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玉米芯发酵乳酸条件的优化与固定化米根霉的探索 摘要 植物纤维物料是极为丰富且价廉的可再生资源，目前，我国5 0 以上的农林废弃物( 年产l o 亿吨) 被焚烧，滚滚浓烟及排放的大 量有害气体造成了严重的环境污染，甚至影响了飞机的正常飞行。人 类赖以生存的环境正在不断恶化，如何有效地将纤维素植物生物质转 化为能源或其它工业产品有着极其深远的意义。以天然纤维素类物质 玉米芯为原料发酵乳酸不仅可以大幅度降低乳酸的生产成本，而 且可以达到废物资源化之目的。本文以资源综合利用为目的，采用米 根霉r m 2 9 9 为发酵菌株，对玉米芯酶解液发酵产l 一乳酸的工艺性能 作了以下研究。 首先，采用正交试验法通过对发酵时间、发酵温度、投加碳酸钙 的量、装液量、( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度、k h 2 p 0 4 浓度、m g s 0 4 - m 2 0 浓度、 z n s 0 4 7 h 2 0 浓度各因子的不同配比组合，获得利用玉米芯酶解液发 酵l 一乳酸的分别酶解发酵方法的最优化条件。并在此基础上研究添 加中和剂的方式对产酸效果的影响。由于玉米芯成分复杂等原因，影 响了米根霉发酵乳酸的产量，但通过葡萄糖发酵实验结果可知本实验 的发酵工艺和使用米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) r m 2 9 9 发酵菌株是可行 的。 同时糖化发酵( s s f ) 可以提高整个过程的效率。而且可以简化生 产工艺、减少设备投资、提高了霉的利用率。利用乳酸菌同时糖化发 酵乳酸工艺研究报道的比较多，原因可能是考虑到乳酸菌发酵温度与 酶解的温度一致。然而乳酸菌营养要求复杂，不利于工业化利用。所 以，本课题将致力于酶解和米根霉发酵同时进行的工艺研究。这也是 植物纤维素的同步酶解与发酵乳酸的一条值得研究的新途径。实验中 发现酶解4 小时后接入米根霉孢子的s s f 法发酵工艺相对其他接种方 式产酸效果最好，达到了纤维素酶与米根霉孢子的最优协调。稀酸处 理的玉米芯相对粉碎处理和碱处理后的玉米芯削减了木糖对米根霉 发酵葡萄糖的抑制作用，产酸量相对较高。是最为认可的预处理方法。 另外，从分步法和s s f 法实验对比发现：在乳酸的得率方面，同时糖 化发酵比分别糖化发酵提高了1 4 4 4 ( 粉碎处理、9 小时加入 c a c o ，) ，说明采用同时糖化发酵过程可以消除产物抑制，提高纤维 素的转化率。 固定化技术是提高生物催化利用率、生物反应速率以及实现高效 连续生产过程的有效方法。将米根霉固定化发酵乳酸具有菌体密度 高，反应速率快，稳定性好，使用寿命长，可重复利用等优点。本课 题研究了海藻酸钠包埋法和壳聚糖表面吸附法固定米根霉发酵乳酸， 并对a c a ( 海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠) 微粒固定米根霉进行初步探 索。这一部分是本课题研究的重点。 从产酸量上比较，最高产酸量出现在海藻酸钠包埋法：从产酸的 稳定性来看，产酸最稳定的是壳聚糖表面吸附法；从固定载体的使用 寿命上比较壳聚糖小球的寿命最长。然而a c a 微粒综合了前两种载体 的优点，使用海藻酸钠包埋米根霉维持了米根霉的产酸性能，同时在 凝珠外包了一层壳聚糖膜，延长了海藻酸钠凝珠的寿命。所以，本文 认为a c a ( 海藻酸钠一壳聚糖一海藻酸钠) 微粒是固定化米根霉较为 理想的载体，是值得致力研究的方向。 本文的创新点是首次利用壳聚糖凝胶作为固定米根霉的载体，推 理了壳聚糖凝聚反应的机理，并通过红外光谱和核磁共振谱图作了推 测。实验也证明了此种方法制得的壳聚糖凝胶小球作为固定米根霉载 体具有足够的韧性和强度。然而由于时间的限制，对壳聚糖凝聚的机 理没有作充分的证明，有待进一步探索。 关键词：米根霉，乳酸，s s f 法，固定化，壳聚糖，a c a 微粒 c o n d i t i o no p t i m i z a t i o nf o rp r e p a r i n gl a c t i ca c i df r o m c o r n c o bf e r m e n ta n de x p l o r a t i o no f f i x i n g r h i z o p u so r y z a e a b s t r a c t b o t a n i cc e l l u l o s em a t e r i a li sak i n do f p l e n t y ，c h e a pa n dr e p r o d u c i b l e r e s o u r c e a t p r e s e n t ，i no u rc o u n t r yt h e r ea r ea b o v e5 0 a g r i c u l t u r a l w a s t e s ( a n n u a lp r o d u c e1 0 0b i l l i o nt ) f i r e d l o t so fs m o k ea n dg a sw e r e e x h a u s t e di n t ot h ea i r , w h i c hr e s u l t e di ns