（食品科学专业论文）卷枝毛霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌和烟草中的表达.pdf

摘要 y 弧麻酸( g l a ；c t 8 ：3 a6 , 9 ，1 2 ) 是一种人体必需脂肪酸，是具有重要生理活性物质前列腺 素、花生四烯酸和白三烯的前体，在人体的激素调节以及脂肪酸代谢过程中有着重要的生理作用。 v 一亚麻酸资源稀少而又具有独特的生理功能，因此其合成过程中的关键酶6 - 脂肪酸脱氢酶成为 国内外学者研究的热点。 本课题在卷枝毛霉m ：，的6 脂肪酸脱氢酶基因于酵母中进行功能验证的基础上，探索建立该 基因在大肠杆菌及烟草等模式生物中的表达体系。旨在通过基因工程技术，构建原核表达载体进 而获得高产t 亚麻酸的大肠杆菌工程菌株；构建植物表达载体，探索利用植物基因工程改良油料 作物品质的可行性。 ( 1 ) a 6 - 脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中表达： 用限制性内切酶x h oi 单酶切原核表达载体p g e x - 4 t - 1 和中间载体p b k - c m v - d e s 6 x s ，分 别回收大载体片段和目的基因片段，将回收纯化的酶切产物在t 。d n a 连接酶的作用下进行连接， 从转化的大肠杆菌d h 5 a 中筛选含有目的基因并且正确插入的重组质粒p g e x 4 r 1 - 6 。将重组 质粒转化到原核表达宿主菌b l 2 1 中，在适宜的培养基及培养条件下进行蛋白诱导表达，6 脂 肪酸脱氢酶大小为5 2 ，4k d ，加上g s t 标签之后目的蛋白的大小为7 8 4l o 。经w e s t e r nb l o t 分析 鉴定，卷枝毛霉6 一脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中有微量表达，说明在原核系统中表达该基因 是可行的。 ( 2 ) a 6 脂肪酸脱氢酶基因在烟草中表达： 利用已经携带6 脂肪酸脱氢酶基因的组成型植物表达载体p c a m b i a l 3 0 1 + 1 2 1 + d e s 6 和 种子特异性植物表达载体p c a m b i a l 3 0 1 + 1 2 1 + s d e s 6 ，通过农杆菌介导法转化烟草三生烟。通 过对抗性烟草进行p c r 检测，获得2 1 株携带6 脂肪酸脱氢酶基因的阳性植株，其中1 7 株含种 子特异性启动子，4 株含组成型启动子。 后续试验主要对烟草种子的脂肪酸成分进行气相色谱分析，以期获得6 脂肪酸脱氢酶基因 在植物中表达的更多信息，为今后油料作物的转基因改造提供理论依据。 关键词：卷枝毛霉，6 脂肪酸脱氢酶，表达，大肠杆菌，烟草 a b s t r a c t g a m m a d i n o l e n i ca c i d ( g l a ；c 1 8 ：3a * 6 , 9 ，1 2 ) i sa ne s s e n t i a lf a t t ya c i df o rh u m a nb e i n g s i ti s p r e c u r s o ro f p r o s t a g l a n d i n ，a r a c h i d o n i ca c i da n dl e u k o t r i e n e sw h i c h h a v em a n y p h y s i o l o g i c a la c t i o n si n h o r m o n a lr e g u l a t i o na n df a t t ya c i dm e t a b o l i z ep a t h w a y t h o u g hg l ah a sm a n yu n i q u ef u n c t i o n s ，i t s r e s o u r c e sa r en o te n o u g h a sar e s u l t ，t h ek e ye n z y m eo fs y n t h e s i z i n gg l a ，a4 一f a t t ya c i dd e s a t l l r a s e b e c o m e st h ew o r l d w i d eh o ts p o to f r e s e a r c h 。 