（环境工程专业论文）好氧反硝化菌诱变育种及16s+rdna序列分析.pdf

声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下独立完成的。论文中取 得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其它学位而使用过的材料。与我共同工作 过的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 作者签名：王疋堤 日期：抛年月 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解沈阳建筑大学有关保留、使角学位 论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权沈阳建筑大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。( 如作者和导师同意论文交流， 请在下方签名；否则视为不同意。) 作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后： 不限因半年口一年口一年半口两年口 作者签名：兰霁缀 日 期：却埤j 目 导师鲐玩烨 日 期：力f 弓j 硕士研究生学位论文 摘要 i 摘要 目前，由于工业的发展和人们生活水平的提高，污水排放量逐年增大，污水中的氮元 素污染愈来愈严重，水体富营养化已经严重影响了人们的生产生活，在这种情况下，对于 污水脱氮技术的研究就显得愈来愈重要。由于好氧硝化反硝化脱氮工艺具有运行操作简 单、运行成本小、基础建设投资少等优点，成为国内外学者和研究人员研究的重点脱氮技 术。但是由于好氧反硝化机理并未明确，反硝化反应条件研究还处于起步阶。本文通过分 离、紫外诱变出具有较强反硝化能力的好氧反硝化菌种，并对菌种进行反硝化能力研究及 分析菌种1 6 s r d n a 序列。 对沈阳市北部污水处理厂二沉池中的活性污泥进行分离、筛选，得到4 株具有在有氧 情况下能进行反硝化反应的好氧反硝化菌株，通过对菌株反硝化能力的测定，确定了一株 菌株w c j 4 ，菌株w c j 4 对n 0 3 一一n 反硝化能力最强，n 0 3 n 去除率能达到了6 1 4 6 ，但 是总氮去除率只有4 0 5 8 。菌株w c j 4 的对数生长周期为o 1 6 h ，对n 0 3 一n 的反硝化反 应最要发生在此阶段。对菌株w c j 4 进行紫外照射诱变! 经过反复筛选得到菌株w z b l 4 。 菌株w z b l 4 的反硝化能力明显得到提高，对于n 0 3 一二n 去除率为9 1 2 1 ，同时总氮去除率 达到了8 5 7 4 。n 0 2 一n 的积累量明显降低，最后达到6 3 0 m l 。对菌株w z b l 4 进行革兰 氏染色和培养观察，发现菌株w z b l 4 为淡黄色、圆形、边缘整齐、表明凸起干燥的革兰氏 阳性菌。 为确定菌株的生长曲线，发现原菌株w c j 4 的对数生长期为1 6 h ，但是诱变菌株w z b l 4 的对数生长期为2 4 h ，诱变之后菌株的对数生长期增长。研究菌株w z b l 4 的最适生长条件， 设计正交试验发现，菌株w z b l 4 在p h 为6 、温度在2 5 时、c n 比为1 0 、以葡萄糖为碳 源情况下，菌株w z b l 4 生长最好。试验中得出菌株w z b l 4 的生长量影响的按大小的顺序 排列为温度、c n 比、碳源、p h 值。菌株w z b l 4 生长受到温度影响最大。在正交试验的 基础上，研究最适生长条件下，菌种w z b l 4 的除氮率，菌株w z b l 4 的去除率从9 1 2 1 提 高到了9 3 3 8 ，原因在于菌株w z b l 4 在最适生长条件下生长状况较好，需要更多的营养 物质和氮元素供自身生长代谢。 此外，在此基础上通过试验研究溶解氧对于菌株w z b l 4 的反硝化能力的影响，通过 对菌株w z b l 4 液体培养时增加摇床转速，增大培养液中溶解氧浓度。试验发现，菌株w z b l 4 的除氮率随着摇床转速的增大而增大，但是当摇床转速达到1 6 0 r m i n 以上时，菌株w z b l 4 的反硝化能力基本不再增加。溶解氧浓度在较低的水平下，对菌株w z b l 4 的反硝化能力有 着显著的影响，但是当溶解氧浓度达到5 o m l 以后，菌株w z b l 4 的反硝化能力基本不受 溶解氧的影响。 通过对菌株w z b l 4 的1 6 s rd n a 的序列分析发现，菌株w z b l 4 属于红色球菌种，1 6 s r d n a 长度为1 3 9 6b p 。菌株w z b l 4 与同菌属的菌种同源性较高，都是达到9 5 以上。红色 球菌种属是已经被研究者发现的能过进行好氧反硝化的菌属，与已发现的好氧反硝化菌种 l i摘要硕士研究生学位论文 也有较高的同源性，今后应着重研究并探讨同源性较高的菌种在功能上的表现出的相似 性，并进行好氧反硝化工艺的扩大试验。 关键词：好氧反硝化菌；正交试验；溶解氧；诱变育种；纯种分离 硕士研究生学位论文 a b s t r a c tj i i a b s t r a c t a tp r e s e n t ，d u et ot h ed e v e l o p m e n to fi n d u s t r ya n dt h ei m p r o v 锄e n to fp e o p l e sl i v i n g s t a n d a r d ，w a s t e w a t e rh a sb e e ni n c r e a s i n gy e a rb yy e a r m en i t r o g e np o l l u t i o ni ns e w a g ei sg 甜i n g m o r ea 1 1 dm o r es 舐o u s ，a i l dt h ew a t e re u t r o p h i c a t i o nh a ss e r i o u s l ya