e r i o u se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n e v e ni n f l u e n c eo nt h en o r m a lf l i g h to ft h ep l a n e s t h ee n v i r o n m e n tt h a t h u m a nd e p e n do nh a sd e t e r i o r a t e dm o r ea n dm o r e h o wt oc h a n g et h e p l a n tc e l l u l o s em a t e r i a li n t oe n e r g ys o u r c e sa n do t h e ri n d u s t r i a lp r o d u c t s e f f e c t i v e l yh a sf a r r e a c h i n gs i g n i f i c a n c e t a k i n gt h en a t u r a lc e l l u l o s e m a t e d a l _ c o mc o ba sr a wm a t e r i a lt of e r m e n tl a c t i ca c i d i tc o u l d n t o n l yr e d u c et h em a n u f a c t u r a lc o s to fl a c t i ca c i db yl e a p sa n db o u n d sb u t a l s oc o u l da c h i e v et h ea i mo fr e c l a m a t i o no fw a s t e s f o rt h ep u r p o s eo f r e s o u r c ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o n ，t h i sa r t i c l ea d o p t e dr h i z o p u so r y z a e r - m 2 9 9a sz y m o g e na n dd i dt h er e s e a r c hh e r e i n a f t e ro nf e r m e n t i n gc o r n c o r ee n z y m a t i c h y d r o l y s i sl i q u i dt op r o d u c el - l a c t i ca c i d f i r s to fa 1 1 o r t h o n o r m a l i t ye x p e r i m e n tw a sa d o p t e dt oa c q u i r et h e o p t i m i z a t i o nc o n d i t i o no ff e r m e n t i n gc o r n c o r ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s l i q u i dt op r o d u c el l a c t i ca c i dt h ec o n d i t i o n so ff e r m e n t i n ga r ef e r m e n t t i m e ，f e r m e n tt e m p e r a t u r e ，t h eq u a t i t yo fc a c 0 3a d d e d ，l o a dc a p a c i t yo f l i q u i d ，c o n c e n t r a t i o no f ( n h 4 ) 2 5 0 4 ，c o n c e n t r a t i o n o fk h 2 p 0 4 ， c o n c e n t r a t i o no fm g s 0 4 。7 h 2 0a n dc o n c e n t r a t i o no fz n s 0 4 1 - 1 2 0 ，w h i c h w e r ec o n f o r m e di nd i f f e r e n tp r o p o r t i o n b e s i d e s ，o nt h i sb a s e ，t h ee f f e c t o fa d d i n gn e u t r a l i z a t i o nr e a g e n to nt h ec a p a c i t yo fp r o d u c i n ga c i dw a s r e s e a r c h e d d u et ot h e c o m p l e x i t y o fc o r nc o r e c o m p o n e n t ，t h e p r o d u c t i o nc a p a c i t yo fl a c t i ca c i dw a sa f f e c t e d ，h o w e v e r ，f r o mt h er e s u l t o fg l u c o s ec o n t r a s t i v ef e r m e n te x p