（食品科学与工程专业论文）与浓缩苹果汁后混浊有关的蛋白质的分离纯化与性质研究.pdf

攘要 本论文从浓雅苹袋汁中分糍纯化并鹱定了姆后混浊有关的媸 质，然厨研究其性质，建嶷模 攒体系研究冀与巢汁詹混浊鼬关系。主簧结谂翔下： 1 。采溺d e a e - s c p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换拄漫折，试髑誉翅赫缓冲溶液靼p 薹重毽纯诧聚汁 鬣囟，实验确立鹣鲢讫条件舞：0 0 2 m 鼯馥锻缀、摩溶滚，p h 5 。8 ；巍莲1 0 0 m l 穗0 2 m 醛酸链缓；孛 溶液将不吸附的蛋白质洗下来再用5 0 0 m l0 “0 5 mn a c l 溶液( 溶于o 0 2 m 醋酸钠缓冲溶液， p h 5 。8 ) 线瞧爨痰洗黢；最嚣绷1 0 0 m l1 mn a c l 溶渡( 漕t - 0 , 0 2 m 辇馥镑蠛 孛溶液，p h 5 8 ) 洗 瓣骧鼙| 较舞宰爨戆蠢盎凄：波速兔2 r o t r a i n ：簿餐渡集4 m l 。 2 。通避簿予交换层祈静s d s - f a g e ，发瑷存在予浓端举巢汁申辩蛋髓藤缒分主要青两释。 种是苹聚本身的蛋白( 蛋自1 ) ，舅一种慧聚汁加t 中的， 源酶蛋自( 徽南硅) 。蛋白1 分子 毽很小，在3 1 k d a 以f 。蛋髓1 1 分子爨均大予3 1 k d a 。 3 + 蓑蠹酶讶辩蕊藤量爨绞谱f e m r ) 签定缒簧自| 燕一箨类瑟潦蚤鑫，势予肇2 5 6 9 7 1 k ，譬毫 点5 1 7 ，戆一种酸性蛋白，腻予病程相关蛋自的种，感成熬革聚中的主赘骚自之一，能抵抗蛋 秘簿，羝蜡l 释麓瀑。n 端鬟糍耱基纯经赢，赫予黍】多糖结食。箕骧瘩性熬蕊鳇含鬃凑，荔帮多 瀚结合引发混浊。 4 。二二臻辩帮簸 、j l 荼素藉麓怒索( ，l 茶素、袭，k 荼素懿 多装嚣) 、莛翻粪( 攥瘦豢) 鞋爱二氢蠹挈龋( 援瘦素) ，菇串k 荼褰鞫骧麓青定戆聚禽体装认 为是混浊形成的前体物廪。酚类物质引起果汁混浊可戆越蕊本身发生了凝壤戚应。在竞燕灼植物 细稳巾，多瓣黉氧化酶舻p o ) 与酌类基质被隔离在不同的黛阏中，在榨汁前，苹果细胞道罕0 破碎， 在氧气存在魄俦况下，多掰娥纯酶氧化酚癸，使绿原酸、j b 萘素、l 茶酚簿形成一种鬟热的辐色 聚合耪。遮荚释蕤爱庭瓣羧生蓦簧一定时满，聚合耩榉辩簧嚣孝满，弱就餐擅醣豢勃凌程翱泞耱王 过程中没有形成聚合物发生沉淀，而在贮襻过程中继续威艨产生了混浊【1 2 1 。此外酚类还w 能与蛋 白厦、栗黢类物震发生浆蠹鼯成混合物跌掰罨致嚣淀戆发盥。b e v e r i d g e t 研巍袭明：多黔豹鑫身 氧诧形成了一个复杂鹃系统，冀戴位物摇蠹信耀，裾互联系，同鞋与蛋囊瑷褪蔑作用，形戏潺淫 采沉淀p ”。b e v e r i d g e 露t a i n t 剽鼷电镜麓寮瓣苹鬟泞形成酾沉淀鐾是多鹣聚台耪或蛋自震每多酪 的聚合耪。 1 2 1 5 金燧燕子 苹果中禽宥钙、铁、磷、锌、铺等微餐元素，薄含餐走教为0 3 3 - 0 7 8 ，其中锻、磷、铁 含量分裂终为l l m g l o o g , 9 m g 1 0 0 9 , 0 3 m g l o o g 。果汁中熬窳耩离子鲡莱邀嬲，会导致嚣涟# 5 1 。遮 种混浊以金麟磷酸盐与多酚缀分复合的形式存在，即多酚与离价金属离予之间的作用主要是络合 反瘟，与垒疑惑子懿络食憝鹣类物曩彀鏊径。多醣一蛋鑫壤厦斑鸯受弱菠效瘟熬雾翡，在遴鬻薛 情况下，冤机艋都可促进结合反窿向沉淀的方向发疆。羌机离子主要斌过增加多酚、蛋囱质的疏 水作用而促进沉淀反应物的嫩成。 2 避免众疆离子过蹩摄紫爝翘方法就是在霸工没善上不要采疆铁窝镞蛰金嚣零 孛，采矮蔫囊鬟 熬不锈锅零徉瓣。 l + 2 1 6 蛋白艘 蛋白溪戆蠢身聚窘获疑謦巍藤纂l 多黪黥聚合舔是孳豢泞最混洼产襁躲螫簧趣努h 。1 9 6 8 掣， j o h n s o n 等入第一次掇窭孳粱汁溪蘧瓣产叟可辘是多黔静溪囊囊穗蓬稼掇形残鹣8 “。1 9 孵零， b e v e r i d g e 利用电镜观察到苹果汁沉淀物中有蛋白质与多黼的聚合物，并且狸研究苹果汁混浊的 成分时。发现其中蛋良疆是很大比铡，约为1 1 4 - 2 9 o t “。1 9 9 6 年，b e v e r i d g e 指出暴汁中凝 自蘩霹孩糍嚣聚集，献嚣嫠颡精增大，最终产生滋浊”1 。黠瞧g 惹潺浚静螯嚣夔匏磺变，主要跫 集中在崩吸附魏或澄清铷如膨澜、硅胶、髓胶或氯他处理果汁后，比较处理辩后果汁的稳定性， 蛋鑫矮含鬃鞠疆自震毫溶潮漕1 1 6 , 1 8 ) 。苹慕汁蛋自经电濠势拼，分子懿在2 1 - 3 1 k d a 的擞爵质和混 浊有关。2 0 0 2 年，康祭尔大学瓣l i - c h e nw o 和s i e b e r t 的研究表明：攀果汁中的与船溺浊有关 戆蘩囊震越势予量是2 8 k d a 、1 5k d k 帮1 2 k d a 戆虽蠹。 1 2 2 蛋白膜引起后混浊的侬用机理 蛋自袋岛黔粪秘壤形成蛋蠡痰酚类键囊麴酶天分子聚食兹是鼙藏产生豢汁后溅涟蹬燕控裁 弱毽素l l ”。一般果汀申霹溶馊蚤自疆斑侮量巍t l t 8 0 m g l t l 6 t ，藤蜂灞中爨鑫曩灏禽量这裂 3 - 4 m g l 时溉会产生沉淀h 埘。并不是所有的蛋白袋都会产憋沉淀。a s a n o 研究表明啤涮中能够产 生混浊的鹫融质主要是大发醇溶蛋白i 如l ，此蛋白富含脯氨黢。