（食品科学专业论文）天然发酵豆豉后发酵过程的动态分析.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 豆豉是以整粒大豆或( 豆瓣) 为原料，经浸泡、蒸煮、制曲、发酵等工序加 工而成的，具有极高的营养价值和医疗价值的大豆发酵食品。 豆豉天然发酵生产周期过长，受季节气温的限制不能常年生产，严重影响了 企业的厂房利用，资金周转，市场供应和规模扩大，增加了厂家的生产成本。为 了控制发酵，实现豆豉生产的工业化，必须实现纯种发酵。要想实现纯种发酵及 工业化生产，其前提是了解自然发酵产品中微生物的分布，变化及其与基质之间 的关系，掌握其发酵机理，确定各微生物菌群在发酵过程中所起的作用，然后才 能筛选出合适的目的菌种进行纯种发酵，实现豆豉的规模化工业生产。同时也要 了解后发酵过程中生成的主要营养成份和风味物质的含量及变化。豆豉后发酵过 程中理化指标对产品成熟时间和产品风味有很大影响，只有各理化指标都达到国 家标准，产品彳能成熟。同时也测定了关键酶酶活在后发酵过程中的变化，确定 了它们对后发酵过程的影响。 本论文通过研究豆豉后发酵过程中微生物菌相的变化、理化指标和关键酶酶 活的变化以及盐度对豆豉后发酵周期的影响，确定了豆豉后发酵过程中的优势菌 群，由理化指标的变化趋势确定了后发酵周期，并降低了盐度。 对豆豉后发酵过程中微生物菌相变化的研究表明，豆豉后发酵过程中主要起 作用的微生物是细菌、霉菌和酵母菌。 后发酵前六天，微生物数量变化较大。细菌总数由制曲木期的7 9 1 0 9 c f u g 迅速降低，到后发酵的第六天降为o 0 8 5 x 1 0 6 c f u g ，以后继续降低，但降低的趋势 越来越缓慢，后发酵十五天后细菌总数基本趋于平稳。由对优势菌群的鉴定可知 细菌主要是乳酸菌，乳酸菌可以产生乳酸和醋酸等有机酸。有机酸也是豆豉风味 物质的重要成分。在豆豉后发酵初期，酵母菌大量繁殖，出现了一个高峰。随着 后发酵的继续进行，由于酸性代谢产物和酒精的积累，酵母菌的活性受到抑制， 所以在后发酵7 天以后酵母菌数量急剧下降，1 8 天以后酵母菌总数基本维持在一 个较稳定的低数量水平上。经鉴定酵母菌优势菌群主要是鲁氏酵母菌 s a c c h a r o m y c e sr o u x i i 。后发酵初期，霉菌的生长已经基本停止并逐渐消亡，但霉菌 所产生的酶类继续发挥作用。在计数平板培养基中的菌落数目基本保持不变，数 量级在1 0 2 1 0 3 之间。经鉴定优势菌群是米曲霉。 对后发酵过程中理化指标变化的研究表明，豆豉后发酵过程中氨基酸态氮含 量逐渐增加，前期变化较快，后期变化较慢，第2 1 天时达到0 6 5 5 ，符合国家标 准，且在以后的几天里其含量变化不大。还原糖在豆豉后发酵过程中的变化不是 很明显，变化很小，后发酵开始时略有上升，但整体呈下降趋势。总酸含量是逐 摘要 渐增加的，初期上升明显，后期缓慢，最后达到1 5 。 后发酵过程中蛋白酶的活力总体呈下降趋势。纤维素酶的活力总体是呈下降 趋势的，中间略有波动。 对添加不同食盐量的豆豉的后发酵过程进行研究，随着盐度的升高微生物含 量下降，豆豉成熟时间延长，在保证质量和风味的i j i 提下，食盐添加量为9 的豆 豉产品成熟时间短，可以降低成本、缩短豆豉生产周期，并且食盐含量低可以降 低高盐量对人体的危害。 关键词：豆豉；菌相：理化指标；关键酶；盐度 山东轻工业学院硕十学位论文 a b s t r a c t d o u c h ii sf e r m e n t e ds o y b e a n s ( o rw a t e r c r e s s ) ，p r o c e s s e db ys o a k i n g ，c o o k i n g ， m a k i n gs t a r t e ra n df e r m e n t a t i o np r o c e s s e s ，a n dh a sh i g hn u t r i t i o n a la n dh e a l t hv a l u e t h et r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o nt i m eo fd o u - c h ii st o o l o n ga n dc a n n o tp r o d u c t p e r e n n i a lb e c a u s eo ft h es e a s o na n dt e m p e r a t u r e a f f e c tt h ew o r k s h o pu t i l i z a t i o nc a p i t a l t u r n o v e r 、m a r k e ta c c o m m o d a t i v e n e s sa n dt h es c o p eb r o a d e n ，t h e r e f o r ei n c r e a s i n gt h e p r o d u c t i o nc o s t f o rc o n t r o l l i n gt