（分析化学专业论文）新型纳米传感器的研制及其在环境农残检测中的应用.pdf

中文摘要 现代的农业生产离不开农药的使用，农药已成为植物免受病、虫、草害的有 效保护手段之一，使粮食生产率得以大幅度的提高，特别是除草剂的使用，极大 地减轻了劳动强度，直接或间接地提高了农业生产水平。但是，由于农药的长期 使用和残留，及其它们的有毒代谢物、降解物、转化物的存在，造成了环境的严 重污染，对人体的危害是难以估量的。目前，国际上对农药最高残留量要求越来 越严格，这些都给农药残留检测技术提出了更高的要求。因此，发展高灵敏的、 对农药及其代谢物、降解物、转化物有特异性响应的检测技术对国民健康和经济 发展无疑具有重要意义。 将纳米材料引入化学传感器中，成为分析化学的一个研究热点，取得了许多 创新性研究成果。其中碳纳米管因其独特的力学、电子特性及化学稳定性，得到 了人们的广泛关注。碳纳米管用于电极材料除了可将材料本身的物理化学特性引 入电极界面外，同时也会拥有纳米材料的大比表面积、粒子表面带有较多的功能 基团的特性。它能在电化学反应中促进电子传递，对某些物质的电化学行为产生 特有的催化响应。除此之外，利用其粒径小、比表面积大、表面反应活性高、催 化效率高等优异特性，还可作为固体促进剂，用于实现酶的直接电化学，使其在 电化学领域有着广阔的应用前景。 本论文的工作主要是将纳米技术以及纳米材料的修饰技术应用于传感器中， 其研究思路表现为：( 1 ) 碳纳米管直接修饰于电极表面，提高农药在电极上的响 应电流，研制对农药有高灵敏度的电化学传感器；( 2 ) 由于碳纳米管有利于提高 生物活性物质的固定量，对生物活性物质有生物兼容性并可改善其氧化还原特性， 利用碳纳米管作为载体材料将对农药有特异性响应的生物活性物质修饰于电极表 面，大大提高了修饰电极的响应电流，制备出对农药有高选择性和灵敏度的生物 传感器，采用电化学技术对其进行表征，并研究其反应机理。本论文的主要研究 内容包括以下几个部分： 1 基于碳纳米管传感器检测环境水样中的农药百草枯 制备了多壁碳纳米管修饰玻碳电极，采用循环伏安法比较了百草枯在裸玻碳 电极和修饰电极上的电化学特性，发展了一种新的高灵敏度检测百草枯的电化学 分析方法。在最佳实验条件下，用方波伏安法检测百草枯，其响应电流与百草枯 的浓度在5 3 8 1 0 - 7 2 3 7 1 0 4m 范围内成很好的线性关系，最低检测限为 5 0 1 0 - 7m ，并用此方法检测了环境中的百草枯。 2 基于辣根过氧化物酶修饰碳纳米管传感器检测农药2 ，4 一二氯苯酚 酶生物传感器在农药残留检测方面具有传统方法不可比拟的优势，而酶对固 定载体材料有很高的要求。本论文利用多壁碳纳米管( m 帆) 作为载体来固定辣 根过氧化物酶( h r p ) ，制备了h r p m w n r r s 修饰玻碳( g c ) 电极，h r p 在g c 电极表面可发生直接的氧化还原反应并保持很好的生物活性。在h 2 0 2 的存在下， 2 ，缸二氯苯酚( 2 ，4 d c p ) 在酶电极上发生氧化还原反应，响应电流与其浓度在 一定范围内成线性关系。通过循环伏安法，电化学交流阻抗法对修饰电极进行表 征。利用计时电流法来检测2 ，4 d c p ，在最佳实验条件下，2 ，4 - d c p 浓度在范 围1 0 1 0 。6 1 0 1 0 4 m 与响应电流成良好的线性关系，其检测限为3 8 1 0 7 m ，并 检测了实际样品中的2 ，4 d c p 含量。本章还讨论了酶电极的动力学方程，计算 其反应过程中的米氏常数。 3 葡萄糖氧化酶一有序碳纳米管修饰铜电极检测农药阿特拉津 一一般情况下制取碳纳米管时，碳纳米管是自由生长，会发生随意弯曲，并互 相缠绕，这无论对其性质研究，还是对其实际应用，都造成了很大的影响。而有 序碳纳米管阵列取向高度一致、管径均匀、不含杂质，阵列中的每根碳纳米管之 间互不缠绕，以此制得的传感器在信噪比和检测限上都有极大的提高。本文采用 有序碳纳米管，制备了有序碳纳米管一葡萄糖氧化酶传感器，基于碳纳米管的高度 有序性，进一步提高了电子传递作用及电化学检测农药的灵敏度。由于阿特拉津 对g o d 有抑制作用，故可以通过测定酶被抑制的活性来测定阿特拉津的含量。