（生物医学工程专业论文）Tat及其介导的纳米粒子的穿膜机制研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t c e l lp e n e t r a t i n gp e p t i d e ( c p p ) ，d e r i v e df r o mt h et a tp r o t o ns e q u e n c eo fh u m a n i m m u n ed e f i c i e n c yv i r u st y p e - l ( h i v - 1 ) ，i so n eo ft h em o s tp r o m i s i n gt o o l sf o ri t s m e m b r a n et r a n s d u c t i o np o t e n t i a la n de f f i c i e n td e l i v e r yc a r g o e s ，i n c l u d i n gn u c l e i c a c i d s ，p o l y p e p t i d e s ，a n dn a n o p a r t i c l e si n t oc e l l s h o w e v e r , t h ec e l l u l a ru p t a k e m e c h a n i s mo f t a t p e p t i d ea n di t sc o u p l e si sn o tv e r yc l e a rb yn o w t h i st h e s i si st oc l e a r i f yt h em e c h a n i s mo fp e n e t r a t i o n ，a n dc a r g od e l i v e r yo ft a t p e p t i d ei n t ob o t hr a b b i tb o n em a r r o ws t e mc e l l s ( b m s c s ) a n dh e l ac e l l s t h em a i n r e s u l t so f t h i st h e s i sa l ea sf o l l o w s ： 1 ) b m s c sw e r ei s o l a t e dv i ad e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n , a n dc o u l db e d i f f e r e n t i a t e di n t oo s t e o b l a s t si nv i t r o 2 ) t a tp e p t i d ec o u l db ei n t e r n a l i z e di n t ob m s c sa n dh e l ac e l l sv i aal i p i d r a f t - m e d i a t e de n d o c y t o s i sp a t h w a ye f f i c i e n t l ya t3 7o c ，w h e r ei tc a nr e a c hi n c l u d e s t h ec y t o p l a s ma n dv i c i n i t yo ft h en u c l e u s i n t e r n a l i z a t i o no ft a tp e p t i d ei n t oc e l l si s d e p e n d e do nc o n c e n t r a t i o n , s e r u m ，t e m p e r a t u r ea n da t e 3 ) t a t m e d i a t e dg e l a t i n s i l i c an a n o p a r t i c l e sw e r ei n t e r n a l i z e di n t ob m s c sv i aa l i p i dr a f t - m e d i a t e de n d o c y t o s i sp a t h w a y , w h e a r a sv i aar e c e p t e r - d e p e n d e n ta n dl i p i d r a f t - d e p e n d e n te n d o c y t o s i sp a t h w a yi n t oh e l ac e l l s i t si n t e r n a l i z a t i o nw a si n h i b i t e da t 4o ca n dd e l e t i o no f a t p 4 ) t a tm e d i a t e da u a u 2 sn a n o p a r t i c l e sw e r ei n t e r n a l i z e di n t ob m s c sv i aa l i p i dr a f t - d e p e n d e n ta n dr e c e p t e r - d e p e n t d e n te n d o c y t o s i sp a t h w a y , w h e a r a sv i aa c l a t h r i nm e d i a t e de n d o c y t o s i sp a t h w a yi n t oh e l ac e l l s i t si n t e r n a l i z a t i o nw a s i n h i b i t e da t4o ca n dd e l e t i o no f a n k e y w o r d s ：t a tp e p t i d ea n dt a tm e d i a t e dn a n o p a r t i c l e s ；c e l l s ；c e l l u l a r - u p t a k e m e c h a n i s m ； l i 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人 在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标 明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声：痧承夸 砷年7 月多日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有 权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的 标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 嵋 ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 孝水夸 ( 第一章绪论 第一章绪论 细胞是生命的基本单位，活细胞和外周环境进行着活跃的物质变换，生物界 中许多生命过程都直接或问接与物质的跨膜转运密切相关。换言之，如果生命活 动中不能实现跨膜运送会诱发疾病”。由于细胞膜的生物屏障作用，只允许少数 脂溶性、非极性、或不带电荷的小分子或细胞膜上有其受体的大分子物质才能进 入细胞。因此，向细胞内转运生物活性物质成为生物医学工程中的研究热点。 1 1 细胞 1 1 1 细胞膜 细胞膜由蛋白、脂质和糖等物质组成( 图1 - 1 ) ，平均厚度约1 0 n m 。一般认 为，细胞膜的共同结构特点是以液态的脂质积分子层为支架，其中镶嵌着具有不 同分子结构因而也有不同生理功能的蛋白质。通常脂质双分子层主要起屏障作 用，而膜中的特殊蛋白质则与物质、能量和信息的跨膜转运有关。细胞膜屏障仅 允许高度脂溶性、分子质量不超过6 0 0d 的化合物或6 个氨基酸残基以下的小肽 进入细胞。 触 图1 - 1 细胞膜结构 f i 9 1 - 1 t h e s t r u c t u r eo fc e l ln l e m b l a n e 懋 迭瓣鲢 第一章绪论 1 1 2 外源性物质进入细胞的介导方法 为了克服细胞膜屏障对外源性治疗分子转运的限制，目前介导大分子物质通 过细胞膜屏障的方法有显微注射法、脂质体法、电穿孔法、受体介导的胞吞作用、 病毒载体等，但这些方法大多低效率或有效负荷不高，操作复杂，难于调控，费 时，容易引起细胞损伤或死亡等缺陷，在应用上受到一定的限制。近年来国外学 者在对一些病毒转染特性的研究中相继发现了一类蛋白转导域( p r o t e i n t r a n s d u c t i o n sd o m a i n s ，p t d s ) ，如h i v - 1m 盯( 4 8 6 0 ) 、a n t p ( 4 3 5 8 ) 、v b 2 2 ( 3 6 7 3 0 0 ) 等，能将外源性蛋白、寡核苷酸等大分子递送进入细胞和核，而且 对细胞膜没有破坏性。p t d s 几乎可以进入所有细胞【2 】包括破骨细胞、夕卜周学单 核细胞和原代细胞等难以转染的细胞，速度快，效率高，所转导的蛋白质可以有 很大的分子量【2 渤，甚至能透过血脑屏障等【5 1 。因此，p t d s 的这些特性说明此多 肽片段具有建立一种新的体内外细胞运载系统的潜能【6 1 。 1 2 p r o t e i nt r a n s d u c t i o n sd o m a i n s ( p t d s ) 1 2 1 p t d s 的发现 蛋白转导域( p r o t e i nt r a n s d u c t i o n sd o m a i n s ，p t d s ) 结构或称细胞穿膜肽( c e l l p e n e t r a t i n gp e p t i d e s ，c p p s ) 是一类能穿越细胞膜功能的特殊的多肽【_ 丌，可以携 带大分子物质进入细胞【8 】。外源性大分子治疗的关键问题是如何将大分子有效导 入细胞内并保持生物学活性，从而参与对细胞水平及基因表达水平的调控作用。 无疑，p t d $ 的发现是该领域的一个重大突破。