（食品科学专业论文）双歧杆菌生理功能特性及其应用的研究.pdf

孟祥晨中文摘要 2 0 0 2 年5 月 双歧杆菌生理功能特性及其应用的研究 摘要 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 是人和动物肠道内重要的生理性细菌，它的存在直接影正 响消化道的健康状况，虽然此菌重要，但其作用机理尚需深入研究。，黝本濒通过体 内及体外实验方法，共计七个实验，包括所研究菌的分离与鉴定：生长特性的研究；影 响其存活因素的研究：对病原菌的生物拮抗；对肠粘膜的粘附与定植；对试验动物的免 疫调解机理以及含双歧杆菌产品的开发，系统研究了该菌的生理功能与作用机理及其应 用。 f 应用t p y 液体培养基，比较了两株商品菌株( 占a d o l e s c e n t i s ，b a ；bi n f a n t i s ，b i ) 、 两株由产品分离菌株( b l o n g u m ，b i ；bb r e v e ，b b r ) 以及两株分离自婴儿粪便菌株 ( b b i f i & t m ，b b ：b l o n g u m 一，b 1 1 ) 的生长与产酸能力，发现：b i 生长速度比b a 快， 产酸能力却弱，前者无明显的生长迟滞期，后者却相反。b l 和b b r 均无明显的生长迟滞 期，培养4 8 h r ，菌液吸光值分别为2 3 4 8 和2 1 6 2 。培养b b 和b l - l 达4 8 h r ，其吸光值 分别为14 0 0 和14 4 7 。商业生产株生长及产酸性状优于来自婴儿粪便的新分离株。 应用模拟胃液p h 、胃液、肠液、肠胆盐环境，研究b a 、b i 、b l 和b b r 的抗消化道 逆环境特性。在p h l 5 酸性条件下作用l ，5 h r ，存活率分别为o1 4 、1 7 8 6 、4 90 9 和95 3 。在加有胃蛋白酶的模拟胃液中作用1 5 h r ，存活率分别为：4 5 3 9 、9 72 7 、 8 45 3 和8 55 l 。在含胰蛋白酶的模拟肠液中作用1 2 h r ，存活率分别为：2 9 1 7 o 、4 7 9 7 、 8 77 0 和7 72 7 。b a 、b i 和b b r 的活菌数随胆盐浓度升高而下降，2 胆盐浓度条件下 作用1 2 l l r 三者的存活率分别为59 2 、1 39 6 和6 12 4 0 。而b i 在各胆盐浓度条件下， 均有生长趋势，这种趋势随胆盐浓度升高而下降。消化道逆环境对此菌的存活有不同程 度的影响以b i 和b l 的耐性最好。 b a 、b i 、b b r 和b i 分别与沙门氏菌共同培养2 0 小时后，前三者使沙门氏菌的菌数 低于1 0 2 c f u m l ，而b i 中却为1 3 1 0 8 c f u m l 。将p h 值接近4 的四株菌的上清液和o i m 、 p h 4 的乙酸乳酸( 3 ：2 ) 混合酸液以一定比例加入培养基中，培养沙门氏菌，发现酸液 对沙门氏菌的抑制作用最强：b a 、b i 和b b r 上清液的抑制强度相近，但不及酸液：b i 上清液的抑制作用最差。将酸液和上清液的p h 调至7 后，对沙门氏菌的生长趋势无影 响但各阶段菌数均低于对照组。 通过扫描电镜观察细菌在仔猪肠粘膜的粘附状况，发现肠道菌群与粘膜表面的粘液 层有密切的联系。采用放射性代谢标记方法研究双歧杆菌与仔猪肠粘膜粘液糖蛋白的粘 附，发现b a 的粘附能力最强，为4 46 1 ；其次是b b r ，为3 32 0 ：b i 和b 1 分别是1 8 , 4 0 和1 l7 8 。相同的实验方法观察到：所实验的糖、初乳粉以及b i 、b l 、大肠杆菌和沙门 氏菌上清均能导致b a 粘附下降，而b a 和b b r 上清却有促进其粘附的作用。 博士学位论文双歧杆菌生理功能特性及其应用的研究东北农业大学 应用动物实验方法，研究b i 和b l 对正常小白鼠免疫功能的调节作用以及对免疫力 低下模型动物的预防与治疗作用。发现：两株菌对正常小白鼠体重、脾体重和肾体重 比无显著性影响；对肝，体重比有增加趋势；能显著增加血液中i g a 、i g g 、c 3 、c 4 、i l - 2 、 i l 6 和i l 8 的含量( p o0 5 ) ，b i 效果优于b l ：b i 可极显著增加i g m 的含量( p o 0 1 ) 。 两株菌均可显著增加双歧杆菌( p o 0 5 ) 和乳杆菌的数量，显著降低大肠杆菌的数量 ( p n d 5 ) 。结果表明：两株菌都能增强正常b a l b c 小白鼠的免疫功能，并具有良好 调节肠道菌群能力，b i 效果优于b 1 。 