h ef e r m e n t a t i o nt or e a l i z et h ep r o d u c t i o no fd o u c h i i n d u s t r i a l i z a t i o n ，w em u s tr e a l i z ep u r es e e d sf e r m e n t a t i o n t or e a l i z i n gt h e s e ，w em u s t k n o wt h ed i s t r i b u t i n g 、c h a n g eo fm i c r o b i a la n dt h ec o n n e c t i o nw i t ht h e g r o u p p r e d o m i n a t i n gt h ef e r m e n t a t i o nm e c h a n i s m ，m a k es u r et h ef u n c t i o no fa p i e c em i c r o b e i nt h ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o n ，a n dt h e ns c r e e no u ta p p r o p r i a t ea i mb a c t e r i u mt op u r e s e e d sf e r m e n t a t i o n ，r e a l i z i n gi n d u s t r ys c o p ep r o d u c t i o no fd o u c h i a tt h es a m et i m e w em u s tk n o wt h ec o n t e n ta n dc h a n g eo fn u t r i t i o ns h a r e sa n df l a v o rw h i c hp r o d u c e di n t h el a t e rf e r m e n t a t i o np r o c e s s i t sd e e p l ya f f e c tt h ep r o d u c t i o nm a t u r et i m ea n df l a v o r f o ri t sp h y 7 s i c sa n dc h e m i s t r yi n d e xi nt h el a t e rf e r m e n t a t i o np r o c e s s n o n eb u tt h e i n d e x e sa c h i e v et h ec o u n t r yi n d e x ，p r o d u c t i o na r em a t u r e a tt h es a m et i m e ，t h ek e y e n z y m ee n e r g ya l s oi sd e t e r m i n e d ，m a k i n gs u r et h ea f f e c t i o nt ol a t e rf e r m e n t a t i o n p r o c e s s i nt h i sp a p e r , t h r o u g hr e s e a r c ho nt h ec h a n g eo fm i c r o b e 、p h y s i c sa n dc h e m i s t r y i n d e x 、t h ek e ye n z y m ee n e r g ya n dt h ea f f e c t i o no fs a l i n i t yt ot h ep e r i o d i co fd o u - c h i l a t e rf e r m e n t a t i o n ，c o n f i r mt h ea s c e n d a n tb a c t e r i u m ，b yt h ec h a n g et r e n do fp h y s i c sa n d c h e m i s t r yi n d e xc o n f i r mt h ep e r i o d i co fd o u - c h i ，a n dr e d u c et h es a l i n i t y t h es t u d i e so nm i c r o b ec h a n g es h o wt h a tb a c t e r i a 、m i l d e wa n dm i c r o z y m ea r e m o s t l ya c t i n gm i c r o b e t h ef o r m e rs i xd a y so fl a t e rf e r m e n t a t i o n ，t h en u m b e ro fm i c r o b ed e c r e a s e sq u i c k l y t h en u m b