w eh a v ec l o n e dt h e 6 * f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ea n di d e n t i f i e di t sf u n c t i o ni ny e a s t ，m y r e s e a r c hi sf o c u s e do ne s t a b l i s h i n gt h ep r o k a r y o t ea n dp l a n te x p r e s s i o ns y s t e m w ec o n s t r u c tp r o k a r y o t e e x p r e s s i o nv e c t o rc a r r y i n g a 6 f a t t ya c i dd e s a t u l a s eg e n ef o ro b t a i n i n ge c o l ie n g i n e e r i n gs w a i nw h i c h c 鞠y i e l dh i 曲a m o u n to fg l a ；w h a t sm o r e ，w eu s ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sc a r r y i n g tf a t t ya c i d d e s a t u r a s eg e n et oe x a m i n et h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o no fg e n e t i cm o d i f i e dt e c h n i q u e si nt h eg e n e t i c i m p r o v e m e n to fo i lc r o p s ( 1 ) e x p r e s s i o no f f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ei ne s c h e r i c m ac o i l ： c o n s t r u c t i n gp r o k a r y o t ee x p r e s s i o nv e c t o rb yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i n gt h ev e c t o r p b k - c m v - d e s 6 x sa n de x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - 4 t - 1 ，t h e nu s et 4 - d n al i g a s et ol i g a t et h ep a r i f i e d d n ap r o d u c t ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw o u l db et r a n s f o m a e di n t op r o k a r y o t ee x p r e s s i o nh o s ts t r a i n b l 2 1 ，c u l t u r e d 蚺s u i t a b l ec o n d i t i o n 。t h e a f a t t ya c i dd e s a t u r a s ei s5 2 4k d ，越翻t h ei n t e r e s tp r o t e i n w i t hg s tt a gi sa b o u t7 6 4k d t h ew e s t e r nb l o te x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ei n t e r e s tp r o t e i nh a s e x p r e s s e di n 最c o l i , s oi t i sf e a s i b l et oe x p r e s sa 。一f a t t ya c i dd e s a a w a s ei np r o k a r y n t ee x p r e s s i o n s y s t e m 。 