（食品科学专业论文）α淀粉酶抑制剂的提取、分离及性质研究.pdf

j i i iti i ii lli ll ll lil ll 17 7 8 2 91 仅淀粉酶抑制剂的提取、分离及性质研究 s t u d yo ni s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fa - - a m y l a s e i n h i b i t o ra n di t sc h a r a c t e r i s t i c s 专业：食品科学 研究生： 指导教师： 王文蒙 李楠副教授 生物技术与食品科学学院 2 0 1 0 年5 月 中文摘要 a 一淀粉酶抑制剂( q a m y l a s ei n h i b i t o r ) 是一类能抑制消化道中糖类吸收的物质的统称， 它是通过抑制和降低肠道内唾液淀粉酶及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解 和消化，从而达到减少人体对糖分的摄取，降低人体血液中糖、脂含量的目的。目前，仅 淀粉酶抑制剂在医药和农业等领域具有广泛的用途。临床医学上它是防治糖尿病、高血糖、 高血脂等病的良好药物；农业上，可将淀粉酶抑制剂基因作为抗虫基因，或者将其制成生 物农药；在酶学研究方面，它可作为探究0 【一淀粉酶活性部位的分析工具或测定a 一淀粉酶同 工酶的反应物。因此，a 一淀粉酶抑制剂应用前景十分广阔。 本实验以白芸豆和小麦麸皮为原料提取分离纯化0 【淀粉酶抑制剂，对其工艺条件进行 了研究。结果表明：小麦麸皮：水= 1 ：8 ( 1 0 0 9 小麦麸皮，8 0 0 m l 纯净水) ，浸泡时间2 h ， 添加0 2 m o l l 的n a c l 助溶，并以7 0 硫酸铵沉淀蛋白，再经超滤膜和冷冻干燥处理，最 终得到2 0 7 2 9 粉末，总蛋白含量2 0 1 m g ，比活力为1 0 3 u m g ，总抑制活力为2 0 7 2 0 u ，收 率为4 1 7 4 。该抑制剂在p h 4 1 1 时较稳定；在8 0 。c 下作用3 0 m i n 酶活性丧失1 0 左右。 白芸豆：水= 1 ：8 ( 1 0 0 9 白芸豆，8 0 0 m l 纯净水) ，2 4 h 浸泡过夜，粉碎搅拌4 h ，添加0 2 m o v l 的n a c l 助溶，得出1 8 4 9 干燥样品，配置成浓度为5 m g m l 的溶液，比活力为2 2 2 u m g ， 总活力为3 3 4 8 8 u ，最终抑制收率为7 1 9 。该抑制剂在p h 3 1 0 时较稳定，8 0 。c 下相对稳 定。 s d s 凝胶电泳测定得出，麸皮0 l a i 得到三条蛋白质条带，分子量分别是3 3 k d ，3 0 k d ， 2 6 k d ；白芸豆0 【a i 得到两条蛋白质条带，分子量分别为3 5 k d ，3 0 k d 。对两种0 【淀粉酶抑制 剂抑制动力学试验表明：小麦麸皮c 淀粉酶抑制剂对嘎一淀粉酶的抑制类型为混合非竞争性 抑制类型，抑制常数为3 4 7 m g m l ；白芸豆0 【一淀粉酶抑制剂对0 【淀粉酶的抑制属于不可逆抑 制。 本实验还做了较大规模的小麦麸皮中a 一淀粉酶抑制剂的提取，为今后工厂化生产提取 提供前期基础数据。 关键词：仅淀粉酶抑制剂；小麦麸皮；白芸豆；分离；纯化；性质 a b s t r a ct a - a m y l a s ei n h i b i t o ri sag r e a tp o t e n t i a lm e d i c i n e , w h i c hc a nr e s t r a i nt h ec a r b o h y d ：r a t e a b s o r p t i o ni nt h ed i g e s t i v et r a c t i tc a ne f f e c t i v e l yi n h i b i ti n t e s t i n a ls a l i v aa n dp a n c r e a t i ca m y l a s e a c t i v i t y , a n di m p e d et h eh y d r o l y s i sa n dd i g e s t i o no fc a r b o h y d r a t e si nf o o d ，r e d u c et h ei n t a k eo f s u g a r l o w e rb l o o ds u g a ra n db l o o df a tl e v e l s i tw i l ln o tp r o d u c eah i 曲b l o o ds u g a ra f t e re a t i n g t h u si n s u l i ns e c r e t i o nw a sr e d u c e