e ro fb a c t e r i ar e d u c e ss p e e d i l yf r o m7 9x10 9 c f u gt o0 0 8 5x10 6 c f u g ，a n dt h e n c o n t i n u e sr e d u c e d b u tt h et r e n di ss l o w l y , f i f t e e nd a y sl a t e rt h eb a c t e r i an u m b e ri s e s s e n t i a lf i x e d n e s s i nv i r t u eo ft h ea p p r a i s a lo fp r e p o n d e r a n tm i c r o b e ，b a c t e r i aa r e l a c t o b a c i l l u sm o s t l y l a c t o b a c i l l u sc a np r o d u c el a c t i ca c i da n da c e t i ca c i da n ds oo n o r g a n i ca c i da r et h ei m p o r t a n ti n g r e d i e n to fd o u c h if l a v o r i nt h ei n i t i a ls t a g e so fl a t e rf e r m e n t a t i o n ，m i c r o z y m er e p r o d u c er a p i d l y a l o n gw i t h t h el a t e rf e r m e n t a t i o ng oa l o n g ，d u et ot h ea c c u m u l a t i o no fa c i d i t ym e t a b o l i z a b l e p r o d u c t i o na n da l c o h o l ，a f t e rs e v e nd a y s ，t h en u m b e ro fm i c r o z y m er e d u c e ds p e e d i l y , i t t a b s t r a c t e i g h t e e nd a y sl a t e r , t h et o t a ls t e a d yn e a r l y b ya p p r a i s a lt h ep r e p o n d e r a n tm i c r o z y m e a r es a c c h a r o m y c e sr o u x i la tt h ei n i t i a l s t a g eo fl a t e rf e r m e n t a t i o n ，m i l d e wg r o w t h a l r e a d ys t o p sa n dd i e so u tg r a d u a l l y , b u tt h ee n z y m ew h i c hp r o d u c e db ym i l d e wk e e p o ne x e r t i n gf u n c t i o n a tt h ef l a t sw h i c ht a k ec o u n to ft h en u m b e rt h em i c r o b en u m b e ri s s t e a d y , n u m b e rg r a d ei sa b o u t10 z 10 3 ，b ya p p r a i s a lt h ep r e p o n d e r a n tm i l d e wa r e a s p e r g i l l u so r y z a e t h es t u d i e so np h y s i c sa n dc h e m i s t r yi n d e xs h o wt h a ta m i n oa c i dc o n t e n ti n c r e a s e g r a d u a l l y , p r o p h a s ec h a n g e dq u i c k l y , a n a p h a s ec h a n g e ds l o w l y , t h et w e n t yf i r s td a yt h e a m i n oa c i dc o n t e n ta c h i e v e d0 6 55 ，a c c o r dw i t hc o u n t r ys t a n d a r d ，a n dc h a n g e ds l o w l y i na n o nd a y s d e o x i d i z es u g a rc o n t e n tc h a n g e dn o to b v i o u s l y ，a tt h eb e g i n n