（食品科学与工程专业论文）冷冻干燥技术生产直投型酸奶发酵剂的研究.pdf

查韭查些查兰 堡堡王堡垫查竺主壁塑皇丝型垄壁型塑竺窒 堡主堂垡笙奎 摘要 本试验针对我国酸奶发酵剂应用现状，以优化选育的嗜热链球菌( s t ) 和保加利亚乳 杆菌f lb ) 为原菌种，对其促生长物质、培养条件、菌体富集方法、冻干保护剂进行了系 统研究，旨在为直投型酸奶发酵剂生产提供依据。 fs t 和lb 在6 种培养基中生长情况比较结果表明：在含有乳成分( 乳清、酪蛋白水 解物) 和天然促生物质( 蕃茄汁等) 的培养基中，s t 和l b 生长相对较好。以乳成分作为增 菌培养基的基质，采用简单组和设计，试验了不同浓度、水解条件( 水解用酶：胰蛋白酶， 时间：3 0 或6 0 分钟，p h = 8 ) 、不同配比的脱脂乳和乳清的增菌效果，结果发现乳清水解 后促生效果明显优于未水解组分，水解脱脂乳增茵效果不尽理想。各组分配比试验中， 4 脱脂乳和6 乳清酶解液以t ：1 混合获最佳增茵效果，固形物含量过高或过低均不利 于s t 和l b 的生长。增菌因子单因素实验表明：酵母粉、蕃茄汁、麦芽汁、啤酒是较为 有效的生长促进因子，缬氨酸对s t 、甲酸对l b 增殖作用显著。从培养基成分综合性考 率，对s t 和l b 分选六种增菌因子，采用三因素三水平两组正交实验( 天然物质为一组， 化合物为一组) 相叠加的设计，确定了乳基质培养基中增菌因子最佳配方： s t ：o 7 酵母粉、5 麦芽汁、5 蕃茄汁、2 乳糖、0 0 5 缬氨酸 l b ：o 7 酵母粉、5 麦芽汁5 蕃茄汁、2 乳糖、7 0 m g k g 甲酸 在此培养基中经3 7 、1 2 小时培养s t 和l b 的菌数分别达5 2 0 x1 0 5 c f u m l 和47 5 x1 0 8 c f u m l ，碳酸钙做为增菌的盐类是不适宜的。采用三因素二次饱和d 最优设训分别 确定s t 和l b 优化培养方程及条件： s , t ：y = 0 5 8 0 0 3 8 x l - 0 0 0 4 x 2 - 0 0 0 2 x 3 0 0 3 1 x 1 2 + 0 0 0 4 x l x 2 0 0 1 l x l x 3 0 0 1 9 x 2 2 + 0 0 0 2 x 2 x 3 0 0 18 x 3 2 ( t ：4 1 8 p h ：6 1 t ：4 6 h r s ) l b ：y = 0 4 9 4 + 0 0 0 3 x 2 + 0 0 0 8 x 3 - 0 0 2 3 x 1 2 + 0 0 0 3 x l x 2 0 0 0 5 x l x 3 - 0 0 18 x 2 2 - 0 0 0 2 x 2 x 3 0 0 1 4 x 3 2 ( t ：4 2 5 cp h 5 9 t ：4 7 h r s ) 在相应条件下培养，s t 和lb 菌数分别增至5 8 0 1 0 c f u m l ，3 0 5 1 0 c f u m l 。 对离心富集条件进行选择研究，结果显示：分离转数和温度是影响富集的两大因素， 高分离转数和较低温度利于菌体富集，蛋白溶解剂的加入减少了培养液中的蛋白颗粒， 提高了离心浓缩倍数。离心富集后s t 和l b 菌数分别可达1 9 5 x1 0 “c f u g 、1 0 2 1 0 ”c f u g 。细菌过滤器的富集方式对菌体形态影响小，但操作过程繁琐、处理量小，不 适合1 = 业化生产。 以脱脂乳为冻干悬浮基质 s t ( 1 5 ) 、l b ( 1 0 ) ) ，在此基础上的冻干保护剂单因子实 验的结果中发现：侧金盏花醇、维生素c 、甘油、蔗糖、海带汁是较为有效的保护剂， 谷氨酸钠对s t 保护效果显著，胱氨酸对l b 保护效果显著。侧金盏花醇对s t 和l b 的 保护效果最好，但其价格昂贵，应用性受到限制。运用兰因素二次旋转正交组合设计建 立l b 保护剂组合模型 y = o 7 2 5 3 0 0 6 9 2 x 1 0 0 3 0 l x l 2 + o 0 1 8 6 x 2 0 0 5 5 6 x 3 + 0 0 1 5 9 x 3 x 2 0 0 3 3 7 x 3 2 在此模型下得到的最优保护剂配方( 甘油i 维生素c 0 3 胱氨酸0 。l ) 可使冻干存活 率达7 9 ，保护剂中胱氨酸和维生素c 的联合作用效果明显，较低的甘油浓度利于其抗 东北农业大学冷冻干燥技术生产酸奶直投型发酵剂的研究 硕士学位论文 冻保护作用的发挥：运用五因素二次旋转正交组合设计建立s t 的冻干保护剂组合模型 y = o 8 4 4 0 0 0 6 4 3 x 12 0 0 6 4 6 x 2 2 + 0 0 0 6 8 x 3 - 0 0 7 1 2 x 3 + 0 0 0 7 5 x 4 0 0 0 0 6 8 x 4 + 0 0 0 6 0 x s + o 0 6 9 5 x 5 2 在此模型下得到的最优保护剂配方( 蔗糖5 甘油2 谷氨酸钠o8 维生素c 1 海带 汁5 ) 可使s t 的冻干存活率达8 4 ，保护剂两两之间作用方式相似，各保护剂在零水 平附近时保护作用较好。 