1 9 8 8 年，f r a n k e l 等【卅发现人的免 疫缺陷病毒( h 二1 ) 中有一种转录调节蛋白t a t , 它能进入细胞核，激活h i v - 1 的启动子，从而促进h i v 的扩增。随后的研究发现，t a t 蛋白本身具有一种极 其特殊的生物学活性，它可以直接穿过细胞膜、细胞核膜并锚着于特异的基因调 控区内。接着，d a n i e l e 掣9 6 】发现，a n t e n n s p e d i a 基因编码的一类同源蛋白质也 能以类似方式穿过细胞膜。2 0 0 0 年郭勇发现，果蝇的周期调节蛋白p e r i o d 1 也 具有类似的生物学功能，并把这类肽命名为细胞膜穿透肽( c e l lp e n e 僦i n g p e p f i d e ，c p p s ) 。目前发现了的蛋白转导域有人体免疫缺陷病毒h i v - 1t a t 蛋白 【6 l o l 、人体i 型单纯疙疹病毒( h s v - i ) d n a 结合蛋白v p 2 2 t 1 、b 型肝炎病毒 蛋白p r e s 2 t 1 2 1 、基态纤维细胞生长因子b f g f 1 3 1 、白介素1 【1 4 1 ，和果蝇触角足 2 第一章绪论 ( a n t p ) 同源异型转录因子等【9 l ，在这些蛋白中除了t a t 、v p 2 2 和a n t p 外其 他蛋白转导能力较弱【l5 1 。 黑腹果蝇触足肽a n t e n a p e d i a 7 2 1 】，是从黑腹果蝇的一个同源蛋白质家族中分 离出来的一类反式作用因子，与其连接的分子均可进入活细胞，无论在3 7o c 或 4o c 下都能发生，且不需受体介导。该多肽的1 6 个氨基酸序列 ( r q i k i w f q n r r m k w k k ) 中的第一个色氨酸对进入细胞很重要，此肽段中高 含量的精氨酸、赖氨酸使其在生理状况下有高正电荷，中和了细胞膜上磷脂所带 的负电荷，形成一个疏水内腔，引导蛋白质进入质膜【1 9 】。 近来的研究中发现，v p 2 2 可以介导一些大的蛋白质如：绿色荧光蛋白 ( g f p ) 、p 5 3 、h s v 胸苷激酶和p 半乳糖苷酶进入猴源细胞、人h e l a 细胞和仓 鼠细胞【1 1 盈】。另一些实验证明v p 2 2 能将一些寡核苷酸链、核酶、r n a d n a 杂 合体导入细胞质及细胞核【2 3 1 ，但其转移机制仍不清楚。 t a t 蛋白1 5 砷8 1 是人类免疫缺陷病毒h i v - 1 的反式激活因子，其穿膜特性主 要由其中的一小段肽链( 氨基酸残基4 8 5 6 ，g r k k r r q r r r ) 即核心肽链决定 2 9 1 。1 9 8 8 年，m a u r i c e 和p a u l 发现了t a t 蛋白能够跨膜递送进入细胞【l o 】，即具 有蛋白转导活性。同年p a b o 和f r a n k e l 通过研究发现t a t 蛋白可以快速地定位 到细胞核，并能保留其反式激活h i v - 1 启动子的生物活性。近来，s c h w a r z e 等【5 】 为了提高t a t 介导的转导效率将几条多肽和t a t 蛋白的一个长1 1 个氨基酸的序 列组成融合蛋白，这段序列为4 7 5 7 个氨基酸( y g r k k r r o r r r ) ，其中精氨酸、 赖氨酸就有8 个。在体内实验中，将融合蛋白经腹腔注入鼠体内，很快在多个组 织中表达蛋白活性，尤其在脑组织中有较高反应，但并不破坏血脑屏障。因此， 可利用t a t 的核定位信号来介导嵌合蛋白质进入非分化细胞。这些t a t 蛋白中富 含碱性氨基酸带正电荷具有跨膜递送功能的多肤片断统称为t a t - p t d s ；尤其1 1 个氨基酸( y g r k k r r q r r r ) 组成的t a t 序列就是t a t - p t d s 中倍受瞩目的穿 膜递送载体。t a t - p t d s 具有较多的优点，它对反应条件的要求不高，转导效率 高，更重要的是它可以介导多种物质进入细胞而对细胞的损伤比较小。这些特点 使t a t 蛋白可以用于组织细胞标记，研究外源蛋白质的功能，进行外源基因的 高效转导。同时，由于t a t 蛋白具有较强的介导穿透力( 可以直接穿过血脑屏 第一章绪论 障) ，这给我们提供了一种新的临床给药方式，我们可以依此直接进行蛋白质给 药。此外，它在基因治疗方面也有不可限量的潜力。 文献报道每个p t d s 的共同之处在于其生理条件下由带正电的多个碱性氨基 酸( 精氨酸和赖氨酸) 组成，与携带物质加入培养基中能快速、浓度依赖性达到 细胞最大浓度，可进入几乎所有细胞( 酵母除外) ，并且对细胞几乎没有毒性， 不破坏细胞膜和血脑屏障，不能被肝和脾巨噬细胞吞噬，也不被溶酶体降解【2 0 1 。 高效运输化合物、多肽和蛋白质至所有靶细胞的系统无疑在生物学上具有广泛的 应用前景。 1 2 2 p t d s 递送功能 1 9 9 1 年f r a n k e l 预言，“姑且不论h i v l 的转染是否与蛋白转导运动有关， 如此高效的转导运动本身就意味着从此可能产生一种高效运输蛋白或多肽进入 细胞的工具。”【2 9 1 。