i n g ，t h e d e o x i d i z es u g a ri n c r e a s e da p p r e c i a b l y ，b u tt h ew h o l ea s s u m ed o w n t r e n d t h ea c i d i n c r e a s e dg r a d u a l l y ，a tt h ei n i t i a ls t a g e s ，t h ei n c r e a s i n gi se v i d e n c e a n a p h a s ei ss l o w l y ， f i n a l l ya c h i e v e d1 5 i nt h el a t e rf e r m e n t a t i o np r o c e s s ，a l b u m e ne n z y m ee n e r g yc o l l e c t i v i t ya s s u m e s d o w n t r e n d c e l l u l o s ee n z y m ee n e r g yc o l l e c t i v i t ya l s oa s s u m e sd o w n t r e n d ，b u tf l u c t u a t e a p p r e c i a b l y t h es t u d i e so nt h ed o u c h iw h i c hw i t hd i f f e r e n ts m i n i t ys h o wt h a tt h en u m b e ro f m i c r o b er e d u c ew i t ht h es a l i n i t yh o i s t ，a n dt h em a t u r et i m ee x t e n d o nt h ep r e m i s eo f e n s u r et h eq u a l i t ya n df l a v o r ，w h e nt h es m i m t yi s9 ，t h em a t u r et i m ei ss h o r ta n d d e p r e s st h ec o s t 、s h o r t e nt h ep e r i o d sa n dd e p r e s st h eh a r mt op e o p l e k e y w o r d s ：d o u 。c h i ；m i c r o b e ；p h y s i c sa n dc h e m i s t r yi n d e x ；k e ye n z y m e ；s a l i n i t y 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文拓者签名：二马4 导师签名：堡硷豳 日期：趔庄年上月掣日 山东轻工业学院硕十学位论文 第1 章绪论 1 1 引言 中国是大豆的故乡，大豆食品是中国传统食品中的一朵奇葩。尤其是发酵大 豆食品种类繁多，如酱油、豆酱、豆腐乳、豆豉等都具有独特的风味。对近几年 世界大豆主要生产国大豆产量进行调查结果如表1 1 。 表1 1 大豆主要生产国的人豆年产量【1 】( 万吨) t a b l e1 1t h es o y b e a no u t p u to fl e a d i n gc o u n t r y 表中数据显示，世界大豆年产量逐年提高，而我国大豆年产量徘徊不前，并 且受国外大豆价格的影响，1 9 9 6 年我国第一次由传统的大豆净出口国变成净进1 2 1 国，且进口量不断增大，至2 0 0 1 年已达1 6 1 3 4 万吨( 见表1 2 ) 。 表1 2 中国大豆生产和进出口情测1 1 ( 万吨) t a b l e1 2p r o d u c t i o na n dt r a d eo fc h i n e s es o y b e a n 年份总产进e l出e l 净进口净出c i 1 9 8 07 9 4 1 9 9 01 1 0 0 1 9 9 41 6 0 0 1 9 9 51 3 5 0 1 9 9 61 3 2 2 1 9 9 71 4 7 3 1 9 9 81 5 1 5 1 9 9 91 4 2 5 2 0 0 0 1 5 4 l 0 1 5 o 2 9 0 1 1 l - 4 2 8 0 1 3 1 9 7 4 3 1 7 1 0 4 1 6 1 0 9 4 8 3 3 8 1 9 9 2 1 9 2 6 l 2 0 3 0 0 2 0 4 2 l 2 l 1 0 2 0 1 0 9 4 7 8 7 2 0 0 11 5 4 5 1 6 3 8 22 4 8 1 6 1 3 4 第l 章绪论 分析中外大豆发展趋势不同的原因，主要有以下几个方面：( 1 ) 生产应用方 面。国外大豆品种油脂含量高，蛋白质含量低，作为油料具有较好的经济价值。 而国产大豆蛋白质含量平均为3 5 - 3 8 ，最高达5 5 ，适合于加工蛋白食品。