冻干菌培养物电镜观察表明：保护剂的加入使冻干基质呈疏松空间网络结构( s t 为 溶岩状，l b 为菜花状) 为菌体存活提供了空间保护屏障；同空白组相比，保护剂的加入 对维持菌体形态起到了很好的作用，冻干后菌体形态变化较小；空白组冻干基质成片层 结构，菌体外露于表面，易受外界不良因素侵袭。 对发酵剂应用特性进行研究，同传统发酵剂相比，冻干发酵剂除产酸稍弱、凝乳时 间稍长( 4 小时5 0 分) 外，制得的酸奶风味、质地均可，组织状态优于液体发酵剂酸奶。广一 关键词：酸奶发酵剂增殖培养徘保护剂冷冻干燥 i i 东北农业大学 冷冻干燥技术生产酸奶直投型发酵剂的研究 硕士学位论文 s t u d y o ft h ep r o d u c t i o no f d i r e c t - t o v a ty o g h u r t c u l t u r e u s i n gf r e e z e d r y i n gt e c h n o l o g y a b s t r a c t c o u n t e r i n gt h ey o g h u r tc u l t u r ea p p l i c a t i o na c t u a l i t yi n o u rc o o n t r y ，t h i se x p e r i m e n t s y s t e r m i c a l y s t u d i e dm a n u f a c t u r em e c h a n i s m sa n d t e c n i q u e s o fd i r e c t - t o 。v a t y o g h u r t c u l t u r et h es o u r c e f u lb a c t e r i aw e r e ：s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l i u sa n dl a c t o b a c i l l u sb a l g a r i c u s w h i c hw e r ec h o s e na n do p t i m i z e dt op r o p a g a t e t h er e s u l t so fs ta n dlbg r o w no nt h es i xc u l t u r e ss h o w e d ：t h er e c o v e r yw a sg o o d o n t h ec u l t u r ew h i c hc o n t a i n e dm i l kc o n t e n t s ( e gw h e ya n dc a s e i nh y d r o l y s a t e s ) a n dn a t u r a l s t i m u l a t e dg r o w t hs u b s t a n c e s ( egt o m a t oj u i c e ) t h i n g k i n go ft h em a n u f a c t u r i n gc o s ta n dt h e n e e do f l o wc o n t e n to f t o t a ls o ld ( t s ) o f t h ec u l t u r e ，w et e s t e dt h es t i m u l a t e dg r o w t he f f e c to f m i l ka n dw h e yw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 、r a t i o sa n dh y d r o l y s i sc o n d i t i o n s ( e ：t r y s i n t ：3 0 0 r 6 0 m i n p h = 8 ) ，e n z y m e - t r e a t e dw h e y w a sa p p a r e n t l ys u p e r i o rt ow h e y ；e n z y m e - t r e a t e d m i l ki sn o ti d e a lt h em i d d l ec o n t e n to f t sm i l k ( 4 ) a n de n z y m e - t r e a t e dm i l k ( 5 ) ( t h er a t i oi s l ：1 1g a i n e dt h eb e s ts t i m u l a t e de f f e c t ，h i i g hc o n t e n to ft sa n dl o wc o n t e n to ft sw e r eb o t h u n s a t i s f a c t o r yf o rs t sa n dl b sg r o w t h t h es i m p l ef a c t o re x p e r i m e n to f s t i m u l a t e