（环境工程专业论文）多糖衍生物手性固定相分离对映体研究.pdf

浙江工业大学硕1 ：学位论文 多糖衍生物手性固定相分离对映体研究 摘要 由于手性药物和农药的两个对映异构体通常具有不同的生物活性 和毒性，甚至具有潜在的相反的药物反应，因此手性药物和农药对映 体的分离与制备研究具有重要意义。本论文利用高效液相色谱，分别 在商品化多糖手性柱和自制的键合型纤维素衍生物手性柱上进行了几 种典型手性药物和农药对映体拆分研究。 论文第一部分以微晶纤维素为原料，4 , 4 二异氰酸酯二苯基甲烷为 偶联剂，制备了两种6 位键合纤维素衍生物手性固定相：键合型纤维 素苯甲酸酯( b o n d e d c t b ) 和纤维素3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯 ( b o n d e d c d m p c ) ，其中6 位键合纤维素苯甲酸酯手性固定相为首次报 道。对自制的手性固定相进行红外表征，并在自制手性柱上采用三种 常用评价纤维素衍生物手性固定相的手性化合物苯偶姻、反式l ，2 一二苯 乙烯氧化物和特罗格尔碱进行评价。b o n d e d - c d m p c 对这三种手性化 合物的选择性优于b o n d e d c t b 。 论文第二部分在自制手性柱b o n d e d c t b 、b o n d e d - c d m p c 和商品 化纤维素衍生物手性柱c h i r a l c e lo d 、c h i r a l c e lo j 上研究了除草剂萘 丙胺的对映体分离。考察了流动相中极性添加剂种类、浓度和温度对 手性分离的影响。在自制手性色谱柱上采用四氢呋喃作为极性添加剂 时仍保持良好的稳定性，与涂覆型商品柱相比，可选择的流动相范围 更广，其中b o n d e d - c t b 达到了基线分离，可用于萘丙胺对映体的分 浙江丁业大学硕十学位论文 析和制备。 论文第三部分在三种商品化多糖手性柱c h i r a l c e lo d h 和 c h i r a l p a ka d - h 和c h i r a l p a ka s h 上拆分了2 ，3 - 二苯基一5 一氯甲基一1 ，3 - 氧氮杂环戊烷和2 - ( 4 硝基) 苯基3 一苯基5 氯甲基一1 ，3 一氧氮杂环戊烷立 体异构体。2 ( r s ) ，3 一二苯基一5 ( r s ) 一氯甲基1 ，3 一氧氮杂环戊烷，在c h i r a l c e l o d 上四个非对映异构体均获得了基线分离，而在直链淀粉衍c h i r a l p a k a d 上对映体之间没有获得分离，在c h i r a l p a k a s 上对映体之间获得了 分离；2 ( r s ) - ( 4 - 硝基) 苯基，3 一二苯基一5 ( r s ) - 氯甲基- 1 ，3 一氧氮杂环戊烷由 于2 位取代的为缺电子芳环，与手性固定相上的富电子的芳环问可以 形成更强的7 c _ 7 c 作用，其在直链淀粉c h i r a l p a ka d 上的保留最强，且 出峰顺序与c h i r a l c e lo d 和c h i r a l p a ka s 不同。 论文第四部分在自制的手性柱b o n d e d - c t b 和b o n d e d - c d m p c 上 拆分了六种三唑类手性化合物( 多效唑、硝酸益康唑、咪康唑、烯唑醇、 戊唑醇和己唑醇) 和三种黄烷酮衍生物( 4 甲氧基黄烷酮、5 甲氧基黄烷 酮和6 一甲氧基黄烷酮) 。在固定相b o n d e d c t b 上两组相近手性化合物 均不能拆分，而在b o n d e d - c d m p c 上则均能拆分。 关键词：手性固定相；对映体分离；多糖衍生物；高效液相色谱 浙江工业大学硕士学位论文 s 7 r u d yo fe n a n t i o s e p a ra t i o nu s i n gp o l y s a c c h a r i d ed e r i 、厂a t i v ec h 【i ia i ，s t p 汀i o n a r yp h a s e a b s t r a c t m a n ye n a n t i o m e r so fc h i r a lp h a r m a c e u t i c a l sa n dp e s t i c i d e ss h o w d i f f e r e n tb i o l o g i c a la c t i v i t i e sa n dt o x i c i t y , s ot h es e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r s i s v e r yi m p o r t a n t t h ee n a n t i o s e p a r a t i o no fs e v e r a l t y p i c a l c h i r a l p h a r m a c e u t i c a l s a n d p e s t i c i d e s w a s i n v e s t i g a