（食品科学专业论文）固态发酵豆粕制备大豆肽的研究.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 豆粕是豆油加工副产品，我国有丰富的来源，其蛋白含量高达4 0 5 0 ，含 有人体所必需的八种氨基酸，为全价蛋白源。大豆肽是一种极具潜力的功能性食 品基料，广泛应用于食品和保健品领域。通过对豆粕进行酶解或微生物发酵，大 分子蛋白被切成数段的小分子，即成为大豆肽，从而提高豆粕的营养价值。我国 大部分的肽类生产都使用酶法，已在蛋白酶选择，酶解工艺参数，水解液脱苦、 脱盐、分离精制等方面取得了一定进展。虽然酶法生产的产品安全性高、生产条 件温和、水解易控制。但仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植物蛋白 酶，且酶解法苦味不能根本去除，脱苦工艺和肽酶价格都增加了生产成本。而液 态发酵法生产大豆肽是现在研究的热门课题，发酵时间短，转化率高，但是伴随 大豆肽的苦味和臭味仍是不易解决的难题。本课题采用固态发酵豆粕生产大豆肽， 目前未见有这方面的报道，因此是从一个新的角度研究生产大豆肽的方法。固态 发酵具有工艺操作简便，耗能低，投资少的优点。且通过微生物作用对某些苦味 肽基团进行修饰和重组，使小肽之间、小肽与氨基酸之问发生移接、重排，克服 了酶解法产品苦味大和口感差等缺点。同时可降低大豆肽的生产成本，提高豆粕 的利用率，加速了功能性肽的产业化进程。 本课题主要研究了以下几个方面：( 1 ) 黑曲霉a s 3 3 5 0 、米曲霉a 一9 0 0 5 单菌种 及混合菌种固态发酵豆粕制备大豆肽的动态发酵过程中各理化指标包括还原糖、 总糖、p h 、蛋白酶酶活和大豆肽转化率的测定。( 2 ) 通过对动念发酵结果的分析确 定单因素条件进行单因素实验。( 3 ) 进行正交试验对发酵条件进行优化。 各理化指标的动态变化如下： 黑曲霉蛋白酶酶活：0 8 4 h 蛋白酶酶活逐渐上升，9 6 h 达到最大值以后蛋白 酶酶活丌始下降，最大值大约在4 6 0 u g 。米曲霉蛋白酶酶活：0 - 2 4 h 酶活上升较慢 酶活基本为零，2 4 8 4 h 酶活上升较快。此后酶活变化趋于平缓，当发酵到1 3 2 h 时 酶活基本达到最大值，1 8 0 h 后蛋白酶酶活略有下降。最大值大约在1 1 0 0 u g 。混 合菌种蛋白酶活最高可达1 4 0 0u g 左右。可见米曲霉蛋白酶活高于黑曲霉，混合 菌种蛋白酶活高于单菌种。 肽转化率：0 - 9 6 h 肽转化率逐渐上升并达到最大值，9 6 h 以后转化率变化趋 于平缓。相同发酵条件，黑曲霉发酵豆粕的肽转化率要大于米曲霉，混合菌种发 酵豆粕的肽转化率要高于单菌种。 还原糖：0 - 3 6 h 还原糖总量迅速升高，3 6 h 以后逐渐缓慢下降。由此可见在 发酵前3 6 h 曲霉的糖酶产糖速率高于曲霉自身的利用率，3 6 h 以后反之。总糖：整 摘要 个发酵过程中总糖不断减少，产生的能量用于自身合成和生产代谢产物。 在动态研究的基础上进行单因素实验，再通过正交试验，并以肽转化率和蛋 白酶酶活为指标确定最佳发酵工艺条件，即： 黑曲霉：豆粕含量( 豆粕占干基) 9 0 ，p h 5 8 ，温度3 0 ，发酵时间9 6 h 。 在此条件下，黑曲霉发酵豆粕肽转化率最大值大约为6 8 ，蛋白酶酶活为4 8 0 u g 。 米曲霉：豆粕含量( 豆粕占干基) 9 3 ，p h 6 8 ，温度3 3 ，发酵时间1 0 2 h ， 在此条件下，米曲霉发酵豆粕肽转化率最大值大约为6 4 ，蛋白酶酶活为1 4 0 0 u g 。 黑曲霉和米曲霉混合菌种：豆粕含量( 豆粕占干基) 9 0 ，p h 6 0 ，菌种比 2 ：1 ，温度3 2 ，发酵1 4 4 h ，在此条件下，大豆肽转化率为8 9 ，混合菌种蛋白 酶酶活性大约为17 0 0 u g 。 关键词：豆粕；固态发酵；黑曲霉a s 3 3 5 0 ；米曲霉a 9 0 0 5 ；大豆肽 l l 山东轻工业学院硕士学位论文 a b s t r a c t d e f a t t e ds o y b e a nm e a li sak i n do fp r o t e i ns o u r c e so ft h ef u l lp r i c e ，w h i c hp r o t e i n c o n t e n ti s 弱h i g ha s4 0 一5 0 ，c o n t a i n i n ge i g h te s s e n t i a la m i n oa c i d sw h i c hh u m a n n e e d b e c a u s eo fd e f a t t e ds o y b e a nm e a lf e r m e n t a t i o na n de n z y m eh y d r o l y s i s ， m a c r o m o l e c u l e sa r ec u ti n t os e c t i o n so ft h es m a l lm o l e c u l e ，w h i c hi ss o y b e a np e p t i d e ， a n dt h e r e b ye n h a n c et h eu t i l i z a t i o no fs o y b e a np e p t i d e s s o y b e a np e p t i d e s ，w h i c hc a n b eak i n do f p o t e n t i a lf u n c t i o nf o o d ，a p p l yw i d e l yi nm a n ya r e a s s o y b e a np r o t e i na l s o i sas u p e r i o rp r o t e i n i tc a nb eh y d r o l y z e di n t os o y b e a np e p t i d e s u s i n go ff u n g a l g r o w t ha tt h es e c r e t i o no fe n z y m e si nt h ed e g r a d a t i o no fd e f a t t e ds o y b e a np r o t e i na n d p o l y s a c c h a r i d et ob e c o m eal o w m o l e c u l a r - w e i g h ts u g a r s ，a m i n oa c i d sa n ds o y b e a n p e p t i d e sc a ni m p r o v et h ec a p a b i l i t y o fi m p r o v i n gd i g e s t i o na n da b s o r p t i o nr a t e s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o np r o c e s si ss i m p l e ，l o we n e r g yc o n s u m p t i o na n dl e s si n v e s t m e n t a d v a n t a g e s m i c r o o r g a n i s m sc a nd e c o r a t ea n dr e c o m b i n es o m es t r u c t u r e so fb i t t e r p e p t i d e s ，s ot h es t r u c t u r e so fp e p t i d e sb e t w e e nt h ep e p t i d e sa n da m i n oa c i d sr e s i d u e s w i l lb ec h a n g e da n dr e s e t t l e d i tc o n q u e r ss o m ed e f e c t s s u c h2 l sl a r g eb i t t e r n e s sa n db a d t a s t e a s p e r g i l l u so r y z a e a - 9 0 0 5a n da s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0c a nh y d r o l y s i st h ep r o t e i n o fs o y b e a nm e a l ，w h i c hi sc h e a pa n de a s yt of i n da sr a wm a t e r i a lt op r o d u c es o y b e a n p e p t i d e 1 1 1 em e t h o dw i l lc u td o w np r o d u c t i o nc o s t a n da c c e l e r a t et h ei n d u s t r i a l i z a t i o n o ff u n c t i o n a lp e p t i d e s t h i st h e s i sf o c u s e do nt h ef o l l o w i n gt h r e ea s p e c t s ：f i r s t ，m e a s u r et h ep r o t e a s e a c t i v i t ya n dc o n v e r s i o nr a t eo fs o y b e a np e p t i d ei nd y n a m i cf e r m e n t a t i o np r o g r e s so f d e f a t t e ds o y b e a nm e a l t h es o y b e a np e p t i d e sw e r ep r e p a r e db ys o l i ds t a t ef e r m e n t i n g d e f a t t e ds o y b e a nw i t ht h em i x t u r eo fa s