g ) e x p r e s s i o no f 厶f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ei nt o b a c c o ： t h ec o n s t i t u t i v ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sp c a m b i a l 3 0 1 + 1 2 1 + s d e s 6a n ds e e d - s p e c i f i cp l a n t e x p r e s s i o nv e c t o r sp c a v l b i a l 3 0 11 l1 2 1 + d e s 6c a r r i e dw i t h4 巴f a t t ya c i dd e s a t m a s eg a n ew e r e t r a n s f o r m e di n t ot o b a c c os a n s h e n g y a nb ya g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dw a r n f o r m a t i o nm e t h o d w e o b t a i n e d2 1p o s i t i v et o b a c c o sc a r r y i n ga 。f a t t ya c i dd e s a t u r a s eb yp c ra n a l y s i s ，i nw h i c ht h e r ea r e s e v e n t e e nt r a n s g e n i ct o b a c c o sw i t hs e e d - s p e c i f i cp r o m o t e ra n df o u rw i t hc o n s t i t u t i v ep r o m o t e r w ew i l la n a l y z et h el e v e lo f l i n o l e n i ca c i db yg cf o ro b t a i n i n gm o r ei n f o r m a t i o na b o u tt h el e v e l o f a 。f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ee x p r e s s e di np l a n t k e yw o r d s ：m u c o rc i r c i n e l l o i d e s ，a 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s e e x p r e s s i o n ，e s c h e r i c h i ac o l i ，t o b a c c o l i a c r a m p a d a s 6 - b a b i s b s a c a m v 3 5 s c a r b r 2 s o c t a b d m f d e p c e b e d 融 f f g l a g u s h y g i p t 0 m s n a a o d o r f p c r s d s t f i s t i l e i n e 缩略词表 a b b r e v i a t i o n a c r y l a m i d e a m p i e i l l i n a m m o n i u mp e r s u l f a t e a c e t o s 州n g o n e 6 - b c n z y l a m i n o p u r e n 。n - m e t h y l e n eb i s a e r y l a m i d e b e v i n es e r u ma l b u m i n c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5 sp r o m o t e r c a r b e n i c i l l i n c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u er 2 5 0 c 时】t r i n l e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d i m e t h y i f o r m a m i d e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c c t i ca c i d x y l e n ec y a n o ) ef f y - l i n