t e d o nc o m m e r c i a l p o l y s a c c h a r i d e - d e r i v a t i v e c h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e s a n d s e l f - p r e p a r e d c e l l u l o s e - d e r i v a t i v ec h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e su s i n gh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y i nf i r s tp a r t ，u s i n gg , 4 一m e t h y l e n e d i p h e n y ld i i s o c y a n a t e 鹊b o n d i n g s p a c e r , c e l l u l o s eb e n z o a t e ( b o n d e d c t b ) a n dc e l l u l o s e3 , 5 一d i m e t h y l p h e n y b c a r b a m a t e ( b o n d e d - c d m p c ) w e r eb o n d e dt o a m i n o p r o p y l s i l i c ag e l a t 6 - p o s i t i o n , t h ep r e p a r a t i o n o fb o n d e d - c t ba n di t s a p p l i c a t i o n o f e n a n t i o s e p a r a t i o n h a v en o ts e e nl i t e r a t u r e r e p o r t a t p r e s e n t t h e s e l f - p r e p a r e dc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf t - i r , a n dt h e e n a n t i o s e p a r a t i o no fb e n z o i n ，t r a n s - s t i l b e n eo x i d ea n dt r o g e r sb a s ew a s s t u d i e d0 1 1 s e l f - p r e p a r e dc o l u m n s ，a n d0 1 1b o n d e d c d m p cg e tb e r e t s e p a r a t i o n h 1t h es e c o n dp a r t , t h eh e r b i c i d e n a p r o a n i l i d ew a ss e p a r a t e do n c h i r a l c e lo d ，o ja n ds e l f - p r e p a r e dc o l u m n s t h ei n f l u e n c eo fm o b i l e i i i 浙江工业大学硕士学位论文 p h a s ea d d i t i v e s ，c o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r eo nt h ee n a n t i o s e p a r a t i o n w a s s t u d i e d ，a n d t h et w o s e l f - p r e p a r e d c o l u m n sc a n u s ew i t h t e t r a h y d r o f u r a n ( t h f ) a sm o b i l ep h a s em o d i f i e r , e s p e c i a l l yn a p r o a n i l i d e c a ng e tb a s e l i n es e p a r a t i o no nb o n d e dc e l l u l o s eb e n z o a t e ，i tc a nb eu s e df o r q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so f n a p r o a n i l i d ee n a n t i o m e r s i nt h e t h i r d p a r t ，t h e c h i r a l s e p a r a t i o n o f 2 , 3 - d i a r y l 一5 一c h l o r o m e t h y l 一1 ，3 一o x a z o l i d i n e s a n d2 - ( 4 一n i t r o ) 一a r y l ，3 a r y l 5 c h l o r o m e t h y l - 1 ，3 。