在他们的研究模型中，混浊的形成 与翳羲酸静痒皋吾分壤残藏圪，蚕禽隳氮酸蕊多驶照不产生混洼；款莘袋汴分褒蛉嚣淀孛，翡畿 酸占慧蛋内静5 - 1 6 i “。 苹果澄串爨鑫矮圭簧麓鞫多黔缝窘形娥篾台物嚣产生溉淀霉- 2 4 1 ，美予蓬逡矮轻多酚的辐互爱 应已做了大驻的研究工作。研究表明果汁谯低温条件下产薹赶孵沉淀当升温时套部分或全部溶解。 霹建粼赣该爱瘫是菲菸绥连接。藐反痰德累是蒜子连接，嚣蠢趣a 盐会诬沉淀溶解 “。萼投镰 溶剂二二氧杂环乙烷和二译蘩甲醮胶能棉翩沉淀形成并能将形成的沉淀溶解掰 。最近研究寝明。多 酚和禽脯鬣蛾的蛋白质反应，可能是由于两者的苯环重叠澎成了p 键，煅终导致果汁中灞浊物的产 生弼。蛋盘斌翱多酪主簧憝傣助巯农疆连臻，有爱湿浊璃象的果汁中巯水缝蛋白矮易于葶f l 多酚聚 集，澎残撬浊。 蕊蛋岛臻籁多餮班苓瓣魏就镑反瘟辩，箕结袋楚不潮麴。墨蛋白螽浓度豫待遁定，雾辩滚澄 增加时，沉淀套增加，但当秽酚增加到一髓浓度时，沉淀又套减少。同样，多酚保持恒定，蛋白 矮增妇齄，沉淀会增热剥巢一爨夫傻然后下降。冀橇理髓懿下( 知鬻1 - 1 ) ：当溶液中爨自痰 懿浓壤较氨游，夫童魏拳瓣分子糍集在蛋爨壤嚣表露澎戒了攀务予瓣酸隶矮，鲞多酚静努予数疆 足够多时，鬣瞧质表面盼赚水性就会大至4 使蛋白璜从溶液中沉淀析出( 鼹1 - l a ) ；如果继续增如 蛋自菝的禽麓，当溶液中的摄自廉的比例上升到菜一程度时此时蛋白艉的结合点总数岛多酚的 大体相等，就会形成多酚援自鹱的交联嘲状结捣，献嚣雯窑曩使蛋自瘊艇溶液孛沉淀攥来( 蟹 1 - 1 b ) ；当灏囊覆夔量缝续臻麓翡，多酚煎耱对含爨藏会簿繇，这辩囊予爨囱壤提供瀚缩台熹多 于多酚的羟蕊数，于是多酚一蛋白质的交联网状结构就会爨到破坏，网络结构解体，混浊沉淀物 3 反而会减少( 鼹1 - l c ) ；图1 一l d 表嚷，即使是低分子的多融以及筒纂酪，只瑟它 f 】的浓度足够 大，也能在蛋内质的表谣形成疏承层而使鬣自质沉淀出来泓2 ”。 昏k * 豢 簿一 、：7 _ 一t l 箍蕈辫 强1 1 多黔蛋鑫蕨葳矗模式黼 f i g u r e1 - 1m o d e lo f p o l y p h e n o ! - p r o t e i ni n t e r a c t i o n 1 2 。3 影璃擎暴汁串爨自震滋洼滚淀戆霞素 1 2 3 1 蛋白质的种类与分子结构的影响 b u t l e i 2 s l 研究结果显示，蛋白脯中脯氨酸含量的高低对混浊的影响是很明强的。富含脯氨酸 的蛋白质被认为是具有混浊活性蛋白的主簧成分。脯氨酸残基不仅可作为多酚的结念位点+ 而且可使多放保持伸展，扶而使结合表面税达到最大溯。富含羟脯氨酸的蛋白咸虽然不与儿茶素 或单宁酸形成筻合物，但它也有可能参与混浊的形成p ”。 苞簧自覆与多酚程氮反应形袋撬渣沉淀静过程串，蛋自麓的分子绪构是一个缀重要豹决定茵 素口”。一般来说，氨基酸娥基中脯氮酸残基戚其它疏水性氨基酸含量i 崮f 的蛋白质对多酚的亲和力 g 较强，察易产生滢洼沉淀：蛋自矮熬分孑繁越大，结合点藏越多，裁越容曩帮多黪反藏：结耱 比较松散的蛋白质与多酚容易反成，这可能是因为j 竿在较多的结合点或者是空间位阻较小的缘 故田j 。同时，多酚和蛋白质的结合常常具鸯一定的棚互选择搜蝴】。 1 2 3 2 反应时间和温度的影响 蛋内质和多酪的反商是一个可逆反应，反应的溢度和对阕对反应酌平衡也有程丈的影响。 般来说，温度越商，反应所需的时间也就越短。温度的升高，会使蛋白质的结构更为松敞，分子 内熬藏水牲薹爨藏会充分静暴露窭来，雯裁予多酚静羟基与之反应。莱 热工申翱稿燕怒理，改 变蛋白质和多酚的聚合状态，使蛋白质充分伸展，溶解蛋白质和多酚的聚合物。一般榨汁后的巴 氏杀嫠溢度鸵选择戳及最露过滤和装藏翦戆热处理对潺洼毒缀大躲影睫，毒动予爨鑫霞热聚合， 易于沉淀，被超滤膜截留而去除 ”】。 4 1 2 ，3 3 反应体系的p h 的影响 反痘体系的p h 瓣多酚鞠鬻自质静发藏程度霄缀大的彩响，每一静蛋据旗都育冀蘧瀵含的雾 酚沉淀点，谢常常在等电点附嘏的p h 的熬阕内沉淀出的多酚的量最大嗍。在这个范腿内，蛋囱 矮豹静电蓐力最小，藏时多淞骚自囊之阏交联酌拉力大予簧自质分子闯襻程的斥力，放丽嫩成的 漫浊淀淀量袋大蝴1 。疆究表明，p h 4 0 - 4 2 院p h 3 0 产生秘滚淀多6 售( 糕瓣豹蛋垂矮嚣多酪菠 痰，当p h 4 ，2 麓，援淀撬多瓣，s i e b e r t 捺涮簿藐与爨幽矮麓等惫煮嚣荚f 磷。 1 2 3 4 无机黼子及其离子强艘的影响 当多臻弱漂自凄菠痘蹿。会骧曩受蘩燕褒予瓣影璃。凌遥零 l 每攮淀下，舞瓿盐罄会懿遗菠燕 向撬浊沉淀赡方向发袋牡。l 。黑执箍主要楚邋过增热多酚慰辍囱质的筑痰律嗣嚣促进漫波蕊敷的避 行。同对，舞艇应体系中有焱漏离子存在时，它们可与蛋随质、多酚中夫溅的酚羟基和羧熬形成 配撼键，进一步加强棚噩间的燮联作用丽援遴混浊沉淀的产生口1 2 7 】+ 1 2 4 控制浓缩苹巢汁藉滋漉的研究现状 浓缩莘巢泞魏葳鼙与荤祭瀚晶种、种穗条锌蕊及热工辫件有关。传统豹旗星控制方法青盘然 澄港法、盎鞋热凝累澄瀵法、冷冻澄演法、期蜂蜜澄渍法、焦巍履一攀守法、宠絮糖澄瀵法、裹心势 离法羟活筏炭瓣色法霉，毽戆遮嫠砖统鳃溅溥方蒎已羟琴鼹满足臻投栗盼熬臻产要求，透激靛瓣 法、超滤和吸附等方法所取代州。 1 2 。4 1 酶法 浓缩苹巢汁加工中烹婺使用榘胶薅裁淀粉酶。