o l e n i ca e i d b g l u c u r o n i d a s e h y g r o m y c i nb l s o p r o p y l - 1 3 - d - t h i o g a l a c t o s i d e m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m d - n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y o p e n i n gr e a d i n gf l a m e p o l y m e r a s ec h i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls d f m e h yd ：r o x y - m e t h y l - a m i n om e t h a n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l 抽e t h y l g l y e i n e v 丙烯酰胺 氨苄青霉素 避硫酸镶 乙酰丁香酮 6 * 苄基躲嘌呤 带义双蓠烯醚黢 牛血清白蛋白 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 羧苄青霍素 考马斯亮蓝r 2 5 0 溴代十六烷基三甲胺 二二甲基甲酰骚 焦碳酸二z 。醮 澳化乙键 己= 氨鞠乙酸 = 甲苯费 y 一亚麻酸 p 葡萄糖苷酸酶 潮霉素b 异丙基硫代b 。d - 半乳糖苷 m s 培养基 a 萘乙酸 光密度 开放阅读框 聚合酶链式反赢 十二烷熬磺酸钠 兰羟甲蒸氨基甲烷 三( 羟甲基) 甲基督氨酸 独创性声明 v 9 3 8 7 0 1 本人声明所呈交的论文怒我个人在导疖攒导下进行的研究工作及取褥的研究成 果。尽我羼知，除了文孛特鬟嬲以标注窝致谢豹地方舞，论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表承了谢意。 研究生签名 突若 帆泐占年6 月j 7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的笈印件和磁盘，允许论文被查阅和借阕，可以采用影印、缩印或翔接等复 制手段保存、汇缡学位论文。弼意中国农渡大学可以用不同方式在不露媒体上发表、 传播学位论文豹全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：莛叠戋时间：如。刍年月1 7 日 导 瀑签名： 留。 罗云i 良 对阕：耐年占月编 1 中国农业大学硕士论文 第一章文献综述 第一章文献综述 人们融常膳食摄入的植物油主要来源予一些油料作物种予中的储存油腊，如大豆、油菜、向 日葵和花生等经济油料作物。植物油中脂肪酸通常以三酰甘油醑形式存在，成分主饔是油酸、豫 演酸、a 豫勰酸、疆耱酸鞠橡糖酸，健对天体具蠢重要嚣券傈健作j ； 4 鲍p 援赓酸划较为稀有。 随着人们对g l a 认识和研究的深入。其应用范围越来越广泛，已经被作为高级营养油、食用添 加裁、营养补充辘、纯妆晶私治疗疾瘸熊药物等。 a6 一脂肪酸脱巍酶是催化p 亚麻黢生成的关键酶，本实验疲酿酒酵母中进行卷技毛霉a 脂 肪酸脱氢酶基因功能验证的基础上，建立了该基因在大肠杆菌及烟草等模式生物中的表达体系。 为探索构建糍产y 。薤麻酸的工穰萤抹提供实验依撂；围h 暹遗转往模式植物煽草，为采溺禧耱基 因工程技术对传统经济油料作物进行改良，从而获得高产十亚麻酸的转基因植物提供理论依据 ( q i ue t 吐2 0 0 2 c o o k 甜口t 2 0 0 2 ) 。 1 。1 a 6 脂肪酸脱氯酶的研究进展 檀物袖的脂脐酸成分申，y 一亚酶酸和兹生四燎酸( a m c h i d o n i c ，2 0 ：4 ，简称a r a ) 是对人 类具有营养保健功能的多不饱和脂肪酸，他们是合成前列腺素的前体。传统油料作物的种子中， ￥一鞭靡酸和花生箱烯酸豹前傣物质亚油酸含量逶常都非常丰富，毽是由于缺乏其会成煞关键酶 基因5 棚日肪酸脱氢酶基因，因此种予油中并不存在y 一豫麻酸和花生汹烯酸。假如能使a6 一脂肪 酸脱氢酶在油料作物中袭达，则可以将其种子中含餐丰富的j 诬油酸和n 一亚麻酸转变为y 一亚麻酸 和花擞靼燎酸。因此，利羯接物基因h ：r 程研究a6 胡s 肪酸脱氢酶在攮物中豹表达成为近年来的热 点。 1 1 1 a6 脂肪酸脱氯酶的分类 a 嘲日肪酸脱氮酶可以分为原核与真核两大类群： ( 1 ) 器核生掰瑶前只有蘸缨菌中报道了a6 。