由于p t d s 具有惊人的携带大分子物质的能力，使之成为多 肽研究领域的一个热点。多种实验显示了p t d s 能携带蛋白质分子、s i r n a 、质 粒、脂质体和磁珠等多种大分子进入到多种细胞中，这说明此多肽建立了一种新 的体内外细胞运载系统的潜能( 图1 2 ) 【3 0 1 。 ( 1 ) 蛋白质：1 9 9 9 年b a r k at 等【3 1 3 2 1 报道了1 2 0k d 的p 半乳糖昔酶与t a t ( 4 7 5 7 ) 融合之后，可以穿越细胞膜甚至进入包括脑部在内的各种组织。d o w d y 等【1 6 】将p 5 3 和p 2 7 肿瘤抑制蛋白输入含有腹膜肿瘤的小鼠模型，结果其寿命比对 照组小鼠延长了2 3 倍。许多有前景的治疗性的蛋白药物由于分子量，电荷和脂 溶性等因素不能导入细胞，通过与p t d s 连接实现蛋白转导可使药物用量显著下 降同时降低了其高浓度带来的副作用。 ( 2 ) 多肽：p e r e a 等人【3 3 1 将长序列的多肽p 1 5 连接到p t d s 后成功的下调了肿 瘤的表达水平。另有其他报道p t d s 成功将多肽引入到动物和细胞内发挥正常的 生物学功效【2 8 ，2 9 3 4 】( 图1 3 ) 。 ( 3 ) 核苷酸：m o r r i s 等人【3 6 】报道了源于h g p 4 1 的新短肽m p g 和t u n g 等 人【3 7 3 8 】用穿膜肽将核苷酸递送到体外培养的细胞，和一般方法载体比较表现了穿 膜肽递送核苷酸的优点如有效、稳定、无细胞毒性等。 4 第一章绪论 ( 4 ) 肽核酸( p e n e t r a t i n gn u c l e u ca c i d ，p n a ) ：p t d s p n a 内化后在细胞浆环 境可自动解脱连接，释放p n a 自由靶向到达目标p ”提高转染效率，效率远远优 于p e i ( p o l y e t h y l e n e i m i n e ) 载体”。 图1 2p t d s 携带多种大分子进入细胞 f i g1 - 2d e l i v e r yo f c a r g o e si n t oc e l lc y t o p l a s mb yp t d s m 刚雌咖h u * 舳 删m 唧 c p r 研o ，m 口一，啊怕 o h 曲u 帅i 忡 h m 口h q 叼m 曲洲p h 慷c 呐 t t t 帅炉q o m 州幅咖， d 。 g 洲m i n删# t ， 谶躺麓鼎巍麓糍麓瓣舞撼黧劂= d w dc _ o m 圈1 - 3p t d s 多肽 f i g1 - 3p t d s - p e p t i d e sc o n j u g a t e s c h ”h一颡紧 第一# 论 ( 5 ) s i r n a s ：s i r n a s 在分子生物学和药物学是有潜力的工具，但最大缺点就 是低的细胞内吞效率。穿膜肽连接后内吞效率比裸s i r n a s 提高好几倍，下调了 靶向m r 3 q a d l l 。 ( 6 ) 脂质体：t o r c h i l i n 等人研究报道了1 4 2 】2 0 0n r nt a t 脂质体载药物后1h 就迅 速进入到细胞。h y n d m a n 等人发现，负电荷的d n a 和正电荷的肽t a t 脂质体相 连转染细胞后明显提高了转染效率h 3 1 。 ( 7 ) 质粒：s a k a g u c h i 等人 4 4 1 发现种新方法，凭借肽( p k k k r k v ) 核定位 序列将质粒送到核1 。另有报道r 8 多肽( 8 个精氨酸) 的转染效率也比 l i p o f e c t a m i n 高i “i 。 ( 8 ) 纳米粒子：w e i s s e l e d e r 州s 1 49 1 课题组递送4 1n m 生物相容性的右旋多糖包 被的超顺磁性氧化铁一t a t 复合物在淋巴细胞的内吞效率比未修饰的纳米粒子提 高了1 0 0 倍：同时造血干细胞和神经干细胞每个细胞可达到1 0 3 0p g ；同时不影 响细胞存活率、分化和增殖。另有报道，1 乱一p e g p e i 复合物一( 9 0n m ) 在体 内保护裸d n a ，低毒性，转染效率比p e u d n a 复台物提高了1 4 倍。 t a t p e g - p l l a ”复合物( 图1 4 ，a ) 携带的疏水性药物不仅可以跨膜进入细胞 浆甚至可到达细胞核。y o n g b e o m l i m 等人用b 一层p t d s 连接到自组装的碳纳米 管上将疏水性药物高效的递送入细胞( 图1 _ 4 ，b ) 【矧。 b 腰1 一( a ) t a i - p e g - p l l a 复合物f b ) 自组装碳纳米管- p 层多肚 f i 9 1 - 4 ( a ) t a t - p e g - p l l a c o n j u g a t e ( b ) r e p r c s e n t a t i o no f t h en a n o n b b o n f o r m e db ys e l f - a s s e m b l yo f fbp 第一章绪论 1 2 3 i r f d s 跨膜机制 活细胞要进行各种生命活动，必然与外界环境发生物质交换。