o x a z o l i d i n e sw a sp e r f o r m e do nc h i r a l c e lo d ，c h i r a l p a k a da n d c h i r a l p a k a s o nc h i r a l c e l o d ，t h e f o u ri s o m e r so f 2 , 3 一d i a r y l - 5 一c h l o r o m e t h y l 一1 ，3 一o x a z o l i d i n e sg o tb a s e l i n es e p a r a t i o n ，a n do n c h i r a l p a ka d t h e r ew a sn os e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r s ，a n do nc h i r a l p a ka s t h ee n a n t i o m e rw e r es e p a r a t e d ；d u et ot h en i t r y l ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n 2 一( 4 - n i t r o ) 一a r y l ，3 - a r y l 一5 一c h l o r o m e t h y l 一1 ，3 一o x a z o l i d i n e sa n dc s p sc a nf o r m s t r o n g 兀- 兀i n t e r a c t i o n , a n do nc h i r a l p a ka dt h er e t e n t i o nt i m ew a sl o n g e s t ， a n dt h ee l u t i o ns e q u e n c ew a sa l s od i f f e r e n tf r o mt h eo t h e rc o l u m n s i nt h ef i n a lp a r t ，t h ee n a n t i o s e p a r a t i o no fs i xt r i a z o l ec o m p o u n d sa n d t h r e ef l a v a n o n ed e r i v a t i v e sw a ss t u d i e do ns e l f - p r e p a r e dc o l u m n s ，t h e ya l l c a nb es e p a r a t e dc o m p l e t e l yo nb o n d e d c d m p c ，w h i l eo nb o n d e d - c t b t h e r ei sn oo b v i o u ss e p e r a t e dp e a ka tt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n k e y w o r d s ： c h i r a l s t a t i o n a r y p h a s e ； e n a n t i o m e r s e p a r a t i o n ； p o l y s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e ；h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 浙江工业大学硕士学位论文 符号说明 c s p 卜手性固定相： h p i c 一高效液相色谱： b o n d e d c 卜_ 6 位键合型纤维素苯甲酸酯； b o n d e d - c d m p c _ 6 位键合型纤维素3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯； c h i r a l c e lo d h - 涂敷型商品柱纤维素3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯； c h i r a l e e lo j - h - 涂敷型商品柱纤维素4 甲基苯甲酸酯； c h i r a l p a k a d h 涂敷型商品柱直链淀粉3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯： c h i r a l p a k a s h - 余敷型商品柱直链淀粉( s ) 1 苯乙基氨基甲酸酯； h e x ( h e x 卜- 正己烷； m a 异丙醇； n 珉一四氢呋喃； b 死时间，m i l l ： r r 一调整保留时间，r a i n ： k i 容量因子，又称保留因子； a - i 盎择性因子，又称分离因子； r 卜_ 分离度； t i s o _ 手性选择温度，k ； f t - 球傅利叶变换红外光谱分析仪； i 紫外检测器 c d 一圆二色检测器 浙江工业大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：纠旁p 睁日期：口7 年多月z 日 j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密毗 ( 请在以上相应方框内打“”) ，7 年6 月z 日 呷年b 月多日 期期 日池 濑 签签 者师作导 浙江_ 丁业大学硕士学位论文 1 1 选题背景与意义 第一章绪论 手性【l 】，英文名c h i n d i t y 或h a n d e d n e s s ，是从左右手的互为镜体或是左手套不等 与右手套的理解来表明分子的呈现旋光的非对称性。