是两性化合物，其上分布着许多羧 基和氨基等酸性、碱性基团，对酸碱度极为敏感，最适p h 值因酶、底物的不同 而异，过酸和过碱时均会引起酶变性，从而降低酶活性，导致反应速度下降， 酶反应速度最大的p h 值是最适p h 值，此时酶的活性最大。 大部分b 一葡萄糖苷酶的等电点都在酸性范围，并且变化不大，一般3 5 5 5 之间，但最适p h 可以超过7 0 ，而且酸碱耐受性强。如：p a a v i l a i n e n 等【抡】人从细 菌a l k a l o p h i l u s d p 分离出细胞外b 一葡萄糖苷酶，其最适p h 就在6 9 之间，而在p h 值为4 0 lo 2 以外还具有一定的催化活性。中国台北学者李约昆( 音译) 等人从 f l a v o b a c t e r i u mm e n i n g o s e p t i c u m 菌种中分离出的b 一葡萄糖苷酶其等电点在9 0 左右，最适p h 是5 o 叫。碱性磷酸酶的最适p h 为7 6 - - 9 9 。 2 ) 温度 酶对于升高温度十分敏感，温度升高会对酶产生两种影响，一方面酶的催 化反应速度加大，另一方面也加速了酶活性的丧失，各种酶的热稳定性是不一 样的，都有各自的最适温度，随着温度升高，酶的反应速度成倍增长，但达到 最适温度后，温度再升高，反应速度又会急剧下降，上述两种倾向维持平衡时， 酶的活性最大，温度超过最适温度时，酶的热变性造成的影响比升温引起的反 应加速的影响更大。因此，在酶解反应时，只要能达到最大反应速度，应尽量 采用较低的温度。b 一葡萄糖苷酶的最适温度在4 0 11 0 。c 之间都有分布。而李约 昆等人分离出的p 一葡萄糖苷酶最适温度在5 0 - 5 5 。c 之间，在6 0 下于磷酸盐缓 冲液中，其活力在1 5 m i n 后只余1 。 3 ) 抑制剂 自然界中存在许多酶的天然抑制剂它们有些是非专一的抑制剂，如植物中 丹宁类成分具有强烈的结合蛋白质的能力，易使酶失活，动物体内的肝素，青 霉素等抗菌素也能影响很多酶的活性，对纤维素酶而言，植物体内的酚类即各 种白色素则是其抑制剂。 b 一葡萄糖苷酶最好的有机抑制剂是反应过程中有相似过渡态结构的 g l u c o n o l a c t o n e 和g l u c o n o p h c y l u r e t h a n 。无机抑制剂a 矿对r 葡萄糖苷酶有强的抑 制作用，h g + j 3 乏4 m o l l 脉也有较强的抑制作用，而c u 2 + ，p b 2 + ，s d s 及e d t a 等常见 抑制剂对该酶活力无明显影响【1 4 】。 杨阳，任大明【1 5 】研究了黑曲霉d 一葡萄糖苷酶的稳定性，发现c 、m 矿、 n 矿、z n + 、m n + 、f e + 对酶活有一定的激活作用；其中m n + 激活能力最强，使酶 活力提高了5 3 9 5 。l i + 、c 矿、c o + 、s n + 对酶活有一定的抑制作用。在m n s 0 4 、 f e s 0 4 、n a c i 三种对1 3 一葡萄糖苷酶有激活作用离子存在条件下可以明显提高 5 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 酶的稳定性。他们还发现，该酶在7 0 保温3 0 s 后，酶活依旧很高，达1 3 2 0 0 ，说明其高温稳定性较强。同时在8 0 保温3 0 s 内仍具有较高活力，达1 2 6 8 7 ，说明该酶能耐制瞬间高温。 4 ) 酶的浓度和底物浓度 酶的浓度增加时，酶失活率将会下降，f i k r e t 等人【1 6 】的实验结果证实了这一 点。在泵送过程中对纤维素酶的失活研究也有类似发现。