dg r o w t h g e n es h o w e d t h a ty e a s tp o w d e r 、t o m a t o j u i c e 、m a l t j u i c ea n db e e rw e r ea l le f f e c t i v es t i m u l a t e d g r o w t hg e n e s t h ee f f e c t so f v a l a n df o r m i ca c i dw e r ea l s oa p p a r e n t u s i n gt h eq u a d r a t i cd e s i g n l 9 ( 3 4 ) ( t h er e s u l t so ft w og r o u pl 9 g 。) w e r ea d d e d ) t od e t e r m i n et h eb e s ts t i m u l a t e dg r o w t h g e n e sf o r m u l ao f t h em i l ka n dw h e y b a s e dc u l t u r e ： st ：5 t u m a t u j u i c e 5 m a l t j u i c e0 7 y e a s tp o w d e r 0 0 5 v a l2 l a c t o s e l b ：5 t o m a t o j u i c e5 m a h j u i c e0 7 y e a s tp o w d e r7 0 m g k gf o r m i c a c i d2 l a c t o s e g r o w no nt h i sc u l t u r ef o r1 2 h r sa t3 7 sta n dl bg o tt o52 0 x 1 0 0 c f u m la n d 47 5 1 0 s c f u m lr e s p e c t i v e l y c a l c i u mc a r b o n a t ew a sn o ts u i t a b l ea st h es t i m u l a t e ds a l tu s e s a td e s i g nt od e t e r m i n et h ec u l t i v t i n ge q u a t i o na n dt h eo p t i m u mc u l t i v i t i n g c o n d i t i o n s ： s t ：y = o 5 8 0 0 3 8 x i - 00 0 4 x 2 - 0 0 0 2 x s 一0 0 31 0 l + 0 0 0 4 x t x 2 0 0 1l x l x 3 00 1 9 x 2 + o 0 0 2 x 2 x 3 - 0 0 1 8 x 3 2 ( t ：4 1 8 p h ：6 1 t ：4 6 h r s ) lb y = o4 9 4 + 00 0 3 x 2 + 0 0 0 8 x 3 0 0 2 3 x l + o 0 0 3 x l x 2 - 0 0 0 5 x l x 3 0 0 1 8 x 2 - 0 0 0 2 x 2 x 3 - 0 0 1 4 x s 2 ( 4 2 5 cp h ：5 9t ：4 7 h r s ) c u l t i v a t e du n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h et w ob a c t e r i ar e s p e c t i v e l yi n c r e a s e dt o5 8 0 1 0 9 c f u m l a n d30 5 1 0 9 c f u m 1 t h ec o n c e n t r a t i n ge n r i c h m e n tc o n d i t i o n sw e r es t u d i e da n dc h o s e n ，t h er e s u l t si l l s t r u t e d t h a tr p ma n dt e m p e r a t u r ew e r et w od m i n a n tf a c t o r s h i g hr p ma n dr e l a t i v e l yl o wt e m p e r a t u r e w e r eh e l p f u lf o rb a c t e r i a sc o n c e n t r a t i n g t h ea d d i t i o no fp r o t e i ns o l v e n tr e d u c e dt h ep r o t e i n p a r c e l so f t h ec u l t u r e ，t h u si m p r o v e dt h ec e n t r i f u g a t i o nc o n c e n t r a t