手性是宇宙间的普遍特征， 从原子到人类本身都是不对称的，自然界存在的糖为d 构型，氨基酸为l 构型， 蛋白质和d n a 的螺旋构象又都是右旋的，因此手性与我们的生活密切相关。而手 性物质的对映体在普通条件下具有相同的物理、化学性质，但在手性条件下两个 对映体具有不同的性质，例如大多数手性药物及农药的各对映体在活性、药理和 药效等方面明显不同，表1 1 列出一些手性药物和农药的对映体不同生物活性。据 统计，目前市场上出售的手性药物中有8 0 9 0 是外消旋体【2 l ，商业用途的1 7 0 多个手性农药绝大多数也是以外消旋体形式出售和使用 3 , 4 1 ，对环境和生物存在巨 大的潜在风险，因此对映体分离具有非常重要的意义。 高效液相色谱手性固定相法操作简便，应用范围广泛，并且可应用于制备级 的分离，是目前研究和应用最多的一种对映体分离分析方法。由o k a m o t o 5 】等人发 展起来的多糖类手性固定相( c s p s ) ，已经被证明是一类性能良好的h p l c 手性固定 相，因其通用性强、经久耐用、样品载荷量大而成为研究和应用最多的一类c s p s ， 同时涂敷型和键合型纤维素和直链淀粉衍生物c s p s 在分离分析对映体方面具有互 补性，极大地拓展了这类c s p s 的应用范围。虽然国外市场上已有一系列多糖类手 性商品柱出售，但多为涂敷型，键合型多糖手性商品柱市场上目前仅有两种，并 且从文献报道中可知，国内外对键合型多糖c s p s 的研究也没有涂敷型那么多，因 此，研制新型键合型多糖c s p s 是十分必要的。纤维素衍生物手性固定相与对映体 之间有很多不同的手性和非手性作用力，这些作用力的强弱和性质也各不相同， 使得其手性识别的机理非常复杂，虽然有很多学者在这一方面进行了大量的研究， 但到目前为止尚没有取得令人非常满意的结果。因此，对多糖c s p s 的手性识别机 理进行深入研究具有一定的理论及实际意义。 浙江工业大学硕士学位论文 表l 一1 对映体的不同生物活性 t a b l e l - lt h ed i f f e r e n tb i o l o g i c a la c t i v i t yo f e n a n t i o m e r s 烯唑醇 r 强杀菌活性 s 强植物生长调节功能 多效唑 杀茵活性为：2 r , 3 r 2 s ，3 r 2 r , 2 s - 2 s ，3 s 氯霉素 r s ，s 杀菌剂 植物生长调节剂 1 2 研究内容 本论文的研究内容主要有以下几个方面： ( 1 ) 制备了两种键合型纤维素衍生物c s p s ：6 - 位键合型纤维素苯甲酸酯 ( b o n d e d c t b ) 和6 - 位键合型纤维素3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯( b o n d e d - c d m p c ) ， 并采用匀浆法装填成色谱柱。采用三种标准手性化合物评价自制手性柱的手性识 别能力。 ( 2 ) 在商品化手性柱c h i r a l c c lo d h 、c h i r a l e e lo j h 和自制b o n d e d o c t b 、 b o n d e x i - c d m p c 手性柱上对萘丙胺对映异构体进行拆分研究，考察了流动相中乙 醇、异丙醇和四氢呋喃以及柱温对拆分的影响，探讨了萘丙胺在这四种c s p s 上的 手性识别机理。 ( 3 ) 在三种商品化的手性柱c h i r a l e e lo d h 和c h i r a l p a ka d h 和c h i r a l p a k 2 浙江工业大学硕士学位论文 a s h 上，对2 取代的3 苯基一5 一氯甲基1 ，3 氧氮杂环戊烷类化合物进行手性拆分研 究，考察流动相中乙醇和异丙醇以及柱温对手性拆分的影响，并初步探讨了其手 性识别机理。 ( 4 ) 在自制手性柱b o n d e d c t b 和b o n d e d - c d m p c 上对六种三唑类手性化合 物( 多效唑、硝酸益康唑、咪康唑、烯唑醇、三唑醇、戊唑醇和己唑醇) 和三种黄烷 酮衍生物( 4 - 甲氧基黄烷酮、5 甲氧基黄烷酮和6 甲氧基黄烷酮) 进行对映体分离研 究，比较两种自制c s p s 对这些化合物的手性识别能力，并初步探讨了其拆分机理。 