da n df a ts y n t h e s i sw a sp l a y e dd o w n ，w e i g h tl o s s c u r r e n t l yi t h a saw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o n si nm e d i c i n ea n da g r i c u l t u r e ，i nc l i n i c a lm e d i c i n ei ti su s e dt o p r e v e n td i a b e t e s ，h i 曲b l o o dg l u c o s e ，h y p e r l i p e m i ae t c ；i na g r i c u l t u r e , i ta l s oc a l lb eu s e da s i n s e c t r e s i s t a n tg e n et oi m p r o v et h ep l a n tr e s i s t a n c eo rm a d eo fb i o l o g i c a lp e s t i c i d e s i na d d i t i o n ， i nt h ee n z y m er e s e a r c h ，i tc a nb eu s e da s e x p l o r eq a m y l a s es i t ea n a l y s i st o o l s ，a sa d e t e r m i n a t i o n g t - a m y l a s er e a g e n tb ys e l e c t i n gp r o c e s s t h e r e f o r e , t h e r e a r ev e r yb r o a d a p p l i c a t i o np r o s p e c t si n0 【- a m y l a s ei n h i b i t o r i nt h i se x p e r i m e n t ( i t a m y l a s ei n h i b i t o rw a se x 缸a c t e df r o mt h ew h e a tb r a na n dtw h i t e k i d n e yb e a n s ，a n dt h et e c h n o l o g yw a sr e s e a r c h e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw h e a tb r a n ：w a t e r = 1 ：8 t h ef i n a lc h o i c eo fs o a k i n gt i m ew a s2 h ，0 2 m o l ln a c ih e l p e dt h es o l u t i o n ，a n d7 0p e r c e n t o ft h ea m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，b yt h eu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n ea n df r e e z e d r y i n g p r o c e s s i n g , a n dg o t2 0 7 2 9p o w d e rs a m p l e ，t h et o t a lp r o t e i nc o n t e n tw a s2 0 1 m g ，s p e c i f i ca c t i v i t y w a s10 3 u m g ，t h et o t a li n h i b i tv i t a l i t yr e a c h e d2 0 7 2 0 u ，r e c o v e r yw a s41 7 4 i tw a ss t a b l e b e t w e e np h 4 11 ；u n d e r8 0d e g r e e sc e l s i u si n3 0 m i n ，t h ea c t i v i t yo fa - a m y l a s ei n h i b i t e rg o t10 l o s s ；w h i t ek i d n e yb e a n ：w a t e r = 1 ：8 t h ef i n a lc h o i c eo fs o a k i n gt i m ew a s2 4h 0 2 m o l ln a c l h e l p e dt h es o l u t i o n ，t os u l f a t ep r e c i p i t a