同时对b a l b c 小白鼠施以环磷酰胺和双歧杆菌，发现：环磷酰胺导致体重、胸腺 体重、i g a 、i g g 、i g m 、c 4 、i l 2 和i l 8 显著下降( p d 0 5 ) ，两株菌能显著预防i l 2 、 i l 6 和i l 8 的下降( p n 酊) ，b i 效果优于b l ，对其他几个指标有轻微恢复作用，效果 不显著。两株菌都可增加双歧杆菌与乳杆菌的数量，降低大肠杆菌数量( p n ) 。 对免疫力低下的昆明小白鼠模型施以双歧杆菌后发现：两株菌对胸腺，体重、i l 2 和 i l 8 的下降有轻微缓解作用，效果不显著。能显著增加乳杆菌和双歧杆菌的数量 ( p o0 5 ) ，降低大肠杆菌的数量( p o 0 5 ) 。 通过优化b i 和b a 增菌培养基，使b i 吸光值提高4 8 ，使b a 生长迟滞期持续时间 缩短约4 个小时。采用优化条件制成的菌粉在4 c 条件下贮存两个月后，菌的存活率在 9 0 以上。 通过研究b i 和b i 在脱脂乳中的生长特性、影响其发酵的因素以及发酵乳的方式优 化双歧杆菌酸奶的生产工艺。发现：选用b l 制作酸奶时，在乳中添加了o 3 酵母粉， 低聚糖取代1 0 的蔗糖，接菌量为1 0 0 , 4 ；选用b i 制作酸奶时，在乳中添加了0 6 的酵 母粉，低聚糖取代2 0 的蔗糖，接菌量为1 5 。3 9 c 条件下发酵，然后再按l ：l 的比 例与普通酸奶混合。所制作的酸奶在贮存期间活菌数在1 0 8 c f u m l 以上。 基于上述实验结果，本课题的结论是：b i 和b l 具有良好的生产和抗逆性条件性状， 有极大的开发与应用潜力。双歧杆菌的生物拮抗作用是营养竞争和代谢产物共同作用的 结果，代谢产物中除乙酸和乳酸外，还有其他机制在起作用。该菌的粘跗具有菌株差异 性，以青春双歧杆菌的粘附能力最强；所实验的糖和初乳粉都可导致青春双歧杆菌的粘 附下降，青春双歧杆菌上清能够促进其粘附：其粘附紊部分存在于菌体表面，一部分 存在于培养液上清中；双歧杆菌粘附素受体可能是糖蛋白：不只一种机制在介导其粘附。 该菌具有增强正常b a l b c 小自鼠特异性和非特异性免疫功能作用以及优化肠道菌群结 构的能力，对小白鼠免疫力低下无明显预防和治疗作用，但可以改善肠道菌群结构。 本课题的创新点是：系统研究了双歧杆菌的生理功能与作用机理及其应用。通过比 较该菌生长和抗逆性条件性状，筛选出具有工业开发价值的菌株。采用放射性代谢标记 方法研究了双歧杆菌与肠粘膜粘液糖蛋白的粘附。理论上证实了双歧杆菌除乙酸和乳酸 代谢产物，还存在其他的机制拈抗沙门氏菌；并证实了该菌可增强正常b a l b c 小白鼠 的特异性和非特异性免疫功能。卜7 ， 关键词：双歧杆菌，生堡持性，生长，病原菌，粘附，免疫调节，应用 2 - 垂堑墨茎圣堡茎i ! ! ! 篓! 星 t h e i n v e s t i g a t i o n o n p h y s i o l o g y f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c so f b 驴d o b a c t e r i u m a n di t sa p p l i c a t i o n si nf o o d s a b s t r a c t 口衍d o b a c t e r i u mi si m p o r t a n ti n h a b i t a n ti ni n t e s t i n a lt r a c t so fp e o p l ea n da n i m a l si th a s b e n e f i c i a le f f e c t s o ni n t e s t i n a lh e a l t hb u ti t sf u n c t i o n a lm e c h a n i s m sa r en o tc l e a r p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ，f u n c t i o n a l m e c h a n i s m so fb i f i d o b a c t e r i u ma n di t s a p p l i c a t i o n s i n f o o d sw e r ei n v e s t i g a t e ds t r s t e m a t i c a l l yb ys e v e ne x p e r i m e n t si nv i t r oa n di nv i v o 1 1 1 e yw e r e c o m p o s e d o fi s o