e r i m e n t ，w ec o u l dc o n c l u d et h i s f e r m e n t t e c h n o l o g y a n du t i l i z a t i o no fr h i z o p u so r y z a er - m 2 9 9a s z y m o g e n a r ef e a s i b l e s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t ( s s f ) c o u l dn o to n l y i m p r o v e s t h ee f f i c i e n c yo fw h o l ep r o c e s s ，b u ta l s o c o u l ds i m p l i f y p r o d u c t i o nt e c h n o l o g y ，r e d u c ee q u i p m e n t i n v e s t m e n ta n dr a i s et h e u t i l i z a t i o nr a t i oo f r h i z o p u s t h e r e s e a r c ho fl a c t o b a c i l l u ss s f t e c h n o l o g yh a d b e e nr e p o r t e dm o r e t h er e a s o nm i g h tb et h a tt h ef e r m e n t t e m p e r a t u r ea n de n z y m a t i ch y d r o l y s i st e m p e r a t u r e i sc o n s i s t e n t h o w e v e r , t h et r o p h i cr e q u i r e m e n to fl a c t o b a c i l l u sw a sq u i t ec o m p l e x ，w h i c hw a s d i s a d v a n t a g et ou s ei nt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，t h i s a r t i c l e t o o ku pw i t ht h es s ft e c h n o l o g yr e s e a r c ho fr h i z o p u so r y z a e ，w h i c h w o u l db ean e wa n dp r o m i s i n gr e s e a r c ha p p r o a c ho fp l a n tf i b r es s f i n t h ee x p e r i m e n t ，w ec o n c l u d e dt h a tt h es s ft e c h n o l o g yt h a tw h e nt h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i sh a dc a r r i e do nf o r4h o u r sa d dr h i z o p u so r y z a eh a d b e t t e rc a p a c i t yo fp r o d u c i n ga c i dr e l a t i v et oo t h e ri n o c u l a b l em e t h o d ， w h i c ha c q u i r e dt h eo p t i m i z a t i o no fh a r m o n yb e t w e e nc e l l u l o s ee n z y m e a n dr h i z o p u so r y z a e t h ec o r nc o r et h r o u g ha c i dp r e t r e a t m e n tc o u l d m i n i f i e dt h er e s t r a i n to fx y l o s et og l u c o s ef e r m e n tr e l a t i v et oa l k a l i p r e t r e a t m e n ta n dc r u s h - p r e t r e a t m e n t ，w h i c ha c h i e v e dt h eh i g h e s tc a p a c i t y o fp r o d u c i n gl a c t i ca c i da n dw a st h em o s ta p p r o b a t o r yp r e t r e a t m e n t m e t h o d m o r eo v e r ，f r o mt h ec o n t r a s t ，w ef o u n ds s f ( c r u s h p r e t r e a t m e n t ； a d dc a c 0 3a sf e r m e n t i n gf o r9h o u r s ) d e v e l o