f r e c t e dt h ep e o p l e s p r o d u c t i o na n dl i f e ，i nm i sc a s e ，f o rt h ew a s t e w a t e rd e n i t r i 6 c a t i o nt e c h n o l o g yr e s e a r c hi sm o r e a i l dm o r ei m p o n a n t a e r o b i cn i t r i f i c a t i o n - d e n i t r i f i c a t i o np r o c e s sh a sm a n ya d v a l l t a g e s ，s u c ha s s i m p l eo p e r a t i o n ， s m a nc o s to fo p e r a t i o n ，l e s s i n v e s t i i l e n to fi n 矗a s t m c t u r e s c h o l a r sa j l d r e s e a r c h e r st h i n ka e r o b i cn i t r i f i c a t i o n d e n i t r i f i c a t i o np m c e s si sb e c o m i n gf o c u si nt h es t u d yo f d e n i t r i f i c a t i o nt e c l u l o l o g yd o m e s t i ca n do v e r s e a s b u tb e c a u s eo fa e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n m e c h a n i s md o e sn o te x p l i c i t l y ，d e n i t r i f i c a t i o nr e a c t i o nc o n d i t i o n sr e s e a r c hi ss t i l li nt h ei n i t i a l s t a g e 1 1 1 i sp a p e rt h r o u 曲t h es 印a r a t i o na n du l t r a v i o l e tm u t a g e n i c i t y ，g e tas t r o n gd e n i t r i f i c a t i o n a b i l i t yo fa e r o b i cd e n i t r i 蛳n gb a c t e r i a ，a n dr e s e a r c ht h es t r a i n so nd e n i t r i 研n gc a p a c i t ys t u d ya 1 1 d a n a l y s i ss t r a i n sa 1 1 ds rd n as e q u e n c e s 印a r a t i n g ，s c r e e n i n gt h ea c t i v a t e ds l u d g ef o n nt h es e c o n dp o n do fs h e ny a n gn o n h e m s e w a g e t r e a t n l e n tp l a n t ；r e e a r c h e r sg o t 4a e r o b | c 。d e n i t r i 6 c a t i o n 。s t r a i n 、衲i c h e a n h a v | e d e n i t r i f i c a t i o nr e a c t i o ni na e r o b i cc a s e s t e s t i n gd e n i t r i f i c a t i o na b i l i t yo f4a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n s t r a i n s ，w eu s e ds t r a i n sw c j 4t od ot h er e s to fe x p e f i m e n t w c j 4s 倾i n so fn 0 3 。- n d e n i t r i 6 c a t i o na b i l i t ya r et h es t r o n g e s t ，n 0 3 一nr e m o v a lr a t ec a i lr e a c h61 4 6 ，b u tt o t a ln i t r o g e n - 锄o v a lr a t ei so n l y4 0 5 8 l o g 撕t h m i cg r o w t hp h a s eo f w c j 4s t r a i ni so 一1 6h ，a 加m o 趴o f t h e d e n i t r i 6 c a t i o nr e a c t i o nw i l lh a p p e na tt h i ss t a g e w ed i du l t r a v i 0 1 e tr a d i a t i o nm u t a t i o no nw c j 4 s t r a i n ，柚da r e rr e p e a t e ds c r e e n i n gg e tw z b 14s t r a i n s d e n i t r i f i c a t i o na b i l i t yo fw z bl4s 的i n s w a si m p m v e d ，n 0 3 一一nr e m o v a lr a t ei s9 1 2 1 ，a n dt o t a ln i t r o g e nr e m o v a lm t er e a c h e d8 5 7 4 a c c u m