l a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fb 驴d o b a c t e r i u m ，c o m p a r i s o no fg r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s ，f a c t o r si n f l u e n c i n gs u r v i v a b i l i t y , b i o a n t a g a n i s mt op a t h o g e n ，a d h e r e n c ea n d c o l o n i z a t i o nt om u c u sm e m b r a n e i m m u n o m o d u l a t i o nm e c h a n i s m so nt r i a la n i m a l sa n d d e v e l o p m e n to f p r o d u c t sc o n t a i n i n gb 埔d o b a c t e r i u m g r o w t ha n da c i d i ca b i l i t yo f 抓，oc o m m e r c i a ls t r a i n s ( ba d o l e s c e n t 西，b a ：bi n f a n t i s ， b i ) t w os t r a i n si s o l a t e df r a mc o m m e r c i a lp r o d u c t s ( bi o n g u m ，b l ：b b r e v e b b r ) a n dt w o s t r a i n s i s o l a t e d f r o m i n f a n t f a e c e s ( b b 驴d u m ，b b ：b 1 0 n g u m ，b l - 1 ) w e r ec o m p a r e d i n t p y m e d i u mt h er e s u l t ss h o w e dt h a tb ig r o w nf a s t e rt h a nb aa c i d i ca b i l i t yo fb iw a sl o w e rt h a n t h a to f b at h e r ew a sn o to b v i o u sd e l a y i n gs t a g ei ng r o w t hc u r v eo f b ib aw a sr e v e r s e t h e r e w e r ea l s on o to b v i o u sd e l a y i n gs t a g ei ng r o w t hc u r v eo fb ia n db b r a b s o r b a n c ea t6 0 0 r i mo f b la n db b rw e r e23 4 8a n d21 6 2r e s p e c t i v e l ya f t e r4 8h o u r sa b s o r b a n e ea t6 0 0 n mo f b ba n d b 1 1w e r e14 0 0a n dl4 4 7r e s p e c t i v e l ya f t e r4 8h o u r sc o m m e r c i a lp r o d u c ts t r a i n sw e r eb e r e r t h a ns t r a i n si s o l a t e df r o mi n f a n tf a e e e si ng r o w t ha n da c i d i ca b i l i 托 c h a r a c t e r i s t i c so ng a s t r o i n t e s t i n a l ( g i dc o n d i t i o nt o l e r a n c eo fb a ，b i ，b 1a n db b rw e r e i n v e s t i g a t e di ns i m u l a t i v ep ho fg a s t r i ca c i d ，g a s t r i cj u i c e ，i n t e s t i n a lj u i c ea n di n t e s t i n a lb i l e s a l t s u r v i v a b i l i t yo f b a ，b i ，b 1a n db b r w e r e01 4 ，1 78 6 ，4 9 0 9 a n d9 5 3 r e s p e c t i v e l y a f t e rl5h o u r si n p h l5c o n d i t i o n ，a n dw e r e 4 53 ，9 72 ，8 45 3 a n d8 5 5 1 r e s p e c t i v e l ya f t e r l5h o u r si ns i m u l a t i v eg a s t r i cj u i c ec o n t a i n i n gp e p s i na n dw e r e2 917 4 79 7 8 77 0 a n d7 72 7 r e s p e c t i v e l ya f t e r1 2h o u r si ns i m u l a t i v ei n t e s t i n a li u i c e c o n t a i n i n gp a n c r e a t i nt h ea m o u n t so f v i a b l eb a b 1 a n db b r d e c r e a s e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n o f b i l es a l ti n c r e a g e dt h es u r v i v a b i l i t yw e r e59 2 1 39 6 a n d6 l2 4 r e s p e c t i v e l ya f t e r1 2 h o u r si ns i m u l a t i v ei n t e s t i n a lj u i c ec o n t a i n i n g2 b i l es a l tn e g r o w t hs p e e dd e c r e a s e dw i t h c o n c e n t r a t i o no fb i l es a l ti n c r e s s e dt h eg i tu o n d i t i o n st o l e r a n c ea b i l i t yo fb 析d o b a c t e r i u m s t r a i n sw a gd i f f e r e n t 1 1 1 et o l e r a n c eo f b ia n db lw o r eb e s ta m o n gt h et e s t e ds t r a i n s t h ea m o u n t so f s a l m o n e l l aw e r eb e l o w1 0 c f u m la f t e r2 0h o u r si nc o - 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s p e c i f i ci m m u n i t yo f n o r m a lm o u s e t h ep r e v e n t i o na n dt h et r e a t m e n to fb ia n db 1o ut h em o u s em o d e lw i t hl o w i m m u n i t y w e r e i n v e s t i g a t e di tw a sf o u n d t h a tt w os t r a i n sh a dn os i g n i f i c a n te f f e c t so u w e i g h i ， s p l e e n w e i g h ta n dk i d n e y w e i g h t t h e r ew a s i n c r e a s et r e n di nr e s p e c to fl i v e w e i g h tl e a ，i g g ， c 岛c 4 ，i l 一2 ，i l - 6a n di l - 8i ns e r u mi n c r e a s e ds i g a i f i c a n t l y0 n d m e a n w h i l e t h ee f f e c t s o fb iw e r eb e t t e rt h a nt h a to fb 1 i g mi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y0 0 0 0w h e nm o u s ew