浙江工业大学硕士学位论文 第二章文献综述 2 1 手性化合物的拆分方法 手性拆分的方法很多，大致可以分为两大类：色谱法和非色谱法。其基本原 理大多是基于把对映体的混合物转换为非对映异构体，然后利用它们在化学或物 理化学性质上的差异使之分开。非色谱法主要有：结晶法 6 9 1 、化学拆分法【m 、 萃取法【】和酶拆分法【悼1 q 等。非色谱法大多操作繁杂、费时、消耗大、收率不稳 定，能拆分的手性对映体的种类有限，从而限制了其广泛应用。目前研究和应用 最多的还是色谱法，其不仅是对映体分析和纯度测定的有力工具，而且还是制备 和纯化的重要手段。 近年来，随着色谱理论的深入研究、技术的日臻完善、仪器及其组件的更新， 使之在手性物质分离分析领域显示出强大的优势【1 7 ，瑚应用于手性分离的色谱技术 主要包括气相色谱( g c ) 、超临界流体色谱( s f c ) 、薄层色谱( t l c ) 、毛细管电泳色 谱( c e ) 和高效液相色谱( h p l c ) 等。 2 1 1 气相色谱法 气相色谱法( g c ) 是较早用来进行对映体分离的一种色谱方法。具有速度快、 简单、灵敏等优点，对于可挥发的热稳定手性分子，它表现出了明显的优势。气 相色谱可以采用直接和间接两种拆分方法，但在气相色谱中不能使用流动相添加 剂法，因此手性固定相法是唯一的直接拆分方法。 气相色谱中用于分离对映体的手性固定相主要有以下几类：( 1 ) 以手性氨基酸 衍生物为选择体的二酰胺、二肽酯、二酰脲等，它们可分离许多手性化合物1 1 9 】。 异氰酸酯类和光气已成为多种化合物手性分离的万能试剂：( 2 ) 光学活性金属配合 物。s c h u r i g 2 0 1 提出了“络合气相色谱法”的概念，把手性分离气相色谱推广到不足 以生成氢键基团的化合物上。这一方法对分离信息素特别有用，但受到热稳定性 的限制；( 3 ) 环糊精衍生物。环糊精衍生物的出现为手性分离开辟了一个新的途径， 是最有前途的一种手性固定相。s a n d 2 i 】等于1 9 6 1 年首先把环糊精衍生物( c d s ) 用 4 浙扛工业大学硕士学位论文 作填充柱气相色谱的固定液。能够用c _ , - c 分离的手性农药中，9 0 以上是在环糊精 手性固定相的基础上实现的。目前商品化的手性气相色谱柱的固定相基本上都是 基于衍生化的环糊精如g - t a ( 2 ，6 二o 戊基3 三氟乙酰基g 一环糊精) 、b d m ( - o 甲基b - 环糊精) 、b p m ( 2 ，3 ，6 三o 甲基b 环糊精) 、b p h ( ( s ) - 2 羟丙基，甲基b 环糊精) 、b p t ( 三氟乙酰基b - p 功和g g r ( - - 氟乙酰基g p h ) 等。( 4 ) 冠醚。周喜 春等【捌合成了一些冠醚修饰型手性固定液。曾昭睿等1 还合成环糊精冠醚毛细管 气相色谱手性固定相，还采用溶胶一凝胶技术制备了羟基苯并冠醚毛细管气相色谱 固定相，并测定了它的色谱性能【卅。 间接衍生化法主要是在没有或缺少相应手性固定相的情况下而采取的一种检 测对映体比率和光学纯度的方法。如b 肾上腺素受体阻断药物的分离【2 5 l 。 与其它色谱法相比，气相色谱法手性分离有以下优点：( 1 ) 可以确定复杂混合 物中少量组分的绝对构型；( 2 ) 绝对灵敏度高，而且与官能团无关；( 3 ) 对手性杂 质的检测限较低，可低于l ；( 4 ) 可以使用线性范围宽的通用检测器；( 6 ) c s p s 可以分离所有挥发性化合物；( 7 ) g - c 柱寿命长，可达数年之长。当然，g c 手性分 离也有其不足之处，不宜分离低挥发性、强极性或分子量大的化合物，限制了其 应用范围。 2 1 2 薄层色谱法 薄层色谱法( ，r l c ) 是最简便的色谱分离技术之一，其分离方式有手性试剂衍生 化法( c d r ) 、手性流动相添加剂法( c m p a ) 和手性固定相法( c s p s ) 刚，但应用较多 的是手性固定相法。与其它色谱法相比，t l c 的优势在于可以在同一条件下同时 析分多个样品，并且有多种检测方法可供选择，如u v 、荧光以及颜色反应检测方 法等；另外一个优点是可以从板上制备样品，迁移速率慢的组份也需要洗脱到板 的另一端就可以回收。 手性固定相法的技术关键在于制备不同的手性薄层板，常用的手性薄层板有 纤维素板及预涂纤维素的薄层板，可用于拆分氨基酸及其衍生物，二肽等对映体。 用非均相乙酰化方法制得的纤维素三醋酸( m c t a ) $ 1 j 备成的薄层板可用于拆分氨 基酸衍生物、镇痛剂的苯酯、黄酮类化合物及一些具有重要生理活性的手性药物 对映体；分子印记法是制备具有高选择性的合成高分子的方法，常用的载体有硅 5 浙江工业大学硕士学位论文 胶及氨基、氰基、二醇基修饰的硅胶等，对氨基酸、糖及其衍生物、一些手性药 物都表现出亲和力，但是有些用做印记分子的物质溶解性差，对手性分离不利； 将手性选择剂化学键合到载体上，进行对映体分离的化学键合的手性薄层板主要 有p 环糊精( p - c d ) 键合相薄层板、p r i c k l e 型手性薄层板、萘乙基脲型薄层板。朱全 红等1 2 7 】将b c d 健合相用苯基异氰酸醋及3 ，5 二硝基苯甲酰氯进行衍生化，制备了衍 生化的b c d 键合相薄层板，在反相色谱条件下分离了氨基酸对映体及一些临床常 用的手性药物对映体如氧氟沙星等。 