（农产品加工及贮藏工程专业论文）克氏原螯虾头制备风味料和提取虾青素的研究.pdf

摘要 克氏原螯虾头制备风味料争提取虾青素的研究 学科、专业：农产品加工及贮藏工程 硕士研究生姓名：钱飞 指导教师： 过世东教授 摘要 本文以克氏原螯虾头为原料，利用剥除虾壳的虾头酶解制成调味料的基础原料，同 时利用虾壳提取虾青素，以达到废弃物的最大化利用。 本研究采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶分别对 克氏原螯虾头进行酶解，以谷氨酸含量和水解度为主要指标，兼以感官评定为辅，筛选 最佳蛋白酶。进行单因素实验和中心点组合实验进行实验设计，考察温度、时间、酶用 量、p h 值、固液比这五个因素对酶解效果的影响。通过分析，确定了碱性蛋白酶为最 佳水解酶，最佳酶解工艺条件为：酶解固液比l ：1 5 、酶解温度6 1 6 。c 、p h 值9 1 、酶与 底物比2 0 2 4 u g 、酶水解时间1 8 6 m i n 。在上述条件下，谷氨酸含量为1 1 0 9 m g 1 0 0 m l ， 水解度达到2 0 7 9 ，水解液干燥后呈淡黄色粉末状，释放出浓郁的虾香味。 本研究分别采用同时蒸馏萃取( s d e ) 和固相微萃取( s p m e ) 两种方法提取克氏原螯 虾头酶解产品物挥发性风味成分，通过气相色谱质谱联用仪对挥发性风味成分进行分 离鉴定。结果表明，s p m e 法所萃取到的化合物基本上都是沸点较低、分子较小的醇、 醛、酮、烷烃类等化合物，而s d e 法可得到较多的长链烃、醇、醛、酸、酯、烷烃类 等相关化合物。将s p m e 和s d e 法结合起来，可对挥发性风味物质进行综合分析。 本研究分析比较克氏原螯虾头以及其酶解产品的主要非挥发性风味成分中的游离 氨基酸和核苷酸类物质。结果表明，酶解后游离氨基酸含量明显增加，达到7 6 8 9 9 10 0 9 ， 其中必需氨基酸( 色氨酸除外) 含量为3 4 4 0 9 1 0 0 9 ，占总游离氨基酸的4 4 7 9 ；呈鲜味的 谷氨酸含量较高，为1 0 8 1 i o o g ，大大超过了其刺激阈值( o 5 9 1 0 0 9 ) ，且对比虾头增幅 也较大( 5 1 5 倍) ：呈甜昧较强的天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、 赖氨酸等的含量及增幅均较高，其他氨基酸含量也有不同程度增高。实验测定了肌酐、 g m p 、i m p 和肌苷在克氏原螯虾头以及酶解产品的含量，结果表明对鲜味贡献很大的 i m p 含量较高，对比虾头增幅较大。 本研究分析了克氏原螯虾头酶解产品的成分、卫生指标以及相关等理化性质。该产 品重金属含量以及卫生指标均达到水产调味品国家标准。同时测定了克氏原螫虾头酶解 产品的相对分子量分布、黏度等指标。研究发现：克氏原螯虾头酶解产品中肽的相对分 子量呈不连续分布，其中肽的相对分子质量在1 4 0 0 以上的较长肽链占8 0 9 ，相对分 子质量在4 0 7 9 5 0 之间的寡肽占8 9 4 ，相对分子质量在4 0 7 以下的小肽以及游离氨基 酸占2 5 1 ；通过对克氏原螯虾酶解产品的黏度研究发现，当浓度超过定限度时，浓 度与黏度呈指数增加，对其进一步加工有很重要的指导意义。 江南大学硕士论文 本研究以克氏原螯虾壳为原料，利用木瓜蛋白酶对其水解处理提取虾青素，通过中 心点组合实验设计优化最佳酶解工艺条件。结果表明，酶解最适条件为：酶解温度 4 8 5 、p h 值5 8 、酶与底物比为2 5 2 2 u g 、水解时间6 3 m i n 、提取总类胡萝b 素 1 1 5 7 6 i t g g 。高效液相检测其虾青素浓度达到1 3 0 6 ，显著提高萃取物中虾青素浓度。 本研究最大化利用克氏原螯虾头，制备了虾风味的调味料基础原料和提取了虾青 素，为虾的废弃物的综合利用提供新的途径。 关键词：克氏原螫虾头；虾壳：酶水解；挥发性风味成分；非挥发性风味 成分；类虾青素 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ec r a y f i s hh e a dh a sb e e nm a d et ob a s i cm a t e r i a lf o rc o n d i m e n tb yh y d r o l y z i n g ，a n d c r a y f i s hs h e l lh a sb e e nu s e df o rt h ee x t r a c t i o no fa s t a x a n t h i n ，w h i c hm a x i m i z e s t h eu t i l i z a t i o n o fw a s t e i nt h ee x p e r i m e n t ，p a p a i n ，p e p s i n ，n e u t r a lp r o t e i n a s e ，t r y p s i nw a su s e dt oh y d r o l y z e c r a y f i s hh e a d ，d e g r e eo fh y d r o l y s i s ( d h ) a n dg l u t a m a t ec o n t e n ta st h em a i ni n d i c a t o r sa n d s u p p l e m e n t e db ys e n s o r ye v a l u a t e ，s e l e c t i n gt h eb e s tp r o t e a s e t h e ns i n g l e f a c t o rt e s ta n d c e n t r a lc o m p o s i t ef o rt h ee x p e r i m e n t a lm e t h o do fc o m b i n i n gt h ee x p e r i m e n t a ld e s i g nt os t u d y t h et e m p e r a t u r e ，t i m e ，e s ，p h ，s o l i d - l i q u i dr a t i oo ft h ef i v ef a c t o r so nt h ee f f e c t so f e n z y m a t i ch y d r o l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l k a l i cp r o t e a s ei st h eb e s te n z y m e ，a n di t s o p t i m u mc o n d i t i o n sa r er a t eo fs o l i d l i q u i dr a t i ol ：1 5 ，p h9 1a n de s2 0 2 4 u gu n d e r6 1 6 c f o r18 6 m i n ，u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h eg l u t a m a t ec o n t e n ti su pt o11 0 9 m g 1 0 0 m l ，a n dd hi s 2 0 7 9 w i t hr i c hs h r i m pf l a v o r t h ev o l a t i l ec o m p o n e n t si nc r a y f i s hh e a da n dh e a dh y d r o l y s a t ew e r ee x t r a c t e db yu s i n g t w om e t h o d s ：s d ea n ds p m e a n dt h ec o m p o n e n t sw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e db yg c m s s p m em e t h o dt h ec o m p o u n d so fe x t r a c t i o na r ee s s e n t i a l l yt h el o w e rb o i l i n gp o i n t ，m o l e c u l a r s m a l l e ra l c o h o l s ，a l d e h y d e s ，k e t o n e sa n do t h e rc o m p o u n d s ，w h i l es d em e t h o dc o u l db em o r e l o n g - c h a i nh y d r o c a r b o n s ，a l c o h o l s ，a l d e h y d e s ，a c i d s ，e s t e r sa n do t h e rr e l a t e dc o m p o u n d s c o n s e q u e n t l y ，o n l yt h ec o m b i n a t i o no fs p m ea n ds d em e t h o d ，a n dc a l lc a r r yo u t c o m p r e h e n s i v ea n a l y s i so fv o l a t i l es u b s t a n c e s t h ef r e ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o n sa t p r e l a t e dc o m p o u n d sa n dt o t a lc r e a t i n i n ec o n t e n to f c r a y f i s hh e a da n dh e a dh y d r o l y s a t ew e r ei n v e s t i g a t e d a f t e rh y d r o l y s i s ，f r e ea m i n oa c i d s i n c r e a s e do b