在 最佳实验条件下，阿特拉津浓度在5 8 0 1 0 7 4 2 2 1 0 5m 范围内与响应电流成良 好的线性关系，其检测限为3 9 1 0 - 8 m ，并检测了实际样品中的阿特拉津含量。 4 基于静电吸附作用自组装构建酶一碳纳米管一表面活性剂传感器 酶在电极上的固定是酶传感器制备中的重要环节，它直接影响酶传感器的检 测性能。本文利用静电吸附的自组装法以碳纳米管为载体将酶固定在电极上来制 备酶传感器，具体制备过程分为以下几个步骤：( 1 ) 将碳纳米管溶解在表面活性 剂中，使碳纳米管表面带有正负电荷，制备碳纳米管一表面活性剂修饰电极；( 2 ) 根据酶的等电点，选择与碳纳米管一表面活性剂带相反电荷的酶溶液的p h ； ( 3 ) 利用基于静电吸附的自组装技术制备新型的酶一碳纳米管一表面活性剂修饰电极。 此类酶传感器制备过程简单、稳定性好、组装到电极表面的酶的量多并可保持其 生物活性，可检测浓度在1 0 1 0 击5 4 1 0 - 5m 范围内的h 2 0 2 ，最低检测限为 5 3 1 0 7m 。这种制备方法为构建检测农药残留的生物传感器提供了一种新的方 法。 关键词：农药，碳纳米管，酶生物传感器，检测 a b s t r a c t m o d e ma 鲥c u l t u r ed e p e n d sc o n s i d e r a b l yo nt h eu s eo fp e s t i c i d et 0a c h i e v e 酉e a t e ra n dg r e a t e rc r o py i e l d s p e s t i c i d e sh a v eb e c o m et h em o s te 骶c t i v em e a n so f p r o t e c t i o np l a n t 丘0 md i s e a s e ，i l l s e c t s ，w e e d sh a 瑚p a n i c u l a r l y ，t h eu s eo fh e r b i c i d e s h 弱伊e a t l yf e d u c e dt h el a b o u rf o r c e ，a n dp r o m o t e dt h ed e v e l o p m e n to fa 鲥c i l l t u r e d i r e c t l y 锄di n d i r e c t l y h o w e v e r ，b e c a u s et h el o n 哥t c 肌u 0 fp e s t i c i d e s ，t h e i r r c s i d u e s ，t o x i cm e t a b o l i t e s ，d e g r a d a t i o np r o d u c t sa n dc o n v e r 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农药的发明和使用大大提高了农作物的产量，但农药大量使用和不合理使用 而引发的环境污染问题，农产品中的农药残留问题，越来越受到各国政府和公众 的关注。随着高效农药的开发应用和待检样品的增加，对农药残留分析技术的灵 敏度，特异性和快速性提出了更为严格的要求。因此，农药残留分析技术的进步 也受到高度重视嘲。 农药残留是指农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的农药原体、有 毒代谢物、降解物和杂质的总称，残存的数量称为残留量嘲田间喷洒的农药只 有1 0 粘附在作物上，其它大部分通过各种方式撒播出去污染大气、土壤和水等。 在一般情况下主要是指农药原体的残留量和具有比原体毒性更高或相当毒性的 降解物的残留量，具体大小与多种因素有关。 农药污染及其产生的危害后果是严重的。农药对大气、土壤和水体污染，对 环境质量的影响与破坏，尤其是地下水污染问题已日趋严重；农药污染的生态效 应十分深远，尤其是对生物多样性保护的影响；农药对人体健康的危害，尤其是 三致作用和对生殖性能的影响显著删。农药污染主要可以分为以下几个方面： 1 农药对水环境的污染 农药污染水的途径通过大气漂移、大气降水、农田农药流失、水面直接喷洒 农药、农药厂排放废水等。