p e d1 4 4 4 r e l a t i v et o s a c c h a r i f a c a t i o na n df e r m e n t a t i o nc a r d e do ns e v e r a l l yo nt h ep r o d u c t i o n r a t i o ，w h i c hc o u l ds h o wt h a ts s fc o u l de l i m i n a t et h ep r o d u c tr e s t r a i n t a n d d e v e l o pt h et r a n s f o r m a t i o nr a t i oo f c e l l u l o s e i m m o b i l i z e dt e c h n o l o g yi st h ee f f e c t i v em e t h o dt o p r o m o t e t h e b i o l o g i c a lc a t a l y s i su t i l i z a t i o nr a t i oa n db i o l o g i c a lt r e a t m e n tv e l o c i t ya s w e l la sr e a l i z et h eh i g h - e f f i c i e n c yc o n t i n u o u sp r o d u c t i o np r o c e s s i th a d m a n ya d v a n t a g e st o u s et h ei m m o b i l i z e dr h i z o p u so r y z a et of e r m e n t l a c t i ca c i d ，s u c ha sh i g ht h a l l id e n s i t y ，h i g ht r e a t m e n tv e l o c i t y ，g o o d s t a b i l i t y ，l o n gl i f ef o ru t i l i z a t i o n ，r e p e a t e du t i l i z a t i o ne t c t h em e t h o d so f s o d i u ma l g i n a t eg e le m b e d d i n ga n dc h i t o s a ns u r f a c ea d s o r p t i o nt of i x r h i z o p u so r y z a ew e r e s t u d i e di nt h ea r t i c l e ，a n du s ea c a ( s o d i u m a l g i n a t e c h i t o s a n s o d i u ma l g i n a t e ) p a r t i c u l a t et of i xr h i z o p u so r y z a ew a s a l s og r o p e dt e n t a t i v e l y t h i ss e g m e n tw a st h er e s e a r c he m p h a s i si nt h e a r t i c l e a st ot h ec a p a c i t yo fp r o d u c i n gl a c t i ca c i d ，t h eh i g hc a p a c i t yw a s p r e s e n t e di nt h em e t h o do fs o d i u ma l g i n a t eg e le m b e d d i n g ；a st ot h e s t a b i l i t yo fp r o d u c i n gl a c t i ca c i d ，t h em o s ts t e a d yo n ew a st h em e t h o do f c h i t o s a ns u r f a c ea d s o r p t i o n ；a st ot h eu t i l i z a t i o nl i f eo ft h ec a r r i e r s ，t h e l i f eo fc h i t o s a ng e lw a st h el o n g e s t h o w e v e r ，a c a p a r t i c u l a t ec o m b i n e d t h e i ra d v a n t a g e s ，t h e r e i nt h es o d i u ma l g i n a t em a i n t a i n e dt h ec a p a c i t yo f p r o d u c i n gl a c t i ca c i da n dt h ec h i t o s a no u t s i d et h es o d i u ma l g i n a t eg e l p r o l o n g e dt h el i f eo fa c ag e l t h e r e f o r e ，a c ap a r t i