e r e t r e a t e dw i t hb i t h em o u n t sb i f i d o b a e t e r i u ma n dl a c t o b a c i l l u si nc o l o na n da p p e n d i x e o n t e n t sw e r ei m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y 幢( 0 o 匀，a n dt h em o u n t so fe n t e m b a c t e r i a c e a ew e n t d o w ns i g a f i f i e a n d y 仍 o0 5 3w h e nm o u s ew e f e 订e a t e dw i 小b 萨d o b a e t e r i u mt h er e s u l t s s h o w e dt h a ti m m u n of u n o t i o n so f n o r m a lm o l b et r e a t e dw i t hb ia n db lw e r ei n , p r o v e da n d 血e t w os t r a i n sh a dg o o da b i l i t yo fm o d u l a t i o no ni n t e s t i n a lm i c r o f l o r a t h ee f f e c t so fb iw e r e b e t t e rt h a nt h a to f b l b a l b cm o u s ew e r et r e a t e dw i t h c y c l e 口h o s p h a m i d e a n d b 斫d o b a c t e r i u m s i m u l t a n e o u s l y i tw a sf o u n dt h a tw e i g h t , t h y m u sg l a n d w e i g h t ，i g a ，i g g , i g m ，c 4 ，i l - 2a n d i l 一8d r o p p e dd o w ns i g n i f i c a n t l yp 0 0 0r e s u l t e df r o mc y c l o p h o s p h a m i d e 耵l ed e c r e a s eo f i l - 2 ，i l - 6a n di l - 8 、砌母p r e v e n t e ds i g n i f i c a n t l yb yt w os t r a i n sp n 口dn l ee f f e c t so fb i w e r eb e t t e rt h a nt h a to fb it h co t h e rp a r a m e t e r sc o u l db er e s u m e ds l i g h t l y t h er e s u l t sw e r e n o ts i g n i f i c a n tt h ea m o u n t so fl a c t o b a c i l l u sa n db 班d o b a c t e r i u mo fg r o u p st r e a t e dw i t hb i a n db 1i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y , a n dt h ea m o u n t so fe n t e r o b a c t e r i a c e ad e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y p n 口5 ) k u n m i n gn l o u s er o o d e lw i t hl o wi m m u n i t yw o r et r e a t e dw i t hb i f i d o b a c t e r i u m i tw a s f o u n dt h a tt h ed r o po ft h y m u sg l a n d w e i g h t , i l - 2a n di l 一8c o u l db em i t i g a t e ds l i g h t l yb yt w o s 圩a i u sn 峙r e s u l t sw e r en o ts i g n i