i n gt i m e s t h eb a c t e r i af i l t e r h a dl i t t l ei n f l e n c eo nt h eb a c t e r i a sm o r p h l o g y , b u tt h eo p e r a t i n gp r o c e s sw a sl a b o u r - l o s ta n d l t i 东北农业大学冷冻干燥技术生产酸奶直投型发酵剂的研究 硕士学位论文 w i t hl o wp r o d u c t i v i t y , s on o ts u i t a v b l ef o rl a r g e - s c a l ep r o d u c t i o n m i l kw a su s e da sf r e e z e d r y i n gm e d i u m ( s t ：1 5 l b ：1 0 ) b a s e do nt h i sm e d i u m ，s i m p l e f a c t o re x p e r i m e n t o f c r y o p r o t e c t a n ts h o w e d ：a d n i t o l 、v c 、g l y c e r o l 、s u g a r a n d k e l p j u i c ew e r e v e r ye f f e c t i v ep r o t e c t i v ea g e n t s s o d i u mg l u t m a t ew a sw i t hhj i g hp e r f o r m a n c e f o rs , ta n dc y s w a sw i t hh i g hp e r f o r m a n c ef o rl b t h ee f f e c to f a d n i t o lw a st h eb e s tf o rb o ms ta n dl b b u t i t sh i g hp r i c el i m i t e di t su t i l i l y t h eq u a d r a t i cr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g nw a su s e dt oi n s t i t u t et h e c r y o p r o t e c t a n t m o d e la n dt h e o p t i m u m f o r m u l a ： st ：y = 0 8 4 4 0 - 0 0 6 4 3 x 1 2 - 00 6 4 6 x 2 。+ 00 0 6 8 x 3 - 0 0 7 1 2 ) c ：3 2 + o 0 0 7 5 x d _ 0 0 0 0 6 8 x 4 2 + 0 0 0 6 0 x 5 - 0 0 6 9 5 x 5 2 ( 5 s u g a r2 g l y c e r o l 0 8 s o d i u mg l u t a m a t e1 v c 5 k e l p j u i c e ) l b ：y = 0 7 2 5 3 0 0 6 9 2 x l - 0 0 3 0 l x j 一0 0 1 8 6 x 2 - 0 0 5 5 6 x 3 + 00 1 5 9 x 3 x 2 - 00 3 3 7 x s 2 ( 1 g l y c e r o l v c 03 0 1 c y s ) i nt h ea b o v ef o r m u l a , t h es u r v i v a lo fs ta n dl bg o tt o8 4 a n d7 9 i nt h es t sm o d e le a c h t w oc o m b i n e dc r y o p r o t e c t a n t sa c t e ds i m i l a r l ya n de v e r yo n ec r y o p r o t e c t a n th a v eb e t t e re f f e c t f l e a ri t sz e r o l e v e l ；i n l b sm o d e lt h e p r o t e c t i v e e f f e c to fc y sa n dv cc o m b i n e dw a s a p p a r e n tl o wc o n c e n t r a t i o nw a sh e l p f u lf o rg l y c e r o lt op r o t e c tb a c t e r i aa g i n a s tf r e e z e - d r y i n g t h ee l e c t r o n m i c r o g r a p h y r e s u l t si l l s t r a t e dt h a tt h ea d d i t i o no fc