t i o nw i t h1 ：1a l c o h o l ，e v e n t u a l l yg o t1 8 4 9p o w d e rs a m p l e ， s p e c i f i ca c t i v i t yw a s2 2 2 u m g ，t h et o t a li n h i b i tv i t a l i t yr e a c h e d3 3 4 8 8 u ，r e c o v e r yw a s7 1 9 i t ss t a b i l i t yi np h 3 10 ，i tw a ss t a b l eu n d e r8 0d e g r e e sc e l s i u s w eg o tt h r e eb a n d sf r o m0 t a io fw h e a tb r a nb ys d sp a g e t h em o l e c u l a r sw e r e 3 3 k d ，3 0 k da n d2 6 k d ；t w ob a n d sw e r eg o tf r o mw h i t ek i d n e yb e a n ，h em o l e c u l a rw e r e3 5 k da n d 3 0 k d t h ei n h i b i t i o nk i n e t i c ss h o w e dt h et y p eo f 静a io fw h e a tb r a nw a sm i x e d n o l l - c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n ，t h ec o n s t a n to fi n h i b i t i o n ( k i ) w a s3 4 7 m g m 1 t h ei n h i b i t i o no f w h i t e k i d n e yb e a n 旺- a 1w a sn o n - r e v e r s i b l e w ea l s om a k e dt h ee x p e r i m e n to f l a r g e - s c a l ee x t r a c t i o nf r o mw h e a tb r a n ，g i v e dt h eb a s i c d a t ef o ri n d u s t r yp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：a - a m y l a s ei n h i b i t o r ；w h e a tb r a n ；w h i t ek i d n e yb e a n ；i s o l a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ； c h a r a c t e r i s t i c s 目录 第一章前言l 1 1 国内外研究概况一2 1 2a 淀粉酶抑制剂的来源及种类4 1 3 理化特性及动力学性质4 1 4 泓a i 作用机制研究一6 1 50 【a i 的应用前景。7 1 5 1 在临床医学方面7 1 5 2 在农业方面8 1 6 本课题的研究目的、意义及主要研究内容9 第二章实验材料、设备与分析方法1 1 2 1 实验材料1 1 2 2 实验设备l l 2 3 分析方法1 2 2 3 1q 淀粉酶抑制剂提取方法1 2 2 3 2 淀粉酶抑制剂活性的测定方法1 3 2 3 3 抑制活力的定义1 3 2 3 4 蛋白含量的测定一1 4 2 3 50 【淀粉酶抑制剂的纯化方法1 5 2 3 6 温度对a 淀粉酶抑制剂的抑制活性影响15 2 3 7p h 对a 一淀粉酶抑制剂的抑制活性影响1 5 2 3 8 金属离子对0 【淀粉酶抑制剂的抑制活性影响一1 5 2 3 9a 淀粉酶抑制剂分子量的测定方法15 2 3 1 0a 淀粉酶抑制剂抑制动力学研究方法1 6 第三章a 淀粉酶抑制剂制备工艺1 9 3 1 标准曲线的制备1 9 3 1 1 淀粉浓度标准曲线1 9 3 1 2 蛋白浓度标准曲线1 9 3 2 ( i t 淀粉酶抑制剂的粗提取2 0 3 2 1 小麦麸皮c c 淀粉酶抑制剂的粗提取2 0 3 2 2 白芸豆0 【淀粉酶抑制剂的粗提取2 4 3 30 【淀粉酶抑制剂的纯化2 8 3 3 1 葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡2 8 3 3 2 d e a e 纤维素的处理及装柱一2 9 3 3 3c m 纤维素离子柱层析3 0 3 3 4s e p h a d e x g 一7 5 凝胶柱层析3 1 第四章q 淀粉酶抑制剂的性质研究3 3 4 1 ( i t 淀粉酶抑制剂活性主要影响因素3 3 4 1 1 温度对0 t , 淀粉酶抑制剂的抑制活性影响3 3 4 1 2p h 对c c - 淀粉酶抑制剂的抑制活性影响3 4 4 1 3 金属离子对n 。