但 目前我国大豆的利用主要以油脂生产为主，生产经济效益低，没有体现出高蛋白 质作物的价值【2 】。( 2 ) 价格方面。尽管自1 9 9 5 年以来，大豆收购价格略有增加， 但种植大豆的收益仍低于小麦和玉米等，所以种植面积有所下降引。( 3 ) 宣传方面。 宣传力度不够使我国消费者对大豆食品的优越性认识不足，没有形成对大豆食品 的新的消费需求，这些现象和目前国际上的大豆食品消费热形成强烈的反差【引。 1 9 9 7 年以来，美国大豆食品的消费量每年以1 0 以上的速度增长。其增长的 原动力，不仅仅是大豆的营养和风味，更主要是大豆蛋白和大豆异黄酮的生理功 能 1 】，如降低乳腺癌、前列腺癌、肠癌等疾病的发病率，缓解妇女的更年期综合症 和骨质疏松症等。大豆异黄酮和大豆蛋白的生理功能，符合现代消费者的健康取 向，而我国在这方面的研究较少，并且我国生产大豆制品尤其是大豆发酵制品生 产方式比较传统，这也是制约我国大豆制品发展的主要原因。 我国豆豉种类繁多，根据制曲时参与的微生物的主要种类，可分为霉菌型豆 豉和细菌型豆豉两大类【5 】。常用的生产方式分为传统的自然发酵工艺和人工接种发 酵工艺。霉菌型豆豉参与制曲的主要微生物是霉菌，天然制曲周期一般为7 天， 发酵时间为3 0 天左右。细菌型豆豉参与制曲的主要微生物是枯草芽孢杆菌，天然 制曲时间一般为6 7 天，发酵时间为3 0 天左右。采用天然发酵工艺生产时间过长， 受季节气温的限制不能常年生产，严重影响了企业的厂房利用，资金周转，市场 供应和规模扩大，增加了厂家生产成本【6 j 。 为了控制发酵，实现豆豉的工业化生产，必须保证实现纯种发酵。与酱油、 豆酱、醋等发酵凋味品一样，要想实现纯种发酵、工业化生产，其前提是了解自 然发酵产品中微生物的分布、变化及其与基质之间的关系，掌握其发酵机理，确 定各微生物菌群在发酵过程中所起的作用，然后才能筛选出合适的目的菌种进行 纯种发酵，实现豆豉的工业规模化生产，同时也要了解后发酵过程中生成的主要 营养成份和风味物质的含量及变化。豆豉后发酵过程中理化指标对产品成熟时问 和产品风味有很大的影响，只有各理化指标都达到国家指标，产品才能成熟。同 时也测定关键酶酶活在后发酵过程中的变化，确定它们对后发酵过程的影响。 1 2 豆豉简介 豆豉是以黑豆、黄豆为主要原料，利用微生物发酵制成的一种调味副食品。 按制曲微生物的不同，豆豉可分为毛霉型、曲霉型、根霉型和细菌型等；按发酵 时是否加食盐，分为咸豉和淡豉；按成品含水量多少，分为干豉、湿豉和水豉。 我国主要生产毛霉型、曲霉型豆豉及少量的细菌型豆豉( 俗称水豆豉) 。曲霉型 豆豉在我国分布最广，由于空气中含有大量的曲霉孢子，所以天然发酵生产的豆 2 山东轻1 = 业学院硕士学位论文 豉一般为曲霉型豆豉。近年来，食品的保健功能比营养和风味更令人注目，人们 对具有预防或治疗某些疾病的食品较感兴趣【7 8 j 。国外以丹贝“t e m p e ”( 印度尼 西亚根霉型豆豉) 和纳豆“n a t t o ( 日本细菌型豆豉) 最为著名，并且对其保健 功能的研究成果令世人注目 9 , 1 0 , 1 1 , 1 2 , 1 3 】。随着现代分析分离技术的发展，人们对豆 豉中生理活性物质的分离鉴定、保健功能的研究也越来越深入。 1 3 豆豉的基本营养价值 大豆蛋白含有人体不能合成而必须从食物中摄取的8 种必需氨基酸，除蛋氨酸 外，大豆蛋白中其他氨基酸含量也较多、较平衡，特别是赖氨酸含量高；大豆脂 肪所含不饱和脂肪酸占8 0 以上。大豆脂肪中含有人体所必需的亚油酸平均达5 0 左右，亚麻酸平均为7 左右；大豆不含胆固醇；大豆中还含有1 8 3 2 的磷脂， 具有多种保健功能。豆豉在发酵过程中微生物产生的蛋白酶使原料大豆的蛋白质 部分水解，故发酵成熟时，可使水溶性氮的含量提高，并使大豆的硬度下降。大 豆中含有的胰蛋白酶抑制剂可以抑制小肠中胰蛋白酶的活力。大豆含有5 的纤维 素，这些纤维素使蛋白质不易与消化酶接触，整粒大豆食用时，其蛋白质消化率 仅为6 0 左右。在豆豉的加工过程中破坏了胰蛋白酶抑制物；纤维素酶使纤维素水 解生成单糖，蛋白酶容易与蛋白质接触水解产生一系列的中间产物，如多肽、氨 基酸等，这些低分子量的蛋白食入后，可以不再经过消化直接为肠粘膜吸收，这 对消化力减退和患有消化功能障碍的病人是十分有利的。豆豉与原料熟化豆相比， 其维生素b 的含量有明显提高；维生素a 、e 的含量基本不变，而且矿物质的可溶 性可增加2 3 倍，利用率可增加3 0 。5 0 【1 4 , 1 5 , 1 6 】。 1 4 豆豉的生理活性物质及其保健功能 豆豉不仅营养价值高，而且自古入药，我国中医学历代医书中都有豆豉治疗 疾病的记载，汉代张仲景的伤寒论中即有“桅子豉汤 ，方中用桅子、豆豉煎汤 治疗外感风寒、不思饮食等症；李时珍的本草纲目中则有“豆豉具开胃增食、 消食化滞、发汗解表、除烦喘等疗效 的记载。豆豉传入日本后，日本科学家对 豆豉的保健作用进行了研究，提出常服豆豉有助消化、提高抗病能力、减缓衰老、 消除疾劳等多种作用。而以大豆为主料，以青蒿、桑叶等为辅料的传统发酵产品 淡豆豉，分别被中华人民共和国药典( 1 9 8 5 年) 和中国医学科学院编著的食品成 分表( 1 9 8 1 年) 收录，被认为是食疗保健药品。