r y o p r o t e c t a n tm a d e f r e e z e - d r y i n gm e d i u mf o r mn e t w o r ks t r u c t u r e ( s t si sl i k el a v a1 b si sl i k ec a u l i f l o w e r ) t h i s k i n do fs t r u c t u r ep r o v i d e ds p a c i a lb a r r i e rf o rb a c t e r i aa n dw a sh e l p f u lf o rc r y o p r o t e c t a n ta n d b a c t e r i at oa c ta g i n s tf r e e z e - d r y i n g c o m p a r e dw i t hb l a n kg r o u pc r y o p r o t e c t a n tc o u l dr e t a i n t h eb a c t e r i a s m o r p h l o g yw e l l ；t h ef r e e z e - d r y i n gm e d i u mo fb l a n kg r o u pf o r m e ds t r a t u m s t r u c t u r ea n db a r e dt h eb a c t e t r i ao nt h es u r f a c e s os u s c e p t i v ef o ro u t s i d eb a df a c t o r s b yc u l t u r eq u a l i t yt e s t ，w es t u d i e dt h ec u l t u r ea p p l i c a t i o nf e a t u r e c o m p a r e dw i t ht r i d i t i o n a l c u l t u r et h ey o g h u r tm a d eb yf r e e z e d r y i n gc u l t u r eh a v eg o o df l a v o ra n dt a s t ea n di t st e x t u r e w a ss u p e r i o rt h a nt h a to f y o g h u r tm a d eb yt r a d i t i o n a lo u l t u r e 0 0 5 i n o c u l u mw a sb a s i c a l y a c c e p t a b l ei nr e a l i t yp r o d u c t i o n m a s t e r a t es t u d e n t ：w a n g y u m a j o r ：f e r m e n t e d f o o d t u t o r ：v i c e p r o f z h a n g l a n - w e i k e yw o r d s ：y o g h u r t c u l t u r e p r o p a g a t i n g c u l t i v i t i o ne n r i c h m e n t c r y o p r o t e c t a n t f r e e z e d r y i n g i v l 前言 酸奶的历史古老而悠久。在埃及遗留的古书和文字中，记载了一种远在五六千年的 叫做f e b e n 的酸性很强的乳饮料；2 0 世纪初梅契尼柯夫的酸奶长寿论对欧州酸奶的普及 产生很大影响。二次世界大战后，对酸奶的生产技术和影响其感官性质的因素有了较深 的了解，开始使用纯菌种制造发酵乳制品；到目前为止，酸乳已成为多种风味物料和 不同菌株联合作用的形态万千、功能各异的乳制品系列。酸乳的两大特点是其工业化生 产和不断推陈出新的主要动力：一是菌株的协同发酵及风味物质的添加形成了其独特的 口味，嗜好性很强。二是对人体的健康作用，集中体现在：促进消化道功能的改善： 进而提高身体各部分器官的免疫力。分解蛋白、促进c a 、p 吸收及合成b 族维生素 的营养作用。随着近年来对肠道内微生态环境的研究的不断深入，在肠道内定殖的益生 菌群的抗病、防衰作用受到人们的极大关注，出现了以双岐杆菌和嗜酸乳杆菌为发酵剂 的功能性发酵乳制品。另外发酵乳的集约化生产中必然蕴藏着巨大的经济效益，多年来 乳制品的消费一直里上升趋势，发展势头良好的液体鲜乳已经打出了新的消费1 3 号：a h e a l t h yl i f e ：i tb e g i n sw i t ham i l k 口j ，而发酵乳也朝着生产规模化、消费时尚化的益生乳方 向发展。 性状优良的发酵剂是保证发酵乳产品质量稳定和高品质的关键因素。