淀粉酶抑制剂的抑制活性影响3 5 4 2a 淀粉酶抑制剂分子量的测定3 6 4 3a 淀粉酶抑制剂抑制动力学研究3 8 4 3 1 酶反应动力学进程曲线的制作和最适酶量的确定3 8 4 3 2 米氏常数k m 和最大反应速率v i 眦的测定3 9 4 3 3o t - a i 对洳淀粉酶的抑制类型3 9 4 3 4 可逆抑制类型及抑制常数4 1 第五章0 【淀粉酶抑制剂扩大化提取试验4 2 5 1 实验设备4 2 5 2 实验试剂4 2 5 3 工艺流程及收率4 3 第六章结论与展望4 4 参考文献：4 6 第一章前言 第一章前言 0 t 淀粉酶是一类存在于自然界的水解酶，用途十分广泛。食品工业、粮食加工、酿造、 发酵、医药行业和纺织品工业都经常使用【1 1 。它通过从分子内部切开仅1 、4 糖苷键而作用 淀粉，生成还原糖和糊精从而催化淀粉水解【2 。3 1 。生成一个最末端残基上的第一个碳原子构 型为伐构型的产物，称为伐淀粉酶。c t 一淀粉酶抑制剂能与c t 一淀粉酶分子上的相应部位结合 并改变弘淀粉酶分子构象，降低它的催化活性或使之丧失。它们对人类、哺乳动物、昆虫 以及微生物的仅一淀粉酶有很强的特异性抑制作用，属于糖水解酶抑制剂的一种。因此，研 究淀粉酶抑制剂，既有相当重要的理论意义，又有十分广阔的应用前景：在农业上，在转 基因抗病虫农作物新品种培育方面提供理论依据，为设计新型无毒无污染杀虫、杀菌药物， 减少环境污染提供实验材料。医药上，为研究开发淀粉酶抑制剂应用产品提供研究基础。 酶学研究方面，它为研究抑制剂与酶的作用提供了新角度，使人类更深层次的了解了酶结 构与功能关系及酶在代谢中的作用，这些对于研究代谢类疾病发病机理和治疗方法具有重 要的意义【4 巧j 。 0 【淀粉酶抑制剂( 0 【一a m y l a s ei n h i b i t o r ，0 【a i ) 是一种糖苷水解酶抑制剂，是一种纯天 然生物活性物质【6 1 ，它存在于植物种子的胚乳中【7 1 ，国外把它称为“s t a r c hb l o c k e r ”【3 1 。2 0 世纪7 0 年代以来，因其在医学上的价值q 淀粉酶抑制剂而被广泛研究，目前已经从豆类、 小麦、野生苋属9 啦! 等植物种子中分离得到a a i ，其中活性较高的是从白芸豆中提取的 a a i ，它对哺乳动物胰旺淀粉酶有较强的抑制作用，国外已经将其作为减肥保健食品进行 应用。 白芸豆( w h i t ek i d n e yb e a n s ) ，生物学名为多花菜豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) ，属于一年生、 缠绕或近直立草本。属豆科( l e g u m i n o s a e ) ，蝶形花亚科，菜豆族菜豆属。别名因地方不同 而各具特色【1 3 】：四季豆( 南方各地) 、芸豆( 东北地区) 、白豆( 广西) 、菜豆、白腰豆、 玉豆、时季豆、四月豆、梅豆、架豆、龙芽豆等。原产美洲的墨西哥和阿根廷，广泛种植 于温带地区。现中国各省区均有种植，其中面积比较大的省份有云南、贵州、四川。 白芸豆【1 4 】植株蔓生，根系发达。高度3 - 5 m ，枝繁叶茂，分枝很多，心脏形叶、深绿色，在 腋处着生总状花序。从植株形态可分为两个类型，矮生种和蔓生种。按其用途可分为软荚 种和硬荚种，前者采收鲜嫩的豆荚，主要作蔬菜；后者采收成熟的籽粒，主要作粮食用。 作为食物，芸豆不宜生食，必须煮透方能食用。是因为【1 5 】芸豆籽粒中含有一种对人体有 毒的蛋白一植物凝集素( p h a ) ，但它对热呈不稳定性，所以食用芸豆必须煮熟，消除其毒性， 第一章前言 更好地发挥其营养效益，否则将会引起中毒。 芸豆营养价值很高，含蛋白质2 5 3 1 1 ，脂肪1 5 - 2 2 ，碳水化合物5 5 6 一7 0 3 以及大量的维生素，据分析【1 6 1 ，每1 0 0 9 的干豆含蛋白质1 9 9 2 0 0 ，脂肪1 6 。2 1 ，碳 水化合物3 7 6 一4 8 5 ，钙1 2 0 m g ，铁1 0 m g 。此外，还包括维生素b 11 5 6m g 和维生素 b 21 0 2 m g 。 我国古医籍的记载，菜豆的果壳、籽、根均可入药。芸豆性味甘、平，具有温中下气、 利肠胃、益肾补元等功用，是一种滋补食疗佳品。芸豆还有镇静作用，对于治疗虚寒呃逆、 胃寒呕吐、跌打损伤、咳嗽、腰痛、神经痛均有一定疗效。芸豆还是一种高钾低钠食品， 非常适合于心脏病、动脉硬化、高血脂患者食用。芸豆籽粒中含有血球凝集素等多种球蛋 白。此外，还可以在芸豆籽粒里提取凝血素p h a ，这是医学上用于止血和动物遗传分析时培 养染色体所必需的【1 7 1 。 