前苏联切尔诺贝力核电站核泄漏 事故后，欧洲放射能污染地区从日本大量进口豆酱，用于放射物质的除却，更使 这类食品受到人们的广泛关注【5 , 1 7 , 1 8 。国内外研究发现豆豉的生理活性物质主要有 大豆异黄酮、褐色色素、溶栓酶、抗菌素、大豆磷脂、大豆低聚糖、大豆皂甙和 大豆多肽类等几种。 1 4 1 大豆异黄酮 大豆异黄酮是一类类黄酮物质，由于具有一定的雌性激素作用，又被称为“植 第l 章绪论 物雌激素 ( p h y t o e s - t r o g e n ) 。大豆异黄酮具有清除自由基、抗真菌及真菌毒素、 抗血管收缩、抗溶血因子等生物学活性，所以在抗肿瘤、抗氧化、防治老年人毛 细血管脆化等方面起着重要的作用。大豆异黄酮是目前大豆中最引人注意的一种 功能性成分。已知大豆中含有的异黄酮化合物，包括染料木苷( g e n i s t e i n ) 、黄豆苷 ( d a i d z e i n ) 、大豆苷( g l y c i t e i n ) 3 种配基以及它们各存在的3 种配糖体，总共有1 2 种 【5 ，1 9 ，9 ，1 2 1 o 1 4 2 褐色色素 褐色色素也称蛋白黑素或类黑精( m e l a n o i d i n ) ，是大豆蛋白质以及它的分解产 物多肽类与还原糖之间作用发生美拉德( m a i l a n d ) 反应生成的。褐色色素呈水溶性， 等电点为p h 2 3 ，为一类弱酸性高分子，具有一种特有的强蓝色萤光，在酸性或 碱性条件下很容易被水解，然而不受消化酶降解。它具有很强的抗氧化活性，主 要是由于其分子内保持有稳定的自由基结构，此结构能捕集溶液中的自由基。同 时，它还会与铁、铜等金属离子相结合，形成不性溶化合物析出。褐色色素还有 类似食物纤维功能、调节血糖及抑制a c e 活性等功能1 5 j 。 1 4 3 溶栓酶 日本学者须见洋行于1 9 8 7 年发现纳豆中有一种具有强溶栓作用的功能因子 纳豆激酶，其溶解血栓能力比尿激酶和纤溶酶原激活因子( p a ) 等治疗血栓症 的药都要强，而且该酶具有无毒副作用、使用安全、体内半衰期长、提取工艺简 便及价格低廉等优点，弥补了现在常用的同类药品毒性较强、副作用较大、体内 半衰期较短及造价较高等缺点。纳豆激酶在体内和体外都具有很好的溶解血栓功 能，通过在纤维平板上滴加纳豆激酶提取液，使平板不透明圆圈变成透明，从而 发现并证明其体外溶栓作用。豆豉中含有溶解纤维蛋白抗栓主要成分溶栓酶， 特别适应患有血栓病、血稠、脑梗塞或亚健康期等疾病的人食用 5 , 1 3 , 2 0 , 1 4 】。 1 4 4 抗菌素 纳豆菌可产生许多抗菌素，可抑制沙门氏菌、伤寒菌、痢疾菌及0 1 5 7 ：h 7 大 肠杆菌等致病菌，且可灭活葡萄球菌。此外，纳豆菌可促进肠道内乳酸菌等的生 长，对调节肠道菌群微生态平衡起重要作用。纳豆具有抗菌功能是由于纳豆菌细 胞中有抗菌成分吡啶二羧酸。它本身并不存在于大豆中，由于纳豆菌的接种 才出现，且它对纳豆菌的生长繁殖也有抑制作用，但对大肠杆菌等其它细菌作用 更强【1 5 , 1 6 , 2 0 。 1 4 5 大豆磷脂 大豆磷脂是由卵磷脂、脑磷脂、磷脂肌醇和磷脂酸等成分组成的混合物。大 豆磷脂是人体组织组成的重要成分之一，所以，它可作为日常多聚磷酸胆胺的来 源，关系到机体内脂肪、胆固醇的代谢酶系统和脂肪在肝脏中的转化作用等。此 外，大豆磷脂还是脑和神经系统中乙酰胆碱以及前列腺素等活性物质的前体，并 4 山东轻工业学院硕士学位论文 能溶解和清除肌体内的某些过氧化脂质、活化脑细胞、调节内分泌系统。所以， 含有大豆磷脂的大豆制品，可延长寿命，对各种老年病和老年性痴呆、脑血管系 统疾病均有不同程度的缓解和治疗作用；也可以调节肌体内胆固醇的沉积，故对 防治心血管疾病也有非常积极的作用；还可增加和改善血液凝固，故可用于补血 制品的生产。此外，大豆磷脂还有保护肝脏、防止脂肪肝和肝硬化的作用，能部 分溶解胆结石和防止胆结石的生成，也可以消除烟、酒和苯胺等毒性物质对人体 的危害，具有一定的解毒作用1 2 。 1 4 6 大豆低聚糖 大豆中天然存在的低聚糖有棉子糖( r a f f i n o s e ) 、水苏糖( s t a c h y o s e ) 、蔗糖等， 其生理功能在于其独有的双歧杆菌增殖特性。通过微生物发酵，低聚糖既有损失 也有生成。发酵过程中低聚糖形成有两大途径：一是微生物产生的糖苷转移酶通 过转糖基作用合成低聚糖；另一是微生物产生的内切半纤维素酶类，如半乳聚糖 酶、甘露聚糖酶和木葡聚糖酶及木聚糖酶等水解半纤维素类多糖产生低聚糖【2 2 1 。 大豆发酵食品中已发现的低聚糖有低聚果糖、蔗果三糖( 包括其三种异构体) 、低聚 半乳糖、低聚异麦芽糖以及低聚木糖等。其中，低聚果糖是在发酵中产生的，主 要是由蔗果三糖的三种异构体在果糖基转移酶的作用下形成的；而低聚半乳糖是 由p 一半乳糖苷酶转糖基作用形成的。在自然界许多微生物如根霉、毛霉等都会产 生半乳聚糖酶，它是一种内切糖苷酶，可水解半乳聚糖产生低聚半乳糖。低聚异 麦芽糖是支链淀粉的酶解产物，其分子中至少含有一个t x - i ，6 糖苷键，在酱油中存 在【2 别；而低聚木糖是木聚糖受木聚糖酶降解所得的产物。