u l a t i o no fn 0 2 - nr e d u c e ds i 印衢c a n t l y ，a n df i n a l l yr e a c h e d6 3 0m l 0 b s e r v et h e r e s u l t so fc u l t i v a t e a r e r 孕锄s t a i n ，f i n ds t r a i nw z b 14i sp a l ey e l l o w ，c i r c u l a r e d g et i d y t m l l l ( d 巧g r a mp o s i t i v eb a c t e a i no r d e rt od e t e r m i n es t r a i n g r o w t hc u r v e ，f o u n dt h a t1 0 9 撕t h m i cg r o w t hp h a s eo fm e o r i 百n a l s t r a i nw c j 4i s16h o u r s ，b u ts t r a i nw z b14w h i c hi sa 1 f t e r m u t a g e n e s i si n d u c e d l o g a r i t i cg r o w t hp h a s ei s2 4h d e s i 印o fo n h o g o n a l t e s tf o u n dt or e s e a u r c ht h eo p t i m a lg r o w t h c o n d i t i o n so fw z b14s t r a i n s ，a n df o u n dc o n d i t i o nw a s p hi s6 ，t e m p e r a t u r ea t2 5 ，c 厂nr a t i o o f1o ，w i t hg l u c o s ea sc a r b o ns o u r c ec i r c u m s t a n c e s ，s t r a i nw z b14 黟e wb e t t e r a c c o r d i n gt om e a n a i y z i n go fo r t h o g o n a it e s tf o u n d ，i n n u e n c e 矗o mt h em o s tt ot h el e s so fw z b 14s t r a i n sg r o w t h i st e m p e r a t u r e ，c 门nr a t i o ，c a r b o ns o u r c e ，p hv a l u e o nt h eb a s i so f o r t h o g o n a l t e s t ，r e s e a r c h e dt h e o p t i m u mg r o w t hc o n d i t i o n s ，a n df o u n dt o t a ln i t r o g e nr e m o v a lr a t eo fs t r a i nw z b 14i n c r e a s e d f 沁m9 1 2 1 t o9 3 3 8 ，t h er e a s o nf o rt h ei n c r e a s ei st h a t 野o w t hc o n d i t i o no f w z b l 4s t r a i n si s g o o di no p t i m a lg r o w t hc o n d i t i o n s ，a n dn e e dm o r en u t r i e n t sa n dn i t r o g e ne l e m e n tf o rt h e i ro w n 掣o w t ha n dm e t a b o l i s m i na d d i t i o n ，s t u d yf o rd i s s o l v e do x y g e ni n n u e n c eo nd e n i t r i f i c a t i o na b i l i t yo fw z b 14s t r a i n s ， i n c r e a s i n gt h er o t a t i n gs p e e do fs h a k i n gt a b l et oi n c r e a s ed i s s 0 1 v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o ni n c u l t u r em e d i u m t h er e s u l to fe x p e r i m e n ts h o w e dm er e m o v a lr a t eo ft o t a ln i t r o g e ni n c r e a s ea s l v a b s t r a c t硕士研究生学位论文 t h er o t a t i n gs p e e do fs h a k i n gt a b l ei n c r e a s e b u tw h e nt h er o t a t i n gs p e e dw a sl6 0r m i na b o v e d e n i t r i f i c a t i o na b i l i t yo fw z b14s t r a i n sd i d n ti n c r e a s e sq u i c k l ya i l ym o r e w h e nt h ed i s s o l v e d o x y g e nc o n c e n t r a t i o ni nar e l a t i v e l yl o wl e v e l ，d e n i t r i f i c a t i o na b i l i t yo fw z b 14s t r a i n sh a