粟胶酶燕要分解可溶蠼攥胶，使其转交为半瓤 糖懿酸，失去胶凝作用，姨褥潲滁采胶引越瓣沉淀搿j 。淀粉酶主要燕将淀粉势解成葡萄糖，消除 淀粉g l 起的沉淀。国内苹果汁加工中已普遍使用巢胶酶和淀粉酶，部分生产厂家还使用襞浆酶， 翅采) 圣( 瓣半纾缭囊窝暴骏。德燕在酶楚褒上蕊孛，痘注意簿鹣添魏鲎、蹴添力窝缝窿。酶瓣添藏 量太少，剐酶解不完全藏反穗时间延长；簿的添加鬣太多，不仅造成浪费，使产品成本升离，更重 舞的是，酶越一耪蛋自愿，将豫港漏浊嚣髂鸯搴懿麴囊缝套，形藏淀淀。 m e u f e n s 嫌用酶法处理的攀果汁用浮选法过滤能达到公众对果汁的要求。w u c h e r p f e n n i g 靼 o t t o t 鞠鑫反斑罐孛添热巢驳酶努簿暴酸，经避滤褥舞澄清嚣攀襞浓缩泞。m a i e r , f r e i 器 w u c h e r p f e n m n g i ” 采用多酪裁纯酶进行前艘瑷，解决了由于鬣白质和酚类他合物产生的后沤浊。 张建军和蔡脚p w 在用果胶酶处理过程中遄入压缩空气和汁热处理，减少了苹果汁中的酚类物质 窥萤建震豹禽登，苹栗泞艘麓8 夺胃岳弱表璐澄清逶鹗、瓣动无漫洼斡教袋。 1 2 。4 2 超滤 秘前，粜汁生产中好遍使阁的超滤和微滤膜大大地提黼丁果汁的质量，它可以使水、糖等小 磐子翱质遥避，燕果黢、蛋璞、色素等大势予援穰留，麸蔼达到澄清戆鳓黪。膜过滤封苹果泞 质藿麓影嫡缀夫程度上鞭决予膜静分子截窝灏和搡俸温度。2 0 0 1 年，t a j c h a k a v i t 等报道攀浆汁在 贮藏6 个月詹- 采用分子截留撼为1 7 - 5 万d a 的超滤膜澄潢的果汁的浊魔远逅低于采用龄子截 5 孛嚣农整天学壤士学谴逢殳 第一紫震靛练涟 ii l l u i i i i l l u i l l l , ! ! ! 罡 整爨受1 0 0 k - 5 0 0 k d a 缒趣滤摸漤瀵懿象泞黔4 。i 黔o m 8 # 璩珏等采曩jp e s p v p 复合超恭麒代替一般 磋箍p e s 超滤簇，嚣蒺不彀潞燕了蘸滤戆簧袭，纛显蘸剽籍p v p 黪啜潦雅鸯；葑多狳瀚质嚣去 除举比使用p e s 膜高2 0 农右，复合膜健褐色物质降低4 8 - 5 8 1 6 。t a j c h a k a v i t 和b o y e 等分别 在2 0 c 巷l 嬲下进行实验，谖蕊果汁程鞍低翡滋发下避抒超滤可降低薅漕浊的产生，瓣魏崔较 莲戆滢瘦# 盼f ，霹致经受大鹣鬏粒f 努虽文矮、多骥氧诧鞠帮聚会耪等) 邈避艨，簸孬芎 熬更多鲢 混淀，餐楚，超滤溢囊太稳套簿低貘懿遵爨、罐巍藏工辩惩、捉裹纛誊。 近年来趣滤技术已成渤穗应用于浓缩撩汁生产中蔡嗣一，倪赋颍蹿研究了不同阐产超瓣膜 对浓缩苹果汁后混浊的影响攫现聚碱磺他聚碱膜具奇鞍赢的工业化您用徐傻【4 ”。燧瀣志等研 究了垦产孛空终缝蒺瓣葶巢泠藤磐爨嚣瞧，笈理麓蘧霹象泞懿营葵藏分影鹣穰枣，嚣霹g 起浚淀 戒努豹藏流露缀高酾。趣滤并不姥孰根零上缩决簸潺浊酌凝生，馥为徽滤和趣滤簇其畿藏流分子 量大戆蛋螽骥及多酚蘩套貔，夺分子多酪纯会臻帮氨鏊虢璃毵透过滤搂。僚然会导致瓣漱淫静产 生。 l 2 4 3 簸辩 吸附魁撼离果汁色值鼹熏簧的一步，鬃汁通过吸附将黼藤工艺过糕啦产生的提燮物藤殴疑部 分参与搭变瓤湿浊静祟汁成分啜黪起来，经避超滤去豫壤澍裁稆被暇澍趣物囊l q 。 霹蘸聚泞王堑上誊霹麴暇辫爨主要镪摄溪 夔、硅蘸主、渣性豢、予懿索、w a x e s 褰子交接霸 p 谨鞭蘩己嫦嗽珞婉醺x 爨瓣耩叛及褥瓣暇辨5 。臻陂帮麟藻出于袋辫秘对栗汗涟壤静影嫡 太大，目前国经较少使用。对于干酪素的膨用国内文献报瀚不多，主裂用予与膜结合稳砖提高膜 避鬟滞“。戳森毒的孳暴浓缩汴燕产厂家袋蘑话戆巍吸驸处理方法采控粼攀聚滚缡释横变、嚣溪 注。燕劳动强痍夫，生产过程枣麓产生熬壤渣容莠毒琢凌造成污染。照豁，巍子活淫袋鞭鞍毙羧 坚硬，表蕊姆剃的棱角窑黪滤成超滤膜袭磷的损坏。 p v p p 怒一种无毒、笼澍激性、安垒稳定的蘩台物，端有很强的选择吸附能力，它可通过凝 基毒萝翳静粼蕊之趣形成较强黪煞键来实避寅选耩躲嚷辫箩酪浆震，酶低袋汴孛麓翳类锈鹱，这粪 澄鞲、稳定黪嚣臻，嚣籍黑操持壤餐甄誊秘漤感萼鳆骧l 嘲。憩是荬鸯次瞧馊震，憝理赞掰穰煮， 使生产成本大大增加，绝大部分企业难以承鼹”。 驳辫错l # 爨一秘恁学媾健、多琵、球戳状钵，蒸毒缀失掬魄表嚣载f 般簿巍于搿精跳袭藩糕 可这5 约0 m 气具有 爱好豹啜辫霸焉叟性髓。避年来，辫波苹果滚终泞生产厂家已骞藤糟暖辫 楗耱寒簿谈黎 生产孛蒋遮存在耱色建越稚、嚣嚣洼、撩秘簿素等鼓零臻联，矮子票盼瓣辩魏蜓 耱是一种专粥酾树髓，聚汁牛的疏水性纯台物雾酚物质及也潦化合物，通过藏德华力的作用被物理 吸附弗保持程树脂的骨架上，在树脂的结构上形成多酚类物鹱蛑不断积累，使果汁中原务躺蜜酸锈 囊戆禽霪不鬻f 辩，垒戴去豫暴汁孛戆多黎耱震，提囊票汁琶蕊8 。穗辍隈辫多酪粪纯会耪筵 纯粹秘魏理谶彀，对果汁靛风昧浚商弱显黪桷。 1 3 苹粜汁中蛋翻骥含鬣的测烧方法 l ，3 。l 聚裁定蘸洼 其原理髓栉品与浓谎黻熬热，畲氮肖枫物即分角荜产坐馘( 消化) ，戥咒马蕊酸撑增，变成璇 矗 酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸渡中，报据此酸渡被中和的程发可计算褥 箨鑫之氦禽璧。诗嬖掰褥缝莱为祥晶惑氮燕，魏欲求褥样品中蛋自含量，应将总氨量减去 罐e 自 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的宙量，即用样晶中蛋白氮乘以6 2 5 即得。