大豆发酵食品丹贝经少 孢根霉发酵后，蛋白质净利用率( n p u ) 提高3 0 ，而低聚糖和植酸明显下降1 2 4 1 。 1 4 7 大豆皂甙 近年来国内外研究表明大豆皂甙具有以下许多生理功能：降脂减肥、抗凝血、 抗血栓、抗糖尿病、抑制过氧化脂质生成及分解、抗病毒、免疫调节、抑制或延 缓肿瘤等作用。鱼红闪【2 5 】等研究表明，在大豆发酵制品大酱的发酵过程中，大豆 皂甙总量未发生大变化，但在制曲的过程中皂甙种类增加到8 9 种，发酵过程中 逐渐减少到4 5 种，并发现大豆皂甙在发酵过程中皂甙糖基被部分水解或d n _ l ：糖 基。但对成品大酱中新皂甙生理活性未作研究，其它大豆发酵食品皂甙变化及活 性研究方面未见报道【2 酬。 1 4 8 大豆多肽类 大豆蛋白质经酶降解生成多肽的生理功能研究取得较大进展，已有许多研究 报道大豆多肽具有许多较新生理作用：降血脂，降胆固醇，低过敏原性，降血压， 促进矿物质吸收，增强运动员肌肉和消除疲劳，调节胰岛素，促进脂肪代谢及抗 氧化等作用【2 7 2 8 1 。此外，大豆多肽对一些微生物如乳酸菌、双歧杆菌、酵母及霉 菌等生长有一定的促进效果【2 9 】。s m a c c h i 和g o b b e t t i l 3 0 1 ，对乳源性活性多肽的研究 5 第1 章绪论 中，发现发酵乳制品更富含各种活性多肽。腐乳生产中，蛋白酶水解大豆蛋白质 d h 在2 5 左右，平均肽链长度约为四个氨基酸残基，正好是大豆多肽产品要求的 肽链长度【3 l 】。说明发酵大豆制品中，大豆蛋白经微生物产生蛋白酶分解后生成多 种可能具有生物活性多肽，今后还应进一步研究该类多肽生理活性作用及其微生 物酶解的最佳条件。 1 5 豆豉的国内外研究状况 1 5 1 国内研究状况 我国的豆豉生产多采用霉菌或细菌发酵法。豆豉在我国已有很久的历史，在 多部文献中都有记载，是我们祖先聪明智慧的见证。四川的潼川豆豉、湖南的浏 阳豆豉、山东水豆豉、广东阳江豆豉都是久负盛名的豆豉品种。 但是我国对豆豉的研究刚刚起步，且尚未实现纯种发酵，对其营养和功能特 性的研究甚少，是一种低档消费品。目前，生产厂家多采用传统的自然发酵工艺， 生产规模小，产品档次低，其市场占有率愈来愈低，发展前景令人堪忧。应加大 科研开发力度，优选、优化生产菌种，将豆豉的生产由传统作坊式向工业化、标 准化方向转变，从而提高产品质量，发挥自身的优势，提高其国内市场份额，进 而发展为国际化的产品【1 5 j 。 目前对国内豆豉制曲过程的研究较多，对后发酵过程的研究较少，张建华【5 8 j 研究曲霉型豆豉发酵机理，对豆豉生产的整个过程进行了研究，对曲霉型豆豉曲 中的微生物分布情况、发酵过程中成分的变化及工艺的优化进行了研究，研究结 果表明，豉曲中的曲霉菌种类主要是埃及曲霉、烟曲霉变种、米曲霉原变种及寄 生曲霉群等，另外还有少量的毛霉菌。发酵过程中成分主要是研究了p h 值、水分、 粗脂肪、粗蛋白、灰分、氯化钠、还原糖、游离氨基酸和总氨基酸、有机酸及异 黄酮等含量的变化。 贡汉坤对传统豆酱自然发酵过程进行动态分析，对传统豆酱生产的不同时期 微生物的分离、培养、计数和归类以及总酸度、氨基态氮、蛋白酶活力等的测定、 分析，初步探明了传统豆酱发酵过程中不同阶段的菌相组成、微生物菌系的消长 变化规律和豆酱发酵体系中的主要微生物，并且在动态分析的基础上，考察了豆 酱生产中的主要微生物及其性能，为多菌种生产提供了理论依据。研究结果表明 酸度、氨基态氮增加到一定的程度以后，达到一个峰值，p h 值逐渐减小到一定的 值后基本不再变化，蛋白酶活力先增加，再减小，直至测定不出。制曲阶段的微 生物中霉菌占绝对优势，主要包括米曲霉、酱油曲霉、高大毛霉和黑曲霉。后发 酵过程乳酸菌和酵母菌大量繁殖，出现了一个高峰值。 我国迄今尚无天培面市。但国内对他也有进行研究，南京农业大学江汉湖教 授自引进天培样品后就对其生产菌种、生产工艺条件及产品营养价值、安全性和 保健性进行了详细的研究。后来又有人在天培的发酵工艺、天培的生产及应用方 6 山东轻工业学院硕士学位论文 面做了研究。而在成品天培风味改善方面的研究仍是空白。 1 5 2 国外研究状况 国外豆豉研究以日本n a t t o 、印尼t e m p e 研究较为深入，他们不仅研究工艺的 改进，而且实现了纯种发酵。纳豆是以大豆为原料，经纳豆芽孢杆菌发酵而成。 具有独特的风味和粘性，并且纯种发酵周期短、便于控制，其保健功能也远高于 豆豉。天培是由少孢根霉发酵而成的，主要是作为肉的替代品用于快餐食品中。 近十余年主要研究这类发酵食品保健功能，日本现已利用纳豆进行深加工为胶囊， 开发成保健品。欧、美等国学者对大豆发酵食品营养价值和保健功能的研究兴趣 也越来越浓。但n a t t o 及t e m p e 与国内毛霉、曲霉型豆豉是完全不同的两类产品， 而且前两类食品有很强地方嗜好性，不适合大多数中国居民口味。以日本的n a t t o 为例，较中国传统豆豉其工艺先进，实现了纯种发酵且对发酵工作菌种研究较为 深入【1 5 , 3 1 , 3 2 】。 