滕肪酸麟氧酶，它定位于震膜和类囊律膜上，其 有三个组氮酸保守区t 序列分别为h x b ) h h ，h k 2 埘3 # i h 和h ) ( f 2 m ，h h ，氨基酸n 端不 存在保守的类似c y t b s 的血效素结合区( h p g g ) ( s a y a n o v ae t 2 0 0 0 ) 。 ( 2 ) 真棱生物a6 一勰藤酸脱氢酶罄是微俸膜缤合酶，它的三个组氨酸保守醒，序列势剐是 h x ( 3 0 r 4 ) h h ，m 缸o r 3 一h 和q x o m ) l h ，氨基酸n 端具有保守的类似c y t b s 的m 红素结 合区( h p c k ) 。主簧存在予植物( 包括藻类和藻菡共生的蔷藓) 、丝状真菌和动物中 ( m u r a y a m ae t 以2 0 0 6 ) 。 1 1 2 at 脂肪骏脱氯酶的结构篡功能 强泊酸( l i n o l e i ca c i d ，1 8 ：2 ，简称l a ) 脱氢生成y 。亚璐骥是出a6 i 瘸肪酸脱氨酶催他的。 6 - 脂肪酸脱氢酶是一种整台膜蛋白，结合在细胞质膜如内质嘲膜、微粒体膜上( k e l l 嘶c k “。， l ：竺塞些茎竺垫兰，。i 耋耋! 苎竺i l l ，l , i目* e _ s _ g ! _ 女e g _ _ e g 目s ! _ ! _ s ! _ e s 日! _ 一 1 9 9 2 ) 。分析已知基因的氨基酸序列发现，此类酶具有特征性的三个保守的组氨酸富集篷 ( h i s t i d i n e r i c hr e g i o n ) 和两个疏水区( h y d r o p h o b i cd o m a i n ) 箕中疏水区跨膜舀次，两三个 组氨酸傈守区在细胞质一侧，憝维持酶活性所必须的。矗气脂膀酸脱氢酶拓扑结构模式圈见1 - 1 圈卜 鼹器膀酸镕氨靛拓扮缝掬模式圉 f i g , 1 - ! m o d e l o f p r o p o s e d t o p o l o g y o f t h e a 6 - f a t t y a c i d d e s a t u r a s e a t 脂肪酸脱氢酶是脂肪酸代谢过程中的关键酶，其催化活性具有位置特异性，它不仅可以 催化皿油酸、n 距麻酸脱氢生j $ 押亚麻酸，还可以催化棕榈酸( h e x a d e c a n o i ca c i d ，c 1 6 ：1 ) 和二 十二碳蕊烯酸( d o c o s a p e n t a e n o i ea c i d ，c 2 2 ：5 ) 脱氢，生成不饱和度更高的脂肪酸。 此外，a6 脂肪酸脱氯酶还拥有其他脱鬣酶活性。已经从斑马鱼( d a n i or e n o ) c d n a 中分离 到一个粪戗的片段，n 端c y t b 5 区薨有三个缀氨酸保守区，通j 童在簿母中进行功能表达发现，这 个基因鞲霹其有a5 、a 6 两种艟氢酶豹潘性( h a s t i n g s e t 改2 0 0 1 ) 。从罄藓中分离得到的a q 肪 酸脱氢酶具商a6 _ 炔他酶功能，能够识别a 含有双键的宸物，囱从羧基端开始的。位导入新的 双键和三键( s p e d i n ge ta , 2 0 0 0 ) 。 1 1 3 at 脂肪酸脱氢酶的分予生物学研究进麓 随着基因工程技术的不断发展，利用基因工程改造脂肪酸代谢途径是进行油料作物晶质改良 的蘸要的潜在手段之一。目前，国内外已分别将所克隆到的a 屯脂肪酸脱氢酶基因构建列合适的 表达载体上，转入油菜、大豆等含油种子作物或工程菌株中进行功能性表达，使得这些新型的油 料作物和基爵工程菌株有更高的盛；油率和翳的日女肪酸产率。 q * 肪酸麓氢酶是台成y 。亚麻酸的限遮酶，对其研究旱麓主要集中在动携体起动力学、食 物诱导、昼夜节结和激素刺激g l 起静交托主。翻终从9 0 年代初期开始对该基因进行炎隆和表达方 面躲霹究，捆继从蓝细菌( r e d d y e t 以1 9 9 3 ) 、高等植物玻璃葭( s a y a n o v a e t a , 1 9 9 7 ) 、鼠肝( a k i e t a t , 1 9 9 9 ) 、线虫( n a p i e r e 以1 9 9 8 ) 及真菌高山被孢霉( h u a r t g e t a t , 1 9 9 9 ) 等不同物种克隆得 到了该基因，在酿酒酵母和烟草中进行了表达。 