2 1 3 超临界流体色谱法 超临界流体色谱法( s f c ) 是采用超临界流体为载体的一种分离技术，由m o u r i e r 等人于1 9 8 5 年首次用s f c 实现手性分离网。其在手性分离分析中的优势表现为： ( 1 ) 超临界流体的粘度近于气体，比液体低的多，可减少过程阻力，采用细长色谱 柱可以增加柱效；( 2 ) 超临界流体的密度与液体相似，因此它有强的溶解能力，适 于分离难挥发和热稳定性差的物质；( 3 ) s f c 系统既可使用h p l c 检测器，也可使 用g c 检测器，如质谱、氢火焰离子化检测器；( 4 ) 可作流动相的超临界流体物质 较多、易得，与h p l c 相比，对环境的污染及操作人员的毒害较少。因此可以有 效的弥补h p l c 和g c 在分离手性物质方面的不足。但是超临晃流体色谱手性柱 的制备较难，分析速度比g c 慢，手性固定相的组成比例需要适当地调节和由于溶 剂效应使选择因子比g c 低等缺点。而且由于技术要求高，设备昂贵等原因，该方 法至今没能得到广泛的应用。 s f c 分离手性化合物可分为直接法和间接法两种，直接法包括使用手性固定 相和手性流动相。目前，手性固定相直接分离法是超临界流体色谱法中发展最快 的领域，一般在超临界流体中加入少量的添加剂( 酸或碱) ，或者极性溶剂( 甲醇、 乙醇等) ，这样既可覆盖固定相表面的活性部位，又可增加流动相的洗脱强度和选 择性，提高了分离效率。y i n g 等【2 9 1 采用超临界c c h ( 添加少量的- - 7 , 胺或三氟乙酸) 作为流动相，以3 种聚糖类手性固定相成功分离了l l1 种手性对映体药物，所有 的分离过程都在1 5 m i n 内完成，7 0 的对映体药物在4 m i n 内得以拆分。m o n i k a o o ! 采用超临界c 0 2 色谱手性固定相法拆分了异丁苯丙酸、布洛芬对映异构体，发现 c 0 2 中改性剂的含量对分离有很大的影响。t o r i b i o 等【3 l 】采用超临界流体色谱在商 6 浙江工业大学硕士学位论文 品直链淀粉手性柱c h i r a l p a ka d 上拆分了六种三唑类手性农药，基于不同的手性 农药，添加不同的改性剂甲醇、乙醇和异丙醇，能得到最佳的拆分效果，拆分时 间均接近于l o m i n 。 超临界流体色谱亦是一种制备分离技术，已应用于食品、医药、生物及石油 等多种领域，在药物方面，已有研究报道制备纯对映体达到了千克级。d a u h - r u m g p 2 i 研究发现超临界c 0 2 色谱是一种比高效液相色谱效率更高、更直接的制备分离技 术，制各拆分了几百克的手性药物。w e l c h 蚓和g a r y 【3 4 1 也报道了超临界流体色谱制 备拆分了千克级的手性药物。 2 1 4 毛细管电泳色谱法 毛细管电泳色谱法( c e ) 是2 0 世纪8 0 年代以来新兴的一种分离技术，由于它 具有高效、快速、简便等特点而被广泛应用于手性分离。c e 以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据样品各组分之间浓度和分配行为的差异而实现分离【3 5 l 。 s t e p h e 和w r e n 3 6 】对该法的分离机制进行了研究，用毛细管区带电泳及环糊精作手 性选择剂分离对映体的方式，推导得出数学模型，并用此从理论上阐述了一些具 体问题。此外，通过n m r 谱中的化学位移和谱峰分裂也可以分析其作用机理。 c h a n k v e t a d z e 等【3 7 1 用1 3 c - n m r 研究了用中性和带电环糊精拆分甲丙氨酯的手性识 别机理。 但是，c e 手性分离的理论尚待完善，对分离结果的预测性差，分离电中性化 合物仍是一个有待更好解决的问题【3 s l ，而且该方法还没有用于手性制备的报道。 2 1 5 高效液相色谱法 高效液相色谱技术( h p l c ) 是2 0 世纪7 0 年代后期发展起来的，现已成为对映 体分离中最重要的一种手段。与g c 和t l c 一样，h p l c 也可以使用间接法和直 接法两种方式拆分对映体，直接法又分为手性流动相添加剂法和手性固定相法。 每种方法都有其优点和缺点。间接方法是用手性试剂将对映体衍生化成非对映异 构体，然后根据它们的化学和物理性质的不同在非手性柱上分离，这种方法不需 要采用昂贵的手性柱，并且灵活；但是，衍生化意味着需要额外的步骤，可能会 产生不想要的负反应使产物分解或消旋化。而且需要手性衍生试剂的光学纯度高， 7 浙江t 业人学硕i ：学位论文 并且在样品中存在可衍生化的官能团。采用手性固定相的直接法方便，并且可以 应用于制备级的分离，但是需要收集昂贵的手性柱来解决各种分离问题。流动相 添加剂法代表了简单、灵活，但不总是可用。因为流动相中的手性选择剂无法重 复利用，因此这种方法不能采用昂贵的试剂进行分离。 ( 1 ) 间接法 有大量的文献报导了利用手性试剂衍生化法分离含有各种官能团手性化合 物，这些官能团主要有氨基( 氨基化合物、氨基甲酸酯、尿素类、硫脲类和磺胺类) 、 羟基( 酯、碳酸酯、氨基甲酸酯) 、羧基( 酯和氨基化合物) 、环氧( 异硫氰酸酯) 、烯 烃( 手性铂络合物) 和硫醇( 硫酯) 等。