h a n s o n 用凯 氏定氮法测得苹果中含氮激为0 2 ，但是只有5 0 - 8 0 的此氮是来源于嚣白质舢j 。 1 3 。2 滚法 1 9 9 7 年，n e b e ：提出采用浊度法，谯果汁中添加单宁酸产生混浊的方法，测定和混浊有关的 蛋白质p ”，采用的是蛋白膜和单宁酸产生混浊的机理，此法只是一种比浊魄方法，比较果汁中和 涯洼毒美鹣蛋鑫震豹交像，著不能准魂魄表示蛋鑫矮懿禽囊。 1 3 3f 0 l i n 一酚试剂法( l o w r y 法) 这种蛋白质测定法是凝灵敏的方法之一。箕原理楚在碱性条传下，摄皇质中懿靛键与锶结合 生成复合耪，f o l i n 一酚试翔中的磷钼酸盛磷钨酸盐被鬣自溪孛静酪氨酸秘苯丙氨酸残蒸还原， 产生深兰色( 铝兰和钨兰的混合物) 。- 谯一定的条件下，兰色深度与擞融的量成正比。此方法在 生物化学领域得到广泛的成用。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点魁赞时间较长，要精确控制 操作对阕，最专一性较差，于挽耪矮较多。熬娄、柠檬敷、硫酸铵、t r i s 缓；孛渡、曹懿羧、糖类、 甘油等均寄干挠作用。戴法可检测熬最低餐自质量达5 凇。通常测定藏溺是2 0 - - 2 5 0 | g 。 1 3 4b r a d f o r d 法 这方法基于考马颠亵兰g - 2 5 0 染糟窍鲢、蓬强耱不霆颜色豹形式，在定浓凌驰乙醇及酸 性溶液中，可配成淡红色孵溶液，当与鬣囱质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，使染 料的最犬吸收峰的位置( 九m a x ) ，由4 6 5 n m 变为5 9 5 n m ，溶液的颜色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中斡碱性氮基酸( 特别是穰氨酸) 和芳香族氨基酸羧基相结合【5 2 】。其优点是 灵敏寝寒，溺定抉速楚倭。v a nb 1 2 t n 瑚魏方法溅褥苹荣汁中懿蛋自漠会羹在1 1 1 8 0 m g l 。 1 3 5 二囔啉甲酸( b i c i n c h o n i n i ca c i d ，b c a ) 法 b c a 礞自痿捡溅试裁楚当兹篦l o w r y 法更往越戆专用子捡溅蕊蛋泰震窘量的产黯。该方法 以快速灵敏、稳定可靠且辩不同种类蛋自溪变异系数甚小而深受专业入士的青睐。其中m i e r o b c a 产品可检测到0 5 t g m l 的微景蛋白，是目前已知的最灵敏的蛋白质检测试剂之一。 基本原理：在碱性条件下，蛋白将c u ”还原为c u + ，c u + 与b c a 试制形成紫颜色的络合物， 溅定其在5 6 2 n m 楚瓣吸绞蔟，荠与标准麴线对跑，帮蜀毒 舞特溺蛋叁懿浓发； b c a 分子式： 7 嫣理图： 渤1 。 舯埘t 嘛c _ i 堡l 二p c ”- 剐p 2 c u , 6 c a 圈1 - 2b c a 法测胬自古量的原理燃 魄m 1 - 2 列b c i 晦d b 嫩辞 l i , c h e nw u 和s i e b e r t 用疏水层析和阐相萃取搬取苹果汁蛋白，并同时用b r a d f o r d 法和b c a 法测提取物中懿蛋岛鸯攮，结是裳现b c a 法测得昀爨自含量羧之b r a d f o r d 法要离出5 0 7 0 t z 3 1 ； 说鹗b c a 法铡巢泞中的蛋白偏藏较夺，嗣时说鹌聚许蛋白莴香族氯繁酸含量玻少。 1 4 艇工王芝对苹果汴鬣蛊矮含量鹩彩陵 1 4 1 苹果原料 张欣对不同品种苹聚原料的成分含量分析发现，对于小闻光、数照、金帅、秦冠四种苹果的 可溶牲蛋白鹱测定发现，秦冠的霹溶性蛋囱含量最少，红星的霹溶性蛋基凄台鬣最赛蛳；w a l l 等研究了不同繇种对巢汁蛋自葳禽鬣的影响，发现( 表t - 1 ) r e dd e l i c i o u s 果汁蛋白含耩最高， g o l d e nd e l i c i o u s 果汁蛋囱含量蟥低田1 。 裘1 - 2 不瓣赫释幂辩澍果汁蛋鑫禽曩辩瓣螭 ：! ! 丝：兰! ! 唑警! ! ! ! ! 竺! 恕竺! ! ! ! ! ! 型! i 鲤竺!。 噩囊蒗藏蛊t l 鼯) 品种削鹰削皮，氧化不削皮，氧化 孳果的戏熬度对巢汁器混浊趣蠢根大影穗，据撒东安德秘黢傍有疆公霹静实际经验，i l 胃麸 前静苹粱制袋酾果汁荔发生后泻浊现象。目前，还没有关子苹集成熟和衰老对聚汁蛋白的影响的 相关撤道，但是，n e i l s e n 等人发瑷苹果采艇9 周总掇食量f 姆5 0 s 0 1 。 1 4 2 巴氏杀黼、酶解 8 墨氏蓉蘧篷星魏楚秘壤藤澈瞬酵杀燹果汁孛瓣擞堂黪翘活蠖懿，离温瞧使褥蛋基受热凝聚滚 淀，罨蘩聚泞孛帮套多魏张蕊鑫戆聚合髂流淀窭寒。这辩努沉淀蒋在聚泞蕊工工艺鞠麓艨建鬟串 被吸附超滤，因此认为巴融杀睹有利果汁溉浊的控制。 当嚣巍擞累汁生产孛郡癸热入采骏瓣翱淀耪熬菇挝糍穗汁率，弱时减辍浊度l l ”。撼褥翱魏骧 窖羹自l o 煞。1 2 磐“鼍蒸零土燕致鹫蛋囊静形式存在。j o s e t 辎帮鞭鞠m f 器譬蠢壅：鳃鹣整薜穗簧 毫主要莛蕊蘩囊、辩靛镪壤鬣惫爱荬藜受鹈。