李梨平标记免疫检测技术新进展课件.ppt

儿童医院儿科医学研究所李梨平,标记免疫检测技术新进展,标记免疫技术的发展化学发光系统及其原理免疫检测项目进展,放免,酶免荧光免疫化学发光,电化学发光,1960S,197080S,2000S,1，抗体技术的革命，从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变2，从手工操作向全自动分析仪的转变3，从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变,1959年Berson和Yalow建立了放射免疫分析方法（RIA），大大提高了免疫测定的敏感度，这种标记免疫测定开拓了医学检验的新领域。,缺点半衰期短，试剂货架期不长。标记物不断变化，试剂批间、批内变化大，标准曲线不能保存反应时间长，操作步骤很难自动化。使用放射性核素，对人体有一定的危害性。分析的限度为10mol/ml或10g/ml。,在一定时期内曾被采用，正在被逐步取代,放射免疫测定法,1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了广泛应用。,酶免疫测定法,缺点试剂制备困难。操作步骤复杂，耗时长。影响因素多，质量控制难以保证。最后测定的是颜色的光密度，其精密度和敏感性不如发光免疫技术。,各实验室操作不规范，质量难以保证。有学者认为ELISA技术已逐步走向退化，可能会逐步退出临床实验室。,发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。,化学发光免疫分析,按发光剂不同分为1.发光酶免疫测定技术（CLEIA）2.化学发光免疫测定技术(CLIA)3.电化学发光免疫测定技术(ECLIA)immunoassay,化学发光免疫分析目前分类,化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。,属于酶免疫测定的一种。只是最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。技术类型根据酶促反应底物不同可分为1.荧光酶免疫测定技术2.化学发光酶免疫测定技术根据免疫学反应模式分1.双抗体夹心法和双抗原夹心法2.固相抗原竞争法：,发光酶免疫测定技术（CLEIA）,用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。技术类型1.分离方法常用磁颗粒分离技术2.免疫学反应模式同酶发光免疫测定技术3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶,化学发光免疫测定技术（CLIA）,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,直接化学发光免疫分析,直接化学发光的机理,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,-夹心法,（1）加入H2O2（pH10）,磁微粒模式图,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,特点抗原和抗体结合与未结合部分易分离缩短抗原抗体结合反应时间，使测定时间减少，并降低交叉污染率。,磁微粒技术,化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,化学发光酶免疫分析,该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,电化学发光免疫技术,电化学发光免疫测定法（ECLIA）发展于1996年，它在发光反应中加入了电化学反应，是继放射免疫、酶免疫、化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术，是电化学和免疫测定相结合的产物。,世界公认的最先进的临床免疫检测技术,1996年德国宝灵曼公司推出Elecsys2010系统世界上第一台应用电化学发光技术的全自动免疫分析仪1998年罗氏公司收购宝灵曼公司2001年罗氏推出电化学发光免疫模块E170罗氏是全球唯一应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商2006年罗氏推出电化学发光免疫模块e6012007年罗氏推出电化学发光免疫模块e411,ECL2010disk,E170,ECL2010rack,e601,Elecsys系列全自动免疫分析仪,e411disk,e411rack,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量。技术类型1.分离方法常用磁颗粒分离技术2.