最早利用c y t b 5 固定的亲和层析法，分离得到鼠肝脏中微体的a t 脂肪酸脱氯酶( o k a y a s u e t a l ，1 9 8 1 ) ，检测到的气脂脐酸脱氢酶大小为6 6 k d ，蛋白内鄢含4 9 的疏水性臻基。 2 0 世纪9 0 年代鼓后随着分予生物学的发展，关于g l a 生物途径中关键酶a t 脂肪酸脱氯酶 的磷究有了飞速豹发展，生产g l a 的研究遴入了分子生物学蹬段。曹次竟隧到瓣6 耀黪酸聪氢 2 中国农业大学硪士论文 第一章文献综述 酶基因是从一株产g l a 的髓细菌( s y n e c h o c y s d ss p ) 中得到的，并且在a6 一脂肪酸脱氢酶缺陷的 蓝细蓠“月。b a e n as p ) 中樗到了成功的表达，实验结果表明，p 亚麻酸等多不饱和脂肪酸存显蔫 积累，这极大的推动了at 嚣黪酸髓氨酶在透俦学水平上的研究0 t e d d ye ta l l 9 9 3 ) 。 1 9 9 9 年s a y a n o v a 等人从植物玻璃苣( b o r a g eo f f i c i n a l i s ) 中克隆得到了a6 - 脂肪酸脱氢酶 基因，并将其在簿母和烟草中表达，使烟草叶组织脂质中y 一豫麻酸大量积累，达到总脂肪酸含避 的3 2 ，验证了这个来自棱物静基因的部分功能。 2 0 0 0 年，s p e r l i n g 等人从苔藓( c e r a t o d o n p u r p u r e u s ) 中克隆了具有双重功能的。一脂肪酸 脱氢酶炔佬酶，它不仅可以在亚油酸c 搪! 上脱氢形成亚麻酸，还可默在该位置上继续脱氢形成 三键。 2 0 0 2 年，c o o k 等将玻璃苣的a6 月目肪酸脱氢酶基因转化马铃薯，获碍较高表达。同年，h o n g 等人从真菌畸雌摩霉( p y t h i u m i r r e g u l a r e ) e d n a 文瘁中克隆褥到编码a 吒脂肪酸脱氧酶盼基因， 与油菜种子贮藏鬣自n a p i n 种子特异性唐动子连接转化油菜，转基因油菜的种子中y - 亚麻酸含鼙 占总脂肪的4 0 ，为获得廿弧麻酸提供了新资源。 禽内近年来也对6 一脂肪酸脱氢酶的克隆、功能研究以及在其他生物中躲表达进行了研究， 2 0 0 0 年，刘莉等人将深黄被孢霉的巳脂肪酸脱氯酶基因在酿酒酵母中进行表达，产生的y 亚麻 酸含量占酵母总脂肪酸的8 6 9 ，2 0 0 3 年。他们将该基因在转基因烟草中进行表达，y 亚麻酸和 十八缓西烯酸含量分别占总麟肪酸含量躲1 9 。7 和3 5 。 此外，2 0 0 4 年，h 云萍等人利用农秆菌介导法将高山被孢霉t 脂肪馥脱氢酶撼羽导入大甄 中，缝气相色谱分析，转基因大豆的脂肪酸成分发生改变，产生的y 亚麻酸最高含量可达2 5 6 。 2 0 0 6 年，王德缓等胰雅致技霉中克隆褥到了t 月旨骆酸聪氢酶基因，在酿酒酵母中避移表达，* 亚麻酸的含量占酵母总脂脐酸含量的7 5 。通过这些研究，验证了丝状真菌中6 脂肪酸脱氢酶 在异源生物中表蛊的可能性，推动了a 。脂肪酸脱氯酶在基因育种上的廊用。 1 1 4 a6 旨肪酸税氢酶的应用展望 a 6 胡肪酸脱氯酶的代谢产物y 弧麻敬和花生四烯酸其舂营养保健功艇，但是从棱物来源褥 到的往往质量不稳定、产量不高，不蘸满足需求鬣及用于生物药品所需缝度，其精练过程也大大 增加了成本。随着分子生物举的发展，可以通过对a6 一脂肪酸脱氢酶基因的遗传改造来控制生物 体中廿亚麻酸和旄生四烯酸的合成，主要有以下两种途径： ( 1 ) 应用蓉闲= 程的方法获得离产的菌株 开发利用微生物的独特的生物含成能力，构建高产g l a 的基因工程菌株。方法主要是：通 过竟陵增船陵遮酶基因的拷爨数来璞强罄因表达自力；通过定点突变技术改变酶静特健，幢冀蹙 有新的碳链长廉和双键引入位置特异性；通过在新受体中表达外源基因来定向产生新的油脂产 品。 ( 2 ) 应用德猕鏊因工程避行漓辩侉物静晶瘊敬照 可以利用生长周期短，易于栽培的油料作物作为g l a 的来源之一。利用植物熬因工程进行 油料作物品质改良有以下几方面优势；油料作物产油量高，商业化农艺生产方式和油的回收处理 技术蠢经相当成熟；溜辩作物可作为潜在的大量生产多不魄和女虢酸p u f a 的廉价和稳定的来源； 中国农业大学硕士论文 第一章文献综述 表达p u f a 的植物，可以捉高植物的耐寒性，从而扩大油料作物栽培区；此外，植物中的p u f a 与鱼油相比具有更大的氧化稳定性( 黄锐之等，2 0 0 1 ) 。 随蔫g l a 生物合戒途径中关键的6 - 嚣肪酸腔氢酶基因的宽隧表达及转基因技术豹深入发 展，构建懿簸静a6 一箱肪酸脱氧酶基因工稳菌株、获褥具有耐寒链和品质优良的植物油魑转基嗣 作物都将为脂肪酸调控基因工程带来巨大的契机。 