g r i g o r o f f 在 1 9 0 5 年首次对酸奶细菌学的研究，标志着人们利用自然环境中的“天然乳酸菌”的时代 的结束：而p e r e 和l o l k e m a 在1 9 5 0 年发现酸乳生产中共同使用s t 和l b 产酸速率明显 加快却是传统液体发酵剂应用的开始p 1 ，液体发酵剂的方便、价廉使得大小生产厂家均 可自行调制，这极大扩充了酸奶生产领域，但在酸奶生产的进一步集约化、规模化发展 中，传统发酵剂的多次活化和扩培的繁琐工艺越来越不能满足要求：伴随着低温干燥生物 技术的发展，西方乳业发达国家已开发出用量小、邮寄储藏方便，直接投入生产的多功 能商品化发酵剂。而我国发酵剂的研究仍停留在液体发酵剂使用及菌种保藏阶段。目前 还没有一家专业化发酵剂生产厂，这极大限制了我国发酵乳制品工业的发展。 1 1 酸奶发酵剂的分类及特点 根据酸奶发酵剂的形态及生产方法可将其分为如下三类： i i 1 液体发酵剂 将菌种分别或按一定比例混合接种于脱脂乳中，在室温下培养，待乳凝固时取出， 经性状和纯度检查合格后，置4 c 左右条件下保存，每隔一周或半月传代一次1 4 】，维持 菌种活力。其特点是：制作工艺简单，菌种可反复多次使用，成本低；使用过程需 多次扩培，生产周期较长：菌体在多次传代培养过程中易出现比例失调、噬菌体污染、 性状变异等一系列问题。 另外，也有国内学者报导：收集培养液中的s t 和l b 菌体，分散在p h = 4 2 的缓冲 液中，装入无菌聚乙烯袋，制成高菌数液体发酵剂，可直接使用p 1 。这种发酵剂在生产 中未见相关实例，其应用特性有待进一步研究。 1 1 2 冷冻发酵剂 按冷冻温度可分为低温冷冻发酵剂和超低温冷冻发酵剂1 6 】 王字前言 1 1 2 1 低温冷冻发酵剂 菌种在以牛乳为基质强化营养物质的培养基中进行增殖培养，待达到最高菌数后分 离菌体，冻藏于3 0 一4 0 的条件下，使用时将菌种活化，然后按液体发酵剂工序进行 生产。其特点是保存期长，菌体活力不易丧失，菌体受侵袭和性状改变的可能性降低， 使用时需活化，耗时较长，且贮存、运输需较昂贵的制冷系统【7 j 。 1 1 2 2 超低温冷冻发酵剂 其制法和特点基本同于低温冷冻发酵剂，不同之处在于其冻藏是在，1 9 6 c 的液氮中 因而菌体活力保持较好，活化时间短，菌数高的发酵剂可直接使用，但液氮储运系统的 造价更是高昂。 1 1 3 干燥发酵剂 喷雾干燥发酵剂的干燥工艺成本较低，但菌体存活率不高，目前主要用喷雾干燥方 法生产酸奶粉p j 。冷冻干燥浓缩发酵剂( c o n c e n t r a t e df r e e z e d r i e dc u l t u r e s ，c f d c ) 又称直投 型发酵剂是现今商业化酸奶发酵剂的主要形式，这种发酵剂的制作工艺如下： 乳酸菌原菌种( 经抗不良因素试验和诱变筛选) 4 特定增殖培养基中增殖f 发酵罐中) l 加入蛋白溶解剂溶解培养基中蛋白颗粒 j 离心或联合膜装置富集菌体 4 菌体和保护剂添加于冻干基质中 l 冷冻干燥( 2 4 3 6 h r s ，至水分含量低于2 1 j 真空包装 l 保存性检验1 9 其特点是活力极高。菌数数量级在1 0 “c f u g ”“1 1 以上，接种量在万分之一以下， 直接投入使用，厂家可省去发酵剂制备实验室保存、邮寄方便产品性状稳定，极大减 少菌体性状变异和噬菌体污染的机会增菌、冻千工艺成本略高，发酵凝乳时间稍长。 从以上发酵剂的分类及各自特点来看，降低发酵剂成本，提高活力，直接投入使用，是发酵 剂的发展趋势和研究热点。 1 2 直投型发酵剂研究概述 1 2 1 抗不良环境能力强、性状优良的菌株的选育1 1 2 1 3 1 乳酸菌是对营养和生长环境要求较为复杂的一类细菌从酸奶粉喷雾干燥结果来看 s t 的抗干燥特性要优于l b 。m i c h e l m o r i c e 等( 1 9 9 2 ) 基于嗜热链球菌( c n r z 3 6 8 ) 的两个不 同菌株的形态、链长，对其冻融性作了比较，发现在低速冷冻过程中，短链长椭球形的 2 d 1 2 由于其比表面积小于长链小球形的d 3 1 ，所以水分子移动速度慢，存活率较低”。 w s k i m ( 1 9 9 8 ) 将乳酸杆菌经“c o o ls h o c k ”( 1 0 c ，5 h r s ) 处理后，菌体内出现一种分子量 约63 k d a 的蛋白，而未经处理的乳酸杆菌不含有这种蛋白，两种乳酸杆菌冷冻后的存活 率分别为8 3 、3 4 t ”1 。提高菌株的有益特性，可部分抵消菌体在经受不良环境时的活 性丧失1 1 6 ，c r i g j o b e r g ( 1 9 9 1 ) 发现三十四株l b 之间蛋白水解度差异很大， a n a l i ag a b r a h a m ( 1 9 9 3 ) 研究认为l b 的蛋白水解力受温度及可溶性氮含量的影响”。 1 2 2 乳酸菌增殖培养 增殖培养基应具有如下特点：适合菌体生长，繁殖速度快，在较短时间内可得到 大量高活力细胞。菌体与培养基易分离。成本低廉，最好能反复利用。重所周知乳 是乳酸菌的良好的天然培养基，但菌体生长后凝乳，不易分离。菌体在经典乳酸菌分离 和计数培养基中生长和分离状况均较好，但成本很高。