但近些年的相关研究变得少了起来，这主要是 商品化的 丑? l c 手性固定相越来越多，但仍有一些研究者致力于寻找新的和更好 的手性衍生化试剂，并取得了一定的进展，如用来做氨基酸、氨基醇和儿茶酚胺 及天冬氨酸消旋酶衍生试剂的富含手性硫醇类试剂的n ( 叔丁基硫代氨甲酰) l 半 胱氨酸乙酯【3 9 】。 ( 2 ) 直接法 手性流动相添加剂法常用的手性添加剂有离子对试剂、配体交换型试剂、蛋 白质亲和试剂、环糊精及其衍生物试剂、冠醚手性包合试剂和手性氢键作用试剂 等【4 0 】。如可以通过添加手性离子对试剂( + ) 樟脑磺酸来分离氨基醇类( p 阻断剂) ， 添加奎宁来分离羧酸类对映体：n ，苄氧基羰基氨基乙酰基一l 脯氨酸在分离b 阻断 剂时的手性选择性好于樟脑磺酸【4 l 】。 手性固定相法分离对映体是目前高效液相色谱中研究和应用最多的一种方 法，在本章第二节中将对其进行较详细的评述。 2 1 6 色谱拆分技术的比较 各类色谱拆分技术分离对映体的优缺点见表2 1 。在各种手性色谱技术中，高 效液相色谱法适用对象广泛，尤其为非挥发性和热稳定性差的手性药物的拆分提 供了更为有效地途径，具有高效、简单、快捷的特点。对于一般的手性样品分离 测定可在一次运行同时实现，对于更复杂的样品还可采用多维色谱技术，并可以 与红外、质谱、核磁共振联用，为复杂样品的快速定性和定量分析提供了方便的 途径，因此高效液相色谱是研究和应用最多的手性色谱技术。 矗 浙江工业大学硕士学位论文 表2 1 色谱拆分技术的优缺点 t a b l e 2 lt h ec o m p r a s i o no f c h r o m a t o g r a p i c a lt e c h n o l o g i e s 2 2 高效液相色谱手性固定相 高效液相色谱法( h p l c ) 是手性分离分析的重要手段【4 2 1 ，而具有不对称手性中 心或手性识别能力的手性固定相( c s p s ) 的开发与研究，是手性色谱的前沿，也是手 性高效液相色谱发展的关键和核，l j 4 3 。高效液相色谱利用手性固定相分离对映体 的研究始于2 0 世纪7 0 年代后期，现已开发出用于高效液相色谱的手性固定相的 种类已有上千种，其中商品化的高效液相色谱手性固定相也已超过2 0 0 多种附4 叼。 人们通过各种研究来发展更有效的新型的手性固定相，或改进现有的手性固定相， 如基于纤维素和直链淀粉衍生物、大环抗生素、手性冠醚、蛋白质、环糊精和具 有光学活性的合成小分子的p i r k l e 型手性固定相等都成功地应用于高效液相色谱 的手性分离，并对手性固定相的手性识别机理进行了大量的研究【4 7 ，4 羽。 根据不同的目的，h p l c 手性固定相有不同的分类方法。如被广泛采用的w a i n e r 分类方法，是按照手性固定相与溶质之间的相互作用机理而分为五类 4 9 , 5 0 1 ，具体 见表2 2 。按照手性固定相的来源进行分类，又可分为天然型、半合成型和合成型 p ”，具体见表2 3 。在各类c s p s 中，由o k a m o t o 等发展起来的多糖类手性固定相已 被证明是一类性能良好的高效液相色谱手性固定相，其中涂敷和键合型的纤维素 和直链淀粉衍生物手性固定相在分离分析对映体方面具有互补性，极大地拓展了 这类手性固定相的应用范围，是目前研究和使用最广泛的手性固定相之一。多糖 类手性固定相的优点是 5 2 1 ：( 1 ) 它们是天然活性物质，容易得到；( 2 ) 它们的葡萄 糖单元的羟基易被衍生化，容易制备出各种选择性的手性固定相；( 3 ) 多糖类c s p s 的载样量大，在大规模制备色谱应用上有很大潜力：( 4 ) 普适性强，适用于许多光 学异构体的拆分。 9 浙江工业大学碗土学位论文 表2 2 高效液相色谱手性同定相按w a i n e r 分类 t a b l e 2 2w a i n e rc l a s s i f i c a t i o no fh p l c c s p s 作用机理 灿或p i r l d c 型黼耶卵抽攮搬麓篙蠹羞昙耄磊趣撼枷佣商键 类型i i 在手性空穴内古有多种吸引作用和包含作用，如纤维素衍生物 类型i i l包含作用如环糊精类型手性固定相 类型i v 通过形成金属非对映异构体诱导手性识别( 手性配体交换色谱) 类型v疏水作用和极性作用，如蛋白质手性固定相 表2 - 3 高效液相色谱手性同定相按其来源分类 t a b l e 2 3t h ec l a s s i f i c a t i o no fh p l c - c s p sb yi t so r i g i n 2 2 1 多糖类手性固定相 多糖类化合物如纤维素和直链淀粉是自然界中大量存在的有光学活性的生物 聚合物。纤维素和直链淀粉是d ( + ) 葡萄糖以p - 1 , 4 糖苷键或a 1 ，4 糖苷键相连而形 成的高度有序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分子，其结构如图2 1 所示。 