（环境工程专业论文）膜曝气生物膜反应器单级自养脱氮研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 由于氮素化合物能够造成水体的富营养化，污水脱氮成为目前水处理领域的重要问 题。然而传统生物脱氮工艺普遍存在工艺流程长，占地面积大，运行成本高等缺点。最近， 一种极具应用前景的新型单级自养脱氮技术被开发出来。该工艺在单一反应器内组合短程 硝化和厌氧氨氧化反应，与传统生物脱氮工艺相比大大降低了运行成本。 本实验实验以包裹无纺布的多微孔炭管作为生物膜载体和供氧装置的膜曝气生物膜 反应器运行基于短程硝化厌氧氨氧化的单级自养脱氮工艺。启动反应器采用先培养驯化 好氧氨氧化污泥，随后再次接种成熟厌氧氨氧化污泥的方式。首先接种普通硝化污泥启动 反应器，通过对膜内腔压力的适当控制逐步降低反应器溶解氧浓度，实现亚硝酸盐的积累。 然后再次接种取自升流式无纺布固定床反应器富集培养的厌氧氨氧化污泥，使无纺布上形 成好氧氨氧化菌与厌氧氨氧化菌稳定共存的膜曝气生物膜，从而实现单级自养生物脱氮。 研究取得的主要结果如下： ( 1 ) 采用升流式无纺布固定床生物膜反应器可以对a n a 仆t o x 菌接种物进行有效的 富集培养。经过1 0 1d 的连续富集培养，反应器内污泥浓度由起始的4 7 0m gl d 培养至 3 1 1 8 4n a gl 1 。在稳定运行阶段，反应器平均进水t n 负荷分别为8 1 8 3m gl - 1 ，在进水 n i - - 1 4 + - n 浓度为2 0 0 2 5 0m gl - 1 时，t n 去除率达到最大值6 3 8 。对培养的厌氧氨氧化 污泥进行扫描电镜观察显示，污泥中大部分为球状细菌，并且聚集成类似花椰菜状的聚集 体。 ( 2 ) 利用p c r 、克隆、荧光原位杂交和实时荧光p c r 等微生物分子生态学实验技术 对实验室富集培养的a n a m m o x 污泥中主要的功能性菌群进行研究。克隆结果显示，富 集培养的a n a m m o x 污泥中含有两类细菌，其中一种的1 6 sr d n a 基因序列与已经报道 的a n a m m o x 细菌k s u - 1 ( g e n b a n ki d ：a b 0 5 7 4 5 3 1 ) 的基因序列十分相似，相似性 9 8 ；另一种的1 6 sr d n a 序列与已经报道的a n a m m o x 细菌u n c u l t u r e dp l a n c t o m y c e t e s b a c t e r i u mg e n ef o r1 6 sr r n a ( g e n b a n ki d ：a b l 7 6 6 9 6 1 ) 的基因序列最相近，相似性达到1 0 0 。用特异性探针p l a 4 6 对a n a m m o x 污泥进行荧光原位杂交分析，结果显示， p l a n c t o m y c e t e s 类a n a m m o x 细菌是实验室培养的a n a m m o x 污泥中的主要功能性细 菌。实时荧光定量p e r 结果表明，1m 样品d n a 模板中含有6 3 2 1 0 4 个真细菌的基因 拷贝，含有1 5 8 x l o 个p l a n c t o m y c e t e s 细菌的基因拷贝，p l a n c t o m y c e t e s 细菌占全部细菌 的4 5o o - 6 0 。 ( 3 ) 实验中，采用包裹无纺布的多微孔炭管为膜组件的m a b r 成功的运行了基于短程 硝化厌氧氨氧化的单级自养脱氮工艺。在t n 容积负荷为9 6 0m gl 1 d 1 ，h r t 为6h ， 曝气膜内腔压力为0 0 1 5m p a ，反应器温度3 5 ，p h 值为7 8 的条件下，容积总氮去除 率可以达到0 7 6 6k g nm 4d 1 。 膜曝气生物膜反应器单级自养脱氮研究 “) 膜曝气生物膜的批式实验结果显示，好氧氨氧化反应主要发生在靠近曝气膜壁侧 的生物膜内，厌氧氨氧化反应主要发生在靠近水体侧的生物膜内。 ( 5 ) 用特异性探针e u b 3 3 8p l u s ，n s 0 1 9 0 ，a m x 8 2 0 和p l a 4 6 对膜曝气生物膜进行 荧光原位杂交，结果显示，膜曝气生物膜内存在明显的分层现象，生物膜内结合探针 n s 0 1 9 0 的好氧氨氧化菌主要分布在生物膜内靠近曝气膜生物膜交界面的好氧区域，而 结合探针a m x 8 2 0 和p l a 4 6 的a n a m m o n 菌则主要分布在生物膜内靠近水体侧的缺氧 或厌氧区域。这种以好氧氨氧化菌为主体的好氧层和以a n a m m o x 菌为主体的厌氧层共 同存在的生物膜分层结构，使两个微生物群落间在合作共生、代谢平衡，从而实现单级自 养生物脱氮。 ( 6 ) 利用特异性引物的巢式p c r ( n e s t e d - p c r ) 和d c _ _ k 3 e 对不同运行阶段的膜曝气生 物膜上的氨氧化菌群结构进行研究。结果表明，氨氧化菌群的d g g e 条带在不同时期形 状不同，揭示氨氧化菌群结构随着反应器溶解氧浓度的逐渐降低而发生变化。