物质的细胞跨 膜转运主要有以下三种方式：( 一) 被动运输：物质顺着浓度梯度从高浓度一侧 向低浓度一侧转运，转运过程中不需要细胞提供代谢能量，能量来自浓度梯度。 ( 二) 主动运输：物质逆浓度梯度，即从低浓度侧经过细胞膜向高浓度侧转运的 过程，需要细胞提供能量。( 三) 囊泡运输：细胞膜对大分子及颗粒物质是不能 通透的，它们进出细胞都必须由细胞膜形成的小囊泡介导。物质以囊泡方式跨越 细胞膜是内化与胞吐过程的重要环节之一。内化可广义地认为细胞以膜囊泡包裹 形式将环境中地生物大分子转运至细胞内的过程，主要分以下类型：( 1 ) 吞噬作 用：细胞内吞较大颗粒或超级复合大分子的过程称为吞噬作用，被吞噬的物质通 常为细菌、病毒、裂解的组织细胞片段以及尘粒等。( 2 ) 胞饮作用：细胞内化大 分子溶质和或液体的过程称为胞饮作用。一般将胞饮泡直径大于1 0 0n m 的胞饮 叫做巨胞饮( m a c r o p i n o c y t o s i s ) ，而将胞饮泡直径小于1 0 0n l n ( 常常小于8 0n m ) 的胞饮叫做微胞饮( m i e r o p i n o c y t o s i s ) 。( 3 ) 受体介导的内化：配体通过受体结 合到细胞膜表面，然后由该处的细胞膜凹陷，并形成独立完整的小泡，将配体带 入细胞内，这一过程称为受体介导的内化或内吞( r e e e p t o r - m e i d i a t e di n t e m a l i z a t i o n o re n d o c y t o s i s ) 。 尽管p t d s 表现出高效的跨膜转导活性，但与p t d s 应用形成鲜明对比的是 其穿膜机制仍然是个迷，引起人们的争议。t a t 是目前已经发现具有蛋白转导功 能的典型代表，具有高效的跨膜活性，但其跨膜机制仍不为人们所知。不同的实 验结果支持不同的跨膜机制。起初研究发现，t a t p t d s 可以在细胞不能进行典型 内吞的4o c 条件下实现转掣5 3 弓5 1 ，而且内吞作用的一般抑制药物如秋水仙素， 紫杉醇，诺可达唑( n o c o d a z o l e ) 等微管特异性药物，细胞松弛素d 等微丝特异 性药物等均不能抑制其转导 5 6 - 5 8 】。阻止能量a t p 产生的药物如叠氮化钠和鱼藤 酮也不能抑制其转导，以上说明t a t p t d s 的转导不依赖能量，与典型的内吞作 用不同。也有报道认为是能是静电相互作用的结果，大多数动物细胞膜的表面都 有硫酸乙酰肝素的存在，这种带强负电荷的硫酸乙酰肝素与带正电荷的t a t 会有 静电相互吸引的作用，使得t a t 首先被吸附到细胞膜。近几年来，直接转导的机制 受到质疑。目前研究最集中、也争议最多的是t a t 及其复合物是否通过内吞作用 7 第一章绪论 进入细胞。各个课题实验组主要集中在t a t p t d s 是否通过以下几种跨膜方式进 入细胞的研究：t a t 及其复合物以c l a t h i n ( 笼蛋白或网格蛋白) 舟导的受体1 5 0 , 6 0 】 内吞途径或c a v e o l a e ( 细胞膜表面穴样内陷) 介导的内吞或l i p i dr a f t ( 脂筏) 介 导的巨胞饮( m a c r o p i n o c y t o s i s ) 或同时通过多种方式进入细胞( 图1 5 ) 】。 图1 - 5t a t 的细胞内化模拟示意圈 f i 9 1 - 5 p o s s i b l e m e c h a n i s m so f t a t p e p t i d e m e d i a t e d i n t r a c e l l u l a r d e l i v e r y r i c h a r d 等人的研究表明，t a t - p t d s 的内化主要依赖c l a t h i n 介导的受体 6 0 , 6 1 】 内吞途径。转铁蛋白是通过c l a t h i n 介导地受体内吞方式进入细胞经典物质之一， 向药物抑制剂如氯婀摩( c h l o r p r o m a z i n e ，c p z ) 是c l a t h i n 介导的受体内吞途径 抑制剂，可以明显地抑制t a t 修饰的脂质体内化和生物学活性， m o n o d a n s y l c a d a v e f i n e ( m d c ) 1 6 2 靴j 可以抑制c l a f l m n 小窝的形成，去k 离子的 高渗培养基 6 5 郴】贝u 能抑制e l a t h i n 介导的受体【。剖1 内吞途径，实验结果表明以上 条件均抑制t a t p t d s 的内化( 罔i - 6 ) ”。 第一章绪论 主等 豁娃 圈1 - 6c l a t h i n 介导的受体内吞抑制剂对t a t 内化入h e l a 细胞的影响 f i g1 - 6e f f e c t so f i n h i b i t o r so f c l a t h i n - d e p e n d e n te n d o c y t o s i s i nh e l ac e l l s 也有研究报道t a t - p i d s 是c a v e o l a e 始- 7 0 1 介导的内吞方式进入细胞( 图1 7 ) 川。