f i e a n t t h ea m o u n t so f l a c t o b a c i l l u sa n db 嘏d o b a c t e v i u mo f g r o u p s t r e a t e dw i t hb ia n db ii n c r e a s e d s i g n i f i c a n f l yp 口0 5 ) ，a n d t h ea m o u n t so f e n t e r o b a c t e r i a c e ad r o p p e ds i g n i f i c a n t l y ( p ；6 8 三4 州、。、，一 b i r t h w e a n i n g i d a t u r i t y o l da g e f 忡a 啪岸缸_ 耐m h 咖_ n r 图卜1新生儿肠道菌群的初级演替图1 - 2 健康人肠道菌生理性演替 7 篁圭兰堡篁塞圣些堑塑兰矍塑璧竺丝垒苎壁星墼竺塞 奎! ! 窒些查耋 双歧杆菌在肠道菌群中属于有益菌，其数量占第四位，目前般认为，其作用位居 首位。正常人每克肠内容物双歧杆菌的数量超过1 0 9 ( 康白，1 9 9 8 ) ，但其数量的多少与 宿主的健康状况、饮食习惯、药物以及精神压力等许多因素有关。其合成维生素和蛋白 质、辅助消化和吸收、防止外袭菌感染以及免疫功能等作用对宿主保持健康状况起到非 常重要的作用，因此双歧杆菌是现代医学、营养学和食品科学研究的重要课题之一。 国内外对双歧杆菌进行了广泛的研究和开发，多集中于应用方面，对其生理功能特 性及作用机制尚需深入研究。因此本课题对双歧杆菌的分离与鉴定，影响其存活的因素， 在体内的粘附与定植，对免疫功能的影响，对病原微生物的拮抗作用以及含双歧杆菌食 品的研制与开发进行深入、系统的研究；以期达到深入揭示双歧杆菌作用机理以及通过 口服双歧杆菌调控消化道微生物区系的目的。 本研究在理论上能进一步探讨双歧杆菌生理功能作用机理，对指导双歧杆菌产品的 开发将会起到积极的推动作用。在生产实践上，可以扩展功能性乳制品的开发领域，拓 宽保健品市场，将会对保健食品的开发起到积极的推动作用。 2 主要研究内容 8 本研究主要内容如下： ( 1 ) 人源双歧杆菌的收集，建立菌种分离、活化、传代与保藏方法。 ( 2 ) 筛选生长特性优良的菌株。 ( 3 ) 筛选抗消化道逆环境的优良菌株。 ( 4 ) 探讨双歧杆菌对肠粘膜粘液糖蛋白的粘附机制。 ( 5 ) 研究双歧杆菌生物拮抗病原菌作用机理。 ( 6 ) 探讨双歧杆菌对小自鼠免疫功能的调节机制以及对肠道菌群的影响。 ( 7 ) 研究双歧杆菌在乳品中的应用途径。 重堂曼垩竺堑墼堑窒些星皇垫奎 ! ! ! ! 兰! 星 1 双歧杆菌研究进展与动态 双歧杆菌是发现最早的生理性细菌之一，把双歧杆菌作为核心来研究人体正常微生 物群的特征和基本规律以及与其他消化道微生物的相互关系是现代微生态学的主要内 容。双歧杆菌数量大，但无毒、无害，而且具有许多生态效应或生理意义。双歧杆菌参 与了人的消化、营养( m i t s u o k a ，1 9 9 0 ) 、代谢( m a r t e a u 等，1 9 9 0 ) 、吸收( g i l l i l a n d s e 等，1 9 8 4 ) 、免疫( s o l i s p e r e y r a 等，1 9 9 3 ) 及抗感染( g i b s o n 等，1 9 9 4 ) 过程。双歧杆 菌伴随人类从出生到死亡的一生，只是在患病、衰老或其它不利条件下才减少，甚至消 失因此双歧杆菌成为近十年来国内外研究的热点，它也被称为“新闻菌”，是人们谈论 颇多的微生物。 11 双歧杆菌的发现及基本生理生化特性 1 1 1 双歧杆菌的发现 法国巴黎巴斯德研究院的t i s s e r ，1 8 9 0 年在巴黎b o u c i c a u t 儿童医院g r a u c h e 教授指 导下读研究生，它的题目是“对婴幼儿消化不良病因的研究”。经过十年的艰苦努力，在 他的两位朋友的帮助下，1 8 9 9 年终于在天然营养儿正常大便内发现了双歧杆菌。同年1 2 月2 日在巴黎生物学会学术会议上发表了他的论文，他指出，天然营养儿和人工营养儿 的大便内有一种革兰氏阳性多形态的杆菌，而且天然营养儿较人工营养儿更多，甚至是 纯种状态，但是不论哪种营养方式的婴幼儿在患腹泻时，这种杆菌就会减少或消失。到 那时为止，所发现的1 5 种细菌，只有双歧杆菌是生理性细菌。从此开辟了近百年来双歧 杆菌研究的新篇章，同时也揭开了研究生理性细菌的新纪元( 康白，1 9 9 8 ) 。 