在稳定运行 单级自养脱氮工艺的m a b r 系统中，膜曝气生物膜内氨氧化菌群的种类不是很丰富，第 1 0 1d 的生物膜样品的d g g e 共含有三个明显的条带。切胶后测序显示，三个条带所代表 的细菌和己报道的n i t r o s o m o n a s 菌属的基因序列具有极高的相似性( 9 9 ) ；另一方面， 巢式p c r ( n e s t e d - p c r ) 和d g g e 对不同运行阶段的膜曝气生物膜上的a n a m m o x 菌 群结构进行研究显示，氨氧化菌群的d g g e 条带在不同时期形状相似，揭示a n a m m o x 菌群结构随反应器运行变化不大。在第1 0 1d 的生物膜样品的d g g e 共含有两个明显的 条带，它们所代表的细菌和已报道的p l a n c t o m y c e t e s 状菌的基因序列具有极高的相似性( 9 7 1 。 关键词：厌氧氨氧化；自养脱氯；短程硝化；膜曝气生物膜反应器；炭管膜 n 大连理工大学博士学位论文 a b s t r a c t r e m o v i n gn i t r o g e nc o m p o n e n t sf r o mw a s t o w a t c ri sa ni m p o r t a n ti s s u en o w a d a y ss i n c e t h & a ec o m p o n e n t sc a l l 鲫s ee u t r o p h i c a t i o ni nr e c e i v m gw a t c r h o w e v e fc o n v e n t i o n a l h i o i o 舀a ln i t r o g e nr e m o v a lp r o c e s s e se x i ts o m ep r o b l e m ss u c ha ss y s t e mc o m p l e x ，l a r g e f o o t p r i n t , h i g ho p e r a t i n gc o s t s ，a n do c t r e c e n t l y , an o v e la n dp r o m i s i n gm i c r o b i a lp r o c e s s c o m b i n i n gt h ea i l a m m o xr e a c t i o nw i t hp a r t i a ln i t r i f i c a f i o ni no n er e a c t o r , e n t i t l e ds i n g l e s t a g e a u t o t r o p h i cn i t r o g e nr e m o v a lh a sb e e nd e v e l o p e d t 1 l i sp r o c e s sw o u l dl c a dt oa ni m p o r t a n t r e d u c t i o no f o p e r a t i o n a lc o s t sc o m p a r e dt oe n v e n t i o n a ln i t r i f i c a t i o n - d e n i t r i f i c a t i o np r o c e s s e s i nt h i ss t u d y , an o v e lm e m b r a n e - a e r a t e db i o f i l mr e a c t o r ( m a b r ) e q u i p p e dw i t l ln o n - w o v e n m a t e d a l ss u p p o r ta r o u n dt h em i c r o p o r o u sc l r b o ut u b em e m b r a n e , w a sd e v e l o p e df o r s i n g l e s t a g ea u t o t r o p h i cn i t r o g e nr e m o v a lb a s e do np a r t i a l n i t r i f i c a t i o na n da n a e r o b i c a m m o n i ao x i d a t i o n ( a n a m m o x ) t h em a b rw a ss t a r t - u pv i as e q u e n t i a la d d i t i o no ft w o t y p e so fs e e d i n gs l u d g e ：a e r o b i cn i t r i 研n ga n da n a m m o xs l u d g e i n i t i a l l y , t h er e a c t o rw a s i n o c u l a t e dw i t hn i t r i f y i n gb i o m a s s b