c i p a t ew a ss u g g e s t e d t ob et h ei d e a l e s tc a r r i e rt of i xr h i z o p u so r y z a ei nt h ea r t i c l ea n dw a s w o r t h yo fr e s e a r c h i n gf u r t h e ri nt h ef u t u r e t h ei n n o v a t i o no ft h i sa r t i c l ei st ou t i l i z et h ec h i t o s a ng e lt of i x r h i z o p u so r y z a e a n dd e d u c e dt h er e a c t i v em e c h a n i s mo fc h i t o s a n c o h e s i o nf o rt h ef i r s tt i m e ，w h i c hw e r ep r o v e db yt h ei n f r a r e ds p e c t r a l a n a l y s i sa n dn u c e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) s p e c t r a la n a l y s i s t h e c h i t o s a ng e lm a d eb yt h i sm e c h n i z mw a sp r o v e dt oh a v ee n o u g h t o u g h n e s s a st h ei m m o b i l i z e dc a r r i e ro f r h i z o p u so r y z a e i nt h e e x p e r i m e n t s h o w e v e r ，d u et o t h el i m i t a t i o no ft i m e ，t h er e a c t i v e m e c h a n i s mo fc h i t o s a nc o h e s i o nh a dn o tb e e ni m p l e m e n t e dt h ef u l l v e r i f i c a t i o n ，s oi ts t i l ln e e dt ob er e s e a r c h e di nt h ef u r t h e rs t e p f a nf e i ( e n v i r o n m e n te n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db ym e i h u az h o u k e yw o r d s ： r h i z o p u so r y z a e ，l a c t i c a c i d ，s s f ，i m m o b i l i t y ， c h i t o s a n ，a c ap a r t i c u l a t e 符号说明 e 一纤维素酶 g 一葡萄糖 c 一浓度 a - - 吸光度 v | 一滴定至终点所用e d t a 溶液毫升数 v 。一吸取发酵液的毫升数 w 一质量 r - m 2 9 9 - - 米根霉r h i z o p u so r y z a em 2 9 9 p d a 一土豆培养基 s s f 一同时糖化发酵工艺 e g u 一内切葡聚糖酶的单位 c p u m l - - 菌落数 a c a 一海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠 p u 一聚赖氨酸 a p a 一海藻酸钠一聚赖氨酸一海藻酸钠 n m r - - 核磁共振 p l a 一聚乳酸 l 棚a h 一乳酸 e m p 一葡萄糖酵解 1 a 一三羧酸 n r i g 一亚硝基胍 e d 一葡聚糖内切酶 c h b 一纤维二糖水解酶 g l d 葡萄糖酐酶 p v c 一聚氯乙烯 p p 一聚丙烯 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己明确注明和引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名类菲 日期：2 盹岁年j 二月2 - 0 日 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅本人授权东华大学可以 将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文 保密口。在年解密后适用本版权书 本学位论文属于 不保密口 学位论文作者签名； 笑莽 日期：2 秽年j 工月二。日 指导教师签名： 日期：年月日 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米根霉的探索 第一章绪论 乳酸是一种重要的有机酸。在食品、医药、化工等领域有着广泛的用途【l 】， 需求量也在逐年增加，尤其是l 乳酸，是一种可被人体完全代谢的安全的食品添 加剂，而最具应用潜力的是用它为原料生产聚乳酸( p l a ) ，制造生物可降解性 塑料以解决合成塑料造成的环境污染问题，其市场潜力巨大。