经研究证实菜豆素( p h a s e o l i n ) 是白芸豆的有效成分，也有人把它称为菜豆蛋白，是一种 7 s 、含三个多肽亚基( a ，p 和丫) 的寡聚球蛋白，共占芸豆籽粒总蛋白的5 0 以上，是白芸豆 主要的贮存蛋白，存在于芸豆的胚轴中【1 8 1 ，种子中含有糖蛋白、一种胰蛋白类的抑制物，此 外还含有血球凝集素( h e m a g g l u t i n i n e ) 。种子的子叶和轴部分含有谷甾醇、豆甾醇和少量菜 油甾醇、植物凝集素( p h a ) 。种皮中含有无色蹄纹天竺素、无色飞燕草素，以及山柰酚、 蹄纹天竺素、飞燕草素、短牵牛素、槲皮素、锦葵花素等的3 一葡萄糖营，山柰酚木糖葡萄 糖苷、蹄纹天竺素、飞燕草素等的3 ，5 - - - 葡萄糖苷。 1 1 国内外研究概况 国外关于0 l 淀粉酶抑制剂的研究起步较早，早在2 0 世纪4 0 年代就有报道证明小麦种 子中含有c 【淀粉酶抑制剂【1 9 1 ，它是一种分子量为2 1 k d 的蛋白质。1 9 4 5 年报道在普通大豆 上也存在a 淀粉酶抑制剂。但在随后二十多年间很少有这方面的报道。之后b i r k 【2 0 】等提出 小麦粉中存在两种0 c 淀粉酶抑制剂，并对它们进行了分离和性质研究。研究显示它们对不 同来源的0 【淀粉酶具有不同专一性。随后的研究【2 l 】表明：小麦种子中的a 淀粉酶抑制剂是 一种多分子蛋白质，它能抑制昆虫和哺乳动物的淀粉酶活性。1 9 7 2 年报道了微生物上也存 在仅淀粉酶抑制剂。2 0 世纪7 0 年代q 淀粉酶抑制剂被广泛研究，随着其在医学上重要作 用的发现，尤其在抑制高血糖方面的作用，使其在八九十年代被深入研究和分析【2 2 】。 目前为止，各种研究已经发现了来自微生物和植物的1 0 0 多种具有抑制0 【一淀粉酶活性 2 第一章前言 的物质，其中一些已经进入到临床试验阶段【2 3 1 。近年来，关于a 淀粉酶抑制剂的研究热点 主要集中在微生物来源的糖( 苷) 水解酶抑制剂的筛选工作，尤其是在同本和德国。现己报 道的这类酶抑制剂有2 0 多种。n a m i k i 2 4 】等人从链霉发酵液中分离得到一种新的寡糖类q 糖苷水解酶抑制剂a d i p o s i n ，体内试验表明它对胰腺或唾液的a 淀粉酶有很强的抑制作 用，达到了降低血糖、血脂浓度的目的。 国内关于酶抑制剂方面的研究起步较晚，开始于7 0 年代后期。福建省微生物研究所 从土壤中筛选得到一种能生产酶抑制剂的菌株s 2 3 5 ，并深入研究了其代谢产物的分离及 理化性质【2 5 1 。上海医药工业研究所在8 0 年代初开始与美国辉瑞公司、日本东京微生物化 学研究所及麒麟啤酒公司开展合作，研究从土壤中寻找由微生物产生的新的生理物质，并 建立了淀粉酶抑制剂的筛选模型【2 6 】。江西省中医药研究所从小麦中提取一种a 淀粉酶抑制 剂，并对其结构组成以及理化特性作了进一步研究【2 刀。河北省科学院生物研究所对酶抑制 剂的研究具有显著成果，在国内首屈一指。该所从链霉菌中获得了产生0 【淀粉酶抑制剂的 菌种s 1 9 1 ，是国内首次从淡紫灰类群中筛选出该抑制剂菌株。随后，他们建立了适合 s 一1 9 - 1 菌株的发酵工艺，并对其化学性质进行了研究。其研究表明：该法得到的伽淀粉酶 抑制剂的活性超过7 0 ，并经小鼠试验证明此q 淀粉酶抑制剂无任何毒副作用。这一研究 已经获得中国科技成果奖。 目前，农业上关于酶抑制剂的研究主要是抗虫基因淀粉酶抑制剂基因，它是一种基于 分子生物学的植物基因工程技术。豆科作物和禾谷类作物的种子中的含有丰富的a 淀粉酶 抑制剂。它的杀虫机理主要由两方面构成：一方面，昆虫食用植物种子后，种子中存在的 0 l 一淀粉酶抑制剂抑制了昆虫消化道内a 淀粉酶的活性，使进入昆虫食道中的淀粉不能消化 水解，阻断了昆虫的能量来源；另一方面，伍淀粉酶抑制剂能与淀粉消化酶形成e i 复合物， 从而刺激昆虫的消化腺分泌过量的消化酶，促使昆虫产生厌食反应，导致其发育不良甚至 死亡。有研究表明，把从大麦或小麦中克隆得到的淀粉酶抑制剂基因整合到烟草中，该基 因在烟草中可以正确表达，具有明显的抗虫效果。中科院也在进行这方面的研究，他们从 事的菜豆淀粉酶抑制剂基因研究正处于试验阶段【2 8 1 。王琳、周铁杨等在野生苋属植物籽实 中新型伍淀粉酶抑制剂的分离纯化及其性质研究中得到一种新型的蛋白质类抑制剂 w a i 1 。m a l d i t o f 质谱测得w a i 1 的分子量为9 8 6 5 ，是目前所有报道中分子量最小 的a 淀粉酶的蛋白质类抑制剂。陈宁、张琪等【2 9 】通过对小麦0 c 一淀粉酶抑制剂降血糖作用的 实验研究表明，小麦0 【淀粉酶抑制剂对患糖尿病的小鼠有降血糖作用，其作用机制可能与 抑制小肠内各肠段的蔗糖酶和麦芽糖酶活性有关。陈宁、吴永宏掣3 0 】在小麦a 淀粉酶抑制 3 第一章前言 剂对于减肥作用的实验研究中做了小麦中洳淀粉酶抑制剂对肥胖症大鼠的影响。