yd e c r e a s i n gt h ea i rp r e s s u r ei nt h el u m e no f c a r b o nt u b e s t e pb ys t e p o n ec 趾o b t a i ns t a b l en i 仃i t ca c c u m u l a t i o n s u b s e q u e n t l y , t h er e a c t o rw a s r e i n o c u l a t e dw i t ha n a l l l n l o xb i o m a s se n r i c h e db yau p f l o wc o l u m nr e a c t o rp a c k e dw i t h n o n w o v e nf a b r i c sc a r r i e r , t oc o n s t r u c taq u i t es t a b l eb i o f i l ms y s t e mf o rs i n g l e s t a g e a n t o t r o p h i cn i t r o g e nr e m o v a l t i l i ss t u d yw a sp e r f o r m o da sf o b o w s ： ( 1 ) t h eu p f l o wc o l u m nr e a c t o rp a c k e dw i t hn o n w o v e nf a b r i c sc a r r i e rw a su s e df o r e n r i c h m e n to f i n c u b a t e da n a m m o x s l u d g e a f i e l 1 0 1do p e r a t i o n , t h ea n a m m o xs l u d g e c o n c e n t r a t i o n si nr e a c t o rw a se n h a n c e df o f i n4 7 0m g 1t o3 1 1 8 4m gl 1 i nt h es t a b l es t a g e o fo p e r a t i o n ，t h ea v e r a g et nv o l u m e t r i cl o a d i n gr a t ew a s8 1 8 3m gl - 1 ，t h em a x i m u mt n r e m o v r a le f f i c i e n c yw a s6 3 8 w i t ht h ei n f l u e n tn i - h + nc o n c e n t r a t i o no f2 0 0 2 5 0m gl 1 1 l em o r p h o l o g yo ft h ec u l t i v a t e da n a m m o x s l u d g ew a so b s e r v e du s i n gs c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o c o p e n l ep h o t o g r a p h ss h o w e dt h a tt h et y p i a lc a u l i f l o w e r - l i k ea g g r e g a t e sc o n s i s t e do f m o s t l ys p h e r i c a li ns h a p ei nt h eo b t a i n e dc u l t u r e ( 2 ) 1 km o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n i q u e sp c c l o n e 。f i s ha n dr e a l - t i m ep c rw e r eu t i l i z e d t os t u d yp r i n i m i l a r i l yt h em i c r o o r g a n i s mi nt h eu p f l o wc o l u m nr e a c t o r 1 1 1 ep l a n c t o m y c e t a l e s e l o n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ea r et w ok i n d so fb a c t e r i ai nt h ec u l t u r e ：o n eh a d 9 8 s i m i l a rw i t ht h ek s u 1s e q u e n c e ( g e n b a n ki d ：a b 0 5 7 4 5 3 1 ) t h eo t h e rh a d1 0 0 s i m i l a r w i t ht h eu n c u l t u r e dp l a n c t o