1 6 选题的目的意义及主要内容 1 6 1 目的意义 尽管国内豆豉种类繁多，生产历史悠久，但由于生产方式落后，产品质量不 稳定，没有引起人们足够的重视，所以研究很少，对于参与发酵的微生物知之甚 少。豆豉的制曲和后发酵时间都很长，需要投入的费用就很多，尤其是以国内民 间自然发酵为主，工业规模较小，产量较低，生产周期较长。对豆豉的后发酵过 程没有系统的研究，对豆豉后发酵过程中微生物菌相的变化及优势菌群的作用、 理化指标的变化及关键酶耐盐能力方面的研究较少。因此，研究豆豉后发酵过程 中微生物的种类、数量及优势菌群变化，分析各种微生物的作用，确定理化指标 的变化情况及关键酶对于实现豆豉的纯菌种发酵、更合理的控制发酵参数，避免 杂菌和有害菌群的污染以及有目的的控制发酵方向、添加有益菌改善豆豉风味等 方面有着重要的意义。 中国营养学会、英国食品标准局等多家权威机构推出食盐的健康服用量为6 9 日，食盐过量易引起高血压、骨质疏松、还会加重糖尿病等。豆豉作为中国传统 发酵食品，其食盐含量较高，但高盐度可以避免杂菌以及有害菌的污染且对风味 的形成有重要的影响，所以本课题还研究盐度对豆豉后发酵过程的影响。 1 6 2 课题主要内容 1 豆豉后发酵过程中微生物种类、数量随时间的变化： 2 对优势菌群进行初步鉴定，确定后发酵过程中微生物数量的变化； 3 了解微生物与基质( 食盐、后发酵过程中所产生的物质对微生物的影响) 、 各微生物之间的关系； 4 确定各微生物菌群在后发酵过程中所起的作用，及其与酶活力的关系。 7 第2 章豆豉后发酵过程中菌相的变化 第2 章豆豉后发酵过程中菌相的变化 2 1 引言 我国对豆豉的研究起步早，但发展缓慢，基本上还处于自然发酵阶段，尤其 是曲霉型豆豉几乎都是自然发酵生产，发酵过程难以控制，产品质量不稳定。为 了控制发酵，实现生产的工业化，必须用纯种发酵代替自然发酵。无论是我国的 酱油，还是日本的纳豆、豆酱和印尼的天培，都是在纯种发酵的前提下实现工业 化的。 自然发酵生产天培的主要发酵微生物为米根霉、少孢根霉等【3 引，尽管米根霉、 少根根霉和葡枝根霉也适于天培生产 3 4 , 3 5 】，但天培工业化生产的主要菌种为少孢 根霉。为增加天培中v b l 2 的含量，常采用根霉和克氏肺炎菌混合发酵 3 6 , 3 7 】。在同本 虽有很多曲霉菌曾被用于酱油的制备，但实际应用的制曲菌种最终选择为米曲霉 和酱油曲霉【3 8 】。而纳豆生产的发酵菌株则是单一的纳豆菌。 与酱油、天培和纳豆从自然发酵向工业化发展的过程一样，要想实现豆豉生 产的工业化，首先要了解自然发酵产品中的主要发酵微生物，然后才能从中筛选 出适合发酵的菌株进行纯种发酵。曲霉型豆豉在我国分布最广，然而从报道资料 和厂家调查的结果表明，对自然发酵的曲霉型豆豉的微生物分布研究甚少，刚处 于起步状态。本章主要通过实验研究传统盐度下( 18 ) 豆豉后发酵过程中微生物 种类、数量随时间的变化，并且对优势菌种进行初步鉴定。 2 2 材料与方法 2 2 1 原辅料 大豆、食盐、姜、花椒、辣椒等均购于长清银座购物广场。 2 2 2 培养基成分及制备方法 ( 1 ) 营养肉汁琼脂培养基( 用于细菌的培养) ： 牛肉膏3 9 ；蛋白胨1 0 9 ；n a c l 5 9 ；琼脂1 5 9 - 2 0 9 ；水1 0 0 0 m l 。 先将蒸馏水与琼脂加热，充分溶解后再加入牛肉膏、蛋白胨、n a c l ，待溶解 后调节p h 至7 0 - 7 2 。1 2 1 高压灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 察氏培养基( 用于霉菌的培养) ： n a n 0 32 9 ；k 2 h p 0 4l g ；k c l0 5 9 ；m g s 0 4o 5 9 ；f e s 0 40 0 1g ；蔗糖3 0 9 ；琼 脂1 8 9 2 0 9 ；蒸馏水1 0 0 0 m l ；p h 自然。 先将蒸馏水与琼脂加热充分溶解后加入n a n 0 3 、k 2 h p 0 4 、k c l 、m g s 0 4 、f e s 0 4 ， 待溶解后，1 2 1 高压灭菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 麦氏琼脂培养基( 用于酵母菌的培养) ： 8 山东轻工业学院硕十学位论文 葡萄糖1 9 ；琼脂1 5 9 2 0 9 ；氯化钾1 8 9 ；酵母膏2 5 9 ；醋酸钠8 2 9 ；蒸馏水 1 0 0 0 m l ；p h 自然。 先将蒸馏水与琼脂加热充分溶解后加入葡萄糖、琼脂、氯化钾、酵母膏、醋 酸钠，待溶解后1 2 1 高压灭菌2 0 m i n 。 ( 4 ) 土豆葡萄糖琼脂培养基( 用于霉菌的鉴定) ： 马铃薯2 0 0 9 ；葡萄糖2 0 9 ：琼脂1 5 9 2 0 9 ：水1 0 0 0 m l ；p h 自然。 配制2 0 马铃薯浸汁时先取去皮马铃薯2 0 0 9 ，切成小块，加水1 0 0 0 m l 。8 0 浸泡l h ，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。o 1 m p a 灭菌2 0m i n 。即成2 0 马铃薯浸汁，贮存备用。配制时，按每1 0 0 0 m l 马铃