在酶的实际应用中， 浆浓一般控制在中浓( 1 0 1 5 ) 范围内。这样一方面有利于酶与底物充分接触， 使反应顺利进行；另一方面也有利于保持酶的活性。 5 ) 超声波 目前，超声波对酶反应的作用机理尚不完全清楚。超声波对酶影响的研究 主要集中在酶水解速度方面。大量研究表明，超声波对酶起激活和钝化作用。 这与酶本身的性质以及超声波处理条件( 如超声功率、超声频率、超声时间、 超声介质等) 密切相关。适宜的超声处理条件可提高酶促反应速度。b a r t o n t l 7 j 于1 9 9 6 年研究发现6 0 w 超声波可以激活任意底物浓度下的a 淀粉酶和葡萄糖 淀粉酶。a t e q a d e l 8 】等利用2 m h z 、5 2 w c m 2 的超声处理木瓜蛋白酶，使酶活性有 较大幅度的提高。s a k a k i b a r a 等【1 9 1 也发现：超声处理可使蔗糖酶水解蔗糖的反应 速度提高3 0 。v a r g a s 等【2 0 】超声处理黑曲霉中转移酶，在两振幅( 2 0 ，4 0 ) 下 都能显著地提高整个转移酶活性，当振幅为2 0 ，作用8 m i n 时酶活力提高最大。 张富新等【2 1 】利用超声提取小牛皱胃酶，与传统提取法提取2 d 、提取活性最大为 5 4 3 6 8 u g 相比，它仅需7 0 m i n ，提取活性就可达6 2 7 6 8 u g , 大大缩短了提取时间， 提高了提取率。肖贵平【2 2 】利用超声从新鲜番木瓜中提取木瓜蛋白酶，在超声功率 3 0 0 w 、频率2 0 k h z 、处理时间2 0 0 s 条件下，其提取的酶活力是未经超声处理的 1 7 l 倍。 如上所述，许多研究表明适宜的超声波处理会提高酶的活性，但改变处理 条件，如频率、功率、处理时间等酶活性有可能被钝化。e r t u g a y 等【2 3 】研究超声 对牛乳中乳过氧化物酶和碱性磷酸酯酶的影响发现振幅为8 0 ，温度为4 0 时 对两种酶具有最大的钝化作用。r a v i y a n 2 4 】发现超声波对番茄果胶甲基酯酶具 有钝化作用，而且发现气穴作用强度增大和温度升高能增强对酶的钝化作用。 z h o n g 2 5 】报导胰蛋白酶活性随着超声波功率从1 0 0 5 0 0 w 变化以及处理时间 ( 1 2 0m i n ) 的延长而降低。有报道在温和的超声条件下作用某些酶，会导致酶活 力的降低，如过氧化物酶，用2 0 k h z 的超声波处理此酶，3 h 后酶活力下降了9 0 。 超声波对酶的钝化作用也会因酶的种类不同而不同。k a s h k o o l i 等【2 6 】用2 0k h z 的超声波处理过氧化氢酶和苹果酸脱氢酶，发现过氧化氢酶活性不被钝化，而 苹果酸脱氢酶则被钝化，而且酶浓度越大，被钝化的程度越高。 6 ) 其它物理因素 许多物理因素如紫外线，放射线等都可能引起酶的失活。另外，压力、剪 6 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 切力对酶的活性也有一定的影响。实验证明，加压可提高酶的活性，降压也可 改进酶的催化效能。f i k r e t 等人【1 6 1 通过实验研究了剪切力作用对酶活性的影响， 试验结果表明纤维素酶活性随着剪切强度的增加及时间的推移而降低，所以， 在酶的运送过程中应避免强烈振荡，以免引起酶的失活。 1 2 研究现状 1 2 1 国内研究现状 国内对微生物酶的研究主要集中在外加固化酶专性处理废水中某一污染 物，而对优化系统中酶的活性来提高处理效率的研究甚少。国内关于废水处理 中微生物酶的研究主要有以下两个方面： 1 、在产品加工过程中【2 7 】 造纸工序中的纸浆漂白是采用氯和氯化物对纸浆漂白，含氯漂白的废液含 有很多有毒的氯化有机物，如三氯甲烷、各种氯代酚、二恶英等等。