c “l a e 是细胞表面5 0 1 0 0t u n 大小的凹陷，它参与细胞的胞吞、胞饮作用、 胆固醇的转运和信号转导。更有报道发现是c l a t h i n 和c a v e o l a e 同时m i 介导的受 体【曲 1 1 内吞途径。 圈l - 7 榔a 生物素以e a v e o l a e 介导的内吞方式进入h e l a 细胞 f i g1 - 7i n t e r n a l i z a t i o nv i ac a v e o l a e - d e p e n d e n tp a t h w a y 。o f t a t - s a c o m b i n e d w i t hb i o t i ui nh e l ac e l l s 目前较多研究更趋向承认t a t 是通过脂筏( 1 i p i dr a f t ) 介导的巨胞饮1 ”1 方式 内吞进入细胞，图1 8 为跨膜示意图1 。j e h a n g i rsw a d i a 等人将具有溶酶体逃 第章绪论 逸功能的h a 连接到t a t ，其中f m4 - 6 4 可以特异性染细胞膜，霍乱毒素是巨胞 饮方式内吞的经典代表物质，转铁蛋白是受体方式内吞的经典代表物质， c a v e o l i n 一1 是c a v e o l a e 方式内吞的重要参与结构蛋白，该实验通过将t a t h a 融合 蛋白和这三种物质共培养，激光共聚焦显微镜观察发现t a t h a 是腊筏介导的巨 胞饮方式内吞进入细胞而非受体或c a v e o l a e 方式内吞。 圈1 1 8 t a t 以巨胞饮方式进入细胞 f i g1 - 8i n t e r n a l i z a t i o nv i am a c r o p i n o c y t o s i sp a t h w a yo f t a t ( a ) 第一章绪论 ( b ) 乏匿 ( c ) 圈1 - 9 c l s m 观察p t d s 穿膜方式 f i 9 1 - 9 i n t e r n a l i z a t i o no f p t d s b y c l s m 第一镕论 有文献报道t 6 0 指出t a t 修饰的脂质体和细胞分别在3 7 。c 和4 。c 培养结果 t a t 修饰的脂质体在4o c 条件下仅仅停留在细胞膜边缘，而3 7o c 时则大量进入 细胞浆甚至细胞核。因此t a t 修饰的脂质体是温度依赖性的途径进入细胞。2 0 0 7 年，s e t h u m m a n 等人的实验表明t a t 修饰的p l l a p e g 载药胶束和乳腺癌细胞 ( m c f - 7 ) 共培养1 5r a i n 即可进入到细胞( 绿色荧光) ，细胞核p i 染色呈红色 荧光，4h 后c l s m 观察到t a t 修饰的p l l a p e g 载药胶束可以定位到细胞核并 推测是以巨胞饮方式进入细胞( 图1 1 0 ) t 7 5 l o 图1 一1 0c l s m 观察t a t _ p l l a p e g 在细胞内分布 f i 9 1 - 1 0 n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o no f t a t - p l l a - p e g b y c l s m 1 3 本课题的提出和研究内容 t a t 具有高效的穿膜活性并能介导纳米颗粒跨膜递送进入细胞，然而迄今为 止，有关t a t 的穿膜递送机制仍然不清楚，因此需要对这种技术的前景和技术姥 陷进行深入的研究。本研究通过对t a t 的穿膜递送机制的深入研究为这项技术 能够早日用于临床治疗奠定基础。 本文的研究内容包括： ( 1 ) 采用密度梯度离心法分离和培养骨髓基质干细胞；m t t 法测定不同代和 矿化诱导后的骨髓基质干细胞的生长曲线；倒置显微镜观察细胞形态学特征； p n p p 法测定a l p 活性。 ( 2 ) t a t - 明胶一硅氧烷、t a t a u a u 2 s 和t a t a u 纳米粒子借助于透射电子显微 镜、表面扫描电镜、表面增强拉曼光谱和紫外分光光度计对纳米颗粒理化性质进 行表征。 第一章绪论 ( 3 ) m t t 法检测t a t 一明胶一硅氧烷和t a t - a u - a u 2 s 纳米粒子的细胞毒性；荧 光显微镜、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测分析纳米粒子的细胞穿膜递送方 式及影响因素。 