v i o u s l y , r e a c h i n gt o7 6 8 9 9 lo o g ，w h i c he s s e n t i a la m i n oa c i d s ( e x c e p tt r y p t o p h a n ) c o n t e n ti su pt o3 4 4 0 9 1 0 0 9 ，a c c o u n t i n gf o r4 4 7 9 ；g l u t a m a t et h a tt a s t e sf l a v o ri su pt o 1 0 81g 10 0 9 ，w h i c hi sm u c hh i g h e rt h a nt h es t i m u l a t i o nt h r e s h o l d ( 0 5 9 10 0 9 ) ，a n dal a r g e i n c r e a s e ( 5 15t i m e s ) ；t h ea m i n oa c i dw h i c ht a s t e ss t r o n gs w e e ta r eh i g hi nc o n t e n ti n c r e a s e ， s u c ha s ：a s p a r t i c ，h e n y l a l a n i n e ，t h r e o n i n e ，p r a l i n e ，s e r i n e ，g l y c i n e ，l y s i n ee t c ，o t h e ra m i n o a c i d sa l s oi n c r e a s e dt ov a r y i n gd e g r e e s i m p , g m p , i n o s i n ea n dc r e a t i n i n em a ya c t i m p o r t a n t l ya n ds y n e r g i s t i c a l l yt ot h ed e s i r a b l et a s t eo fc r a y f i s hh e a da n dh e a dh y d r o l y s a t e p h y s i c a la n dc h e m i c a li n d i c a t o r so fc r a y f i s hh e a dh y d r o l y s a t ei sa n a l y s e d ，h e a v ym e t a l s ， m i n e r a lc o n t e n ta n dt h eh e a l t hi n d i c a t o r sa sw e l l m e t a lc o n t e n ta n dh e a l t hi n d i c a t o r so ft h e p r o d u c th a v em e tt h er e q u i r e m e n t so fg bf o ru n i q u ef l a v o ra n dr i c hn u t r i t i o n t h er e l a t i v e m o l e c u l a rm a s sd i s t i l b u t i o nw e r es t u d i e d t h er e s u l t so fr e l a t i v em o l e c u l a rm a s sd i s t r i b u t i o n d e t e r m i n e db yg e lh p l cs h o w e dt h a tt h em rd i s t r i b u t i o no fe n z y m e - h y d r o l y z e dp e p t i d e w a s n tc o n t i n u o u s ，o fw h i c hw i t hm re x c e e d i n g14 0 0w e r e8 0 9 ；m e d i u m p e p t i d e sw i t hm r 4 0 7 - 9 5 0w e r e8 9 4 ；a n ds m a l l p e p t i d e sa n df r e ea m i n oa c i d sw i t hm rl e s st h a n4 0 7w e r e 9 6 b yt h er e s e a r c ho nt h ev i s c o s i t yo fc r a y f i s hh e a dh y d r o l y s a t e ，i tf i n d st h a tt h e c o n c e n t r a t i o na n dv i s c o s i t yi n c r e a s ee x p o n e n t i a l l yw h e nt h ec o n c e n t r a t i o ne x c e e d sac e r t a i n l i m i t ，t h ec