若在使用 化学漂白剂前用木聚糖酶来处理，可以减少氯和氯化物及其他化学漂白剂的用 量并提高纸浆的白度。 制革的传统脱毛工艺是用灰碱法，其中硫酸钠和猪皮作用后产生一种很强 的硫化物，味臭有毒，污染环境，灰碱液腐蚀设备和产房。应用胰蛋白酶制剂 对皮革进行软化和脱毛可减轻生产中的污染，有利实现工艺过程生态化和无废 生产，真正实现清洁生产的目标。 2 、在污染物降解中 上海市政府科委、农委、畜牧办正在对“生物活性酶 处理畜禽养殖污水 的新技术进行推广。该技术以中草药提取的生物活性酶为核心，结合现代废水 处理的新技术，综合处理养殖污水，实现污水的达标排放【2 引。 在制浆造纸工业中含木素衍生物和其它化合物有许多是有毒的，现有的技 术很难除去。苏振华【2 9 】认为，在一种酚型氧化酶存在下曝气，可使酚型化合物 聚合进而沉淀或在硫酸铝的作用下絮凝出去。 李晓敏等【3 0 】比较了碱性脂肪酶法脱墨废水和化学法脱墨废水的污染负荷， 结果表明，脂肪酶法脱墨废水的污染负荷指标比化学法低，并且可生化性强。 由白腐真菌分泌的三种胞外酶：木质素过氧化物酶、乙二醛氧化酶和漆酶 能降解木质素及与木质素结构相似的多种有机化合物，在治理重油、多环芳香 烃、四氯苯酚的污染中得到广泛应用。 许多工业废水温度高、酸碱性强，用普通微生物进行生物处理往往需要冷 却、调节p h 值及稀释等，这样不仅加大工作量，而且增加基建费用。一些化工 7 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 废水常含有大量有毒有害物质，利用微生物体内含有的对这些物质具有较强耐 受力的极端酶，可催化其降解，使其无害化【3 l 】。如日本豆腐生产中排放的废水 温度为8 0 9 0 。c ，因此，日本研究了在5 4 。c 下高温处理该废水的工艺。杨红红 等【3 2 】利用嗜热菌及其酶处理平均温度为6 0 c 的焦化厂排放废水，废水中的酚、 氰和c o d 去除率都较高，而且减少了冷却所需的基建和运行费用。周群英等 【3 3 】用筛选得到的嗜温菌高效降解了温度为6 0 c 6 8 c 的含酚废水。在废水处理 中应用的其他极端酶还有耐重金属酶。台湾成功大学高铭木等【3 4 】将筛选出的耐 铜、耐镍真菌用于电镀废水的处理。青霉素酶是一种抗代谢物的极端酶，能分 解青霉素，是细胞出现青霉素抗体的原因之一，也是抗生素生产废水可以采用 生物法进行处理的可行性因素之一。 1 2 2 国外研究现状 欧洲成本法8 4 7 ( e u r o p e a nc o s ta c t i o n8 4 7 ) 成员所研究人员【3 5 j 在筛选适用于 废水脱色的酶方面进行了大量研究。他们对微生物酶，如偶氮还原酶 ( a z o r e d u c t a s e ) 、过氧化氢过氧化物酶( c a t a l a s e p e r o x i d a s e ) 和漆酶( 1a c c a s e ) 进行研 究，以确定能优化工艺效率的动力参数。使用商品或固定化漆酶对含活性染料 的废水进行脱色，通过水的循环利用达到节能、节水的目的。 丹麦科学家p e rn i e l s e n 教授领导的研究小组一直从事市政污水处理过程中 活性污泥絮凝体的活性、各种专性酶的测定以及酶的提取方法等的研究 3 6 - 3 9 j 。 南t e r h o d e s 大学对减硫系统的酶学进行了深入的研究，为富含硫的洗矿水 的生物处理提供了理论指导【4 0 ，4 1 4 2 】。 