sa s i 印i f i c a l l ti m p a c tb yd i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o n ，b u tw h e nd i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o n o f5 0m la b o v e ，d e n i t r i f i c a t i o na b i l i t yo fw z b14s t r a i n sc a i l n tb ei m p e c t e db yt h ee a e c t so f d i s s o l v e do x y g e n b a s e do ns t r a i nw z b1416s rd n as e q u e n c ea n a l y s i sf o u n dt h a ts t r a i nw z b14b e l o n gt o i 湎o d o c o c c u s ，16s rd n a1 e n g t hi s 139 6b p c o m p a r e i n gm eh o m o l o g yo fs t r a i nw z b14w i t h b a c t 舐a si nm es 锄eb a c t 嘶a lg e n u s ，h o m 0 1 0 9 yi sh i 曲e ra n da b o v e9 5 h a sb e e nf o u n dt h e r e s e a r c h e r st h a ti sb a c t e r i a lg e n u so fa e r o b i cd e n i t r i f 矾n g a n dr h o d o c o c c u sh a v eh i g h e r h o m o l o g yw i mt h ea e r o b i cd e n i t r i f 弭n gt h a th a db e e nd i s c o v e r e d i nt h e 向t l l r et h er e s e a r c h s h o u l df o c u so ns i m i l 撕t yp e r f o r n l a n c ei n 如n c t i o no fs t r a i n si nh i 曲e rh o m o l o g y ，a n de x p a n d i n g t e s to fa e r o b i cd e n i t r i f 如n gp r o c e s s k e y w o r d s ： a e r o b i cd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ； o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ； d i s s o l v e do x y g e n ； m u t a t i o nb r e e d 衄g ； s e p a r a t i o n 硕士研究生学位论文目次 i 目次 摘要i a b s t r a c t i i i 目次i 第一章绪论1 1 1 氮素污染现状及危害1 1 1 1 氮素污染现状1 1 1 2 氮素污染危害2 1 2 污水脱氮处理方法2 1 2 1 物理化学法2 1 2 2 生物脱氮方法3 1 3 好氧反硝化研究5 1 3 1 好氧反硝化菌研究现状5 1 3 2 好氧反硝化概念的明确5 l ：3 3 好氧反硝化的生物学解释6 1 3 4 好氧反硝化工艺的优势7 1 1 3 5 好氧反硝化微生物影响因素一7 1 3 6 好氧反硝化研究的不足1 0 1 4p c r d g g e 技术11 1 4 11 6 s rd n a 细菌分类基础1 1 1 4 21 6 s rd n a 的分析方法1 1 1 4 3 微生物鉴别中1 6 s rd n a 基因技术的应用1 2 1 4 4p c r d g g e 的优点和缺陷1 2 1 5 论文的研究意义、目的及内容1 3 1 5 1 好氧反硝化菌育种的意义、目的13 1 5 2 论文的研究的内容13 第二章试验材料与测定方法15 2 1 菌源1 5 2 2 试验主要仪器、药品及用品1 5 2 2 1 试验主要使用仪器15 2 2 2 试验所用培养基16 2 2 3 试验所用p c r d g g e 常用试剂1 6 2 2 4 试验药品17 2 2 5 试验分析测定方法1 9 1 1 目次 硕士研究生学位论文 2 3 本章小结1 9 第三章好氧反硝化菌的分离纯化2 l 3 1 前言2 1 3 2 试验方法2 1 3 3 实验结果2 2 3 3 1 好氧反硝化菌的分离纯化2 2 3 3 2 菌株生长曲线2 2 3 3 3 菌株w c j 4 的反硝化能力测试2 3 3 4 本章小结2 4 第四章紫外诱变育种2 4 4 1 前言2 4 4 2 试验方法2 4 4 2 1 菌悬液制备2 4 4 2 2 紫外诱变过程2 4 4 2 3 最佳照射时间确定：j ：一j ：2 4 4 2 4 正突变优势菌株筛选2 4 4 3 实验结果2 4 4 3 1 最佳照射时间：2 4 4 3 2 筛选正突变优势菌株：j 2 4 4 3 3 正交试验测定菌株w z b l 4 生长条件2 4 4 3 4 菌株w z b l 4 最适生长条件下的反硝化能力测试2 4 4 3 5 摇床转数对菌株w z b l 4 好氧反硝化效果的影响2 4 4 3 6 菌株w z b l 4 的个体形态2 4 4 3 7 诱变菌株w z b l 4 的生长曲线2 4 4 4 菌种保存2 4 4 5 本章小结2 4 第五章p c r 分析菌种1 6 sr d n a 序列2 4 5 1 前言2 4 5 2 试验方法2 4 5 2 1 菌体d n a 提取2 4 5 2 2p c r 反应2 4 5 2 3 凝胶制作方法2 4 5 2 4 