农田农药流失是水体中农药的重要来源，因为农田使 用的农药量大。使用于农田的农药可经过多种途径进入水体，如降雨、地表径流、 上海师范大学硕士学位论文 农田渗滤和水田排水等。农药对水环境的污染状况，经欧美各国广泛调查，发现 有6 0 多种农药在地下水中被检测到。 2 农药对土壤的污染 农药进入土壤的途径主要有3 种：a ) 农药直接进入土壤( 使用除草剂、拌种 剂和防治地下害虫的杀虫剂) ；b ) 为防治病、虫、草害喷洒于农田的各种农药， 有相当部分落入土壤表面；c ) 农药随大气沉降、灌溉水和动植物残体而进入土 壤。农药在土壤中残留期长短与农药性质有关，化学性质稳定的农药残留期长， 残留期长的农药一方面可保持较长时间的活性，另一方面高的残留活性不仅污染 第一茬作物，而且对后茬作物也造成污染，如上世纪8 0 年代使用的“六六六现 在仍可在土壤中测定出来。残留期长的农药直接污染土壤，间接污染水源。土壤 的农药残留和污染，主要集中在农药使用地区的0 3 0c m 深度的土壤层中，土壤 农药污染程度视用药量而异，若以m g k g 为单位，一般在几个至几百个单位，通 常为几十个单位。 3 农药对大气的污染 农药对大气污染来源有两方面：曲农田喷洒农药时，一部分被浮游的尘埃 所吸附，并向大气扩散；b ) 农药厂排出的废气污染更为严重，有资料报道，某 些农药厂排出的有害气体给周围的蔬菜田造成了严重污染，蔬菜表现叶片皱缩、 果实畸形坚硬。农药对大气的污染程度与范围，主要取决于施用农药的性质、施 用量、施药方法以及施药地区的气象条件。 4 农药对环境生物的影响 由于农药的使用，消灭了一些捕食性、寄生性的天敌，使自然界害虫与天敌 间失去了平衡，造成害虫猖獗；也消灭了传粉的昆虫，使作物产量受到了影响， 同时还使生物栖息场所发生了改变。 5 农药对人体健康的危害 环境中的农药，一般通过3 个途径进入人体，即呼吸道、消化道和皮肤。农 药经过呼吸道进入人体的程度，取决于大气中残留农药的浓度。通常水溶解度大 的粉剂、水剂农药易被人体吸收而引起中毒，尤其是一些无嗅、无味、无刺激性 上海师范大学硕士学位论文 的农药，易被人们忽视，中毒的可能性要大一些。农药经过消化道进入人体，主 要是食用受农药污染的食物引起的中毒，因消化道对农药的吸收最强，危险性也 最大，常见的农药急性中毒事故大都是误食已受农药污染的食物而引起的。 农药残留分析是对待测样本中微量农药残留进行定性和定量分析的方法，对 残留农药进行分析和检测，是为了评价农药残留的危害性，保障人体健康，防止 环境污染。我国农药残留分析技术始于2 0 世纪5 0 年代，经历了6 0 年代的气相色谱， 7 0 8 0 年代的高效液相色谱，到了9 0 年代以后，农药残留分析技术日新月异，一 些新技术的出现大大简化了农药残留分析的步骤。农药检测方法日趋完善，并向 简单、快速、灵敏、多残留、低成本、易推广的方向发展。 1 1 2 农药检测中的常规仪器分析法 1 色谱法 色谱法是根据被分离物质在色谱柱中的分配系数的差异对其进行分离，采用 不同的检测器对各化合物分别进行测定，根据保留时间和峰面积( 或峰高) 实现 对化合物的定性定量分析。 气相色谱法的分离效能高，选择性高，灵敏度高，分析速度快和应用范围广。 梁定鸿等n 们采用c 1 8 固相萃取法以石油醚为洗脱剂，用g c e c d 对水中溴氰菊酯的 测定进行了研究，最低检测浓度为0 1j c l g l ，回收率达8 3 以上；z h 柚gn 1 1 利用 s p e g c f p d e c d 对中国香港九龙湾水域进行了检测，发现了1 7 种有机磷和1 8 种有机氯农药。 一 2 高效液相色谱法 高效液相色谱法高效，快速，自动化并能解决难分离农药等特点成为农残分 析中强有力的检测技术。蒋新明等n 2 3 研究了用高效液色谱( h p 柱后衍生荧光 检测系统测定氨基甲酸脂类农药的方法。用r a d i a lp a kc 柱在不同流动相梯度条 件下对六种农药和三种代谢产物进行分离，通过柱后衍生化技术提高荧光检测器 的灵敏度。该方法分离效果好，最低检测浓度为2 肛g l ，最小检出量为2n g 。 3 毛细管电泳法 3 上海师范大学硕士学位论文 由于其具有分离效率高、快速、样品用量少等特点，毛细管电泳法在近年得 到了迅速发展。