m y c e t e sb a c t e r i u mg e n ef o r1 6 sr r n a ( g e n b a n ki d ： a b l 7 6 6 9 6 n f l u o r e s c e n ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) a n a l y s i su s i n g1 6 sr i t n at a r g e t i n g o l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sp l a 4 6s h o w e dt h a tt h ed o m i n a n tp o p u l a t i o nd e v e l o p e di nt h eu p f l o w c o l u m nr e a c t o rw a sh y b r i d i z e dw i t hp l a 4 6g e n ep r o b e s i tm e a n st h a tt h ec u l t i v a t e db i o m a s s i nt h er e a c t o rw a se l a s s i f l e di nt h eg r o u po fp l a n c t o m y c e t a l e sb a c t e r i a t h er e s u l t so f r e a l - t i m ep c rs h o w e dt h a tt h e r ea r e6 3 2 x 1 0 b a c t e r i a1 6 sr i ) n ag e n ec o p ya n d1 5 8 x 1 0 4 p l a n c t o m y c e t a l e sb a c t e r i a1 6 sr d i n ag e n ec o p yi nt h el 山c u l t u r e ，i kp l a n c t o m y c e t a l e s 膜曝气生物膜反应器单级自养脱氮研究 b a c t e r i ao c c u p i e d4 5 - 6 0 o f t h eb a c t e r at o t a im n o u n t ( 3 ) t h eo p e r a t i o no ft h em a b rf o rs i n g l e s t a g ea u t o t r o p h i cn i t r o g e nr e m o v a lw a s s u c c e s s f u ld u r i n gt h et e s t e dp e r i o d d u r i n gt h et e s tp e f i o d ，t h em a x i m a ln i t r o g e nr e m o v a lw a s 0 7 6 6k gnr n - 3d 1w i t hav o l u m e t r i cl o a d i n go fo 9 6k gn m - 3d - 1 ，i n t r a - m e m b r a n ea i r p r e s s u r eo f 0 0 1 5m 田乱r e a c t o rt e m p e r a m r eo f 3 5 a n dp h o f 7 8 ( 4 ) b a s e do nt h e s ea e r o b i ca n da n a e r o b i ca c t i v i t ym e a s u r e m e n t s i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h e p a r t i a ln i t r i f i c a t i o no c c u r r e di nt h er e g i o n sn e a rt h em e m b r a n e - b i o f i l mi n t e r f a c e , a n dt h e a 丑a n h n o xo c c u r r e di nt h er e g i o n sl l e a rt h eb i o f i l m - l i q u i di n t e r f a c e ( 5 ) f l u o r e s c e n ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) a n a l y s i su s i n g1 6 sr r n at a r g e t i n g o l i g o n u c l c o t i d ep r o b e se u b 3 3 8p l u s n s 0 1 9 0 a m x 8 2 0a n dp l a 4 6s h o w e dt h a tt h e e x i s t e n c eo f t w ov i s i b l ea c t i v el