传统的乳酸发酵多 是以富含淀粉质谷物或糖蜜为原料，从节约粮食以及提高农业生产副产品的利用 率等方面考虑，以天然纤维素类资源如竹竿、草杆、玉米桔、玉米芯、稻草、稻 壳、麸皮、甘蔗渣等发酵生产乳酸已日益受到人们的重视。纤维素类物质是自然 界中一种潜在的数量巨大的可再生资源，是地球上数量最丰富的多糖化合物，并 且极为廉价，这些对降低发酵生产的成本有着十分重要的意义。 1 1 乳酸的结构、性质及应用 1 1 1 乳酸的结构与性质 乳酸( l a c t i ca c i d ) 学名为a 一羟基丙酸( 2 一羟基丙酸) ，分子式为c 3 h 6 0 3 ， 分子量9 0 0 8 。乳酸是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和 微生物中。由于其分子内含有一个不对称的c 原子，所以具有光学异构现象， 从而具有d 型和【广型两种构型1 2 1 。其结构及结构式如下： 图i l 乳酸结构 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米根霉的探索 d f 0 一乳酸 i + j - 嚣酸 图卜- 2 乳酸结构式 l 乳酸为右旋，但l - 乳酸盐或酯却是左旋的：d 一乳酸是左旋的；当l ( + ) 一 乳酸和d ( 一) 一乳酸等比例混合时，即成为消旋的d l 乳酸。 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，熔点1 6 8o c ，沸点1 2 2 ( 2 k p a ) ，相 对密度1 2 4 9 1 3 1 。乳酸与水可以完全互溶，不易结晶出来。6 0 以上浓度的乳酸溶 液有很强的吸湿性。在6 7 1 3 3 p a ( 0 5 l m m l - i g ) 的真空条件下反复分馏，可以得到 纯品的乳酸结晶。 乳酸通常是乳酸( c 3 h 6 0 3 ) 和乳酰乳酸( c 6 h l 0 0 5 ) 的混和物，为无色透明 或浅黄色糖浆状的粘性液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸。与水、乙醇、乙 醚、丙二醇，甘油、丙酮混溶，它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯【引。 乳酸可分为工业级、食品级和药典级。工业级乳酸是含量5 0 母0 的乳酸溶液， 具吸湿性，煮沸浓缩时，乳酸缩合为乳酞乳酸和2 乳酰羟基丙酸，加热稀释又 转化为乳酸。食品级的乳酸含量为8 0 以上，药典级的乳酸含量为8 5 0 - - 0 0 0 1 2 i 。 在水溶液中，乳酸( 缩写h l a 或l a h ) 解离为质子h + 及乳酸根阴离子l a 。 平衡时的解离量与溶液p h 及乳酸的p k a 有关。当溶液p h 等于乳酸的p k a 时， 约有一半乳酸原料以解离形式存在；当p h 值大于p k a 时，大部分呈解离形式( 也 称为乳酸盐阴离子或乳酸盐形式) ；在另外一方面，当p h 小于p k a 时，将有大 量乳酸呈非解离态( 也称为酸的形式) 。乳酸原料的p k a 可变化。例如，在2 5 时，p i c a 为3 8 6 ，在5 1 2 时，p k a 约为3 8 9 。另外，当乳酸的浓度增加时，其p k a 将降低，反之将升高，但其范围一般在3 4 7 7 3 9 。 由于乳酸含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应。如氧化反应、 还原反应、缩合反应和酯化反应等【4 l 。 2 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米根霉的探索 1 1 2 乳酸的应用 乳酸，作为一种古老而重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、饲料、化工 等领域。由于乳酸的酸性柔和且稳定，有利于改善食品的风味，在食品工业上广 泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。可用于清亮饮料、糖果、糕点的生产，也可用 于鱼、肉、蔬菜的加工和包藏。与柠檬酸、苹果酸等食用酸相比，具有很强的竞 争力。在软饮料方面，乳酸在很大程度上取代了柠檬酸和磷酸等，在啤酒制造上， 美国禁止使用磷酸等有机酸调节p n ，而全部使用乳酸。世界上四分之一的乳酸 又来生产硬脂酰乳酯酸。乳酸，特别是l 一乳酸，对人和畜无害，而且有很强的 杀菌作用，其杀菌能力是柠檬酸、酒石酸、琥珀酸的几倍。因而，乳酸可以直接 用作手术室、病房、实验室、车间等场所的消毒剂。乳酸可添加于烟草中，能保 持烟草的湿度，提高烟草的质量。乳酸可用于制革工业中脱石灰，它能使石灰变 成可溶性的乳酸钙盐而除去，使皮革柔软、细密，从而制成高级皮革。乳酸还可 以用来处理纺织纤维，可使之易于着色，增加光泽，使之触感柔软。l 一乳酸， l 一乳酸钠和葡萄耱、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。l 乳酸铁、l 一乳酸钠、乳酸钙使补充金属元素的良好药品。由于人体只含有l - 乳 酸脱氢酶，d 一乳酸不能被人体吸收，而且过量食用对人体有毒。因此，世界卫生 组织提倡使用l 一乳酸作为食品添加剂和内服药品，取代目前普遍使用的d l 一 乳酸。