免疫学反应模式同酶发光免疫测定技术3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶,电化学发光免疫测定技术（ECLIA）,电化学发光原理,底物：三联吡啶钌Ru(bpy)2+3N羟基琥珀酰胺酯(NHS)三丙胺(TPA),在电极阳极表面，以上两种电化学活性物质同时失去电子发生氧化反应，2价的Ru(bpy)2+3标记物被氧化成3价的Ru(bpy)3+3的标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*，TPA+*很不稳定，自发地失去一个质子而形成自由基TPA*，其为强还原剂，将一个电子给3价的Ru(bpy)3+3，使其成为激发态的Ru(bpy)2+3，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的Ru(bpy)2+3衰减时发射一个波长620nm的光子，重新形成基态的Ru(bpy)2+3。这一过程在电极表面周而复始进行，产生许多光子。使得光信号增强。,电化学发光反应的原理三联吡啶钌和三丙胺在电极表面发生的电化学发光反应,SandwichPrinciple双抗夹心法,largemolecularweightantigensaremeasureddirectlyproportionalmeasurement,means:lowsignal=lowconcentrationhighsignal=highconcentratione.g.TSH,CA15-3IIassays,双抗夹心法&桥联免疫法,CompetitivePrinciple竞争法,smallmolecularweightantigensaremeasuredindirectlyproportionalmeasurement,means:highsignal=lowconcentrationlowsignal=highconcentratione.g.T4,FolateIIassays,竞争法,电化学发光免疫系统核心原理,电化学发光,磁性微粒子固相,亲和素-生物素间接包被,流动池检测系统,简单试剂管理，先进的定标概念,直径最小2.8um表面积大而均一磁性微粒子呈悬浮状态使异相反应变成类均相反应加快反应速度提高反应灵敏度,磁性微粒子固相载体的优点,专利的链霉亲和素-生物素包被技术,适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖等。,亲和素包被微粒子高效、均一、稳定、通用。,链霉亲和素-生物素间接包被的优势,生物素结合物与标本液相反应。,生物素-亲和素反应亲和力强。,由磁铁将结合标记Ag-Ab复合物的磁性微粒（结合相）吸附于电极上，游离相被缓冲液冲走；电极表面的电化学发光的信号检测完成后，磁铁移走并使用系统清洁液冲走电极表面的结合标记Ag-Ab复合物的磁性微粒子；实现了结合相与游离相的全自动分离,流动池检测系统,电化学发光免疫分析示意图,灵敏度高这是CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5105倍。,化学发光免疫分析的优点,几种标记免疫技术灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10-1810-1510-1210-9,线性范围宽发光强度在46个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于放射免疫分析技术。,几种标记免疫技术线性范围的比较,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,105104103102,安全性好试剂无放射性危害，环保、安全且易保存,几种标记免疫试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,1815129630,InhA发现与应用历史,1932年McCullagh发现非类固醇来源的抑制物质1966年HCG和LH检测的实现推动了Inh调节作用的理念1975年Sherman&Korenman观察到卵巢卵泡液中存在抑制素样物质,1985年从牛和猪的卵泡液中分离出Inh1986年基因克隆和重组技术进一步分离出Inh，并大批量生产,上世纪90年代InhA欧美等国开始应用于临床筛查唐氏综合征，以及先兆子痫等生殖健康领域的研究DSL公司研发了ELISA方法试剂用于唐氏综合征筛查获得了美国FDA许可,InhA在欧美国家临床得到广泛应用，并列入主要国家指南标准，证明其临床价值2005年贝克曼库尔特收购DSL公司后，拥有独家专利。实现InhA检测自动化，进一步优化其临床应用的可行性和便利性2012年4月贝克曼库尔特完成在中国SFDA注册，填补国内InhA产筛应用及其他临床应用的空白,40,抑制素属于TGF-超家族成员,PadmanabanSuresh,etal.,EndocrineJournal,2011,Inhibin-A=+A32kDa糖蛋白男性：睾丸支持细胞、塞尔托利细胞女性：卵巢颗粒细胞、黄体细胞、子宫内膜、胎盘负反馈抑制垂体FSH的分泌,抑制素A的结构和合成,deKretserDM,etal.,HumReprodUpdate,2002,CompanyConfidential,43,抑制素A参与调节女性卵泡发育,MendezLozanoetal.,FertilSteril,2006(Abstract),InhA临床应用方向,唐氏综合征筛查指标,性激素检测菜单