每个葡萄糖单元具有5 个手性碳原子，故由1 1 个葡萄糖单元构成的纤维素分子将有 5 n 个手性中心。因而作为主体分子能为客体分子提供一个良好而易得的手性环境， 而且葡萄糖单元2 ，3 ，6 - 位上的3 个羟基易被衍生成酯或醚类，从而降低纤维素的极 性，引入含有可产生氢键氢键、偶极偶极、哥兀键及立体选择等效应的取代基， 从而提高手性识别能力，因此制备大量的纤维素和直链淀粉衍生物更具使用价值。 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 乃百万万 纤维素直链淀粉 图2 i 纤维素和直链淀粉结构图 f i g 2 - 1 t h es i x l g t o r e so f c e l l u l o s ea n da m y l o s e 多糖类化合物或其衍生物用作手性固定相一般有三种方式：( 1 ) 做成凝胶颗粒 直接装柱；( 2 ) 涂敷在大孔载体如硅胶上；( 3 ) 化学键合于硅胶表面。而涂敷型和 键合多糖类c s p s 应用最广泛，以下主要对涂敷型和键合型多糖类c s p s 进行评述， 兼带多糖类衍生物直接用作手性固定相的应用。 ( 1 ) 涂敷型多糖c s p s 涂敷型多糖c s p s 的制备方法是把多塘化合物在均相条件下通过酯化和醚化的 方法完全取代葡萄糖结构单元上的羟基， 应的衍生物涂覆到大孔十氨丙基硅胶上， 引入不同分子结构的官能团，然后将相 得到相应手性固定相。这类c s p s 目前已 有很多商品化的手性柱，具体如表2 4 所示( 包括三种多糖衍生物直接用作c s p s 的商 品柱1 。 涂敷型纤维素c s p s 是一类良好的多糖c s p s ，其发展经历了三个阶段：纤维素 三醋酸酯( c t a ) 、纤维素三苯甲酯( c t b ) 及纤维素三氨基苯甲酯( c t p c ) ，其结构单 元如图2 2 所示，其中x 为苯环上不同的取代基。 纤维素三醋酸酯( c t a ) 是最早研究的多糖c s p s ，可由纤维素与乙酰氯反应制 得。h e s s ef g l h a g e l s 3 , 5 4 1 在非均相条件下首次制得了c t a ，研究表明c t a 具有较好 的手性识别能力，这种手性识别能力来源于纤维素的晶体结构本身。当c t a 溶解于 溶剂并涂渍在硅胶上时，对很多外消旋体也表现出了手性识别的能力，但o k a m o t o 等【5 5 5 闱报道其手性识别能力不同于原来的微晶纤维素三醋酸酯。 纤维素三苯甲酯( c t b ) 是一类良好的多糖c s p s ，可由纤维素与苯甲酰或苯环上 有取代基的苯甲酰氯反应制得。此类手性固定相的手性识别能力一方面来自手性 吸着点羰基和苯环，这使c t b 比c t a 具有更高的手性识别能力。羰基和苯环分别与 对映异构体的极性部分和芳环部分发生氢键、偶极偶极及 g - 兀作用，两个单一对映 体与手性吸着点的作用力不同，通过反复作用达到手性分离；另一方面来自对映 浙江工业大学硕士学位论文 异构体在c s p s 手性空腔中的空间适应性，不同的制备条件如涂敷溶剂影响着c t b 及其衍生物的超分子结构的有序程度和手性空腔的空间适应性，从而影响了手性 识别能力【5 7 巧9 】。在纤维素三苯甲酯( c t b ) 的研究中，有很多关于c t b 单独使用或涂 敷在硅胶上制成手性固定相的应用报道。如o k a m o t o 等【删研究了涂敷在硅胶上的纤 维素三苯甲酸酯及其衍生物手性固定相，发现手性识别能力与苯环上的取代基以 及取代基的位置有很大的关系，其中纤维素三( 4 甲基苯甲酸酯) 表现出了很高的手 性识别能力。f r a n c o t t e 等 6 1 ，6 2 】将c t b 衍生物直接制备成颗粒c s p s ，而不是涂敷到 硅胶上，也取得了良好的手性分离效果。 纤维素三氨基苯甲酯( c t p c ) 可由纤维素与苯基异氰酸酯或苯环上取代的苯基 异氰酸酯的化学反应制得，这一类衍生物比纤维素三苯甲酯( c t b ) 表现出了更高的 手性识别能力，适应性也更广，是近年来应用和机理研究较多的一类多糖c s p s 6 3 1 。 该类手性固定相手性吸着点是极性的氨基甲酸酯，手性识别能力主要受控于 - n h c o o 基团，固定相中的- n h 基、c = o 基与样品间存在氢键作用，c = o 与样品 问存在偶极偶极作用。与c t b 及其衍生物类似，苯环上取代基的性质、数目及位 置对氨基甲酸酯的极性有着显著影响，因此，苯环的取代基对手性化合物的拆分 影响很大。一般苯环上有取代基团的衍生物的手性拆分能力比没有取代基的好， 当取代基为给电子基团( 如甲基) 时，使固定相中的羰基上氧原子的电子云密度增 强，一般易拆分吸附在羰基上的极性化合物，如醇、氨基化合物等；当取代基为 吸电子基团( 如氯) 时，使固定相中的- n h 的酸性增强，一般易拆分吸附在- n h - 的化 合物，如带羰基、醚的化合物等。当苯环上为单取代基团时，甲基在苯环的3 - 或4 位时手性识别能力高，而在2 位时低州，而苯环上为杂原原子取代基团时也表现 出较低的手性识别能力，如烷氧基、硝基等【6 卯，这主要是烷氧基、硝基等基团的 极性较强，易与样品作用，影响拆分效率；当苯环上