吼j 卸s k y 等运用毛细管区带电泳( c z e ) 分离出了浓度为1 0 由m 的季铵盐除草剂。目前，毛细管电泳法尚缺乏灵敏度很高的检测器，可利用的紫 外检测器能检测几个皮克( p 亩，样品浓度被限制在1 0 咱级。 4 薄层色谱法 此方法简便易行，可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的分离和筛选。 2 0 世纪8 0 年代发展起来的高效薄层色谱法与扫描技术结合，是一种易于建立和掌 握的半定量技术。 5 直接光谱分析 近红外衰减全反射光谱和表面增强拉曼光谱使光谱分析灵敏度提高1 0 2 1 0 7 倍，具有高的表面检测灵敏度以及易于获得全波段振动光谱等优点，因而在农药 残留分析上得到了广泛应用。 常规仪器分析法由于其样品预处理复杂烦琐，仪器昂贵且不易携带，需要试 样量较多，操作复杂耗时，在连续监测及现场测定中受到限制，难以满足环境监 测中大量样品的快速检测需要。 1 1 3 化学生物传感器在农药检测中的应用研究 生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗 透成长起来的高新技术，在环境监测、生物医学、食品、医药及军事医学等领域 有着重要应用价值。 1 免疫传感器 免疫分析( i 咖i u n o 勰姐y ，凶是基于抗原抗体之间高度选择性反应而建立起 来的检测抗原或抗体技术。其检测农药的原理是将化学农药作为半抗原，与大分 子蛋白质结合后制备成具有抗原性的物质，再免疫动物，刺激动物机体产生具有 特异性的抗体，制备的抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能，可与抗原 选择性地结合。由于其具有选择性强、灵敏度高的特点，免疫学分析方法成为一 种十分有效的生物检测方法n 钔。迄今应用到农药检测领域的免疫分析方法除了传 上海师范大学硕士学位论文 统的放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析等外，近年来还 出现了流动注射免疫分析、免疫传感技术等新方法n 蚴1 。认具有特异性强、灵敏 度高、分析容量大、分析成本底、安全可靠、操作简便、对样品的前期处理要求 不高等特点，因此适宜于农药残留的现场分析。但是免疫传感器本身有一定的缺 陷，因为一种抗体只能检测一种化合物，所以有必要了解清楚被测定的化合物并 找出与它相符的抗体。例如：帕拉息昂不是对氧磷，虽然它们有相似结构( o 代 替s ) ，或者与相似剩余物( 阿特拉津、西玛津等) 有类似的结构。 2 酶传感器 不同酶传感器检测农药残留物机理是不同的，有些酶对农药残留物具有催化 转化能力( 如酪氨酸酶对酚类) ，有些残留物对酶活性有特异性抑制作用( 如有 机磷酸酯类对乙酰胆碱酯酶) 或作为调节、辅助因子对酶活性进行改饰( 如m n ( i i ) 对辣根过氧化酶) 。检测酶反应所产生的信号，可以间接测定残留物的含 量。 应用于农药检测的酶主要是乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 和酪氨酸酶( t ”) ：t ) ，r 常用于检测苯、氯酚、氰化物、碳酸盐和莠去津；其他一些酶可用于检测另外一 些环境污染物，如硝酸盐、硫、磷、重金属和苯。z u e m 等人乜1 1 利用酶抑制作用， 因敌敌畏导致a c h e 活力降低，发展了一种流动注射方法，检测敌敌畏，并且能 检测水中p p m 水平的铜而无需进行预浓缩。f e m 锄d 0 等人用鳗鲡a c h e 作为生物传 感元素对抗胆碱酯酶的有机磷和氨基甲酸酯盐进行了检测，可以检测1 0n m 水平 的对氧磷，而敌敌畏和焦磷酸四乙酯等农药的检测下限则更高唿1 。主要优点是灵 敏度高、快速( 几分钟内可以同时检测8 个样品) 、准确、可重复使用。 3 细胞器传感器 1 ) 细胞器酶传感器 细胞器酶传感器由取自有机体的富含酶的细胞或含该种细胞的组织固定在 原电极的表面制成。细胞或组织中含有大量有用酶。往往酶的活性和寿命高于分 离的酶。