1 2v 一照麻酸的研究进展 甄繇酸是h e i d u s c h k a 予1 9 1 9 年扶暂时菜辩植物月见摹中发现豹( 吴广耗等，1 9 9 4 ) e 其 分子式为c 1 8 h 3 0 0 2 ，化学名称为：顺式6 ，9 ，1 2 ，十八碳三烯酸，呈非共辘立体构堑a g l a 的结构式如图i - 2 所示： 圄1 - 2y 亚凑酸结辛每式 f i g 1 - 2 t h es t r u c t u r eo fy t i n o l e n i ea c i d 1 2 1 y - 皿麻酸的生理功能 p 亚麻酸是以亚油黢为底按，在a 屯目i 舫酸艟氢酶的作翔下脱氛形成的，在营券学方垂它棱 誉为“2 l 墩纪功髓性食品的主角”，其潜在的保健及药用侨馕受铷国内， 营养及捺臻学界的重视。 ( 1 ) 降胍脂、抗动脉粥样硬化作用 g l a 具有明显的调节衄脂功能，它可以降低血浆甘油三醢、胆嗣醇、o 一脂蛋白的浓度，其活 性是羝酒酸豹1 6 0 多倍。捧为裁列腺素p g e l 髓前体，g l a 可以抑潮盘小扳的聚嶷，维持血小板 静生理功能( o u i v e r n a u e t 砖1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) 治_ i 宁离血压作用 g l a 谯肾脏中可以被转化成d g l a 相从，进一步生成赢塍调节物p g e 2 ，激活血管平滑肌 繇苷酸环纯酶，增加缨胞熬c a m p 承平面箭张斑管，逶过调繁觐律永帮电解质代滚，增抽鹭盘流 量或与冀宅血管活性物质相鬣律用等方式采参与血压调节。 ( 3 ) 抗肿瘤作用 现有的研究结果显示，体外培养g l a 对多种肿瘤细胞有明显的抑制作用( m u n o ze ta , 1 9 9 9 ) 。 ( 4 ) 改簧糖尿病并发癜 由g l a 组成的磷腊可以增强细胞膜上磷脂的流动性，增强了囊田胞膜受体对胰岛索的敏感性， 4 中国农鼗大学磋上论文 菇一章文献综述 而由g l a 生成的前列腺素可以增强腺苷酸环化酶的活性，提商胰岛p 细胞胰岛索的分泌，从而 减轻了糖尿病的病情( b u m a r de la , 1 9 9 8 ) 。 5 ) 减聪体用 最新研究表明( t a k a h a s h ie t a t , 2 0 0 0 ) ，g l a 能够增加棕色脂肪解联蛋白一l 基因盼表达， 通过增加棕色脂肪的解聚，选至u 对肥胖的治疗。 此外，还发现g l a 可以用于治疗精神分裂症、普通鳞癣病、更年期综合征、亭廷顿氏舞蹈 症、苯砸黼艨症、帕金森炙癌、哮喘、湿疹、甲狄旁腺亢进等多静病症，其有不瓣程度的治疗效 果，预示饕g l a 具有广阑鹃应角前景。 1 2 2y 弧麻酸的生物资源 y 亚瘀酸属于多不饱和# 镕肪酸，其熔点低予谗帮脂肪酸，由予生物静长耀进化，它通常分布 在高寒魄带的植物殴及永生生物中( 尹卓容替，1 9 9 6 ) 。经过大蘩躲霹究发现，y * 强麻酸斡生物 资源主臻密植物资源和微生物资源两部分； ( 1 ) 植物资源 p 亚麻簸主要分布于柳时菜辩紫草科、玄参科、虎耳草辩等菇等捶豹中( j a m e s 材砖1 9 9 5 ) 。 g l a 会鬣较高的继物有：月撼草、聚合草、爨柏仑、华出松秘子、皴i l 莩、瑶藏徽i l 草帮玻璃 苣。 ( 2 ) 微生物资源 主鬟是摆微球藻和真热。徽球藻是海洋中多不魄和精舫黢静骧始生产者，日本豹 o n a c l s c c m c n t 公司生物研究所和东京农业技术大学生物工程蓉联合对薪鲜海农中静兰丝藻和小 球藻进行光照培养获得y 弧麻酸，其含量分别为总脂肪酸含鬣的2 6 2 5 和1 0 。人们也已经发 现了一系列用于工业发酵生产y 亚麻酸的蔺类包括被孢霉属、根霉属、小克银汉霉属等( 魏明 等，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 3 y 亚瘗酸的钱瀣途径 在脂肪酸代谢途径中，由于at 脂肪酸脱氯酶催化的亚油酸至y 亚麻酸的脱氢反应是限速反 应，大多数组织内y 豫麻酸的禽量都很低，正常情况下，其占磷脂脂肪酸小于0 2 ，占甘油脂肪 酸小予0 + l 冁，占嗣醇疆船黻露分比小于2 ，瓣。 y 一甄癣酸的代落途径( h o r t o b i ne t a l 。1 9 9 2 ) 如图1 3 ： 中豳表北大学硕士论文 第一章文献综述 ! _ g 自_ s ! ! e ! _ e g 目_ e 目i i i ! ! ! ! _ s 自_ _ 圉1 _ 3 十亚麻酸台成逡径 f i g1 - 3 醅e 协b 啦i ep 鼬yo f c - l l n o l e n i e i d l 。