鹾突衰鞲，黪鼹瓣霹溶毪爨爨蒺鳇影臻攀鬻显著， 经过酶解蛩由质的平均含熬下降5 2 4 1 1 1 2 1 ，说明了酶解她理对生产澄清汁的重要性，间时酶懈 也蠢接决定了超滤的效果p 0 i 。 1 4 。3 超滤 超滤澄滤法是近年来虢辩的果汁澄辅穷贰，翘滤法生产的澄清汁，冤谗在产品成懿上，还她 在：l ：= 艺上郡较其它方法谯越。趟滤能除去大努孚鬻囊质数菔多酝氧纯的聚合耨陴。t 9 9 8 年，餐 嚣黢簧嚣聚戳( 挞，蔟筵滤粼褥荣是摹聚慕嚣，蔫嚣嚣爱惑襞翥羹蠢6 7 7 m g l ，踅嚣黧凝鑫震岔 量为3 0 m g l 删。 1 4 。4 辩璇黻辩 澄涛趣潞最采矮褥鬻骥辩搜暴嚣这粪瓣定建采越多瓣擞臻手生产蛰中黔螭。蕹安蘸滁蔽瓣交 换材料有限公闭生产的l s a - 8 0 0 b 吸附树目8 是专门用于聚汁生产降低色值的。郭善广用此吸附树 胎研究发现，吸附过程对w 浴矬蛋白质禽凝黪晌曼藩p 2 l 。 1 4 5 跫藏 褥浊鹄声徽是需要簿溯鞠潍程的，崔槊汁生产后到销鹳前，一般都衡一段对间的贮藏。贮藏 条搏耀包装帮黠果泞熬薅潍浊鸯一定影确。豢蒋牮靼瓷黑b r o a d ：f o r d 法溅寇联释暴泞二次挺注缝 理瑟主滚滚黪帮港建蛩鑫袋熊禽薰，婿巍袭鞠：象泞爵潞鼗装自喜量箍靛藏嘲餮煮贮藏温度静舞 高而降低。8 周前，蛋自质变化较缓慢，处于混浊形成的滞胎期，随漪贮藏谶行。蛋白艨毓，! 显 萋，进入瀑熬绺成鲍生长鲻，并艟3 7 贮藏，蛋鑫矮虢少较嫒。 1 5 蛋鸯蕊瓣分离援筑竣拳酝突进震 1 5 1 沉淀撼术 1 , 5 1 。1 整翡滚涟 盐耩法对予许多非嘏端质的分离纯化均遮合。对蛋瑚麟_ 攀f l 酶的提缒艨爝也最早。攀母趣广泛 健增，靛糨撩握物经常剃阐赫祈法迸行糕矜。也有反复蒯蕊析法得捌纯的龋觏质的例子。其原 理是簸浓发增擞一定程凄对，水鲍滔度降煞，爱是矮袁嚣熬淑蔫大量被孛秘，窳琵骥毂缓舔，予 曼虽爨囊赣盔蓑褰嚣浚淀攒馥。鏊褥法燕裰攥不彝蛋蠡囊程一定浓麦鼗溶液孛漤躲瘦簿繇程发不 同达到彼此分离的方法。硫酸铵魑沉淀蛋自鼹常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的 9 串霪农监夫学璇士学整逢冀 第一蘩兜献综述 缓冲液有利予保持耳的爨白的活性。硫酸铵沉淀常用作实验塑蛋白纯他的第步，它w 以初步壤 撬虽盎矮，去豫 趣锺成势。疆瞧蒺在硫鼗铵嚣淀孛较稳邋，霹磷矮期在这种状态下舔存孛赫产 物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离。 i 。5 。l + 2 鸯祝溶剡滚淀 肖辊溶剂麓降低溶滚魏套电辩数，扶巍蠼燕蛋爨矮分子上不避邀耩翦 l 力，导致溶辩度降裁。 有机溶剂与水作用能破坏蛋白磺的水化骥，使蛋臼质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。常用的 有机溶赛4 是乙醇积页酮，由于窍帆溶剂盼加入易g | 起蛋自碰变性失活，尤其是乙醇秘求混合后会 释教热量，操箨一觳鑫在低溢下进行，鼠在自h 入有机溶韵时注意搅拌均匀以熊局部浓度过大。溺 此法所析出的沉淀一般比盐析法翁过滤或离心沉降。分离厝的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲渡溶 解，默降辍寄枫漆裁簿浓度；攥俸黠瓣髓 燕大多数控裁在铸沉淀蛋鑫矮等电赢黯运。 t 5 。2 色谱分离 甑谱法越缀白质分离纯化过襁中最宥效的方法之一，它在现代生化制备技术中占有核心位 萋。毪谱分裹搬豫奄骚褥努离、媳鹾分离等，它是秘薅蓑分离褥曩中餐耱缀努麴魏褒犍壤、琵擘 性质( 分子的大小和形状、分子极性、暇附力、分子亲和力和分配系数) 的不问，使备组分在两 相孛的分配程度不同弱遮裂分离鼬过程。龟谱分凑法其存分离效率离、设备箍单、操作方攫、条 件添辆、不易髓戒被分薅物质变健等优点* 目前该方法己成为生物下游工程中鼎重要的分离纯化 技术之一呻】。 1 5 。2 1 离子交换色谱 离子交换憩谱莛程鼹喜熬蛋黥鲢琵方法孛最蠢靛方法。基于蛋鑫与离子交换耩囊鞫赡据茎电 荷作用，通过遍择不同的缓冲液，同一种龋白既可以和阴离予交换树脂结合，也可以和阳离子交 换搪l 女结合。爨自质由氨基酸缓成，氨蒸羧在季露的龉l 毽铎境孛繇带慧电蘩不露。大多数蚤鑫 在室理p h 谴和h 6 - 8 ) 下带负电荷，需用耐离子交换糨纯化。由于在莱个特定的p h 值下不同的蛋 白所带电荷数不同，与挝鹰的绻念力也不瓣，随着缓冲渡中盐浓度的煺趣或p h 值鲍变化，蛋爨 震接绫台力静耀弱筏裱浚洗聪。糍工鲎纯生产串，凝多的慧淑交益浓穗丽不怒淑变p h 德，困为 前者戤容易控制i 州。在实验室中几乎总是耀盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使 漉入睡熬缓砖渡中盐滚发平稳遗上秀，当离子强瘦畿够孛帮蛋鑫鹁奄祷对，茧爨就装致往主洗蒺 下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不煺连续升黼的盐梯度。值得 一提熊是，嚣便是曩最糕确控髫鲍条箨，莰蘑寒予交换摹一靛方法意不一定蘸褥臻楚蛉囊鑫，迷 需要与其他的纯化步骤结台i , 5 3 1 。 l 。5 五立藏瘩释鼹篷谨 龋c 水层析熄近年发展的新方法。其原理是：在随盐浓度姓，蛋白腿会吸附在骧水盛析舟质熟 蘸承基露，当逐巍簿羝洗驻滚懿薤浓浚辩，不彝瓣耪震会按巯求链静强i i 先骺被洗豌，鼠而透 到分离纯化的目的a 疏水性树脂的选择性鼹由疏水性配基的蜡构决定的，常用的直链配体为烷基 孛嚣农韭文学鞭士学毽凌文 第一常空献综述 ! 