第一章绪论 参考文献 【1 】a l b e r t s b ，m o l e c u l a rb i o l o g yo ft h ec e l l m g a r l a n dp u b l i a h i n gi n c ，19 9 4 ，4 7 7 - 6 4 7 【2 】 s c h e l dwm d r u gd e l i v e r yt ot h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ：g e n e r a lp r i n c i p l e sa n d r e l e v a n c et ot h e r a p yf o ri n f e c t i o n so ft h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m 晒r e v i e w so f i n f e c t i o n sd i s e a s e s ，19 8 9 ，7 ：16 6 9 16 9 0 【3 】e g l e t o nrd ，d a v i stp b i o a v a i l a b i l i t ya n dt r a n s p o r to fp e p t i d e sp e p t i d ed r u g si n t o t h eb r a i n 厶刀p e p t i d e s ，1 9 9 7 ，1 8 ( 9 ) ：1 4 3 1 - 1 4 3 9 4 】 s i l h o lm ，t y a g im ，g i a c c am ，e ta 1 d i f f e r e n tm e c h a n i s m sf o rc e l l u l a ri n t e r n a l i z a t i o n o ft h eh i v - it a t - d e r i v e dc e l lp e n e t r a t i n gp e p t i d ea n dr e c o m b i n a n tp r o t e i n sf u s e dt ot a t 翻e u r o p e a nj o u r n a lo fb i o c h e m i s t r y , 2 0 0 2 ，2 6 9 ：4 9 4 - 5 0 1 5 】 s c h w a r z esrh oa ，v o c e r oa k b a n ia i nv i v op r o t e i nt r a n s d u c t i o n ：d e l i v e r yo fa b i o l o g i c a l l ya c t i v ep r o t e i ni n t ot h em o u s e j 7 s c i e n c e ，1 9 9 9 ，2 8 5 ：1 5 6 9 1 5 7 2 【6 】 f r a n k e lad ，p a b oc0 c e l l u l a ru p t a k eo ft h e t a tp r o t e i nf r o mh u m a n i m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s j 7 c e l l1 9 8 8 ，5 5 ：11 8 9 - 11 9 3 【7 】y o n gg u o n l se n c o d em p e0 9 0 7 0 0 818 8 - 8 19 3 【8 】 j a r v e rp ，l a n d eiu t h eu o f c e l l - p e n e t r a t i n gp e p t i d e sa sat o o lf o rg e n er e g u l a t i o n 厶口d r u gd i s c o v e r yt o d a y , 2 0 0 4 ，9 ( 9 ) ：3 9 5 - 4 0 2 【9 】d a n i e l ed ，a l a i nhja n dg e r a n dce t 以t h et h i r dh e l i xo ft h ea n t e n n a p e d i a h o m e o d o m a i nt r a n s l o c a t e st h r o u g hb i o l o g i c a lm e m b r a n e s 晒j o u r n a lo fb i o l o g i c a l c h e m i s t r y , 1 9 9 4 ，2 6 9 ( 1 4 ) ：1 0 4 4 4 1 0 4 5 0 【1 0 】 g r e e nm ，l o e w e n s t e i np m a u t o n o m o u sf u n c t i o n a ld o m a i n so fc h e m i c a l l y s y n t h e s i z e dh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u st a tt r a n s - a c t i v a t o rp r o t e i n 明c e l l p r e s s ，1 9 8 8 ，5 5 ：1 1 7 9 - 1 1 8 8 【11 】 e l l i o t t1 3 io h a r ep i n t e r c e l l u l a rt r a f f i c k i n ga n dp r o t e i