新指标,孕中期四联筛查方案（AFP+hCG+uE3+InhA）,卵巢/黄体功能评估先兆子痫预测指标葡萄胎诊断及监测,InhibinA,2019/12/14,46,可编辑,唐氏综合征筛查应用建议依据,中华人民共和国卫生行业标准WS322.12010：胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准第1部分：中孕期母血清学产前筛查(2012年12月31日颁布实施),美国ACMGStandardsandGuidelines美国ACOGPracticebulletin加拿大SOGCClinicalPracticeGuideline加拿大BC省PerinatalServicesBCObstetricGuideline美国2010-CLSI-maternalserumscreening2ndedition,SURUSS2003FASTER2005BUN2003ChinaInhAstudyproject,InhA-唐氏筛查,中国卫生部行业标准,其他国家筛查指南或标准,文献依据临床研究数据,47,常用筛查方案术语,48,中国卫生部行业标准,胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准第1部分：中孕期母血清学产前筛查,49,其他国家筛查指南与标准,全球主要国家筛查策略,50,经美国病理医学学院（CAP）授权,美国唐氏综合征筛查:2011/12年,均检测InhA,51,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,DetectionRate(%),孕妇年龄+三联四联联合血清整合整合,孕中期孕早期-整合-,30%,71%,81%,85%,87%,94%,89%86%,95%93%,不同唐氏筛查模式的性能,在5%假阳性率,85%79%,SURUSSBUNFASTER,74%,69%,52,孕中期二联,三联&四联筛查:四联筛查降低假阳性率，提高检出率,筛查方案及选择,SURUSS研究(Wald等，2003),*假设80的孕妇接受羊穿并且有0.9%的致流产率。新生儿唐氏综合症的预期发生率为1.74/1000。二联，三联和四联筛查采用的截断值分别为1:470，1：385和1:300。,降低假阳性率和提高检出率的意义:筛查中FPR的降低意味着进行侵入性诊断的孕妇数量减少了。因为羊膜腔穿刺比筛查贵10倍以上，因而降低了成本。同时，还可以降低侵入性诊断可能造成的正常胎儿的流产率和由此给孕妇造成的精神创伤。提高检出率在降低整体筛查成本同时并为患者提供更多信息以便在作出最佳选择的基础上检出更多唐氏患儿。因此，SURUSS研究推荐对于孕中期参加孕期保健的孕妇：孕中期四联筛查为最佳方案,53,整合筛查为最高效安全的筛查方案如果无法开展NT检测：推荐血清整合筛查方案对于孕中期参加孕期保健的孕妇：孕中期四联筛查为最佳方案对于孕早期参加产筛测试的孕妇：推荐孕早期联合筛查,SURUSS研究结论,四联筛查与孕早期联合筛查相同DR下，FPR相当,54,四联筛查在95%可信区间下正确检出率可以提高到81%,已接近于孕早期联合筛查13周检出率相比较二联和三联而言检出率提高10%以上,FASTER研究(Wald等，2005),FASTER研究,55,国内InhA临床数据-抑制素A研究项目,56,研究中心信息,57,不同假阳性率下的检出率,TC新三联比PE三联DR提高5.3%，TC四联比PE三联DR提高12%本实验的TC四联结果与SURUSS文献上的结果接近,58,不同检出率下的假阳性率,TC新三联比PE三联FPR降低22%，TC四联比PE三联FPR降低51%,59,中国出生缺陷现状中国每年有100万出生缺陷儿发生,其中只有30%可以治愈或纠正全国累计有近3000万个家庭曾生育过出生缺陷和先天残疾儿,占全国家庭总数1/10中国每年有约3-5万唐氏儿,10万神经管缺陷患儿出生造成沉重的社会负担和精神压力:-此项支出每年达到300亿以上-每个唐氏患儿仅医药费支出就达25万以上-1个患儿累及7个成人关键在于预防:三级预防可大幅度减少出生缺陷和先天残疾儿的发生-1级:孕前保健-2级:孕期保健(产前筛查与诊断)-3级:新生儿筛查(早发现早干预),60,孕中期四联80%的检出率意味着,抑制素A与产前筛查,最大程度地提高孕中期筛查的筛查效率，提高检出率，降低假阳性率更少的孕妇选择昂贵高风险的羊水穿刺手术易于质量管理控制，普及推广，适合中国国情为“准父母”减轻了沉重的心理负担和经济负担较少的投入，减少产前筛查项目成本，极大地节省医疗资源提升产筛中心服务水平，降低医疗风险,已成为欧美孕中期唐氏综合症筛查的常规指标,61,性激素检测菜单新指标建议依据,抑制素A在黄体中期达最大值，说明在黄体期主要同黄体细胞产生抑制素A水平反映了IVF-胚胎移植治疗后黄体数量ROC曲线提示抑制素A在0.553MoM时，预测妊娠失败的能力最佳，敏感性达90.6%，特异性为99.5%,目前没有单一的指标可以准确预测子痫前期抑制素A随子痫前期的严重程度增加而升高可以应用四联指标对先兆子痫进行风险评估,正常妊娠孕妇抑制素A水平的显著升高与葡萄胎孕妇抑制素A水平没有重叠清宫后，抑制