o n c e n t r a t i o na n dv i s c o s i t yi n c r e a s ee x p o n e n t i a l l y ，w h i c hi sv e r yi m p o r t a n tg u i d i n g s i g n i f i c a n c ei ni t sf u r t h e rp r o c e s s i n g t h ec r a y f i s hs h e l lh a sb e e nh y d r o l y z e db yp a p a i nf o rt h ee x t r a c t i o no fa s t a x a n t h i n t h e 江南大学硕士论文 o p t i m a lh y d r o l y z e dc o n d i t i o nw a sd e t e r m i n e db yt h er e s u l t so fc e n t r a lc o m p o s i t ef o r e x p e r i m e n t a ld e s i g na n dt h ea n a l y s e so f r e g r e s s i o ne q u a t i o n ：4 8 5 co f t e m p e r a t u r e ，5 8o f p h ， 2 5 2 2 u go fe s ，6 3m i no fh y d r o l y z e dt i m e u n d e rt h ee x p e r i m e n t a t i o nc o n d i t i o nu s e d ，t h e a m o u n to ft o t a lc a r o t e n o i d si s115 7 6 1 峙g w e t ，a n dt h ed e n s i t yo fa s t a x a n t h i nr e a c h e st o 13 0 6 b yh p l c ，w h i c h eo b v i o u s l ye n h a n c e st h ed e n s i t yo f a s t a x a n t h i n i nt h i ss t u d y , t h ee n z y m ec o m p l e xf l a v o ra n dt h es h r i m pc a r o t e n o i d sw a sm a d e ，w h i c h m a x i m i z e dt h eu t i l i z a t i o no fw a s t e ，a n dp r o v i d e st h en e ww a yf o rc o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o n o fs h r i m pw a s t e k e y w o r d s ：c r a y f i s hh e a d ；c r a y f i s hs h e l l ；e n z y m o l y s i s ；v o l a t i l ec o m p o u n d s ；n o n - v o l a t i l e c o m p o u n d s ；a s t a x a n t h i n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：砷年7 月乡。日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：盈垒一一导师签名：趋进j 。 日期：岬年7 , 9 7 。日 1 引言 1 引言 1 1 克氏原螫虾头综合利用现状 我国虾类资源极为丰富，在虾仁加工过程中虾头、虾壳等下脚料仅少量用于制备几 丁质、提取氨基酸、萃取虾青素、萃取甲壳素、制备聚多糖等。克氏原螫虾头主要成分： 几丁质( 1 0 2 0 ) 、蛋白质( 2 0 - 4 0 ) 、虾油( 富含d h a 、e p a ) 、虾青素、各种氨基酸、 有益元素和维生素以及各种矿物质等。其中克氏原螯虾头蛋白质中必需氨基酸占 4 5 3 3 ，与牛奶蛋白粉的4 5 6 9 和酪蛋白的4 6 1 4 基本接近。克氏原螯虾头经水解可 制成营养丰富、具有保健治疗功能的调味品，又可作虾昧食品的添加剂；克氏原螯虾壳 可制成甲壳素，壳多糖及氨基葡萄糖盐酸盐等。 虾头的综合利用一般采用下面工艺流程( 图1 1 ) ，以制取多种用途的产品： 图1 - 1 虾的下脚料的综舌工艺流程怿1 f i g i 一1p r o c e s sfl o wo f t h ec o m p l e xu t i l i z a t i o no fs h r i m pw a s t e 克氏原螯虾头在国外除生产虾酱和甲壳质外，美国利用克氏原螯虾废弃物回收蛋白 质、提取虾青素等类胡萝卜素、生产虾粉、虾头液体饲料、调味海产品和模拟虾风味物 质；厄瓜多尔利用克氏原螯虾头来生产一种低纤维、低甲壳质的虾头浆与液体饲料，制 备聚氨基葡萄糖；日本把克氏原螯虾头磨成粉来用作鱼类饲料、作体表润色剂，还研究 分离了虾风味物质，并将其作为食品添加剂赋予食品以虾类的独特风味。