nd e l i v e r yb yah e r p e s v i r u s s t r u c t u r a lp r o t e i n 凹c e l l ，19 9 7 ，8 8 ：2 2 3 - 2 3 3 【1 2 】o 豁ss ，h i l d te n o v e lc e l lp e r m e a b l em o t i fd e r i v e df r o mt h ep r e s 2 - d o m a i no f h e p a t i t i s - bv i r u ss u r f a c ea n t i g e n s 凹g e n et h e r a p y , 2 0 0 0 ，7 ：7 5 0 7 5 8 1 4 第一章绪论 【1 3 】 s o s n o w s k ib a ，g o n z a l e za m 9c h a n d l e rl ae ta 1 t a r g e t i n gd n at oc e l l sw i t hb a s i c f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( f g f 2 ) 凹j o u r n a lo fb i o l o g i c a lc h e m i s t r y , 19 9 5 ，2 71 ： 3 3 6 4 7 3 3 6 5 3 【1 4 】 r u b a r t e l l ia ，c o z z o l i n of t a l i om e ta 1 an o v e ls e c r e t o r yp a t h w a yf o ri n t e r l e u k i n - 1 b e t s ，ap r o t e i nl a c k i n gas i g n a ls e q u e n c es 7 e m b oj o u r n a l ，1 9 9 0 ，9 ：1 5 0 3 - 1 5 1 0 【15 】 s c h w a r z es r , d o w d ys ei nv i v op r o t d nt r a n s d u c e i o n ：i n t r a c e l l u l a rd e l i v e r yo f b i o l o g i c a l l ya c t i v ep r o t e i n s 。c o m m p o u n d sa n dd n a 啊t r e n d si np h a r m a c o l o g i c a l s c i e n c e s ，2 0 0 0 ，2l ( 2 ) ：4 5 _ 4 8 f16 n o g u c h ih ，k a n c t oha n dw 街g ce ta l p d x 一1p r o t e i nc o n t a i n i n gi t so w l a n t e n n a p e d i a - l i k ep r o t e i nt r a n s d u c t i o nd o m a i nc a nt r a n s d u c ep a n c r e a t i cd u c ta n di s l e t c e l l s 晒d i a b e t e s ，2 0 0 3 ，5 2 ：1 7 3 2 1 7 3 7 【17 】 n o g u c h ih ，m a t s u s h i t ama n dm a t s u m o t ose t 以m e c h a n i s mo fp d x - 1p r o t e i n t r a n s d u c t i o n 啊b i o c h e m i c a la n db i o p h y s i c a lr e s e a r c hc o m m u n i c a t i o n s 2 0 0 5 3 3 2 ： 6 8 7 4 【1 8 】n o g u c h ih ，m a t s u m o t osa n do k i t s ute ta 1 p d x 一1p r o t e i n 蝤i n t e r n a l i z e db yl i p i d m f l d e p e n d e n tm a c r o p i n o c y t o s i s 凹c e l lt r a n s p l a n t a t i o n ，2 0 0 5 ，1 4 ：6 3 7 - 6 4 5 【19 】p r o c h i a n t z 八m e s s e n g e rp r o t e i n s ：h o m e o p r o t e i n s ，t a ta n do t h e r s 凹c u r r e n t o p i n i o ni nc e l lb i o l o g y , 2 0 0 0 ，1 2 ( 4 ) ：4 0 0 - 4 0 6 【2 0 】 j o l i o ta ，p r o c h i a n t za t r a n s d