112 双歧杆菌的分类 伯杰氏细菌手册第l 版( 1 9 2 3 ) 到第4 版( 1 9 3 4 ) 将其取名为b a c t e r o d e sb i f i d u s ， 并归到拟杆菌属( b a c t e r o i d e s ) 中，伯杰氏手册第5 版( 1 9 3 9 ) 、第6 版( 1 9 4 8 ) 、第7 版( 1 9 5 7 ) 将其命名f f ：f l a c t o b a c i l l u sb i f i d u s ，归类于乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 。1 9 5 8 年 日本的光冈等人提议独立设立双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) ，1 9 7 4 年伯杰氏细菌鉴定手 册将双歧杆菌作为正式属名列入，当时属内有1 1 个种。在伯杰氏系统细菌学手册1 9 8 6 年版中列入2 4 个种( 金世琳，1 9 9 9 ；凌代文，1 9 9 9 ) 。随着实验方法和研究设备的不断 完善，近1 0 年来又陆续发表了8 个新种，包括鸡双歧杆菌( b g a l l i n a r u m ) 、高卢双歧杆 菌( b g a l l i c u m ) 、反刍双歧杆菌( 占r u m i n a n t i u m ) 、瘤胃双歧杆菌( 占m e r y c i c u m ) 、波伦 亚双歧杆菌( 占s a e c u l a r e ) 、异型双歧杆菌( b i n p i n a t u m ) 、龋齿双歧杆菌( 0 d e n o c o l e n s ) 以及乳双歧杆菌( 占l a c t i s ) 。因此，目前见诸报道的双歧杆菌共有3 2 个种，其中分离自 人体的有1 2 个种。当前人源双歧杆菌应用于生产的菌种包括：两歧双歧杆菌( bb i f i d u m ) 、 长双歧杆菌( 占l o n g u m ) 、青春双歧杆菌( ba d o l e s c e n t i s ) 、短双歧杆菌( 占b r e v e ) 和婴 儿双歧杆菌( b i n f a n t i s ) ( 凌代文，1 9 9 9 ) ，其中婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌属于婴儿型， 9 博士学位论文双歧杆菌生理功能特性及其应用的研究东北农业大学 只在婴儿的肠道内生存并占优势，随着人的年龄增高则逐渐减少或消失；两歧双歧杆菌、 长双歧杆菌和青春双歧杆菌属于成人型，在成人肠道内存在较多。对于双歧杆菌的分类 研究，属内种和种间亲缘关系问题的探讨近十余年有很多报道，不同的人应用不同的方 法进行探索和研究，要达成共识还有待于对双歧杆菌本质特性的进一步研究。 11 3 双歧杆菌的形态 双歧杆菌的细胞呈现多样形态：短杆较规则型( 婴儿双歧杆菌) 、纤细杆状型( 嗜热 双歧杆菌) 、球型( 兔双歧杆菌) 、棍棒型( 齿双歧杆菌) 、勺型( 长双歧杆菌) 等，单个 或链状、栅栏状排列，或聚集成星状( 凌代文，1 9 9 9 ) ，这些双歧杆菌的细胞形态具有一 定的代表性。但同种不同的菌株形态也不尽相同，即使同一菌株在生长的不同时期或培 养于不同的条件下也可能显现不同的形态。经过一段人工培养，可为直杆状，这种表型 变异是可逆的。双歧杆菌菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的 质地。 1 1 4 双歧杆菌的生理生化及生态学特性 双歧杆菌的生理生化及生态学特性比较复杂，详见表1 1 。 表卜1双歧杆菌生理生化及生态学特性( 凌代文，1 9 9 9 ；康自，1 9 9 4 ) t a b i e l 一1 p h y s ；o l o g i c a l b i o c h e m i g a i a n de c o l o g ；c a lo h a r a c t e r i s t i g so f 8 if i d o b a o t e r i u m 项目生理生化及生态学特性备注 革兰氏染色 耐氧程度 运动性 芽孢 触酶 过氧化氢酶 吲哚、联苯胺反应及明胶滚化 硝酸盐还原反应 生长温度 生长p h 值 专性厌氧 无运动性 不形成 不还原 经多次传代后可变成微需氧 星状和蜜蜂取歧杆菌例外 驯化菌株呈阳性 生长于含有溶解红细胞培养基 时有硝酸盐还原作用 最低温度为2 5 - 2 8 c ，最适温度为3 7 - 4 1 最高温度为4 3 - - 4 5 c 最低p h 值为4 5 - 50 ，最适p h 值为65 - 7 0 ，最高p h 为8 , 0 - - 85 双歧杆菌对糖类的分解代谢途径不同于乳酸的同型发酵或异型发酵，而是经由特 殊的双歧支路，在果糖6 一磷酸磷酸酮酶的作用下对葡萄糖代谢最后生成乙酸和乳酸， 两者摩尔比为1 5 ：l ，不生成c o ：、丁酸、丙酸。