电泳及凝胶保存2 4 5 2 5p c r 扩增产物检测及测序2 4 5 2 6 同源性分析和系统发育树的构建2 4 5 3 实验结果2 4 硕士研究生学位论文目次 i i i 5 3 1d n a 提取及凝胶电泳2 4 5 3 21 6 s rd n a 序列分析2 4 5 3 3 菌株w z b l 4 的b l a s t 检索2 4 5 3 4 序列同源性比较及系统分类鉴定2 4 5 4 本章小结2 4 第六章结论2 4 6 1 结 沦2 4 6 2 创新点2 4 6 3 建议2 4 参考文献2 4 作者简介2 4 致谢2 4 l v 目次硕士研究生学位论文 c o n t e n t s a b s t r a c t 一l a b s t r a c t i i i c o n t e n t s i c h a p t e r1i n t r o d u c t i o n 1 1 1p r e s e n ts i t u a t i o na n dt h eh a n no f n i t r o g e np o u u t i o n 1 1 1 1p r e s e n ts i t l l a t i o no f n i t r o g e np o u u t i o n 1 1 1 2n eh a r mo f n i t r o g e np 0 1 1 u t i o n 2 1 2s e w a g ed e n i t r i 6 c a t i o nt r e a t m e n tm e t h o d s 2 1 2 1p h v s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d 2 1 2 2b i o l o g i c a ld e n i t r i f i c a t i o nm e t h o d 3 1 3a e r o b i cd e n i t r i 母i n gr e s e a r c h 一5 1 3 1r e s e a r c hs t a t u so f a e r o b i cd e n i t r i f 弧n gb a c t 嘶a 5 1 3 2a e r o b i cd e n i t r i 研n gc o n c e p t 5 1 3 3b i o l o 百c a l i n t e 叩r e t a t i o no f ，a e m b i cd e n i t r i f y i n g ：_ ：o 。一6 1 3 4a d v a n t a g eo f a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o nt e c h n 0 1 0 9 y ：7 1 3 5a e r o b i cd e n i t r i 伽n gm i c r o o r g a n i s mi n f l u e n c ef a c t o r s j 7 1 3 6l i m i t a t i o n so f a e r o b i cd e n i t r i 伽n gs t u d y 1 0 1 4p c r d g g e t e c h n i q u e 一1 1 1 4 1b a s i so f16 s rd n ab a c t e 打a lc l a s s i f i c a t i o n 1 1 1 4 2a n a l v s i sm e t h o do f16 s rd n a 1 l 1 4 3a p p l i c a t i o no fm e16 s rd n a g e n et e c h n o l o g yi nm i c r o b i a l i d e n t i 6 c a t i o n 1 2 1 4 4m e r i t sa 1 1 dd e f e c t so f p c r d g g e 1 2 1 5r e s e a r c hs i 印i f i c a n c e ，p u 印o s ea 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a t i o na b i l i t vt e s to f s t r a i nw c j 3 2 3 3 4s u m m a r yo f c h a p t e r3 2 4 c h a p t e r4u l t r a v i o l e tm u t a t i o nb r e e d i n g 2 4 4 1f o r e w o r d 2 4 4 2t e s tm e t h o d 2 4 4 2 1b a c t 甜as u s p e n s i o np r 印a r a t i o n 2 4 4 2 。2p r o c e s so f u l t r a v i o l e tn l u t a t i o n 2 4 4 2 3 【) e t e 咖i n et h eb e s ti i t a d i a t i o nt i m e 2 4 4 2 4p o s i t i v em u t a t i o na d v a n t a g es t r a i ns c r e e n i n g 2 4 4 3t h ee x d e r i m e n t a lr e s u l t s 2 4 4 3 1b e s ti r r a d i a t i o nt i m e 2 4 4 3 2p o s i t i v em u t a t i o na d v a n t a g es t r a i ns c r e e n i n g 2 4 4 3 3o 砒o g o n a l t e s tm e a s u r e m e n tt os t u d yg r o w t hc o n d i t i o n so f s t r a i nw z b l 4 2 4 4 3 4d