酸度控制型培养基是基于乳酸菌 生长到一定阶段其主要抑制生长物质是乳酸及其盐类这原理发展起来的，分为内控型 和外控型两种1 1 ”，内控型是在培养基中加入一定量的缓冲盐，在菌体一定的生长期内恒 定p h ，促进菌体生长：外控型采用发酵罐培养菌体，通过p h 控制装置，自动向培养基 中流加碱液，以中和乳酸，培养过程中，p h 基本恒定，促生效果较好但当乳酸盐积累 到一定浓度水平后，也会抑制菌体生长。乳和乳清基质培养基是近年发展起来的一类增 菌培养基。s l m i t c h e l l ( 1 9 8 3 ) 研究肽化甜乳清培养基对l a 的促生作用时发现，菌体在 低固形物组分( 2 5 、5 ) 中生长的效果优于高固形物组分( 7 5 ) 口。s i _ w r i g h t ( 1 9 9 2 ) 运用多元回归分析确定了以乳清和脱脂乳为基质的p h 控制型生产发酵剂培养基的最佳 配方口u ：美国专利u s 0 0 5 0 9 8 ，7 2 1 报导应用超滤浓缩乳作为发酵剂培养基，其较高的缓 冲能力可使菌数高达2 5 1 0 c f u m l 以上“。c l a u d e p - c h a m p a g n e 等( 1 9 9 1 ) 比较了l b 在乳清、酶解乳请( 经木瓜蛋白酶和胃蛋白酶处理) 和牛乳中生长情况，酶解乳清效果 明显优于乳清，牛乳和牛乳与乳清混合( 1 ：1 比例) 两组培养基差别不大1 2 3 1 。 增菌培养基除去基质外，各种增殖因子也是产生高菌数的关键，表l 为国内外报道研 究的较为广泛认可的乳酸菌增殖因子。 另外在菌体培养过程中降低培养基的氧化还原电势，通入n 2 或c 0 2 均会有益于菌体 生长。 1 2 3 菌体的富集 菌体富集的方法主要有两大类。类是离心法，即借助离心机的离心力作用使菌体 沉积，以提高悬浮液的含菌量。此类方法简便、快速、处理量大适合商业化生产；但在 离心过程中可能会对菌体造成一定的损伤，培养液中水不溶性成分的含量也直接影响菌 体浓缩倍数。第二类方法是膜渗析法，将菌体在生物反应器( 发酵罐) 内培养，利用膜 装置将菌体与培养液分离，以浓缩菌体。根据培养目的，膜与反应器的连接有多种方式； c l a u d i n e pa t ( 1 9 2 8 ) 利用生物反应器与超滤装置相连生产s t 菌悬液，生物量最高可达4 0 酣， 细胞产量是传统发酵剂的九倍 2 6 1 ：e b o y a v a l ( 1 9 9 2 ) 利用“两段式细胞循环反应器”将经 l a 适度发酵的培养液送到第二段生物反应器中以供双岐( b b ) 菌生长繁殖，可同时制得 l a 和bb 的液体发酵剂p “。膜渗析法有对菌体影响小，获得的菌体浓度高，培养液可 复利用等优点，但膜装置成本高，滤膜的污染、清洗、杀菌、老化等一系列问题使商业 王宇前言 化生产受到定程度的限制。 表1 乳酸菌增殖因子 分类名称促生长功能出处 蛋酪蛋白水解物较强的促s t 、lb 及各种乳酸菌生长功能 蓦典培养基配方 白目前已知的最有效增殖因子 类 蛋白胨 非乳基质培养基中提供氮源，各类蛋白胨 中以胰蛋白胨效果最好 经典培养基配方 糖 葡萄糖对lb 有一定促生作用也可用于s t 【2 5 】、【2 6 】、 蔗糖促生效果不明显 r m s 2 7 】 乳糖促s t 生长效果明显，特定的浓度水平能【2 q 减少菌体自溶 同上 类 麦芽糖 【6 】 脂类卵磷脂 【2 8 1 及s p a n 8 0 细胞脂肪酸含量增加，凉千存活率提高1 2 相关 t w c c n 8 0 同上 同上 物质 b _ 磷酸甘油二 具定的缓冲作用，对s t 有一定效果m 1 7 1 2 7 】 钠盐 氨基缬氨酸s t 较好的促生物质 6 j 酸甲硫氨酸同上同上 及维维生囊c同上m 1 7 1 2 7 】 生素 盐碳酸钙 菌种保藏中应用，维持茸体活力【6 】 类硫酸锌、硫酸 可能对菌体某一代谢过程有重要作用 【3 0 】 锰缓冲作用 同上 磷酸盐及柠檬 酸盐 1 , 2 4 冷冻保护剂及抗冻保护机理 冷冻干燥对菌体主要形成以下几方面的危害：细胞内冰晶的形成。冰晶有机械刺 伤作用和溶质效果( s o l u t ee 恐c t s ) 细胞膜成分的丧失及膜的渗漏和穿孔关键蛋自的变 性( 细胞膜上及c y t o p l a s m i c 上) 生物细胞膜叠状六棱形( h e x2p h a s e ) 的形成新陈代 谢过程中各类关键作用酶的活性改变p ”。目前关于保护剂的保护机理的几种假说主要建 立在保护剂与细胞膜宏观结构的作用基础上；增强磷脂膜的稳定性：多羟基的糖类保 护剂以氢键或其它方式与细胞壁上磷脂膜结合，增大头部空间，降低了磷脂的转变温度， 也使磷脂膜之间不致产生折叠粘连而至细胞死亡p 。”】。玻璃体学说：渗透性保护剂的 加入可限制冰晶的形成而形成玻璃体，减少了冰晶的机械破坏作用【3 7 】。包埋作用：某 些具包埋特性的材料，可将菌体包埋掩蔽而减少细胞内冰晶的形成，但可能影响菌体活 性的发挥。保护剂的保护机理是一个涉及范围十分广阔的领域，保护剂与细胞宏观结构 的作用并不能解释不同种类、不同用量及复配保护剂等一系列因素的不同保护作用。 