研究结果 表明，小麦a 一淀粉酶抑制剂对由营养饲料喂养的肥胖大鼠的肥胖症有确切疗效( 各种肥 胖指标均有显著变化，如：l e e 值、体重等) ，对大鼠的药理药效作用明显【3 。 1 2q 一淀粉酶抑制剂的来源及种类 弘淀粉酶抑制剂可以是蛋白质、多肽类或者碳水化合物，但大部分都是有机化合物， 其来源不同理化性质也就具有一些差异。0 【一淀粉酶抑制剂的天然存在类型有三种：( 1 ) 微 生物产多肽，如：h a i m ( 来自微生物的人胰腺洳淀粉酶抑制剂1 和p a i m ( 来自微生物猪胰腺洳 淀粉酶抑制剂) ；( 2 ) 微生物产的带一个寡生物胺单位的含氮碳水化合物；( 3 ) 在谷类、豆类 及其它较高等植物中发现的大分子蛋白质抑制剂。 目前为止，从小麦、大麦、高粱、花生、谷物、大豆、芋头根等植物中均已分离得到 蛋白类的a 一淀粉酶抑制剂，它们的分子量在9 k d 6 3 k d 之间。据报道，目前已经分离得到 了一种具有双功能的抑制剂，即枯草杆菌蛋白酶旭淀粉酶抑制剂，并测定了它的特性。该 双功能抑制剂能同时结合一分子a 淀粉酶和一分子蛋白酶( 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶) 。 l a y e l 【3 2 j 等人的报道显示，菜豆比其它豆类具有更高的研究价值，因为菜豆中含有几种 类型比较特殊的a 淀粉酶抑制剂，包括不耐热和耐热型的抑制剂。因此，有关菜豆的研究 受到了许多国内外研究者的广泛关注。k a t a o k a 3 3 1 等的研究表明：黑菜豆中含有两种同效抑 制剂。另有研究表明，白菜豆中的某些抑制剂为一种糖蛋白，带有一个肽或者多个不同的 肽，能抑制昆虫和哺乳动物淀粉酶的活性，但并不抑制植物中0 【淀粉酶的活性，因此其在 植物抗虫基因工程研究领域中具有潜在作用【3 4 1 。 严哲等【3 5 1 研究了不同植物果实中旺淀粉酶抑制剂的分布情况，并探讨了g t 淀粉酶抑制 剂的含量与果实淀粉含量之间的关系，其研究结果表明：淀粉含量越高的植物果实中所含 的a 淀粉酶抑制剂含量越高，反之亦反。也就是说，果实中的旺淀粉酶抑制剂含量与果实 中的淀粉含量呈正相关性。 1 3 理化特性及动力学性质 仅一淀粉酶抑制剂的分子量大多在1 0 6 0 万之间，也有分子量仅数千的多肽，由一个或 者多个亚基组成。不同的0 【淀粉酶抑制剂，它们的分子量，所含的亚基个数，碳水化合物 4 第一章前言 的含量以及p i 等特性都有所不同( 见表1 1 ) 1 3 6 - 3 9 1 。 不同q 淀粉酶抑制剂的抑制活性大小，热稳定性，最适抑制p h 值以及发挥最大抑制 活性所需的预温时间等都有所不同。 表1 1 植物中a 淀粉酶抑制荆的化学物理特性 t a b l e l 一1t h ec h e m i c a la n dp h y s i c a la c t i v i t yo f c t a ii np l a n t 目前，对小麦粉仅淀粉酶抑制剂的研究已经比较成熟了，它主要由分子量分别为1 2 k d 、 2 4 k d 、6 0 k d 的三种蛋白质组成。其中，分子量为1 2 k d 的蛋白是单体，；分子量为2 4 k d 的 蛋白是二聚体，它在盐酸胍的作用下可以分解成两个分子量接近1 3 k d 的单体；分子量为 6 0 k d 的是四聚体，它裂解之后的单体分子量也接近1 3 k d 加l 。分子量为1 2 k d 的抑制剂能有 效地抑制昆虫淀粉酶的活性，但不能抑制哺乳类动物的淀粉酶活性：分子量为2 4 k d 和6 0 k d 的两种抑制剂均能很好的抑制包括人类在内的大多数哺乳动物的c 【淀粉酶活性【4 。分子量 为2 4 k d 的抑制剂因其电迁移率的不同又被分为0 1 9 、o 3 6 、o 3 8 和0 3 5 等不同型号，它们是 根据在p a g e 凝胶上的电泳迁移率来命名的。其中，名为a a 1 0 1 9 4 2 l 、a a 1 0 2 8 1 4 3 1 和 5 第一章前言 c t - a 1 0 5 3 4 4 j 的三种抑制剂的氨基酸序列已被研究确定，比较发现c c a 1 0 5 3 和q a 1 0 1 9 这两种 抑制剂的组成单体均为含有1 2 4 个氨基酸残基的多肽，这充分说明二者具有高度的同源性。 m a e d a 、p u l s 、f o l s c h 【4 5 4 刀等工作者研究了喂食0 【淀粉酶抑制剂后，糖尿病患病动物的 变化。他们的研究表明：在连续喂食掺有小麦粉0 【淀粉酶抑制剂的食物3 - 9 周之后，患病 狗和小鼠对胰岛素的需求持续减少，分析其原因在于，e t 淀粉酶抑制剂抑制了狗和小鼠消 化道中的淀粉酶活性，阻碍了它们对碳水化合物的消化和吸收，达到了使它们的食欲降低、 体重下降，但并不引起其胰腺肿大和增生的效果。 另有研究发现：人体十二指肠分泌的胰腺酶活性能被从小麦粉中得到的高纯度仅一淀粉 酶抑制剂显著抑制，且该抑制作用具有高效专一的特剧4 8 1 。