同时，m a r j a a n a n o u s i a i n e n 等【6 】和t h e o d o s i af g a r o f a l a k i 等【7 j 对克氏原螯虾壳中蛋白质和克氏原螯虾头 中所含油脂进行分析，对国内克氏原螯虾头的利用有一定的对比与借鉴作用。 1 2 生物酶技术生产风味调料 生物酶解技术是利用酶的催化分解作用，将大分子的蛋白质在一定程度上切割成小 江南大学硕士论文 分子的肽类和氨基酸。酶在温和的条件下有特异的作用和功能，避免了使用极端的p r i 和温度。蛋白酶通常会给蛋白质带来功能性质上的有利变化，对水溶性物质的回收和风 味的形成作用很大，使它们更易添加到食品中以提高食品的营养价值，而且生物方法通 常更易获得好的风味。用酶解技术获得的水解动物蛋白含有大量的游离氨基酸，可以用 于调味品的增香，提高鲜度，增加风味料的浓度。在水产品的应用研究方面，使用蛋白 酶使鱼肉蛋白的溶解性增大，也有很多学者将具有蛋白酶活力的酶添加到鱼的碎料中以 提取海产品的风味物质，获得较高的经济效益【8 j 。 a s b j o mg i l d b e r g 9 】综述了海产品的副产品酶法加工。s i m p s o n 等【l o j 用胰凝乳蛋白酶 和胰蛋白酶水解新鲜的和冷冻的虾肉，得到的水解物中含有高含量的甘氨酸、脯氨酸和 精氨酸，并研究了产物的组成对品质的影响。h y u n g 等【l l 】用一种外切肽酶f l a v o u r z y m e 水解螃蟹的副产品，成功解决了以往酶制剂用于提取海产品风味物质时因为水解度不合 适而产生苦味的问题。k r i s t i n s s o n 等【1 2 】用碱性蛋白酶和内脏丝蛋白酶研究了大西洋鲑鱼 肌肉蛋白的水解动力学，研究发现，所选定的蛋白酶中，a l c a l a s e 2 4 l 的活力最高，经 济性最强。 1 3 风味物质研究 1 3 1 挥发性风味物质研究 食品中挥发性风味成分的分析十分复杂，样品的预处理方法对风味物质分析的结果 影响很大，从食品中提取出挥发性风味成分的样品制备方法可以分为根据化合物的溶解 性制备和根据化合物的挥发性制备两大类【l6 】。通常分析肉制品风味和芳香类物质的样品 制备方法有顶空分析法( h e a ds p a c e ，简称h s ) 、吹扫捕集法( p u r g ea n dt r a p ，简称p t ) 、 液液萃取法( l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n ) 、固相萃取法( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ) 、超临界流体 萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，简称s f e ) 、同时蒸馏萃取法( s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o n e x t r a c t i o n ，简称s d e ) 和固相微萃取法( s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，简称s p m e ) 等。 s d e 是l i c k e n s 和n i c k e r s o n ( 1 9 6 4 ) 提出的，是一种以蒸馏为基础的十分传统的风味分 析方法，广泛应用于熟肉、动植物油脂、蜂蜜、茶、蛋品、乳品以及各种果蔬风味物质 的样品分析制备方法【l 7 1 。虽然它存在溶剂污染和花费大的缺点，但是它在萃取时，对样 品进行了加热处理，模拟了烹煮的过程，非常适合对于煮虾挥发性风味的提取。虾及其 副产品( 尤其是虾头和内脏) 加热后产生挥发性风味成分，结合我国的饮食习惯，采用s d e 方法提取虾头的挥发性风味成分。固相微萃取技术( s p m e ) 是2 0 世纪9 0 年代以来出现的一 种比较新颖的风味分析技术【l8 1 。它几乎克服了以前一些传统样品处理中的所有缺点，具 有无需有机溶剂、简单方便、测试快的优点，已经广泛用于食品挥发性风味成分的分析 检测，如火腿【1 9 , 2 0 】、猪肉【2 1 ，2 2 1 、牛肉【2 3 ，2 4 1 、南京盐水鸭【2 5 】、鱼医j 2 6 , 2 7 】、海扇贝【2 8 i 等食品 风味的检测结果都有报道。 对于风味成分的定量分析方法有面积归一法、内标法、外标法。归一法要求各成分 能流出色谱柱，并能在色谱图上显示出色谱峰时方能进行定量计算，但由于组分的相应 因子不同，无法得到准确的定量结果：外标法也称标准曲线法，这种方法受到分析条件 1 引言 的限制，对操作者的分析水平要求较高，目前常用的是内标法，该方法将一定量的标准 纯物标加到样品中，同时测定内标物和各成分的峰面积和对应值，计算出个组分在样品 中的含量，因此可以消除实验操作中的误差，克服归一法的缺点，检测结果也较归一法 准确。