c t b e n s o n 等( 1 9 9 8 ) 以金仓鼠胰岛细胞的冷冻保存为例说明细胞膜的生物物理性质方 面的信息有助于估测细胞的冷冻存活率，这方面的信息与如下的一些基本低温生物学的 量有关：h p ( h y d r a u l i cc o n d u c t i v i t y ) 及其活化能冷冻保护剂渗透性及其活化能反射 4 系数 f 3 8 】，r u r tas a n t a r i u s ( 1 9 9 6 ) 试验了d m s o 、甘露醇、甘油等渗透性保护剂和蔗糖、 葡萄糖等非渗透性保护剂之间的联合作用，发现它们与膜成分之间的作用方式截然不同， 渗透性保护剂的浓度会影响非渗透性保护荆的保护作用【3 ”，c j c r a t i g ( 1 9 9 1 ) 发现细胞膜 胶体结构的变化主要受低温溶剂和温度的影响，而细胞生物胶体网络会帮助细胞在外界 不良因素条件下维持恒定的渗透压【4 “。从国外低温生物学的研究发展方向来看，多涉及 动物胚胎、人体细胞和器官及部分微生物等领域，对乳酸菌研究相对较少，且多是通过 冻干存活率来估测保护剂的冷冻保护效果。表2 为目前国内外报道的一些乳酸菌冷冻保 护剂。 综上所述，在继续寻找乳酸菌高效价廉冷冻保护剂的同时也应注重将乳酸菌的微观 结构与抗冻保护剂的添加量、协同作用及细胞内各种成分之间的生物物理、生物化学、 生理反应对应起来。 表2 国内外报道乳酸菌冷冻保护荆 分类名称存活率适用菌体 多甘油 3 5 | p l a n t a r u m a t c c 8 2 1 4 t 4 j 一 6 7 1 4 s _ c 【3 0 1 兀侧金盏花醇 醇甘露醇 3 5 1 4 s t 3 0 l 糖蔗糖 2 6 3 1 b 1 4 q 类乳糖 s t 6 l 麦芽糖 s 一6 】 葡萄糖 s t 1 4 3 ib 海藻糖 3 s 1 a c t i s 糊精 蛋白类脱脂乳 2 4 s ta t c c l 9 2 5 8 ”4 1 及肽类血清蛋白 3 0 l c a s e l a c c c 9 3 社u 蛋白胨 1 0 1 b 1 3 0 1 氨基酸类谷氨酸钠 8 2 s ta t c c l 9 2 5 8 t 4 1 j 及其它胱氨酸 7 8 1 b a t c c l1 8 4 2 4 l 】 天门冬氨酸 3 s c r e m o r l s b 磷酸甘油 0lb l 赖氨酸 1 0 i _ b 5 s f a e c i u m h l l p e 9 6 0 0 0 1 2 5 冷冻干燥 冷冻干燥的基本原理是：将配制的溶液，在冰冻状态下通过低压升华和解吸附的方 法，使制品水分减少到使其在长时间内无法维持生物学或化学反应的水平。其主要优缺 点如i f ：工艺过程对组分破坏程度最小仪器设备及制品通过除菌过滤、真空包装， 杂质微粒少，无污染产品贮藏稳定性很高设备造价高、能耗大工艺过程时间较长 ( 典型干燥过程周期需要2 0 - 4 0 小时左右) 。e w o l 趣1 9 9 0 ) 等比较了真空冻干和常压冻干 对s t 的影响，结果表明：常压冻干减少3 5 的能耗【4 ”，但冻干存活率却下降了5 0 。 冻干工艺中各参数的控制对于获得高品质的产品来说至关重要过冷度：冷冻液的过冷 度对冻结质量的结晶状况等影响较大，持续的过冷即导致整个溶液的冰晶迅速生长，以 致在表面不能形成玻璃化的非晶型结构冻结速度冻结速度低，使晶核较大，升华速度 快，但结晶均匀性差，会刺伤细胞冻结速度高，晶型均匀细小，会使冷冻液中水蒸气 顺利逸出。减少对细胞的刺激，但冻结速度太高会形成持续的过冷品温干燥过程中 当品温控制值较低时，制品的内在质量易于保证，但可能导致干燥时间长，运行不经济， 品温控制值偏高或失控时，制品质量指标将受到影响，因此应多次验证品温确保其参数 优化。冻干终点确定及真空度较早地确定冻干终点会使制品水分超标，影响贮藏稳定 性。长时间的干燥导致不必要能源和时间浪费进而影响制品的内在质量：当制品冰块较 厚时，真空度控制的要求较低，当冰块较薄时，真空度控制较高，这样的真空度控制， 能形成恰当的热对流能量供应，使制品表面始终处于匀速干燥的压力状态”j 。 1 3 酸奶发酵剂国内外应用现状 早在1 9 世纪末2 0 实际初，西方乳业科学家就开始研制浓缩发酵剂【4 ”，到现在酸奶 发酵剂已经实现商业化，并涌现出一批知名发酵剂制造商，例如：丹麦h a s e n 公司、美 国m a r s h e l l 公司和m a u r i f o o d 公司、澳大利亚c s i r o 研究所、荷兰n i z o 研究所1 4 “等，它 们生产的发酵剂性能优良、形态各异，遍布世界各地的乳品企业。例如：1 9 8 8 年底汉森 公司开发的y o - f l e x 发酵荆，可直接入罐生产，有多种型号，乳品厂可根据当地消费者嗜 好选购能生产不同酸度、风味、粘度的酸奶的发酵剂。另外汉森公司还开发出含双岐杆 菌和嗜酸乳杆菌的直接使用型a b 发酵剂，极大的方便了功能性发酵乳的生产1 4 ”。 而我国目前大多数生产厂家仍采用传统的液体发酵剂工艺进行生产【4 ，一些中小型 企业因缺乏专业技术人员制备发酵剂，经常由于菌种