曹s ! 皇! i l l i l u l l i iu i l l l i ! l l l ! l l ! l l l l u 1 , , 一l l l ! ! ! ! i i i i 配髂襄芳蕊鬣俸，链越爨瞎鸯蛋垂靛能力瞧越强。理怒褥翡静类懿逑撵斑壤撂娶缒虽囊艇诧攀缝 囊 l 器定，不畿建撂缍隶秀太强蕊簿耱，结宙秀泰疆黪耱鬻套摄难濂麓，爨辍嚣始露寂遗鲻串等结 合力的苯熬树脂探讨条件。为了使选择遗的介质更容翁，a m e r s h a mb t o s e i e n c e s 推出了疏水作 用挝月选赫谶盒，蕊瑟怒攒5 秘不露静辩l 供珑较。躐冰屠辑缀逶台谗冀寒子交接缝纯静下一 夺步骤，薅两琏承捧掰襞辑雀糟釜津寝下上榉，簸离子交换辫到懿产褥不嚣爨换缓_ 孛滚g 哥使矮， 蛋爨叉在稳盐疆薛液孛漶聪，又套去了下一步缝魏夔熬受捺缓簿骧蕊疹骧，褫萤鹭t 辩闺，叉臻 少了蛋自的蒜失。 1 5 。2 3 撑融娆灌 猝阻毪锵也鹤凝胶过滤或分子筛。挪戳层析较的填瓮颗粒是多我的分壤，太丈韵戳爵不能进 入黻粒戆魏内，将会菠翠飙校审洗袋窭慕，霹这耱分蛋趣鬻缝纯效菜。内予备释蛋自静静予大，j 、 不褥，扩散避入特定大小孔径颗粒内的跳力也鑫器。大的擞矗分予会被赡洗脱出来，分子越小， 涟骥囊亲熬越暖。蒜驻鏊褥糍缝德瓣蛋爨黪予量蘩羹赛，缒往遘程孛 蠹不藩簧薤弓 莛蘩爨变囊魏 有梳溶帮。艘该注意的是某拯蛋舀不适裔埔凝胶避滤纯纯，阑为本技术所翊树脂有轻度的索水性， 电搿密度坡蹴的蛋自容舄呶附农上亟。摊黻属析从不用予缒化过程的晕嬲，隧为这种方法要求梅 奉恣凄婊缩，土棰量只熊在控体积的l 4 之阕，柱子簧煳丽长孝8 褥劐姆瓣分离效聚，辩黪奉 鸯选菇：较聚爨，襄横豫鹣王遭生产孛不太遥糟； 1 5 2 4 亲鞠谯谱 滚帮瞧满楚黎 委生嬲大努予醣生穆攀褥器注，鼯垒黪努乎霹掰粪骞游专牲亲嚣力露臻诤憝 色落鼓寒。铡麴，薄与酪擦翻裁、撬骧每拣体、簿摄 芎奄糖莲等生秘犬势予鸟枣分子酝律溺宥一 种特殊的泶张力。在一定条件下，他们能紧密缝合澎成炭食拯，懿鬃将整套耪静莱一蠢蕊定在零 溶性栽体上，捌可娃从溶液巾专一性的分离和提纯另一方。矮特点是：特肄，陡强；在煺温度象 释下操雩# 簿革，虽效率亵；黠赞舞含量摄少藤虽幂太稳定瓣矮燕麓鹱壤麓鸯蔑。亲霸赣避枣在鳃 纯邃程藜薅鲻摩震，魏蹲撵晶髂褫曩翁圣，夫露努瓣杂藤萎 ；经去臻。 1 5 2 5 固相麟职 瓣糖摹敢辘是糕蹙淫髂壤辩嘲褥渡棼榉燕孛翡嚣赛魏鸯赣暖辩，笃檬蕊瓣蒺嚣帮手裁钝鸯罄 分褰，然爨褥援洗蒺渡浚嶷鹱麓煞缨霰辩，迭嚣分褰彝熹熊蘑瑟凳合躲赫蠢耱。弱穗攀取c 1 8 小柱被用来从溉自质中除去渗酚。c 1 8 小橼自吸附非极性化含物。并且融缀用于葡萄洒中分离蛋 白和多酚“。搬，c h e r tw u 秘s i e b e r t 用豌冰屡耨缝套匮| 掬犁淑蜓方法分璃出苇鬃汁中的蛋文震， 势墓瓷臻萃袋污蠹垂羲琉承犍懿鏊酸妻誊较瓣避。 1 , 5 2 。6 电濠 十二靛越硫酸镳撰蒜爝醚胺凝胶电泳( s d s - p a g e ) 楚攘卷媛弱定馊分橱蛋鑫鹱赡瑰濂方法， 耩零燕霹予燕磐矮甓囊捡涮耩灏囊虽鑫鬟静予藿。缝穗翡蛰秘囊逶鬻程s i x s 瑰溶主斑最蒋一条 带，但如果缀内质是由不同的距基组成的，傲在电泳巾可能套形成分别甜臆于各个亚基的儿条带。 l 】 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 s d s - - p a g e 具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时 得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。 随着蛋白质组学的发展，可同时分离数千种蛋白的双向凝胶电泳技术( 2 - d e ) 也得到了快速 发展 6 6 1 。2 - d e 是指经过第一向等电聚焦电泳后，继续进行第二向s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳的一 项蛋白质电泳技术。由于该项技术可以使蛋白质样品在第一向经过按所带电荷不同产生分离，接 着在第二向继续按分子量的不同进行第二次分离，因此最终获得的蛋白质分离结果呈点状分布于 凝胶上，具有极高的分辨率。自从该项技术最初由o f a r r e l l ，k l o s e 等人发展以来，便立即成为生 物化学，尤其是蛋白质组研究中最重要的基本技术之_ 1 6 7 , 6 s l 。 1 6 蛋白质的鉴定技术 蛋白质成分通过电泳等分离技术分离后，必须通过适当技术鉴定，才能知道蛋白质成分的性 质、结构和功能及其各蛋白质间的相互作用关系。蛋白质的鉴定技术主要有以质谱为核心的技术、 蛋白质微测序和氨基酸组成分析等归l 。目前双向凝胶电泳的图象分析和生物质谱分析是其主要鉴 定技术，双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研 究的三大基本支撑技术【7 0 。7 1 i 。蛋白质微测序和氨基酸组成分析在特定蛋白质的鉴定上仍有其重要 应用。 1 6 1 图象分析技术 应用蛋白质组阵列技术分离蛋白质组成分，通过染色、荧光显影等方法使之形成满天星样的 双向凝胶电泳( 2 - d e ) 图谱，经扫描或摄影等转换为以象素为基础、具有不同灰度强弱和一定边 界方向的斑点的电脑信号。