然而，同一监测器对不同物质具有不同的相应值，两个等量的不同物质出峰面积 往往不相等，由于缺少标样，到目前为止，各种成分对特定监测器的相对校正因子都没 有报道瞳9 1 。 挥发性成分是水产品风味质量的重要因素，它们对风味的贡献取决于其阈值和浓 度。目前对克氏原螯虾头研究主要停留在蛋白、氨基酸组成、脂肪酸等基本营养成分的 分析，以及制作克氏原螯虾头营养品工艺方面的研究，对其风味的研究还是空白。 1 3 2 非挥发性风味物质研究 食品的特殊味道决定于水溶性的、低相对分子质量的非挥发性风味成分。它们可以 产生酸味、甜味、苦味、咸味等四种基本滋味，以及鲜味、辣味、涩味、金属味等其他 独立滋味【3 们。在甲壳类鱼肉中，非挥发性成分是基本风味的生成因素。按种类分为含氮 化合物( 游离氨基酸、核苷酸、有机碱和相关化合物) 和不含氮的化合物( 糖、有机酸和无 机化合物) 以及其他的化合物如维生素、矿物质和色素等1 3 。研究结果表明，鲜味存在 于4 0 多种化合物中，如游离氨基酸、小肽、甜菜碱、核苷酸、酰胺、有机碱、有机酸等 滋味呈味物【3 2 】。而对肉类的鲜味贡献最大的化合物主要有两大类：一类是以游离谷氨酸 为代表的氨基酸类化合物。另外一类是以5 肌苷酸( i o n o s i n e 5 m o n o p h o s p h a t e ，简称 i m p ，又称5 次黄嘌呤核苷酸) 、5 鸟苷酸( g u a n o s i n e 5 - m o n o p h o s p h a t e ，简称g m p ，又 称5 鸟嘌呤核苷酸) 为代表的5 核苷酸及其衍生物，统称为核苷酸类鲜味料 3 3 j 。因此， 最重要的非挥发性成分是氨基酸和核苷酸。 游离氨基酸是肉类重要滋味物和香味前体物，这类物质来源于内源蛋白酶对蛋白质 的分解作用。游离氨基酸的味感与其疏水性呈显著的负相关，疏水性较弱的游离氨基酸 味甜，而疏水性较强的氨基酸味苦。黄涛p 4 j 通过对不同品种鸡肌肉风味品质的研究表明： 肉中各种游离氨基酸是共存的，且这种共存关系对肉的特殊昧感的形成是必需的。因此 游离氨基酸对肉滋味的贡献不仅与其绝对含量有关，、而且受游离氨基酸相互平衡的影 响。甲壳类鱼肉中含有大量的精氨酸、牛磺酸、甘氨酸和脯氨酸。这些游离氨基酸使得 甲壳纲动物有一种甜的味道，并且在加热期间生产挥发性风味化合物。游离氨基酸是各 种水产品重要滋味的呈味物和香味前体物。 核苷酸是较为重要的鲜味物质，甲壳类鱼肉中的核苷酸有1 0 0 多种，他们有不同的 生理功能。从食品化学角度来看他们还是呈鲜味物质，特别是肌苷酸和核苷酸与味精( 谷 氨酸钠m s g ) 混合时产生协同效应( 又称相乘作用) ，具有显著的增鲜作用。肌苷酸对甜味、 肉味有增效作用，对咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，即有味觉缓冲作用1 35 。水产 类食品中核苷酸含量对研究水产类风味以及呈昧物质之间的相互关系有着重要的意义。 1 4 虾青紊的提取研究 虾青素( a s t a x a n t h i n ) ，学名为3 ，3 二羟基一4 ，4 一二酮基1 3 ，p 胡萝卜素，属于叶黄族 江南大学硕士论文 ( x a n t h o - h y l l s ) 酮式类胡萝卜素，易溶于有机溶剂，难溶于水，具有独特的着色、抗氧化、 防癌p 、促进抗体产生、抵御紫外线、改善视力、免疫力、色素形成和神经连通以及 改善生育等功能【3 8 】。虾青素广泛存在于自然界中，女1 ：i - 大多数甲壳类动物和鲑科鱼类体 内，植物的花中以及火烈鸟的羽毛中等，起显色作用。 天然虾青素一般有如下来源：从水产品加工废弃物中提取虾青素、利用藻类如雨生 红球藻( h a e m i t t o e o c c u sp l u v i a l i s ) 等生产虾青素、利用细菌如乳酸分支杆菌( m y c o h a c t e r - i n m ，l a c t i e o l a ) 生产虾青素、利用法夫酵母( p h a f f i a r h o d o z y m ) 发酵生产虾青素等。据文献 资料表明：s s a h i n d r a n m 等【3 9 1 在印度洋海域的甲壳纲动物中，发现虾青素及其酯占总类 胡萝卜素的6 5 5 6 7 6 ；g l a d i s n 等【4 0 j 通过实验证明在墨西哥弯捕获的龙虾中，虾青 素双酯、单酯、游离虾青素及叶黄素分别占总类胡萝卜素的7 、1 2 、1 0 、8 。 目前，提取虾青素的方法有很多，姜启兴等【4 l j 报道了目前国内外从甲壳类水产品加 工下脚料中提取虾青素的提取方法有碱提法、油溶法、有机溶剂法、超临界c 0 2 萃取 法。本实验主要采用酶处理后，采用有机溶剂提取。 1 5 立题背景和意义 随着养虾业飞速发展，各种虾的加工也不断扩大，有大量的虾头被当作废物丢弃，这 样既浪费了资源，又对环境造成极大的污染。同时在国内的克氏原螯虾加工中，虾头中 约3 0 的钙盐、约3 0 的蛋白质均未回收利用，绝大多数虾青素经日光照射和高锰酸钾 氧化脱色被除去。总之，对克氏原螯虾头的开发和利用率均较低，有很大的市场前景。 