l 一乳酸经过聚合可生成直链的或环状的聚乳酸。聚l 一乳酸是无毒的高 分子化合物，具有生物相容性，在人体内能被分解为l 一乳酸为人体代谢，不引 起变态反应，因此可用于生产缓释胶囊制剂，可使血液中药物浓度相对降低、提 高疗效，降低副作用，在治疗癌症方面取得可喜进展；也可生物降解纤维，用于 制成手术缝合线随伤口愈合而被人体吸收，不需拆线；也可制成生物植片，以修 复骨折或其它机体损伤；聚乳酸与其它材料共制成的生物降解塑料在自然条件下 缓慢分解，它不像p v c ( 聚氯乙烯) 、p p ( 聚丙烯) 塑料那样造成“白色污染”。 人们发现聚乳酸在空气、水和普通细菌存在条件下可完全分解成水和c 0 2 ，形成 良好的生态循环。聚乳酸具有良好的初期机械性能，熔点约为1 7 0 1 2 ，其模材对 氧、水气具有良好的透过性，又有良好的透明性，另外还有较好的抗菌、防霉性， 使用寿命可达2 3 年，已经成为良好的绿色材料【5 8 】。 乳酸在可生物降解塑料方面的应用，对于减少“白色污染”，实现可持续发 3 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米报霉的探索 展战略具有及其重要的意义，不久的将来数百吨级的塑料将被聚乳酸所取代例。 1 2 乳酸的生产方法 1 2 1 发酵法 发酵法制备乳酸传统上是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为原料，经微生物发 酵生产乳酸。常用于乳酸发酵的微生物有乳杆菌、根霉菌、链球菌，据文献报道 也有用嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌作为l 乳酸的生产菌种。 按乳酸细菌发酵糖类经由的过程和生成产物的不同，可将细菌的乳酸发酵分 为同型乳酸发酵( h o m o f e r m e n t a t i o n ) 、异型乳酸发酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o n ) 和混合 酸型乳酸发酵( m i x e da c i df e r m e n t a t i o n ) 1 2 1 们。 传统意义上的同型乳酸发酵或异型乳酸发酵是针对乳酸细菌而言的，米根 霉，作为一个好氧的真菌，靠呼吸产能并提供合成军体的中间体，就发酵产物而 言，其发酵类型属混合酸发酵，它经由e m p ( 葡萄糖酵解) 途径生成丙酮酸， 然后再进入t c a ( 三羧酸) 循环，副产物有机酸是乳酸的前提物质丙酮酸在一 些酶的作用下生成的。 1 2 ，2 化学合成法生产乳酸 由化学合成法生产乳酸u 可通过多种途径，乳腈法，即是乙醛与氢氰酸经碱 性催化作用生成乳腈，然后通过蒸馏回收纯化，并用硫酸水解为乳酸，粗乳酸用 甲醇酯化得到乳酸甲酯，径流候水解生成乳酸。还包括糖的碱性催化水解，丙烯 乙二醇氧化，乙醛、一氧化碳和水在高温高压下反应和乙二醇的硝酸氧化等反映 过程。 1 2 3 酶法生产乳酸 本崎等研究了2 一氯丙酸酶法转化生产乳酸，他分别从恶臭假单孢菌 p s e p u t i d a 和假单孢菌11 3 细胞中提取纯化出l - 2 - 卤代酸脱卤酶( 简称l 酶) 和 d l 一2 一卤代酸脱卤酶( 简称为d l 一酶) ，使之作用于底物d l 一2 一氯丙酸，即 4 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米根霉的探索 可制得l 一乳酸或d 乳酸】。 h u m m e l 等从d 乳酸脱氢酶活力最高得混乱乳杆菌( l a c e o n f u s u s ) d s m 2 0 1 9 菌体中得到d 乳酸脱氢酶，以无旋光性得丙酮酸为底物得到d 乳酸。 1 2 4 乳酸的生产方法的比较 化学合成法的缺点是产品为外消旋体混合酸，并且其原料是乙醛和剧毒物氢 氰酸，使得人们对其产品的安全性不放心，况且其成本也较高，因而化学合成法 生产乳酸的工艺大大受到了限制；酶法生产乳酸虽可以获得单一光学纯度乳酸， 但工艺比较复杂，难于工业化；微生物发酵法生产乳酸，可以通过菌种和培养条 件的选择而获得具有立体专一性d 乳酸、l 一乳酸或两种异构体以一定比例混合 的消旋体。另外发酵法生产乳酸能以葡萄糖、乳糖等为碳源，还能利用淀粉、纤 维素等为原料发酵生产乳酸，因此微生物发酵法生产乳酸因其原料来源广泛，生 产成本低，产品光学纯度高，安全性高等特点二成为乳酸重要的方法吩1 2 1o 一 1 3 国内外的乳酸研究进展 1 3 1 国内外研究概况 一、国际方面【8 1 3 i ： 1 7 8 0 年，席勒从酸乳中提炼制得乳酸。 1 8 7 5 年，巴斯德发现使乳变成酸的乳酸菌。 1 8 7 8 年，李斯特成功地分离出乳酸细菌，命名为乳杆菌，即今天的乳链球菌。 为纯种培养乳酸菌、进行工业化生产奠定了基础。 1 8 4 1 年，b o u t r o n 和f r e m y 采用自然发酵生产乳酸。 1 8 5 7 年，p a s t e u r 在研究乳酸发酵过程中发现了乳酸菌。 1 8 7 8 年，l i s t e r 则从腐败的牛乳中分离了乳酸菌，乳酸菌的获得使发酵工艺得到 了巨大的发展。 1 8 8 1 年，c h a r l e se a v e r y 公司采用纯种发酵工业化生产乳酸。 