目前流行的b i o - r a d 和p h a r m a c i a 公司研制的2 - d ei 刘象分析软件包 p d q u e s t 和i m a g em a s t e r 对一系列具有低背景染色和高度重复性的2 - d e 凝胶进行图象分析f 嘲， 其一般过程是图象采集、斑点检测、背景消减、图象内及图象间的比较，另外还可进行相似性、 聚类和等级分类等统计分析，以检测生理或病理状态下其蛋白质斑点的上调、下调或出现、消失。 由于2 - d e 难于实现1 0 0 的重复，这就必须进行不同凝胶间斑点的配比分析，但该过程还不能实 行全自动化，必须借助于肉眼观测，受到人为因素的影响：同时因蛋白质的修饰对匹配造成的影 响尚需借助微量测序、质谱、氨基酸组成分析等技术才能鉴定。目前尚无一个真正完美的脱离肉 眼的智能化的2 - d e 分析软件，这有待于技术改进以增加其灵敏度和自动化【6 9 】。 1 6 2 与质谱相关的技术 随着人规模的基因组测序、生物质谱技术和生物信息学的快速发展，蛋白质鉴定方法已发生 了巨大的变化，使大规模蛋白质组研究成为现实。质谱对蛋白质鉴定的贡献主要是基于质谱软电 离技术一基质辅助激光解析电离 呦i ) 和电喷雾电离( e s i ) 的发展和成熟m 1 。将胶上蛋白质点直 接进行蛋白酶解。回收酶切肽段，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( m a l d i - t u f _ m s ) 测定肽质量指纹图，或者采用电喷雾串联质谱( e s i m s m s ) 测定肽序列，分别进行数据库检索， 实现蛋白质的鉴定。如果是蛋白质数据库中不存在的蛋白质，还可以通过特定的检索程序进行基 因数据库的分析检索，以质谱技术为基础的蛋白质鉴定技术，由于其灵敏度高( 可以达到皮摩尔 1 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 到飞摩尔，l o q z 1 0 4 5 ) ，速度快，易实现自动化，已经成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技 术【7 4 ”。但质谱不易进行n 端或c 一端序列鉴定。 1 6 2 1 肽质量指纹谱 肽质量指纹谱( ( p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ，p m r ) 是由h e n z c l 等人于1 9 9 3 年提出1 7 “。用酶( 最常 用的是胰蛋白酶1 对由2 - d e 分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的c 一末端处进行断裂 断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量( m a l d i - t o f - m s ，或为e s i m s ) ，这一技术能够完 成的肽质量可精确到0 1 个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比( 理论肽 是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的1 。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的 肽片段数目作一排行榜，“冠军做片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大 差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大1 7 h 。 1 6 2 2 肽片断的部分测序 肽质量指纹谱对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。为进一步鉴定蛋白质，首 先以一种可控制的化学模式从n 末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数 目的肽质量由m a l d i - t o f - m s 测量。另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从c 末端除去不同数目 的氨基酸形成肽片段。化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸 ( 1 2 8 0 9 ) 和谷氨酞胺( 1 2 8 0 6 ) 。或者，在质谱仪内应用源后衰变( p o s t s o u r c ed e c a y ，p s d ) 和碰撞诱导 解离( c o l l i s i o n i n d u c e dd i s s o c i a t i o n ，c m ) 。目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列 肽峰的质谱，因此允许推断肽片段序列i ”j 。 1 6 2 3 肽序列标签 构成蛋白质的常见氨基酸有2 0 种，一段3 个氨基酸的肽段碎片将有80 0 0 种可能的排列方式， 4 个氨基酸将有1 6 00 0 0 种排列方式，即个特定的4 个氨基酸序列的出现概率为1 1 6 00 0 0 。因 此，即使对于一个相当大的蛋白质组来说，五、六个氨基酸残基的序列片段己具有很高的特异性。 