细胞器传感器的作用机理有两种情形：( 1 ) 利用农药对细胞或组织中 酶的抑制作用；( 2 ) 利用农药对绿色植物细胞光合作用的拮抗作用。 5 上海师范大学硕士学位论文 e s c h e r i c l l i 细胞作为一种有机磷水解酶( o p h ) ，最早用作生物传感器。因 为o p h 催化p l o ，p q ，p q 和p - - c n 键的剪切产生了质子，农药对该催化 反应有抑制作用。用p h 电极作为原电极，对氧磷的测定范围为o 2 5 1 0 。6 2 5 0 1 0 吨m ，响应时间1 0m i n 嘲；利用烟叶组织制作的传感器可用来测定马拉 硫磷、甲基对氧磷、对氧磷和涕灭威，其中甲基对氧磷和涕灭威检出限分别为 0 5 l o 9 和4 0 l o 嘈m ，其它农药在二者之间扫铂。 2 ) 基于光合成系统p si i 的传感器 利用农药对植物叶绿体光合成的抑制作用进行电化学检测也有报道。全细胞 生物传感器是光合反应中心( r c ) 中的苯醌结合位点( q b ) ，作为p s 类除草剂的 特异性受体而起作用。高等植物光合作用通常产生氧气，并在反应中产生中间物 质过氧化氢，因此可以通过监测氧和过氧化氢生成速率的差异检测农药。文献嘶1 从菠菜叶中分离的光合作用细胞作为光敏元件，用玻璃光纤照射，用铂电极监测 光反应产物过氧化氢，测定了除草剂阿特拉津。文献嘲1 利用电化学沉积将分离出 的光合作用细胞印制在电极上制作成多元的生物传感器，对阿特拉滓进行检测。 文献伫刀制备藻青菌s y l l e c h o c c i i ss p 传感器，利用二氨基均四甲苯作为中介体，将 提取的细胞悬浮液直接滴在玻碳电极的表面，再用透析膜进行覆盖，用卤素灯照 射电解池，可对多种污染物如重金属、三嗪类除草剂、氨基甲酸盐类杀虫剂进行 检测。 作为一种新的检测手段，生物传感器具有高选择性、高灵敏度、低成本、能 在复杂的体系中进行快速在线连续监测，十分符合环境工作的特点。生物传感器 的出现为环境中农药监测的连续化和自动化提供了可能，降低了农药监测的成 本，加强了环境监督的力度。经过近3 0 年的研究，生物传感器获得了极大的发展， 出现了各种各样的传感器，它将会成为最具潜力的环境检测工具。 1 2 碳纳米管在生物传感器中的研究进展 自从1 9 9 1 年日本j i i n a 教授用真空电弧蒸发石墨电极，并对产物作高分辨透 射电镜( m 砸m ) ，发现了具有纳米尺寸的碳的多层管状物一碳纳米管以来汹1 ， 由于其特殊的结构和独特的物理、化学、电学特性以及潜在的应用前景而倍受人 们的关注。 6 上海师范大学硕士学位论文 碳纳米管又称巴基管，属于富勒碳系，是一种纳米尺度的具有完整分子结构 的新型碳材料。如图卜1 所示，它是由碳六元环构成的类石墨平面卷曲而成的纳 米级中空管，其中每个碳原子通过s p 2 杂化与周围3 个碳原子发生完全键合，各单 层管的顶端有五边形或七边形参与封闭。碳纳米管的径向尺寸为纳米量级，轴向 尺寸为微米量级，具有较大的长径比。碳纳米管有单壁和多壁之分，单壁碳纳米 管( s i i l 西e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e ，s 啪) 由一层石墨片卷曲而成，管径一般 为1 6n m ；多壁碳纳米管( m u l t i w a l l e dc a r b o nn 锄o t u b e s ，m w n r s ) 由多层柱 状碳管同轴套构而成，层数在2 5 0 之间不等，层与层间距约0 3 4n m 。碳纳米管 的尺寸处在原子、分子为代表的微观物体和宏观物体交界的过渡区域，使它既非 典型的微观系统也非典型的宏观系统，因而具有表面效应、体积效应、量子效应 和宏观量子隧道效应。 图l - 1 单壁碳纳米管( a ) ；多壁碳纳米管 1 2 1 碳纳米管对生物分子的电催化作用 利用碳纳米管对电极表面进行修饰时，由于碳纳米管的小粒径、大比表面积 效应以及碳纳米管表面带有较多的功能基团而对许多生物分子具有电催化作用。 赵广超等人汹3 研究了多巴胺在不同电极上的循环伏安曲线。多巴胺在玻碳电 极上出现了一对准可逆的氧化还原峰，其峰电位差e p 为6 7m v ，而在碳纳米管 修饰电极上，其峰电位差仅为3 1m v ，更接近于理想状态下2 电子反应的峰