p e r g i l l u s o r y z a ea - 9 0 0 5a n da s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 s e c o n d ，m a k es u r et h es i n g l ec o m p l i c a t i o nc o n d i t i o nt h r o u g ht h ea n a l y z eo ft h e d y n a m i cf e r m e n t a t i o nr e s u l t sa n dd os i n g l ec o m p l i c a t i o nt e s t t h i r d o p t i m i z e t h e c o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o nb yd o i n go r t h o g o n a lt e s t t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a li n d i c a t o r so ft h ed y n a m i cc h a n g e sa r ea sf o l l o w s ： a s p e r g i l l u sn i g e rp r o t e a s e ：0 - 8 4 h l i v i n gi n c r e a s e dg r a d u a l l y ，a f t e r9 6 h l i v e s t a r t e dd e c l i n e d ，a n dt h em a x i m u mc a nr e a c hi na b o u t4 6 0 u g a s p e r g i l l u so r y z a e p r o t e a s e ：0 - 2 4 hs l o w e ra c t i v i t yi n c r e a s e da c t i v i t yb a s i c l ys t a yz e r o ，2 4 - 8 4 h a c t i v i t yr o s e d f a s t e r w h e nt h ef e r m e n t a t i o ng o tt o13 2 h ，t h eb a s i ca c t i v i t yr e a c h e dt h em a x i m u m ， a f t e r18 0 ht h el i v e as l i g h td e c r e a s e d m a xc a nr e a c ha b o u t110 0 u g a b s t r a c t p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t e ：0 - 9 6 hp e p t i d e c o n v e r s i o nr a t eg r a d u a l l yi n c r e a s e d a n dr e a c h e dt h em a x i m u m ，a f t e r9 6 hc h a n g e so ft h ec o n v e r s i o nr a t et e n d e dt on o t c h a n g et h eb a s i cf l a t t h es a m ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，a n da s p e r g i l l u s f e r m e n t a t i o no f s o y b e a n m e a lp e p t i d ec o n v e r s i o nr a t ew a sg r e a t e rt h a na s p e r g i l l u so r y z a e r e d u c i n gs u g a r ：0 - 3 6 hr e d u c i n gs u g a rr a p i d l yi n c r e a s e d t h et o t a l ，3 6 hl a t e r g r a d u a l l yd e c l i n e d t o t a ls u g a r ：t h ew h o l ep r o c e s so f f e r m e n t a t i o no fs u g a rd e c l i n e d a d y n a m i cr e s e a r c hb a s e do ns i n g l e - f a c t o rt e s t ，a n dt h e nb yo r t h o g o n a lt e s t i n g a n dc o n v e r s i o na n dap e p t i d e 1 i v i n gi n d e xf o rt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s st od e t e r m i n et h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ： a s p e r g i l l u sn i g e r ：r a wm a t e r i a l si s ( s o y b e a n w h e a tb r a n ) 9 0 ，p h 5 8 ， t e m p e r a t u r eo f 3 0 。