a y e r si ne x p e r i m e n t a l 队b o n ei st h ep a r t i a ln i u i f y i n gl a y e r l o c a t e di n t h er e g i o no fo x y g e n - r i c hm e m b r a n e - b i o f i l mi n t e r f a c e , d o m i n a t e db y n s 0 1 9 0 - p o s i t i v ea o b 1 1 l eo t h e ri st h ea n a m m o x a c t i v el a y e rl o c a t e di nt h er e g i o no f a n o x i c l i q u i d - b i o f i l mi n t e r f a c e ，d o m i n a t e db y p l a 4 6a n d a m x 8 2 0 - p o s i t i v e a n a m m o x m i c r o o r g a n i s m s a sar e s u l to ft h i ss t u d y , t h ea o ba sw e l la sa n a m m o xb a c t e r i aw e r e p r e s e n ta n da c t i v ei ne x p e r i m e n t a lm a b r a n dt h ec o o p e r a t i o nb e t w e e na o b a n da n a m m o x b a c t e r i aw a sc o n s i d e r e dt ob er e s p o n s i b l ef o rs i n g l e - s t a g ea u t o t r o p h i cn i t r o g e nr e m o v a l ( 6 ) t h en e s t e dp c r d g g ew a sp e r f o r m e dt oc o m p a r e1 6 sf d n af r a g m e n tp r o f i l e so f a o b c o m m u n i t yc o m p o s i t i o no fm e m b r a n e - a e r a t e db i o f i l mi nd i f f e r e n to p e r a t i o ns t a g e t h e d n ab a n dp r o f i l e so fa o bv a r i e da td i f f e r e n ts a m p l i n gt i m e s ，s u g g e s t i n gt h a tas t e pb ys t e p d e c r e a s eo fo x y g e nc o n c e n t r a t i o nb yr e g u l a t i o n so fp r e s s 唧ei nt h el s m e l lo ft h em a b r c a u s e dac h a n g ei nt h ea o b c o m m u n i t yc o m p o s i t i o no ft h ei n o c u l a t e ds l u d g e t h ed o m i n a n t a o bc o m m u n i t yw a sn o tv e r yc o m p l i c a t e da tt h es t e a d ya u t o t r o p h i cn i t r o g e nr e m o v a ls t a g e o f m a b r s a m p l eo f d a y 11 0s h o w e dt h r e es t r o n g l ys t a i n e db a n d s ( a ，ba n dc ) w h i c hw e r e c x c i s e df r o mg e l sa n da m p l i f i c db yp c a n dt h en u c l e o t i d es e q u e n c e sw c l - ed e t e r m i n e d 1 1 l e o b t a i n a b l em a j o rb a n d so f a o bc o m m u n i t ys h o w e dh i g hs i m i l a r i t yf 9 9 s i m i l a r i t y ) t ot h e g e n u sn i l r o s o m o n a sa f f i l i a t e dw i t ht h eb e t as u b c l a s so f t h ec l a s sp r o t e o b a c t e r