虾作为一种具有独特风味的食物，除具有丰富的营养之外，还具有四十多种生香成 份，可制成一种天然的的调味珍品。利用蛋白酶水解虾头可生产虾调味料，更好地利用 虾头这资源，开发新产品，因此，通过酶水解虾头，制成各种调味品以及营养品，具有 十分重要的现实意义。 尽管人工合成虾青素在成本上具有相当的优势，天然虾青素产品仍然在市场上活 跃。这主要是由于积累在动物产品中的天然产物进入人的食物链后对人体的健康有更好 的影响。使用对人体或动物体健康有营养或保健功能的着色剂，是未来着色剂发展的方 向。因此，通过提取天然虾青素，开发天然虾青素产品是未来虾青素产业发展的趋势。 总之，利用宝贵的虾头资源，对于淡水生物资源的综合开发利用和大力发展循环经 济都将起到重要的推动作用，同时将对我国长江流域环境保护以及农民增收做出贡献。 1 6 本课题研究的主要内容 本文以克氏原螯虾头为原料，展开了以下研究： ( 1 ) 以剥除壳的克氏原螯虾头为主要原料，制取调味料的基础原料。 ( 2 ) 禾l j 用s d e 和s p m e 法提取克氏原螯虾头酶解产品挥发性成分，并分离鉴定。 ( 3 ) 分析克氏原螯虾头酶解产品的主要非挥发性成分( 核苷酸和氨基酸) ，研究酶解对 克氏原螯虾头非挥发性风味物质的影响。 ( 4 ) 分析克氏原螫虾头酶解产品成分、卫生指标以及其理化性质。 ( 5 ) 以克氏原螯虾壳为原料，探索性研究提取虾青素工艺。 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 试验材料与设备 2 1 1 试验材料 克氏原螯虾头( 水分7 5 1 6 、粗蛋白1 2 5 7 、灰分4 2 7 、粗脂肪2 7 1 、糖类o 9 4 ， 其他4 3 5 ) ，江苏宝龙集团有限公司提供。 中性蛋白酶( 7 5 3x1 0 4 u g ) 、酸性蛋白酶( 3 0 5x1 0 4 u g ) 、碱性蛋白( 2 8 1x1 0 4 u d 、 木瓜蛋白酶( 4 6 2 x1 0 4 u g ) ，无锡杰能科生物工程有限公司；胰蛋白酶( 8 2 6 x1 0 4 u g ) ，国 药集团化学试剂有限公司。 戊酸甲酯( 色谱纯) ，广卅i 伟伯化工有限公司；虾青素标准样品，购于s i g m a 公司； i m p 和g m p 标品，江南大学测试中心提供；肌苷和肌酐，国药集团化学试剂有限公司。 福林试剂，实验室自制；乙腈、甲醇、三氟乙酸，为色谱纯试剂；无水乙醚、碳酸 钠、酪氨酸、磷酸二氢钠、丙酮、磷酸氢二钠、硼酸、硼砂、甲醛、干酪素、硫酸铜、 硫酸钾、浓硫酸、浓硝酸、无水n a 2 s o 。、氢氧化钠、盐酸、甲醛、柠檬酸、氯化钠、葡 萄糖等均为分析纯。 2 1 2 主要仪器设备 u v - 2 1 0 0 型分光光度计，尤尼柯( 上海) 仪器有限司；冷冻干燥机，美国热电公司； d e l t a 3 2 0 s 型酸度计，梅特勒托得多( 上海) 仪器公司；w a t e r s6 0 0 高效液相色谱仪， 美国w a t e r s 公司；3 k 3 0 冷冻离心机，s i g m a 公司；t u 1 9 0 0 双波长紫外扫描仪，北 京普析通用仪器有限公司；r e 一8 5 z 型旋转蒸发仪，上海青浦沪西仪器厂；s b a 4 0 c 生 物传感仪，山东省科学院生物研究所气相色谱质谱联用仪：t r a c em s ，美国f i n i g o n 质 谱公司制造；s p m e 萃取装置( 萃取头7 5 9 md v b c a r p d m s ) ，上海安谱科学仪器有限 公司；s d e 装置，实验室定制；o l d e r s h a w 精馏浓缩柱，江南大学分析测试中心等。 2 2 试验方法 2 2 1 克氏原螯虾头酶解工艺研究 2 2 。1 1 原料的预处理 将克氏原螯虾头洗净，晾干水分，剥除虾壳( 做为提取虾青素原料) ，用万能粉粹机 粉碎，冻藏备用。 2 2 1 2 酶解工艺流程 虾头浆叶加缓冲液混合一恒温水浴振荡酶解_ 灭酶( 沸水浴1 0 m i n ) _ 离心一清取上 液干燥一杀菌理化测定。 将虾头浆在常温下解冻，按固液比为1 ：1 5 加水在一定条件下进行水解，水解过程 调节p h 值。酶解结束后，立即沸水浴1 0 r a i n 灭酶，最后3 0 0 0 d m i n 离心l o m i n 得酶解 上清液。 江南大学硕士论文 2 2 1 3 酶的筛选 原料经解冻后、粉碎，准确称取1 0 9 于锥形瓶中，按固液比1 ：1 5 加入对各种酶适 宜p h 值缓冲液，然后按酶与底物比分别加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、 胰蛋白酶和碱性蛋白酶，立刻放入调好温度的恒温水浴锅中，进行酶解反应3 h 。水解结 束后立即移至沸水浴中，灭酶1 0 m i n ，离心取上清液作相关测定。以谷氨酸含量、水解 度( d h ) 作为主要评价指标，兼以酶解液风味的感官评定为辅助指标，筛选出最佳水解酶。 2 2 1 4 单因素实验 确定虾头酶解的五个因素水解时间、酶与底物比、温度、p h 和物液比的最适条件。 ( 1 ) 水解时间的确定 为了确定水解时间对水解度的影响，准确称取虾头浆1 0 9 ，在p h 9 0 、固液比1 ：1 5 、 温度6 06 c 、酶与底物比为2 0 0 0 u g 的情况下分别水解1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 、6 h ，观察不 同酶解时间对酶水解效果的影响，绘制趋势线。 ( 2 ) 酶与底物比的确定 为了确定酶与底物比对水解效果的影响，准确称取虾头浆1 0 9 ，在p h 9 0 、固液比 1 ：1 5 、温度6 0 4 c 、水解3 h 条件下，分别按酶与底物比5 0 0 u g 、1 0 0 0 u g 、1 5 0 0 u g 、2 0 0 0 u g 、 2 5 0 0 u g 、3 0 0 0u g 、3 5 0 0 u g 加入酶，观察不同酶与底物比对酶水解效果的影响，绘制 趋势线。 ( 3 ) 水解温度的确定 为了确定水解温度对水解效果的影响，准确称取虾头浆1 0 9 ，在p h 9 0 、固液比l ：1 5 、 酶与底物比2 0 0 0 u g 、水解时间3 h ，分别在3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 下进行水解， 观察不同酶解温度对酶水解效果的影响，绘制趋势线。 ( 4 ) 初始p h 值的确定 为了确定初始p h 对水解效果的影响，准确称取虾头浆1 0 9 ，在固液比l ：1 5 、酶与 底物比2 0 0 0 u g 、水解时间3 h 、水解温度6 0 c 下，分别在p h 7 0 、p h 8 0 、p h 9 0 、p i l l 0 0 、 p h l1 o 条件下水解，观察不同初始p h 值对酶水解效果的影响，绘制趋势线。 ( 5 ) n 液比的确定 1 为了确定固液比对水解效果的影响，准确称取虾头浆1 0 9 ，在p h 9 0 、酶与底物比 2 0 0 0 u g 、水解时间3 h 、水解温度6 0 ，分别以固液比4 ：1 、2 ：1 、1 ：1 、l ：1 5 、1 ：3 加入 缓冲液，观察不同的固液比对酶水解效果的影响，绘制趋势线。 2 2 1 5 中心点试验对酶解工艺的优化 为了确定克氏原螯虾头酶水解的最适条件，同时考虑到各因素之间的交互作用，本 实验以谷氨酸含量、水解度为主要参考指标，兼以酶解液风味感官评定作为辅助指标。 采用中心点组合试验设计，回归分析用s a s8 0 完成。 2 2 2 克氏原螯虾头酶解产品挥发性风昧成分分析 2 2 2 1 样品制备方法 重蒸无水乙醚：将无水乙醚用o l d e r s h a w 柱，4 5 蒸馏，去掉前2 0m l 、后2 0m l ， 得中间馏分。 6 2 材料与方法 无水n a 2 s 0 4 ：将无水n a 2 s 0 4 在5 0 0 ( 2 下灼烧3 小时，放在干燥器中冷却，备用。 内标溶液配制：称取1 0 0 m g 戊酸甲酯至于1 0 0 m l 的容量瓶中，用无水乙醇定容。 同时蒸馏萃取( s d e ) 法：样品8 9 ，均匀的加入至l j l 0 0 0 m l 圆底烧瓶，加几颗沸石，加 水4 0 0 9 ，加入内标溶液0 5 m l ，接s d e 装置一端，用电热套加热；装置的另一端接2 5 0 m l 圆底烧瓶，内装l o o m l 重蒸乙醚，5 0 c 恒温水浴加热回流1 5 0 r a i n 。收集乙醚萃取液，加 入干燥的无水硫酸钠适量，放入冰箱内冷冻2 4 h ；过滤后用o l d e r s h a w 精馏浓缩柱4 5 * ( 2 水 浴除去乙醚，浓缩至l m l 左右，装入尾瓶中贮于1 8 冰箱中，待气相色谱一质谱联用仪 分析。 固相微萃取( s p m e ) 法：样品8 9 ，装入1 5 m l 样品瓶中，将样品瓶置于5 0 c 的水溶 液中保温1 5 m i n ，萃取头5 0 顶空吸附4 0 m i n ，气相进样口2 5 0 下解析2 m i n 。 2 2 2 2 测定条件 色谱条件：色谱毛细管柱为o v l7 0 1 柱( 柱长3 0 m ，内径0 2 5 m m ，液膜厚度0 2 5 1 a m ) ； 起始温度3 2 ，保持3 m i n ，然后以4 。c m i n 的升温速度升温到6 0 c ，再以8 * c m i n 的 升温速度升温到1 0 0 * c ，最后以1 8 c m i n 的速度升温到2 4 0 c ：汽化室温度2 5 0 ( 2 ；进 样量l 皿；载气为h e ，体积流量0 8 m l m i r a 分流比为1 0 ：1 2 。 质谱条件：电离方式为e i ，电子能量7 0 e v ，灯丝发射电流为2 0 0 “a ，离子源温度 为2 0 0 ，接口温度为2 5 0 。 2 2 2 3 数据处理 实验数据处理由x c a l i b u r 软件系统完成，未知化合物经计算机检索同时与n i s t 谱库 ( 10 7 kc o m p o u n d s ) 和w i l e y 谱库( 3 2 0 kc o m p o u n d s ，v e r s i o n 6 0 ) 相匹配，仅当正反匹配度 均大于8 0 0 ( 最大值为1 0 0 0 ) 的