c ，f e r m e n t a t i o nt i m e9 6 h a s p e r g i l l u so r y z a e ：r a wm a t e r i a l si s ( s o y b e a n w h e a tb r a n ) 9 3 ，p h6 8 ， t e m p e r a t u r eo f33 。c ，f e r m e n t a t i o nt i m e10 2 h t h er e s u l t ss u g g e s tt h a t ：u n d e rt h ec o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o nf o r14 4 h ，t h e b e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gs o y b e a np e p t i d e sb ys o l i ds t a t ef e r m e n t i n g d e f a t t e ds o y b e a nw i t ht h em i x t u r ea s p e r g i l l u s o r y z a e a - 9 0 0 5a n da s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 a r e ：p h 6 0 t h er a t i oo fi n o c u l a t i o n2 ：1 ；t h et e m p e r a t u r eo ff e r m e n t a t i o nw a s 3 2 k e yw o r d s ：d e f a t t e ds o y b e a nm e a l ；s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ；a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ； a s p e r g i l l u s o r y z a e a 一9 0 0 5 ；s o y b e a np e p t i d e 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 论文作者签名： 里量拯 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属l u 东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：卫至扭 同期：2 芝芝呈年l 月二l 日 导师签名：笙盔必 日期：圣! 空阜年月阜日 山东轻工业学院硕：仁学位论文 第1 章绪论 1 1 引言 豆粕是油脂加工副产品，其中的大豆蛋白含量很大，在4 5 0 5 5 o 之间， 而且其中8 0 o 以上都是水溶性蛋白【4 1 。因此，豆粕作为可开发的最丰富的植物蛋 白资源，主要用作饲料，少部分用于发酵食品生产，近4 0 的优质大豆蛋白未得到 有效利用，造成大量蛋白资源的浪费。以豆粕为原料进行深加工和综合利用的研 究显得相对薄弱。 大豆肽是大豆蛋白水解后的产物，功能性的大豆肽f l q 3 - 6 个氨基酸组成【l , 2 1 ， 其必需氨基酸组成与大豆蛋白质完全一样，含量丰富且营养平衡，而且肽类化合 物更容易被人体消化吸收，克服了大豆蛋白质在营养学上的弱点，具有比大豆蛋 白质更丰富的营养和功能特性，是一种极具潜力的功能性食品基料；另外，大豆 肽独特的生理结构特性，具有比大豆蛋白质更加优越的加工性能【3 】。近年来，大豆 肽的开发研究已成为国内外研究的热点。 我国大部分的肽类生产都使用酶法，已在蛋白酶选择，酶解工艺参数，水解 液脱苦、脱盐、分离精制等方面取得了一定进展。虽然酶法生产的产品安全性高、 生产条件温和、水解易控制。但仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植 物蛋白酶，且酶解法苦味不能根本去除，脱苦工艺和肽酶价格都增加了生产成本。 而液态发酵法生产大豆肽是现在研究的热门课题，发酵时间短，转化率高，但是 伴随大豆肽的苦味和臭味仍是不易解决的难题。本课题采用固态发酵豆粕生产大 豆肽，目前未见有这方面的报道，因此是从一个新的角度研究生产大豆肽的方法。 1 2 大豆肽的营养及保健功能 随着生物技术的进步和生命科学的发展，生物体内活性肽的生理功能受到了 越来越多的重视，尤其是许多活性肽的生理功能和结构的明朗，更是推动了科学 界对活性肽的研究。 ( 1 ) 氨基酸均衡 大豆肽的氨基酸组成与大豆蛋白质基本相同，必需氨基酸平衡良好且含量丰 富，见表1 1 。 第l 章绪论 表1 1 大豆分离蛋白( s p i ) 和大豆肽氨基酸组成 1a b l ei 1c o m o o s l t l o n0 1s o vd r o t e l r li s o l a t ea n ds o y l g e a np e p n o ea m l n oa e l a _-_-ow 氨基酸 s p l 人豆肽氨基酸 s p i 大豆肽 天冬氨酸 9 2 1 0 0半胱氨酸1 0 0 9 丝氨酸4 54 1酪氨酸 3 23 1 谷氨酸1 7 01 9 2缬氨酸3 83 7 甘氨酸 3 63 4 蛋氨酸 1 2 1 2 组氨酸2 22 3赖氨酸4 95 4 精氨酸 7 07 3 异亮氨酸 4 13 9 苏氨酸 3 23 0 亮氨酸 6 55 9 丙氨酸 3 33 2 苯丙氨酸 4 74 4 脯氨酸 4 3 4 4 ( 2 ) 易吸收性 将大鼠的小肠摘出并翻转过来，分别以大豆蛋白、大豆肽和具有大豆肽同样 组成的氨基酸混合物作翻转小肠试验，研究在消化酶不存在的条件下，这些蛋白 源是否能通过小肠黏膜。结果发现，大豆蛋白不能通过小肠黏膜，而大豆肽以及 同样组成的氨基酸混合物则能通过小肠黏膜。因此表明，大豆肽不仅具有与大豆 蛋白相同的必需氨基酸组成以及与大豆蛋白相比更易被消化吸收，而且其吸收速 度和吸收率与其它蛋白质和氨基酸混合物相比都是最高的。因此，大豆肽可以用 于维持和改善蛋白质营养状态，作为肠道营养剂或制成流态食品。 ( 3 ) 促进钙及微量元素吸收作用 由于大豆蛋白中植酸、草酸、纤维、单宁及其他多酚的存在，显著抑制了动 物对c a 、z n 、c u 、m g 和f e 的生物利用率。经研究表明，大豆肽具有与钙及其他微 量元素有效结合活性基团，可以形成有机钙多肽络合物，使溶解性、吸收率和输 送速度都明显提高，能促进钙的被动吸收。此外，大豆肽还能与f e 、g u 、s e 、m g 和m n 等多种微量元素结合，形成有机金属络合肽，是吸收和输送微量元素很好的 载体。 ( 4 ) 低过敏性和低抗原性 过敏反应是一种异常的病理性免疫应答。由于食物或食物组分中过敏原的存 在，因此，也会导致i g e 传递的特异性过敏反应。大豆蛋白具有一定的抗原性，尤 其是其中的7 s 和2 s 成分。通过酶的降解，大豆蛋白中的抗原成分大大减少，用酶免 疫测定法研究发现，大豆肽的抗原性比大豆蛋白质降低至1 1 0 0 1 10 0 0 5 1 。 ( 5 ) 促进脂肪代谢 日本学者小松卡夫等人在治疗儿童肥胖症的过程中发现，脱脂大豆蛋白降解 得到的大豆肽比牛乳更能提高基础代谢水平，进一步的实验表明添加大豆肽的食 2 山东轻工业学院硕上学位论文 品产热量最高，说明食后发热量增加，促进能量代谢进行，并且可促进皮下脂肪 减少。 对儿童肥胖症患者进行肥胖治疗，采取低热量饮食的同时以大豆肽作补充食 品时，比仅仅用低热量饮食时更能加速皮下脂肪的减少，加快因进食诱导产生的 热量的增加和加速基础代谢的上升。给小鼠在游泳过程中灌喂含有5 的大豆肽的 水溶液，小鼠附睾脂肪垫和周围脂肪的质量比对照组明显减少。因此，大豆肽不 仅能阻碍脂肪的吸收，还具有更强的促进脂肪代谢的效果。 ( 6 ) 抗氧化功能 易维学【6 】利用d p p h ( i ，1 二苯基一2 一苦肼基) 在5 1 7 n m 有自由基清除剂( 抗氧化剂) 存在且d p p h 的单电子被配对时，颜色会变浅，最大吸收波长处的吸光度也会变小， 而这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系，这一原理常用来研究大豆 肽的抗氧化活性。结果表明，5 8 4 9 大豆低聚肽的抗氧化能力相当于1 9 的t b h q ( 特 丁基对苯二酚) 纯品。其抗氧化能力是因为氨基酸残基含有组氨酸或酪氨酸，而组 氨酸和酪氨酸能消除自由基或整合金属离子的缘故1 7 ，8 】。 1 3 豆粕简介 我国是豆粕的生产大国，豆粕产量位于美国、巴西、阿根廷之后，居世界第 四位。东北三省是我国大豆的主产区，同时也是我国的豆粕的生产基地，加上山 东、河北、河南，豆粕产量约占全国的9 0 以上。1 9 9 3 1 9 9 4 年度之前，我国豆粕 产量一直维持在5 0 0 万吨以下。1 9 9 3 1 9 9 4 年度，国内豆粕产量首次突破5 0 0 万吨， 达6 3 8 5 力吨。之后，国内豆粕生产虽然受进口豆粕的冲击，但产量还是稳步增长。 随着人民生活水平的逐步提高，我国城乡居民对肉蛋禽鱼等食品的摄取量大幅增 加，促进了饲料加工业的迅猛发展。家禽、优质瘦肉型猪所用饲料迅速增加，刺 激了对优质蛋白饲料的需求。我国饼粕类产品很多，油菜籽和棉籽饼的产量也很 大，但这两种饼粕都要经过脱毒后才可用于饲料。因此，目前国内使用的优质饼 粕主要是大豆粕1 9 j 。 豆粕是大豆经浸提脱油后的碎片状或粗粉状的副产品，是目前使用最多、最 广泛的植物性蛋白质饲料原料。 豆粕是一种优质植物蛋白源，含粗蛋白约4 3 ，必需a a 含量高、组成合理。 