而且，其它酶和胆汁酸在胃或 十二指肠中的分泌并不会受到该抑制剂的影响，十二指肠的p h 环境也不会发生任何改变。 研究还表明，小麦粉中的洳淀粉酶抑制剂具有较广泛的酸碱耐受性和较高的热稳定性【4 9 1 ， 它在p h 值4 1 1 之间化学结构稳定，抑制活性不受影响；它在7 0 下加热3 0 m i n 后，抑 制活力基本上没有改变。 1 4 仅a i 作用机制研究 目前关于伐淀粉酶抑制剂对0 【淀粉酶的抑制作用的机理有两种猜想：一种是0 【一淀粉酶 抑制剂通过分解a 淀粉酶而使其失活【5 0 】；另一种是0 【淀粉酶抑制剂和a 一淀粉酶在相互作用 过程中形成一种特殊的酶抑制剂复合物( e i ) 而使酶失活【5 1 】。 随后t o r m o 等人通过实验得出了其真正的抑制机理：a 一淀粉酶抑制剂并不是一种蛋白 分解酶，它是通过与c t 一淀粉酶形成可溶性的复合体( e i ) 导致淀粉酶失去活性，进而失去 对淀粉的分解能力。后来，有研究者通过进一步的化学计量研究得出了以下结论：在a 淀 粉酶抑制剂与猪胰腺g t 一淀粉酶相互作用的过程中，c 【淀粉酶抑制剂和淀粉酶是按照1 ：1 的 比例形成e i 复合物的【5 2 1 。后来有其他研究者确认了t o r m o 等人的结论，并进一步指出：a 淀粉酶抑制剂并不是通过它与g t 淀粉酶竞争淀粉而起到抑制作用，而是直接通过它与0 【 淀粉酶的结合改变淀粉酶的构象，导致其丧失分解淀粉的能力【5 3 】。 c h o u d h u r y 和m a e d a 5 4 4 5 等人通过实验得- n t + 麦粉中的a a i 与人唾液淀粉酶反应的 机理图，其中，酶的主链为黑色部分，抑制剂主链为灰色部分。 6 第一章前言 图1 - 6 人唾液a 淀粉酶h a s 一a 1 0 1 9 复合物中酶和抑制剂之间的选择性反应示意图 f i g1 - 6d i a g r a ms h o w i n gs e l e c t e di n t e r a c t i o nb e t w e e ne n z y m ea n di n h i b i t o ri nt h eh a s n - a 1 0 19 c o m p l e x 近来，m y 0 _ j e o n f 5 6 1 等人报道说，植物中的与昆虫及哺乳动物的伐淀粉酶或真菌的淀 粉糖苷酶是以1 ：1 的摩尔比相结合的，达到抑制其酶活性的作用，但该类0 【一a i 对高等植 物和细菌的洳淀粉酶无任何效果。 1 50 【。a i 的应用前景 1 5 1 在临床医学方面 糖尿病是一组由遗传因素及环境因素引起的临床综合症，是全世界发病率最高的疾病 之一，仅次于肿瘤和心脑血管疾病，糖尿病的预防和治疗已经成为全球性的卫生保健问题。 糖尿病并发症是造成糖尿病患者痛苦和死亡的主要原因，餐后血糖水平与血管并发症 密切相关，是引发大血管并发症和微血管并发症的关键因素，因而减少各种糖尿病引发的 并发症是治疗糖尿病的关键。 a 淀粉酶抑制剂是第一个以降低餐后血糖为目标的新型糖尿病治疗药物，它通过抑制 7 第一章前言 人体消化道内糖代谢的关键酶的活性，达到控制人体餐后血糖水平的目的，对糖尿病及其 并发症具有很好的疗效，因而在临床上具有较高的应用价值。 1 9 7 7 年德国拜耳公司从游动放线菌s e l 8 、s e 5 0 和s e 8 2 的代谢产物中提取到拟低聚 糖成分的抑制洳葡萄糖苷酶和泓淀粉酶的活性物质，并且开发成为第一个淀粉酶抑制剂类 降糖药物阿卡波糖( a c a r b o s e ) 。目前在临床上应用此类药物的还有日本武田药品株式会社 生产的伏格列波糖和米格列醇( m i 酉i t 0 1 ) 。 a 淀粉酶抑制剂还能阻止口腔中淀粉类食物的糖化，减少由糖类形成的齿垢，从而预 防龋齿。此外，有报道称，0 c 淀粉酶抑制剂的应用使肠道内残留的糖类增加，有利于肠道 有益菌群的生存，并将残留的糖发酵生成乳酸，使肠道趋于酸性环境，从而促进食物中钙 的溶解和吸收，产生预防和治疗骨质疏松症的效果【5 7 1 。另外，它还将作为一种新的保鲜、 防腐等食品添加剂也在被研究和开发。 以a 淀粉酶抑制剂作为主要成分的减肥产品也已经得到应用，在北美和同本以在白芸 豆中提取的a a i 为主要原料的减肥、降糖保健食品十分流行。亚洲人的饮食结构主要以淀 粉为主，因此从控制机体糖代谢中的关键酶的活性入手，开发0 【淀粉酶抑制剂对特定人群 的降糖及减肥具有相当广阔的应用前景。 1 5 2 在农业方面 据不完全统计，在农业生产中，全世界农作物每年总收入的1 3 损失都是由于虫害造 成的。目前，采用化学药物防治的方法是农作物害虫防治的主要手段，但是，化学药物在 防治虫害的同时也对自然环境和生态平衡造成了严重的破坏作用。因此，化学防治方法将 被逐渐淘汰。另一种手段是植物产生的天然害虫防治法，也就是指植物通过进化产生一些 具有防御性的化合物，来使自己获得一定程度的害虫抵抗力的方法，其中就包括a 淀粉酶 抑制剂的产生。