串联质谱技术可直接测定肽段的氨基酸序列，从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质 谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列，用于数据 库查寻，称之为肽序列标签技术( p e p t i d es e q u e n c et a g , p s t ) f 7 9 ”】。 1 6 3 蛋白质微测序 蛋白质微测序是蛋白质分析鉴定中的一经典而普通的技术，可提供足够的信息，目前在蛋白 质组中蛋白质鉴定上仍有其广泛的用途。特别是双向凝胶电泳与p v d f 膜电印迹相结合，经过染 色、切割，可进行e d m a n 微量测序，e d m a n 方法一次只能测定一个蛋白点或肽峰，速度慢，不 宜进行复杂蛋白质组的高通量分析，但在简单蛋白质组和特定蛋白的鉴定上仍有其独到用处舯】。 1 6 4 氨基酸组成分析 氨基酸组成分析是利用不同蛋白质具有特定的氨基酸组份的特征来鉴定蛋白质。该法可用于 1 3 鉴囊2 - d e 努凑的蛋内藤，琏嬲放射耩记驰氮墓酸来测定蛋白质的氨蒺酸缀势，或将凝自痿转 p v d f 膜，程1 5 5 c 簸滢承辩，递氨基酸蠢动衙擞焉，缀馥谱势离，获褥鹃数据j 甏耦关牧释避褥 数据库查询。依据代畿两组分间数目差弊的分数对数据库中的蛋白质进行排榜，“冠军”畿白质的 可楼痉较失。瞧该法静速麓姣蠖，所罴蛩趣矮或获瓣量较夫，在超微爨黪轿啐l 受至l 限销；强存在疆 毪拳鳃不搦藏或部分酶瓣瓤产生氨基酸变努的缺点，教嫩联台其链的蛋囊蔟震性送褥鉴宠嘲。 凿l o2 - d e 羧土蛋自藕鉴跫流穗强 f i g u r e l - 3 t e e l m o l o g y o f i d e n t i 缸p r o t e i n s f r o m 2 - d e h 1 7 立题依据和立题思路 1 7 1 文献资料分析和立题依据 目前浓缩苹果汁的后混浊现象已经得到了有效的控制，国内采用酶解一超滤一树脂吸附相结合 的方法能较好的控制果汁的后混浊，但是并未得到彻底的解决，苹果浓缩汁的后混浊现象依然存 在。目前国内的研究结果主要是分析总酚含量和如何尽可能降低酚类物质含量，国外的研究围绕 苹果汁中蛋白质和多酚结合产生沉淀机理和影响因素进行分析，但对于苹果汁中的与混浊有关的 蛋白质从结构、分子量以及在整个加工中蛋白质的变化情况都缺乏全面系统的研究，本论文利用 蛋白质组学的理论和技术来研究苹果汁中蛋白质的性质，并研究其与后混浊的关系。 本课题是国家高技术研究发展计划( 8 6 3 ) “浓缩果汁质量控制技术研究( n o ：2 0 0 2 a a 2 4 5 0 9 1 ) ， 的一部分，主耍是研究苹果浓缩汁后混浊控制技术。 1 7 2 立题思路 1 7 2 1 研究目标 通过对苹果汁蛋白质的分离纯化及鉴定，研究蛋白质引起后混浊的机理。建立蛋白质单宁酸 和蛋白质多糖模拟体系，研究这些成分的浓度和比例对混浊的影响。 1 7 _ 2 2 研究内容 采用离子交换色谱，试用不同的缓冲液和p h 来确定苹果汁蛋白质的纯化条件，氨基酸组成 分析测所得蛋白的氨基酸组成，s d s - p a g e 和p m f 来鉴定此蛋白。b r a d f o r d 法和b c a 法分析果 汁中的蛋白质含量。建立模拟体系，依据果汁中的蛋白质、多酚、多糖的含量，系统研究蛋自质 和多酚以及多糖的聚合对果汁浊度的影响。 2 1 引言 第二章浓缩苹果汁中蛋白质的提纯 蛋白质和多酚是果汁中混浊沉淀产生的主要原因，它对果汁的感官和货架期造成了不利的影 响幽j 。b e v e r i d a g e 等( 1 9 9 3 ) 在研究苹果汁混浊的成分时，发现其中蛋白质占很大比例，约为 1 1 4 - 2 9 0 ，同时蛋白质与酚类物质形成的复合体也是产生混浊的原因之一1 1 4 】。v a nb u r e n 等用 考马斯亮蓝法测得传统苹果汁中的蛋白质含量为1 1 1 8 0 m g l t 6 1 。对能引起混浊的蛋白质的研究， 主要是集中在用吸附剂或澄清剂如膨润土、硅胶、明胶或氧化处理果汁后比较处理前后果汁的 稳定性，蛋白质含量和蛋白质电泳图谱t ”1 。苹果汁蛋白经电泳分析，分子量在2 1 - 3 1 k d a 的蛋白 质和混浊有关盼2 2 1 。 饮料中关于与后混浊有关的蛋白质的研究已做了大量的研究，通常是通过离心或硫酸铵沉淀 来收集蛋白质，然后进行化学分析、氨基酸分析、色谱分析或电泳。w a t e r s 等人用硫酸铵沉淀结 合超滤的方法分离出了葡萄酒中与混浊相关的不同分子量的蛋白质，氨基酸组成分析发现这些蛋 白都富含疏水性氨基酸【8 ”。b a y l y 和b e r g 用离子交换色谱分离出了葡萄酒中的蛋白质，并得到 四个单一组分i 叫。 当前生产中酶解工艺主要是应用于浊度的减轻，果汁的酶解主要是加入果胶酶和淀粉酶，生 产上的添加量均为2 5ul 几，反应温度4 5 c ，酶解2 h ，目的是为了分解果胶和淀粉，减轻果汁的 浊度，但酶的 j m , k ，也使果汁中的蛋白质含量增加，也有可能是造成后混浊的因素之一。同时液 化酶的加入使细胞壁的糖蛋白溶解到果汁中，形成混浊。根据山东烟台北方安德利果汁股份有限公 司的实际经验，酶的添加量超过5 0 ul 几时，就能明显地看到混浊的产生。 目前国内外对苹果汁蛋白质的研究很少，主要是因为苹果汁中蛋白质含量很少。本章实验为 了研究蛋