l y s2 5 3 0 ( 是生长肥育猪营养需要量的2 倍，是蛋鸡营养需要量的4 倍) ；色 氨酸0 6 0 7 ；胱氨酸0 5 0 8 ，蛋氨酸o 5 0 7 ，蛋氨酸+ 胱氨酸是蛋鸡营 养需要量1 倍以上；l y s + a r g l 匕例恰当( 1 0 0 ：1 3 0 ) ，与大量玉米和少量鱼粉配伍， 特别适于家禽营养需要；其他如组氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等含量也都 在畜禽营养需要量之上i l o 】。 除了丰富的蛋白质，豆粕中还含有许多能产生生物效应的活性物质，其种类 3 第1 章绪论 及功能见表1 2 。 表1 2 豆粕中生物活性物质种类及功能 t a b l ei 2t h et y p ea n df u n c t i o no ft h eb i o l o g i c a la c t i v i t ym a t e r i a lo fi nd e f a t t e ds o y b e a n 种类功能 大豆低聚糖 大豆皂甙 大豆异黄酮 人豆活性肽 改善胃肠道、增强免疫力、降胆固醇 抗凝血、抗氧化、抗病毒、免疫调：市 抗雌激素、心血管防护、预防骨质疏松 降血脂、促进矿物质吸收、脂肪代谢 1 。4 国内外研究现状 我国于2 0 世纪8 0 年代开始了大豆肽的研究，近几年研究开发逐渐活跃起来， 并已初步实现大豆肽的规模化生产。2 0 世纪8 0 年代后，酶化学的迅速发展，大豆 蛋白的酶解工艺和酶解过程的研究取得了较大的进展。微生物发酵法是通过微生 物的生化反应将大豆蛋白转化为大豆肽，此法生产的大豆肽不是将大豆蛋白质简 单切成小肽，而是将小肽之间的移接和重排的过程，通过微生物作用可对某些苦 味基因进行修饰、转移和重组，制得的大豆肽具有溶解性好，苦味和异味小，口 感好，溶解黏度小，受热不凝固等优点。微生物发酵法克服了酶解法生产大豆肽 易使产品：苦味大和口感差等缺点i j 引。 大豆肽的生产方法有直接酶解法和发酵洌m 】。直接酶解法由于使用高价格的 酶而提高了大豆肽的生产成本；发酵法由于把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解 生产结合在一起，降低了大豆肽的生产成本，应用前景较好l l 副。 在豆粕固态发酵方面，有研究i l6 】用优良菌种少孢根霉r t 3 制备菌丝碎片发酵 剂，固态发酵豆粕生产饲料。新工艺较常规生产工艺缩短发酵时间2 4 h ，不需分段 控温。制备菌丝时葡萄糖、尿素分别是根霉液态生长最好碳源和氮源。发酵豆粕 蛋白消化率达9 2 1 8 ，氨基酸比、化学生物价、必需氨基酸指数和蛋白质功能比 值分别提高2 7 、1 2 、1 9 和3 8 。另外有人以大豆分离蛋白为原料 1 7 j ，通过米 曲霉的发酵生产大豆肽，先以水解度为指标初步探索发酵工艺条件，然后通过正 交试验，并以大豆多肽含量为指标确定摇瓶发酵的最佳工艺条件，即发酵液初始 p h 6 0 ，发酵培养温度2 8 ，培养基中大豆分离蛋白含量3 ，摇瓶转速1 8 0 r m i n ， 发酵时间6 0 h - 7 0 h ，得到的大豆多肽发酵液具有良好的口感。采用米曲霉( a 3 0 4 2 ) 和啤酒酵母混合菌株固态发酵法生产发酵豆粕【1 8 】，利用霉菌产生的多种酶系，降 解其中的纤维素及蛋白质等物质，利用酵母菌合成菌体蛋白。研究了发酵料坯组 成接种菌配比、接种量及发酵温度对发酵豆粕中蛋白质含量的影响，得到了最佳 工艺条件：即最适温度2 8 ，发酵料坯组成1 0 0 ：6 ( 豆粕麸皮) ，接种菌配比为l ： 4 山东轻工业学院硕士学位论文 3 ( 米曲霉酵母) ，接种量6 ，发酵时问为2 h 。发酵豆粕中粗蛋白含量可达4 9 o ， 比原料中增加1 2 1 。我国河南遂平华康生物工程有限公司利用压榨后的豆粕开发 出了大豆蛋白纤维，建成了一条年产1 5 0 吨、可生产1 5 0 0 万米面料的工业化生产线， 生产出了性能优良、可以满足纺织产品加工性能要求的大豆蛋白纤维。 目前发达国家在大豆肽的研究方面取得许多成果，大豆肽产品得到广泛开发 和应用。国际上对大豆肽的研究始于2 0 世纪7 0 年代，其中美国和日本处于大豆肽 生产和应用的前列。美国与日本在2 0 世纪8 0 年代相继研究出大豆多功能肽，并己 成功地将大豆肽用于食品工业。2 0 0 0 年日本批准大豆肽作为降低胆固醇的特定保 健食品。美国d e l t o w n s p e c i a l i t i e s 公司建成年产5 0 0 0 吨大豆肽的工厂，功能性大豆 肽已成为国外功能保健食品的主要配料之一【1 9 1 。对大豆多肽的研究，美国和日本 无论在基础理论还是在应用研究方面，均处于世界领先地位。美国2 0 世纪7 0 年代 初研究的新型大豆深加工产品大豆多肽，d e h o w ns p e c i a t i o n 公司建成了年产 5 0 0 0 t 食用蛋白肽的加工厂。日本2 0 世纪8 0 年代开展此方面的研究，不二制油公司、 雪印和森永等乳业公司均己成功地将大豆肽应用于食品工业领域【2 。 但是，现代发酵工业大多以大规模液体深层发酵为特征，小分子产品在水性 发酵液中含量大都在1 0 上下，许多高价值或大分子浓度更低，有的甚至大大低于 1 ，因而发酵液产品提取后产生大量的废液，生产规模越大，废液越多，污染越 重【2 们。 