1 8 9 4 年，e i j k m a n 发现鲁氏毛霉产少量乳酸。 1 8 9 6 年，l e i e h m a n n 分离获得5 0 ( 2 下发酵的优良乳酸菌一德氏乳杆菌，由酒， 5 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米根霉的探索 麦芽汁生产乳酸。 1 9 11 年，斋藤采用华根霉生产d 哥l 酸。 1 9 1 7 年，赤木采用德氏乳杆菌以甘薯淀粉为原料进行工业化生产乳酸。 1 9 3 6 年，w a r d 分离获得优良l 乳酸产生菌米根霉，进行表面培养产l 乳酸。 1 9 8 2 年，千烟一郎等采用卡拉胶、海藻酸钠固定化粪链球菌、嗜热链球菌，l 乳酸生产能力为1 3 4 m g ( m l h ) ，l - 乳酸浓度为4 6 5 9 l 1 9 8 5 年，中山大树等采用嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌生产l 一乳酸，并采 用卡拉胶固定化凝结芽孢杆菌。 1 9 8 9 年，h a n g 等采用米根霉n r r l 3 9 5 以玉米为原料直接发酵生产l - 乳酸，产 酸3 5 4 9 k g 玉米。 1 9 8 9 年，k i tk o v i t s 等采用凝结芽孢杆菌d s m 5 1 6 9 菌株发酵，其中l 乳酸占 9 9 8 。 1 9 9 8 年，c h o u d h u r y 等研究了在3 种稀释剂中用三辛基胺提取乳酸的方法。 特别是近年来，国外在乳酸发酵方面的技术成果层出不穷，有许多都已经工业化 推广了。 二、国内方面【1 2p 3 一v 2 2 ： 1 9 4 4 年，重庆振元化学药品厂采用德氏乳杆菌发酵生产乳酸菌。 1 9 8 5 1 9 9 2 年，无锡第二制药厂、河北秦皇岛乳酸厂、沈阳乳酸厂、银川乳酸 钙厂等采用“双酶法”处理原料，大型发酵罐生产乳酸及乳酸钙。 1 9 9 1 年，蒋明珠等采用米根霉发酵l 乳酸小试。 1 9 9 1 年，曹本昌等采用米根霉发酵l 乳酸小试。 1 9 9 1 年，杨予培等采用米根霉发酵l 乳酸小试。 1 9 9 1 年，刘祖同等固定化米根霉e l 5 6 发酵生产l 乳酸。 1 9 9 2 年，曹本昌等分离筛选干酪乳杆菌鼠李糖亚种菌株进行l - * l 酸发酵。 1 9 9 4 年，杜连祥等分离筛选嗜热凝结芽孢杆菌。 1 9 9 5 年，上海工业微生物研究所协助上海崇明乳酸厂酯化法提取l 乳酸。 1 9 9 7 年，金其荣等分离选育出l 乳酸达9 9 6 米根霉突变株，适于米粉、玉米 粉等多种原料。 1 9 9 8 年，陈育如等对纤维素酶和米根霉同时糖化发酵纤维素为l 乳酸进行了研 6 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米根霉的探索 究，并建立了发酵过程的动力学。 1 9 9 8 年，李玉龙等人建立了描述固定化米根霉间歇发酵生产乳酸过程的双层反 应扩散理论模型。 1 9 9 8 年，罗郡等人根据乳酸发酵纤维素水解具有一致的最佳温度、p h 值及厌氧 要求的特点，研究了纤维素的同时糖化和乳酸发酵( s s l f ) 过程，建立了相应的动 力学模型。 2 0 0 1 年，马其荣等人对米根霉c 3 9 5 生产l 乳酸的发酵工艺进行了研究，确定了 玉米淀粉发酵的最佳培养基。 2 0 0 2 年，白冬梅等人研究了以d 一淀粉酶为主的多种酶配合作用对玉米生粉乳 酸发酵的影响。 2 0 0 2 年，刘伟等人采用细菌进行l 乳酸发酵生产。研究了不同发酵条件下合适 的碳源浓度、氮源浓度、接种量。 2 0 0 4 年，李兴江等对米根霉深层发酵甘薯淀粉制各l 乳酸工艺进行了研究。 1 3 2 根霉发酵生产乳酸的研究进展 一、研究现状田1 1 9 8 9 年，h a n g 等阴i 对米根霉发酵产l 乳酸进行了研究，每公斤粗淀粉原料 可生产3 5 0 克的l 乳酸；1 9 9 4 年s u n t o m s u k 等通过紫外诱变处理和n t g ( 亚硝 基胍) 诱变处理，得到乳酸积累浓度达8 9 s g l ，比原始菌株提高了近6 0 ；我 国的曹本昌等人于1 9 9 1 年选育出一株优良菌株，对该菌株的性能及产酸条件进 行了研究，在5 0 0 l 发酵罐进行扩大实验，当葡萄糖浓度为1 0 时产酸7 0 9 l 以 上，该菌株以玉米粉作培养基，当玉米粉浓度为1 2 时产酸7 0 l 以上，其中l 一乳酸纯度最高达9 9 ；蒋明珠等1 1 9 9 1 年筛选出一株高产稳定菌株，在摇瓶 培养条件下，初始葡萄糖浓度为1 5 0 9 l ，3 5 ( 2 培养4 8 h 产l 乳酸达1 1 8 4 9 l ，对 糖转化率达7 8 9 ；杨虹等1 9 9 4 年利用淀粉一酸性培养基富集培养，并结合商 锰酸钾一溴化钾平板法从土壤中筛选出了产酸为8 1 9 l 的菌株，以其为出发菌株 进行诱变，从琥珀酸平板上获得菌株产乳酸达1 0 3 9 l ，对糖转化率为6 8 9 ；杨 子培等人1 9 9 5 年使用米根霉t l 5 2 7 9 菌株以玉米淀粉深层发酵生产l 乳酸，在 3 立方米的发酵罐中，当玉米淀粉为1 3 0 9 l 时，产酸9 4 1 9 l ，对糖转化率为 玉米芯发酵乳酸条件优化与固定化米根霉的探索 7 9 5 5 。发酵液经分离、提取和精致，l 乳酸纯度达9 8 以上，并且发酵过程 实现了很高的稳定性。2 0