i a o nt h eo t h e r h a n d n e s t e dp c r - d g g ew a sa l s op e r f o r m e dt oc o m p 盯e1 6 sr d n af r a g m e n tp r o f i l e so f a n a n - r i l o xc o m m u n i t yc o m p o s i t i o no f r e i n o c u l a t e ds l u d g ea n dm a b rs y s t e ma td a y s6 5a n d 11 0 d e s p i t et h ed i f f e r e n c e si ns a m p l i n gt i m e s s a m p l e sf r o md a y6 0a n d1 1 0o fm a b r r e v e a l e ds i m i l a rd g g ep r o f i l e s ，s u g g e s t i n gs i m i l a rc o m m u n i t yc o m p o s i t i o na tt h e s es t a g e so f s y s t e mp e r f o r m a n c e s a m p l eo f d a y11 0s h o w e dt w os t r o n g l ys t a i n e db a n d s a n de ) w h i c h w e r em o s ts i m i l a rf 9 7 s i m i l a r i t y ) t ot h eu n c u l t u r e dp l a n c t o m y c e t eb a c t e r i u ma f f i l i a t e d w i t ht h ed e e p - b r a n c h i n gc l a s sp l a n c t o m y e e t e s k e yw o r d s ：a n a m m o x ：a u t o t r o p h i e m e m b r a n e - a e r a t e db i o f i l mr e a c t o r ( m a b r ) ； n i t t o g e nr e m o v a l ；p a r t i a l n i t r i f i c a t i o n ； c a r b o nt u b em e m b r a n e i v 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：幺丝日期：丝z 2 ：1 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名；主：蕉作者签名；差，丝 导师签名：圭羔! 至鲨 导师签名：蜢l 手葛坠一 2 通年王月三日 大连理工大学博士学位论文 引言 随着工农业生产的发展和人民生活水平的提高，含氮有机物的排放量迅猛增加，水 体质量急剧恶化，对环境乃至生态系统造成巨大危害。大量氨氮废水排入水体不仅引起 水体富营养化、造成水体黑臭，而且将增加给水处理的难度和成本，甚至对人群及生物 产生毒害作用。我国氮素污染所致的水体富营养化更是触目惊心，湖泊“水华”及近海 “赤潮”时有发生，越演越烈。水体富营养化已危害农业、渔业、旅游业等诸多行业， 并对饮水卫生和食品安全构成巨大威胁。 氮素污染日益加剧，排放标准日趋严格；而高浓度氨氮废水的生化处理有高需氧量、 高生物量等需求，更是氮素污染控制的瓶颈问题。高浓度氨氮废水来源广且排放量大， 化肥、焦化、石化、制药、食品、垃圾填埋场等均产生大量高浓度氨氮废水，该种废水 对环境危害大，且难于处理，已引起国内外业内人士的高度重视。采用传统生物脱氮工 艺处理高浓度氨氮废水普遍存在占地大、能耗高、外加大量有机碳源以及脱氮效率低等 不足，新型的高效、低耗脱氮技术成为水污染控制领域的研究热点。 近十多年来，许多国家加强了对生物脱氮的研究，并在理论和技术上都取得了重大 突破。2 0 世纪8 0 年代末一种全新的生物反应厌氧氨氧化( a n a e r o b i ca m m o n i ao x i d a t i o n , a n a m m o x ) 的发现，为单级自养生物脱氮工艺的开发提供了依据。c a n o n ( c o m p l e t e l y a u t o l r o p h i cn i t r o g e nr e m o v a lo v e rn i t r i t e - c a n o n ) 、o l a n d ( o x y g e n - l i m i t e da u t o t r o p h i c n i t r i f i c a t i o n - d e n i t r i f i c a t i o n o l a n d ) 以及s n a p ( s i n g l e - s t a g en i t r o g e nr e m o v a lu s i n g r l l 雒- m l n o xa n d p a r t i a l n i t r i t a t i o n , s n a p ) 等单级自养脱氮工艺，均是通过条件控制，使好 氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌在一个生境中共存，于同一个反应器中进行短程硝化和厌氧 氨氧化，实现全程自养生物脱氮。