素A水平在10-15天内迅速降到非妊娠水平，利于监测,InhA-性激素,卵巢/黄体功能评估,先兆子痫预测,葡萄胎诊断与监测,62,63,反映黄体功能,ChatchaiTreetampinich,etal.,HumRepro,2000,妊娠组治疗方案：激素替代HRT自然周期NAT克罗米芬最低刺激CC卵巢刺激单胎COH-VS多胎COH-VM,64,ChatchaiTreetampinich,etal.,HumRepro,2000,HRT组（无功能卵巢），抑制素A水平极低反映了缺乏有功能的黄体自然周期组相比卵巢刺激组抑制素A水平低是因为只有一个黄体接受卵巢刺激方案的妇女都有多个黄体，抑制素A水平最高,反映黄体功能,65,预测不良妊娠结局,PasqualeFlorio,etal.,FertilityandSterility,2004,ROC曲线提示抑制素A在0.553MoM时，预测妊娠失败的能力最佳，敏感性达90.6%，特异性为99.5%。,66,妊娠期高血压发生的常见类型2000年全国孕产妇妊高征死亡率为7.6%，位于各种死亡原因第二位可能机制：滋养细胞浸润胎盘床不足、子宫-胎盘缺血缺氧合体滋养细胞缺血、发育良；细胞滋养细胞增生各种生物因子分泌失控,子痫前期,目前没有单一的指标可以准确预测子痫前期,JYu,etal.,UltrasoundObstetGynecol,2011,发展成严重子痫前期的孕妇相比正常孕妇，血中和羊水中的抑制素A水平明显升高。,Shin-YoungKim,etal.,JKoreanMedSci,2006,69,抑制素A随子痫前期的严重程度增加而升高,VorapongPhupong,etal.ArchGynecolObstet,2009,葡萄胎,正常妊娠12-14w非妊娠妇女卵泡期部分性葡萄胎清宫前/后,正常妊娠孕妇抑制素A水平的显著升高与葡萄胎孕妇抑制素A水平没有重叠清宫后，抑制素A水平在10-15天内迅速降到非妊娠水平，利于监测,PasqualeFlorio,etal.Cancer,2002,71,抑制素A通过抑制FSH、以及性腺局部旁分泌发挥其生理作用青春期开始，卵巢是女性抑制素A的主要合成器官在月经周期中，抑制素A主要由黄体合成，负反馈控制FSH分泌抑制素A水平可用作预测卵巢功能的减退，评估黄体功能妊娠前期，主要由黄体合成抑制素A；妊娠中晚期，主要由胎盘合成抑制素A抑制素A可以用于预测子痫前期、唐氏筛查、诊断葡萄胎,结语,肿瘤诊疗现状：肿瘤早期临床症状不明显70-80%患者一经诊断均处于肿瘤晚期丧失了早期治疗机会，预后差，3-5年的生存率较低肿瘤的诊断：病理学影像学实验室检查肿瘤的治疗：手术放疗化疗其他综合治疗,肿瘤的诊断和治疗,肿瘤标志物为肿瘤的早期诊断提供了可能,肿瘤标志物动态监测，可以评估肿瘤的治疗的疗效，在影像学改变之前提示肿瘤的复发和转移,胃泌素释放肽-GRP,GRP=胃泌素释放肽初始作为胃肠激素检测,GRP的生理学功能:刺激胃的G细胞分泌胃泌素参与平滑肌细胞的收缩促进细胞间的相互作用上皮细胞增殖、转移和细胞扩散中发挥重要作用,ProGRP在良性疾病的分布,MolinaRetal.AnticancerRes.2005,25,1773-1778,肾衰是导致ProGRP假阳性升高的重要因素，51.6%的肾衰患者ProGRP升高,ProGRP对在多种肿瘤的分布,source:PetraStieber,Inst.F.Klin.Chemie,KlinikumderUniversittMnchenGrosshadern,2010,cut-offProGRP:30pg/mLProGRP主要在SCLC显著升高,ProGRP在肿瘤升高的百分比,SCLC,ProGRP是SCLC诊断特异性的标志物,样本分布,目的：评估ProGRP对不同类型肺癌的诊断价值结果：ProGRP对SCLC诊断的敏感性=83.8%；特异性=95%,KimH-Retal.Oncology&Hematology2011,26,625-630,肺癌标志物临床指南NACB推荐,source:NACB:PracticeGuidelinesAndRecommendationsForUseOfTumorMarkersInTheClinic:LungCancer(Section3P),TToxoplasmagondii（弓形体）OOthers(ParvovirusB19,Eppstein-BarrVirusetc.)RRubellaVirus（风疹病毒）CCytomegalovirus（巨细胞病毒）HHerpesVirus（单纯疱疹病毒）,TORCH,弓形体1-7/1,000lifebirths风疹病毒0.2-0.5/1,000lifebirths巨细胞病毒10/1,000lifebirths,TORCH感染发病率和易感人群,如下情况一般需要TORCH感染检测：免疫状态测定孕期急性或既往感染诊断新生儿感染诊断免疫低下患者监测（例如：AIDS或移植患者）,TORCH孕期感染最危险对胎儿或新生儿造成严重不良后果,Toxo-脉络视网膜炎、脑积水等严重后遗症Rubella44%患者听力损害，还见于房间隔、小儿畸形、智障等CMV-生长和中枢神经系统异常，如听障和智障HSV-粘膜、皮肤、眼部、内脏和中