最适发酵温度3 5 , 4 0 c ，d n a 碱基 组成摩尔百分比为5 7 - - - 6 8 。 12 影响双歧杆菌存活与生长的因素 1 0 孟祥晨双歧杆菌研究进展与动态2 0 0 2 年5 月 双歧杆菌是一种专性厌氧菌，对环境条件和营养要求严格，因此影响其存活和生长 的因素也很多。 121 不同酸性条件对双歧杆菌存活的影响 双歧杆菌要进入肠道中发挥作用，需经过胃的酸性环境，其在胃酸中的存活情况直 接关系到生理功能的发挥。此外大多数食品是酸性的，p h 对双歧杆菌存活的影响也是非 常重要的( y a s u s h i 等，1 9 9 2 ：s o z z i ，1 9 8 9 ) 。表1 2 是些研究结果，由这些研究结果可 以看出，多数研究着眼于菌体在酸性乳制品中贮存期问的存活率，仅少数以胃酸状态进 行试验，这类试验胃酸p h 多设定在3 q5 ，极少出现胃酸分泌初期的p h 2 左右，此外作 用时间也是进行此类试验时应考虑的重要问题之一。 表卜2 不同酸- 陛条件对双歧杆菌存活的影响 t a b i e l 一2t h ee f f e c t so fd i f f e r e n ta c i dc o n d i t i 0 1 1o ns u k v i v a b iii t yo f 占i f i d o b a e t e r i u m 蘸株影响情况 参考文献 1 2 2 温度对双歧杆菌存活的影响 温度是产品加工过程中使用较多的物理量，生产中常见的温度包括低温和高温处 理。因为许多产品的杀菌和熟制都需要在高温下完成，而双歧杆菌对温度的敏感性限制 了其使用和加工范围。现在对高温条件下，如何保持双歧杆菌的活性研究得还比较少， 几乎没人深入这方面的研究。只是袁杰利( 1 9 9 4 ) 对双歧杆菌微囊化进行了初步的研究， 通过对双歧杆菌微囊化的初步研究显示：微囊化的双歧杆菌在干燥过程中死亡率明显下 降，在室温条件下保存，其存活率比对照组有较大的提高。 低温对双歧杆菌存活率的影响大多数是研究冰淇淋中双歧杆菌的存活情况，m o d l e r h w 等人( 1 9 9 0 ) 研究表明，冰淇淋中的双歧杆菌在1 7 c 贮存7 0 天，存活率可达9 0 以上。 另外育种工作者还可以通过驯化耐高温菌株，或者采用生物工程技术生产耐高温菌 株，在一定程度上也可以提高其对高温的耐受性。 1 2 3 胆盐对双歧杆菌存活的影晌 博士学位论文双歧杆菌生理功能特性及其应用的研究东北农业大学 由于胆盐的存在改变了菌体外膜的通透性，所以对双歧杆菌产生抑制、杀灭作用， 进而影响双歧杆菌的存活( 杨嫒绚，1 9 9 8 ) 。表l - 3 是胆盐对双歧杆菌存活影响的些研 究结果。这类研究应注意两个问题，一是用牛胆汁模拟人胆汁的可行性，根据目前的研 究文献，牛胆汁被普遍用于培养基作为选择性分离、培养人类肠内致病菌，所以牛胆汁 的效力应与人胆汁相当接近，可以用于模拟人胆汁。二是胆汁的浓度与作用时间，由于 对人体内肠道中胆汁的实际浓度目前尚没有完备的描述，所以浓度和时间的选择相对困 难，通常认为，当食物进入小肠内消化的第个小时内，胆汁浓度达2 ，第二个小时 降至05 ( 杨嫒绚，1 9 9 8 ) 。 表1 _ 3 胆盐对双歧杆菌存活的影晌 t a b i e l 3t h ee f f e o t so fb ii es a i t0 1 1s u r v i v a b iii t yo fb i f i d o b a c t e r i u m 1 2 4 不同类型培养基对双歧杆菌生长繁殖的影响 双歧杆菌的分离培养除了要创造适合于它们生长的厌氧环境条件外，还需要提供适 于它们生长的培养基。目前见诸报道的适于双歧杆菌生长的培养基有：e m b 培养基( 蒋 寒青，1 9 9 3 ) 、g a m 和m g l p 培养基( 孔健等，1 9 9 5 ) 、p y g 培养基( 杨文博等，1 9 9 5 ) 、 b s 培养基( 温朗聪等，1 9 9 6 ：牛钟相等，1 9 9 6 ) 、m r s 培养基和l a b 培养基( 马向前 等，1 9 9 7 ) 、t p y 培养基( 郭骏等，1 9 9 8 ) 、改良t p y 培养基( 鲍行豪等，1 9 9 7 ) 、b i b 培养基( 居述林等，1 9 9 8 ) 、b m 培养基( 罗珍兰等，1 9 9 8 ) 、b h i 培养基、v l 培养基、 e u g o n 琼脂培养基( 凌代文，1 9 9 9 ) 、硫乙醇酸盐培养基( 王筱兰等，