这些单级自养生物脱氮技术具有占地少、耗能低、剩 余污泥产量少等优势，被国内外评价为可持续的生物脱氮技术。其不仅弥补了传统硝化 反硝化工艺的缺陷，提高了废水脱氮效率，降低了废水脱氮成本，也填补了高浓度含 氮废水没有直接脱氮技术的空白，必将成为未来脱氮技术的主流。在我国氮素污染的治 理过程中，借鉴和应用这些科技成果，无疑具有重要的现实意义。但目前运行的单级自 养脱氮技术的反应器普遍存在负荷低、稳定性差的问题，限制了该技术的实际工程应用。 基于单级自养脱氮技术工业化应用发展需求，本研究采用膜曝气生物反应器，以实 验室高氨氮模拟废水作为处理对象，运行基于短程硝化一厌氧氨氧化途径的单级自养脱 氮，通过膜内压力和温度的适当控制，在透气膜表面形成以好氧氨氧化菌为主体的好氧 层与以厌氧氨氧化菌为主体的厌氧层同时存在的生物膜分层结构，实现微生物群落间的 协同共生。并利用膜曝气生物反应器无泡曝气氧传质效率高和透气膜比表面积大的特点 强化反应器生物持留能力，实现自养脱氮工艺的高效、低耗及长期稳定运行，为自养脱 氮这一世界前沿脱氮技术的实现建设新工艺和新方法。 膜曝气生物膜反应器单级自养脱氮研究 1 废水生物脱氮技术及膜曝气生物膜反应器研究进展 1 1 生物脱氮过程中的微生物学原理 生物脱氮过程主要包括氨化、硝化、反硝化和厌氧氨氧化作用四部分【l 】。氨化作用 就是指含氮有机物转化为氨基酸，只有进入内脱氨基产生氨的过程。其中硝化作用又分 为两个阶段，n i - h + 氧化成n 0 2 。阶段和n 0 2 进一步氧化成n 0 3 阶段。反硝化作用主要是 在厌氧条件下，n 0 3 - 通过n 0 2 。还原为氮气的过程。厌氧氨氧化作用是指，在厌氧条件下， 微生物直接以n h 4 + 为电子供体，以n 0 3 或n 0 2 。为电子受体，将n h 4 + 、n 0 3 或n 0 2 转变 成n 2 的生物氧化过程。生物脱氮过程是个微生物作用的过程f 2 3 1 ，具体生物脱氮过程中 各项生化反应特性见表1 1 。 1 1 1 氨化作用 通过微生物胞外蛋白酶的水界作用使含氮有机物转化为氨基酸之后进入体内脱氨 基产生氨的过程成为氨化作用( a m m o n i f i c a t i o n ) 【4 】。此过程可在好氧或厌氧条件下进行。 好氧条件下参与脱氨基的微生物主要有枯草哑炮杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌等，厌 氧条件下的微生物主要腐败梭菌、兼性大肠杆菌、酵母菌、变形杆菌。 1 1 2 硝化作用 化能无机自养菌将氨氧化为硝酸盐的过程成为硝化作用( n i t r i f i c a t i o n ) 。早在1 8 7 7 年，施来兴等【5 】就通过实验证明了这一生物学过程的存在。1 8 9 0 年维诺格拉斯基利用含 铵盐的无机硅胶培养基首次对硝化细菌进行了研究，证明硝化过程包括两个连续而又独 立的阶段：氨氧化为亚硝酸盐的过程、亚硝酸盐氧化为硝酸盐的过程，参与这两个过程 的微生物同属于硝化杆菌亚群。 ( 1 ) 氨氧化为亚硝酸的过程 氨氧化细菌首先在氨单加氧酶( a m o ) 的作用下将氨氮氧化为n h 2 0 h 和和h 2 0 ， 此过程中的2 个外源电子来自于后续的羟胺氧化，通过c y t e 和c o q 由h a o 传递给 a m o ，n h 2 0 h 氧化为n 0 2 。是由羟胺氧化还原酶( h a o ) 进行的【6 】。a m o 是一种膜整 合蛋白，而h a o 存在于周质中。参与此过程的微生物特性见表1 4 ，反应方程式为： n h 3 + 0 2 + 2 旷+ 2 e _ n h 2 0 h + h 2 0 ( 1 1 ) n h 2 0 h + h 2 0 一n 0 2 + 5 h + + 4 e ( 1 2 ) ( 2 ) 亚硝酸氧化为硝酸的过程 亚硝酸氧化菌将n 0 2 。氧化成n 0 3 ，产生a t p 和n a d h ，并通过卡尔文循环固定 c 0 2 。原子示踪实验证明在亚硝酸盐好氧氧化过程中，产物硝酸盐中的氧原子来自于水。 亚硝酸氧化酶( n o r ) 位于细胞的呼吸颗粒上，与膜紧密结合，因为能量的需要，参与 2 大连理工大学博士学位论文 此过程的细胞色素不是c 型而是a 型，整个体系成为“亚硝酸氧化酶”，整个反应至今未 检出任何中间产物，是一步完成的。 以上介绍的利用无机物的化能自养代谢过程，各反应的还原电势都比较高： e ( n 0 2 ，n h i + 户3 4 0m v ，e ( n 0 3 n 0 2 。) = 4 3 0m v ，因此欲使无机基质的氧化和n a d 的还原相耦联，必须提供一定的能量，而细菌的氧化磷酸化效率很低，n a d 还原过程 产生1 分子n a d h 絮消耗3 分子a t p ，然而实际情况是氧化1 分子亚硝酸盐只产生1 分子a t p ，因此为了获得合成细胞所需的还原力，必须消耗大量a t p ，这就是硝化细菌 生长慢、世代周期长、细胞产率低的原因 7 1 。 