随着固态发酵技术的改进和完善，固态发酵不仅可以应用于液态发酵不能实 现的发酵过程，也可应用于一些目前已有的液态发酵过程并与之一争高低i l 引。应 用现代固体发酵技术能实现大规模生产，而且其投资规模和生产成本往往要比液 态发酵法低，特别适合于一些精细发酵制品的制备和生产，更重要的是现代固态 发酵往往没有影响环境的污染废物产生，在食品加工业中将发挥越来越重要的作 用【4 2 , 4 4 】。9 0 年代以来，随着能源危机与环境问题的日益严重，固态发酵技术以其 特有的优点( 如无“三废”排放) 引起人们极大的兴趣。固态发酵领域的研究及其在 资源环境中的应用取得了进展，丰要表现在生物燃料、生物农药、生物转化、生 物解毒及生物修复等方面的应用1 4 引。 豆粕经固态发酵则可有效提高蛋白质生物转化率。豆粕发酵与菌种发酵剂密 切相关，而根霉是最常用菌种。传统发酵豆粕的发酵剂主要有三种：( 1 ) 前一批发 酵豆粕饲料：( 2 ) 以前豆粕发酵时使用的覆盖物中霉菌残留物；( 3 ) 高热过度生长 真菌菌丝体。这些发酵剂的活力不均，且常遭受其它微生物污染，出现难以预测 的发酵，甚至导致全部发酵失败1 4 6 , 4 7 】。目前国内外还未见固态发酵法生产大豆肽 的探究。 5 第l 章绪论 1 5 立题依据 目前大豆肽多以大豆蛋白为原料，酶法或液态发酵法生产，成本较高，影响 了其推广应用4 8 , 5 0 】。本课题的目的是以廉价易得的豆粕为原料，采用固态发酵法， 通过微生物的多种蛋白酶直接对豆粕中的蛋白质进行水解，并对其发酵条件进行 优化，以期将来能实现利用豆粕通过固态发酵法来生产大豆肽的目标。这对于降 低大豆肽的成本，扩大其应用范围，具有积极的意义。 曲霉对营养要求较低，只要求培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等 元素即能生长良好，是发酵工业应用常见的菌种之一；另外，曲霉发酵豆粕生产 大豆多肽具有不产生真菌毒素，符合食品卫生要求，菌丝体易成型，培养条件粗 放，有较多的酶系，内肽酶和端肽酶共同作用豆粕，既能切割中间肽键又能切割 末端肽键，生长温度宽，利于常年生产等优点。理论上可以得至0 功能特性更好的 大豆多肽。 1 6 研究内容 本课题探索霉菌发酵豆粕制备大豆肽的方法，主要研究豆粕发酵制备大豆肽， 通过测定黑曲霉和米曲霉单菌种及混合菌种发酵过程中蛋白酶酶活和转化率的动 态变化趋势，然后在单因素实验的基础上，运用j 下交试验分析方法对发酵条件进 行优化，并探索黑曲霉和米曲霉混合发酵豆粕的最优发酵条件，为大豆肽的生产 提供理论依据。 ( 1 ) 发酵过程中p h 值的变化情况、蛋白酶酶活的变化情况以及总糖和还原糖含 量变化情况等各理化指标动态变化的测定分析； ( 2 ) 单菌种单因素条件的研究和优化； ( 3 ) 各指标之间天系的探讨； 6 山东轻工业学院硕士学位论文 第2 章黑曲霉发酵豆粕制备大豆肽的研究 2 1 引言 黑曲霉可产生多种活性较强的酶系，如纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等。 酸性蛋白酶主要是端肽酶( 如天冬氨酸蛋白酶) ，研究表明端肽酶能从大豆蛋白 肽链的末端开始水解，特异性地切断疏水性多肽末端的两种疏水性氨基酸，使大 分子蛋白被切成数段的小分子，即成为大豆肽。 本实验研究黑曲霉发酵豆粕生产大豆肽中影响产蛋白酶酶活、转化率的主要 影响因素进行详细的实验，研究各个因素分别对于发酵的影响，测定不同发酵条 件下的蛋白酶酶、转化率活并绘制发酵过程中的动态曲线。对黑曲霉固态发酵法 生产大豆肽的广泛应用提供参考。 2 2 材料与方法 2 2 1 原料 黑曲霉a s 3 3 5 0 ，购自山东大学微生物学实验室； 豆粕，山东万得福集团生产； 麦麸，市场购买。 2 2 2 试剂 0 1 m o l l 氢氧化钠溶液，6 m o l l 氢氧化钠溶液，3 ，5 一二硝基水杨酸，l m g m l 葡萄糖标准溶液，福林酚试剂，0 4 m o l l 碳酸钠溶液，0 4 m o l l 三氯乙酸溶液， 1 酪蛋白溶液，p h 7 2 磷酸缓冲溶液，p h 2 3 乳酸乳酸钠缓冲液，p h l 0 0 硼砂一 氢氧化钠缓冲液；6 m o l l 盐酸溶液，l 酪氨酸标准溶液；浓硫酸过氧化氢水混合 液( 2 ：3 ：1 ) ，硼酸指示剂混合液，混合指示剂，o 3 n a c l 溶液。 2 2 3 仪器设备 h w s 2 5 0 型恒温恒湿培养箱上海精宏实验设备有限公司 m j p s 1 5 0 型霉菌培养箱上海精宏实验设备有限公司 d z k w c 型电子恒温水浴锅黄马市卸甲综合电器厂 l g l 0 2 4 a 高速离心机北京医用离心机厂 g h x 9 0 0 0 b 1 隔水式恒温培养箱上海福玛实验设备有限公司 s w c j 2 g 型双人净化工作台苏州净化设备有限公司 a l 2 0 4 电子天平梅特勒托利多仪器有限公司 k j e l t e c2 3 0 0 全自动凯氏定氮仪 福斯分析仪器公司 d h z 型大容量恒温振荡器上海福玛实验设备有限公司 7 第2 章黑曲霉发酵豆柏制各大豆肽的研究 s p e c t r u m l a b2 2 p c 可见光分光光度计 上海棱光技术有限公司 p 8 1 0 酸度计北京赛多利斯仪器系统有限公司 2 2 4 实验方法 2 2 4 1 固态发酵工艺流程和培养基的配置 ( 1 ) 固态发酵工艺流程： 菌种活化 l 原料( 主要为豆粕) 专灭菌一固态发酵一三氯乙酸提取一大豆肽提取液。 ( 2 ) 斜面培养基，察氏固体培养基【5 6 】； ( 3 ) 液体活化培养基，察氏液体培养基【5 6 】； ( 4 ) 斜面活化菌种转接到液体培养基中，于3 0 。c ，2 0 0 r m i n 振荡培养3 6 h ，待 生成均一小菌丝球时可用于发酵。 ( 5 ) 固态发酵培养基：按6 5 含水量配制发酵基质，配制不同豆粕与麸皮豆粕 含量、p h 条件下的豆粕，取10 9 分装于2 5 0 m l 三角瓶中，1 2 1 ，2 0 m i n 灭菌，待 用。 ( 6 ) 固体发酵方法：取一定量的豆粕，按不同比例加入麸皮，调p h 至5 4 6 6 ， 发酵料坯含水率调节至6 5 。经灭菌、冷却，分别用黑曲霉、米曲霉接种，接种 量为1o ，将接菌后的发酵培养基放入相对湿度9 0 霉菌培养箱不同温度f 培养， 发酵过程和结束后测定发酵豆粕中各项指标。 2 2 4 2 还原糖和总糖的测定 ( 1 ) 还原糖的测定采用3 ，5 一二硝基水杨酸比色法f 2 4 】 计算： 还原糖( ) = c x l 0 3 x b 1 0 0 v w 2公式( 2 1 ) 式中c 测定样品溶液查得相当于葡萄糖量( g ) ； b 样品溶液稀释倍数； v 比色时吸取样液的量( m l ) ； w 样品的重量( g ) 。 ( 2 ) 总糖测定采用酸解法 准确称取样品2 9 ( 精确纪录到0 0 0 0 1 9 ) ，用l o m l6 m o l l h c i + 1 5 m l 的蒸馏水 沸水浴酸解2 0 m i n ，5 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，调p h 7 0 移到1 0 0 m l 的容量瓶中，定 容，吸取l m l 至于2 5 m l 容量瓶，加入二硝基水杨酸2 m l ，沸水浴加热2 m i n 冷却 定容至l o m l ，在5 8 0 n m 处测定吸光度。 计算： 8 山东轻工业学院硕士学位论文 总糖( ) = c x l 0 。x b x l 0 0 v w 2 2 4 3 蛋白酶酶活的测定 采用福林酚法测定口5 】 计算： 公式( 2 2 ) 蛋白酶酶活力x = k x a x 4 1 0 x n公式( 2 3 ) 式中a 平行试验管的平均光吸度； 4 离心管中反应液总体积( m l ) ； l 卜反应1 0 m i n ； n 稀释倍数： k 值为9 7 1 7 ，由酪氨酸浓度标准曲线得出。 2 2 4 4 肽转化率的测定 采用凯氏定氮法测定口6 1 。 计算： 大豆肽转化率= 酸溶蛋白含量原豆粕蛋白含量 具体为：转化率= d 幸l ( m 木8 9 母3 5 宰4 6 ) 式中驴一凯氏定氮值( g l o o m l ) i 提取液总量( m 1 ) m 取样量( g ) 8 9 一培养基豆粕含量 3 5 培养干基含量 4 6 豆粕含氮量 2 2 4 5p h 值的测定 公式( 2 - 4 ) 公式( 2 - 5 ) 取样品2 0 0 0 9 ，加入蒸馏水1 0 m l ，均质后用p h 计测定此悬浮液的p h 值【5 3 1 。 计算： p h 水= 6 9 0 p h 为酸性，公式为：2 * 1 0 x + 1 0 * 1 0 p h , = 1 2 * 1 0 。p n 测 p h 为碱性，公式为：2 1 0 - 1 4 + x1 0 1 0 。p h = 1 2 * 1 0 1 4 + 叩铡 公式( 2 6 ) 公式( 2 7 ) 2 3 结果与讨论 2 ，3 1 发酵动态过程 按2 2 4 1 方法，在9 0 豆粕含量、1 0 黑曲霉接种量、p h 6 0 、3 0 。c 培养条件 下进行发酵，通过研究发酵动态过程中还原糖、总糖、蛋白酶酶活、肽转化率、 p h 值在预定发酵条件下的变化，从而确定发酵最优条件，使豆粕得到最大程度利 用。 9 第2 章黑曲霉发酵豆粕制备大豆肽的研究 2 3 1 1 蛋白酶酶活 福林酚法测定蛋白酶酶活的标准曲线如图2 1 所示。 要 星 童 刨 米 蓉 o1 02 03 04 05 0 浓度( p g m 1 ) 图2 1 酪氨酸浓度标准曲线 f i 醇1t y r o s i n ec o n c e n t r a t i o ns t a n d a r dc u r v e 6 0 根据标准曲线得酪氨酸标准曲线的回归方程为： y = o 010 3 x 0 0 0 0 9 ，r 2 = 0 9 9 9 3 公式( 2 8 ) 式中x 甘氨酸浓度( p g m l ) y 吸光度 在标准曲线上求得吸光度为1 时相当的酪氨酸微克数( 即为k 值) ：k = 9 7 1 7 蛋白酶酶活的变化趋势如图2 2 所示。 仓 e 烬 塔 嚣 正 嘲 5 0 0 1 0 0 0 o2 44 87 29 6 1