日本东京大学的r a j e e v g o e l 教授对s b r 反应器内的厌氧和好氧条件下活性 污泥的酶的活性进行了比较，选择3 4 种胞外酶对酶的合成、酶的位置以及酶在 活性污泥中的稳定性进行研究，实验发现，各种专性酶的活性在s b r 中厌氧与 好氧条件无明显变化，表明在单一污泥系统中，酶的损失与合成达到了一个动 态平衡【4 3 肿】。 此外，美国、德国、法国、奥地利等许多国外学者都从不同方面对微生物 系统中酶的微环境、作用机理等做了一定的研究【4 5 舶 4 7 1 。 1 3 研究内容 1 3 1 待测四种胞外水解酶 因为城市污水的主要成分是蛋白质、多糖和脂类，还有氮、磷等物质，本 课题选取相应的四种酶：p 葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶和脂酶。 8 。缝懋 厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中水解酶的活性研究 ( 1 ) p 葡萄糖苷酶( d g l c ) b 葡萄糖苷酶( d g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 l ，简称i b - g l c ) ，又称p - d 一葡萄糖 苷葡萄糖水解酶，其分子式是：c 1 2 h 1 5 n 0 8 ，是一种能催化水解芳基或烃基与糖 基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的胞外水解酬4 8 1 。在废水处理系统中，由于 废水通常由多糖、蛋白质和脂类等物质组成，且多糖组分约占总废水c o d 的五 分之一。已有研究表明，微生物基团分泌的酶在整个降解有机污染物的生化反 应中起着关键作用。 ( 2 ) 碱性磷酸酶( a p a ) 碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，e c 3 1 3 1 ，简称a p a ) ，正式化学名为 磷酸单酯水解酶，分子式为c 6 h 4 n n a 2 0 6 p 6 h 2 0 。碱性磷酸酶为含锌的糖蛋白， ：笙m d + 的激活下，能催化各种磷酸单酯、a t p 、焦磷酸化合物的转磷酸化作用 和水解作用。a p a 对磷酸基团是专一的，而对分子中余下的部分则特异性极低。 本系统中利用碱性磷酸酶可以有效降解各类有机磷化合物。 ( 3 ) 亮氨酸氨基肽酶( l a m p ) 亮氨酸氨基肽酶( l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e ，简称l a m p ) 分子式是 c 1 2 h 1 7 n 3 0 3 ，是一种蛋白分解酶，能水解肽链n 端并由亮氨酸与其他氨基酸形成 肽键的酶。其广泛分布于肝，肾，胰，肌，脑等组织。肝中的l - a m p 主要定位 于肝实质细胞及毛细胆管上皮细胞。血清中l - a m p 测定的诊断价值，主要是应 用与肝胆疾患的诊断。在本系统中亮氨酸氨基肽酶主要用来降解水中的蛋白质。 ( 4 ) 脂酶( l i p ) 脂酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ，简称l i p ) ，又称甘油酯水解酶，其分子式为 c 2 2 h 3 5 n 0 4 ，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物中，是一类具有多种催化 能力酶类，广泛用于甘油及水不溶性酯类水解、醇解、酯化、酯交换及合成等。 在油水界面上，脂酶可催化酯水解生成脂肪酸和甘油，然而在无水条件下能催 化与之相反合成反应。脂酶催化特性在于在油水界面上其催化活力最大。在污 水处理系统中脂酶主要