1 1 3 反硝化作用 生物反硝化过程( d c n i t r i f i c a t i o n ) 是指将硝酸盐0 q 0 3 3 和亚硝酸盐( n 0 2 3 还原成氮气 ( n 2 ) 的生物反应过程【扪，能够进行反硝化作用的细菌称为反硝化细菌( d e n i t r i f y i n g b a c t e r i a ) 。从微生物学的角度看，反硝化反应是反硝化细菌的厌氧代谢过程，n 0 3 是电 子受体，n 2 是代谢产物，同时还需要有机物作为电子供体。反硝化反应实质上是一个 n 0 3 或n 0 2 的生物还原过程，即是通常所说的生物脱氮【9 】。 典型反硝化细菌为芽孢杆菌属、生丝微菌属、假单胞菌属、莫拉氏菌属、螺菌属和 硫杆菌数的一些种，其中的酶系主要为硝酸还原酶( n a r ) 、亚硝酸还原酶( n i r ) 、氧 化氮还原酶( n o r ) 、氧化亚氮还原酶( n 2 0 r ) 。 1 1 4 厌氧氨氧化作用 厌氧氨氧化是指在厌氧条件下，微生物直接以n h 4 + 为电子供体，以n 0 3 或n 0 2 - 为电子受体，将n h 4 + 、n 0 2 。或n 0 2 。转变成n 2 的生物氧化过程。 通常认为氨的氧化只能在有氧的条件下进行，但是理论上氨也能作为反硝化的无机 电子供体。b r o d a e l 0 】在1 9 7 7 年根据反应的自由能计算，发表了一篇题为“自然界中遗失 的两种矿质营养菌”的论文，预言自然界中存在2 种尚未发现的矿质营养菌，其中之一 为以氧或硝酸根或二氧化碳为电子受体，把氨氧化为氮气的自养菌。但直到2 0 世纪9 0 年代中期，荷兰的m u l d e r 研究小组才从一个硝化系统的中试反应器中发现了该现象】。 在该系统中，一类高度富集的罕见的自养微生物占主导地位，它们可以利用氨作为电子 供体直接进行亚硝酸盐的反硝化作用，这个过程被定义为厌氧氨氧化( a n a e r o b i c a m m o n i u mo x i d a t i o n , a n a m m o x ) 。 这一发现意味着，如果把a n a m m o x 反应与一个亚硝酸盐型硝化过程结合在一起， 那么在没有其他有机或无机电子供体的条件下，厌氧氨氧化菌可以利用硝化过程中产生 的n 0 2 将剩余的n h 4 + 氧化而产生n 2 m 。因此，该反应对于无机含氨氮废水或有机电子 供体严重不足的废水具有非常大的意义，而且与传统的硝化反硝化工艺相比可以节省大 量的供氧能耗【1 3 1 。自那以后，许多研究者对此产生了极大兴趣，大大加速了该生化过程 3 膜曝气生物膜反应器单级自养脱氮研究 在环境工程中的应用研究【1 4 - 2 2 。 通过n ”示踪研究表明【2 3 1 ，在氨被微生物氧化的过程中，羟氨最有可能作为电子受 体，羟氨本身又可能由亚硝酸盐分解而来。批式实验显示，当有过量的羟氨和氨存在时， 可以观察到联氨的短暂积累( 如图1 1 ) 。联氨转化为氮气被认为是亚硝酸盐还原为羟氨 所需电子的必要条件。而该过程存在两种可能的反应机理 2 4 , 2 5 】：在细胞质内，一个由膜 包裹的复杂酶把氨和羟氨转化为联胺，联胺则在细胞质内氧化为氮气。其一：在细胞质 内负责联胺氧化的同一种酶上的不同位点，利用内部联胺氧化为氮气时的电子。其二： 联胺在细胞质内转化为氮气，它产生的电子通过电子传递给细胞质内的亚硝酸还原酶 ( 如图1 2 ) 。亚硝酸盐则被还原为联胺。联胺被认为是在固氮酶反应中的连接酶的中间 产物。而且，亚硝化单胞菌( n i t r o s o m o n a s ) 提纯后的羟氨氧化还原酶( h a o ) 具有催 化联胺转化为氮气的能力【2 “。在a n a m m o x 菌种细胞提取液中发现了h a o 的高活性， 表明在a n a m m o x 过程中，有相似的酶在起作用【2 ”。而且，几种h a o 肽段的氨基酸 顺序是一致的，在数据库中没有任何同源染色体。从a n a m m o x 中获得的酶与亚硝化 单胞菌羟氨氧化酶相似 2 s 】，包含几种c 型细胞色素。该酶在4 6 0n n l 处有吸收峰，同 a n a m m o x 酶在4 6 8n n 处吸收峰的特征相刨”】。该种酶能催化氧化羟氨和联胺，尽管 羟氨是更好的底物，但在细胞提取液中，联胺的氧化速率( 1 5 0n m o lm i n 。1 ( n a g 蛋白质1 0 ) 足够维持0 0 0 3h - 1 的增长速率。a n a m m o x 反应受到0 2 的强烈抑制，因此不可能由氨 的单氧酶( a m 产生羟氨，产生羟氨的另一个可替换的机理是c 型亚硝酸还原酶细胞色 素对亚硝酸盐进行不完全还原，但还未获得这一机理的直接证据。 n h + 图1 1a n a m m o x 可能的反应途径 r i g 1 1t h ep o s s i b l er e a s o np a t