c c 一淀粉酶抑制剂的杀虫机理有两方面：一方面在于，它能抑制昆虫消化道 内的a 淀粉酶的活性，导致昆虫食入的淀粉不能得到消化和水解，从而阻止了昆虫主要的 能量来源；另一方面在于，淀粉酶抑制剂能和淀粉消化酶结合形成e i 复合物，从而刺激昆 虫的消化腺分泌过量的消化酶，致使昆虫产生厌食反应，最终导致昆虫发育不良或者死亡。 利用转基因技术来抗虫害是一种新兴的害虫防治手段。这种手段主要是基于仅淀粉酶 抑制剂的高度专一性抑制作用，很适合通过转基因技术来赋予植物尤其是农作物的抗虫基 因。目前，国内外学者正在积极进行转基因植物的研究，通过导入a 淀粉酶抑制剂的基因， 加强植物抗虫性，这样可以通过植物的自身抵抗力减少化学杀虫剂的使用，从而达到减少 r 第一章前苦 环境破坏和维持生态平衡的目的。 1 6 本课题的研究目的、意义及主要研究内容 由于目前国内外肥胖和糖尿病患者甚多，市场上充斥着各种号称能医治的药物，但是 绝大部分的药物疗效都言过其实，甚至有的根本就没有什么效果，有的即使有一定的效果， 但同时却存在着更大的副作用，极少一部分疗效不错副作用较小的药物由于其价格过分昂 贵不能为广大患者所接受，无法解除病痛给他们带来的身心痛苦。为了找到一种既不需要 他们忍受节食、绝食的痛苦，同时又能够起到防治肥胖和糖尿病的健康有效的药物，我们 注意到了仅淀粉酶抑制剂这种蛋白抑制酶，它能够有效的、专一的抑制人体q 一淀粉酶( 包 括唾液酶和胰腺酶) ，在肥胖和糖尿病方面应用具有很大的潜力。 但是，小麦粉和白芸豆毕竟为人类生存必要的粮食之一，如果单纯用小麦粉作为原料 提取a 一淀粉酶抑制剂，那么，供给人类的粮食就会较少一部分。而且小麦麸皮和白芸豆中 含有丰富的蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素等，- 由于其具有重要的营养学特性，越 来越引起人们研究的兴趣。我国是小麦种植大国，每年可利用开发的小麦麸皮则可达2 0 0 0 万吨以上，是我国大宗农副产品资源之一。如果能够充分地利用麸皮进行深加工和综合利 用，将具有很高的经济效益和社会效益。相比之下，小麦麸皮相比白芸豆有更大的研究与 利用的价值。 因此，本论文完成的工作为白芸豆和小麦麸皮浸提工艺的探索和完善，包括种类的选 择，提取过程中浸泡时间，盐浓度及硫酸铵饱和度的选择，每一步测定其蛋白浓度与抑制 活力，确定最佳工艺条件，之后进行超滤，盐析( 酒精沉淀) ，脱盐，冷冻干燥成粉末， 然后进行了纯化并验证了蛋白性质，为今后的扩大实验规模及进一步提取提供可靠数据。 主要研究内容分以下几部分： ( 1 ) 小麦麸皮和白芸豆中a 一淀粉酶抑制剂的提取工艺 ( 2 ) 小麦麸皮和白芸豆中仅淀粉酶抑制剂的纯化工艺 ( 3 ) 0 【淀粉酶抑制剂的活性的研究 ( 4 ) 仅淀粉酶抑制剂的酶学性质 a 酶的热稳定性 b p h 对酶的稳定性 c 金属离子对酶活力的抑制作用 o ( 5 ) 0 【一淀粉酶抑制剂分子量的测定 ( 6 ) q 一淀粉酶抑制剂的抑制动力学分析 a 最适酶量的确定 b 酶反应动力学方程的建立 c q 淀粉酶抑制剂对a 一淀粉酶抑制类型( 可逆或不可逆) 的研究 d a 一淀粉酶抑制剂对0 【一淀粉酶可逆性抑制类型的研究 l o 第二章实验材料、设备与分析方法 第二章实验材料、设备与分析方法 2 1 实验材料 本论文中所用到的主要实验试剂与药品列于表2 一l ： 表2 1 实验试剂一览表 t a b l e 2 - 1t h el i s to f r e a g e n t 试剂名称出品公司 小麦麸皮 白芸豆 猪胰a a m y l a s e 牛血清白蛋白 考马斯亮蓝g 2 5 0 k - h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 可溶性淀粉 h c l 乙醇 ( n h 4 ) 2 s 0 4 氯化钡 n a c l 氯化钾 无水氯化钙 m g s 0 4 n a o h 磷酸 d e 5 2 s e p h e d e x g 7 5 大成( 天津) 食品有限公司 市售 s i g m a 北京鼎国生物技术有限公司 上海化学试剂公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市赢达稀贵化学试剂厂 天津市化学试剂批发公司 天津市化学试剂批发公司 天津市化学试剂批发公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市德恩化学试剂有限公司 天津市四通化工厂 天津市四通化工厂 天津市四通化工厂 天津市北联精细化学品开发有限公司 天津市富禄化工试剂厂 天津市化学试剂批发公司 w h a t m a n 公司 w h a t m a n 公司 2 2 实验设备 本论文中所用到的主要实验仪器列于表2 2 ： 第