3 基因工程表达体系的研究进展 基霹工程的最终目的是在一个合适魏系统中，使多 源鏊因褥至l 离效表达，献弼产生有重要价 值的蛋臼质产晶。这个过程包括外源基因的克隆、转录、转译、加工和分离纯化。基因工程的表 达系统分为原核表达系统和真核表达系统两大类( 卢圣栋，现代分子生物学实验投术) 。 原核表这系统相对籍单、效率越、易操作、周期短，嶷核蛋自在簸核宿主细胞太肠扦菌中的 表达不仅行之有效，而且成本低廉。但许多在细菌中合成的囊核蛋白或因辑叠的方式不正确，或 因折叠效率低下，比活性往往会很低。 菜些外滚基因表这的蛋自要有生物活性，往往需蘩迸行翻译括加工，铡如二硫键的正确彩成， 蛋白的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或通过特异蛋白酶避彳亍裂解等。毒鉴予此，又发震了多释 6 中国农业大学硕士论文 蒴一章文献综述 i l l l q l i i i ! l m ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 目! 曼 粪核表这系统，如簿母、哺嚣动物细胞、琵虫细胞及转基鞴动植物等。 1 3 i 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌的遗传学和生理学特性研究的比较透彻，是目前最常用的表达宿主。在原核细胞中 袭达拜源基鞲g 毒，由于实验设计的不同，总的来说可产生融合型和菲融合麴表达蛋白。不与细菌 的任何蛋白或多肽融台巍一起鳃表达蛋自称为落融合强自，非融合蛋黩的优点在予它曩有j # 常近 似于真核生物体内骚自质的结构，因此，表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然媛自 质，菲融合蛋自的最大缺点是容易被细菌鬣白酶破坏。融合强白摄指蛋白质的n 术端有原核d n a 序列或其它d n a 序列编码，e 璇由真核d n a 黪完熬序列缡码。窘原孩多肢的融合蛋交是避免缨 菌蛋白酶破坏的最好措施，而禽另一些多肽的融合蛋白则为表达产物的分寒纯化等提供了极大的 方便。 基爨工程中裔克隆载钵和表达载体乏分。表这载体怒适合在受侮细藏中表选井瓣基因鹩载 体。下掰介绍三种类型用于基因表达的原核载体。 1 3 。1 1 非融合蛋白表达 非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融在一起的袭达蛋自。其优点是它具有类似真 棱生物体内蛋白成的结构，产生的袭达产物生物学功能更接近于生物体内天然蛋白。不利的地方 楚容易被细菌蛋自污染。 大分子鬣和中分子量的蛋白常以此形式表达，表达产物裳会以包涵体形式出现。当包涵体出 现后，瓶常表达的蛋白不其生物活性，因而必须经过溶解复性才能得到有活性的天然产物。常用 鼬表达载体膏p k k 2 2 3 - 3 ，p b v 2 2 0 蒋。 比较有特点的袭达载体p k k 2 2 3 - 3 载体是由b m s i u s 等在哈佛大学的g i l b e r t 实验室鳃建鲍。在 大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平地表达外源基因。它具有1 个强的t a c ( t r p 1 a c ) 启动子。 这个启动子楚由姊的1 3 5 区和l a c u v - 5 寤动予静一l o 区域，操级基因和s d 序列组成。在l a d 宿 主，例如j m l 0 5 ，t a c 启动子受阻遏，但只要在适当的对臻，加上i p t g ，戴可去嫩遏，紧接t a c 启动子的是1 个墩自p u c 8 的弗克隆位点，使之得容易把目的基因定位在扁动子和s d 序列箭： 在多克隧位患下游的1 段d n a 顺序中，还包裔1 个很强的r m b 核糖体r n a 的转录终止子，目 的是为了稳定载钵系统的，载体其容部分燕由邸r 3 3 2 组戏戆。 1 3 ，1 。2 分泌潺白袭达 在分泌型蛋白袭达载体上，关键的编码信号肽的序列取自大酝杼菌中分泌蛋自的基因：q 鼢a ( 外膜鬣自基因) 、p h o a ( 碱性磷酸脂酶) 、p h o s ( 磷酸盐结合蛋白s ) ，这样产生的蛋臼具 有跨膜的信号肽，雨鞋鞭细胞揆上信号虢谈剐蛋自结合，被分泌至糟h 胞周质问和细胞蚪。这样， 分泌后的蛋自不舍甲硫氮酸；_ i 鼍质及胞鲍的蛋自酶含嚣明显低予匏内，表迭的蛋蠢不暴被降解： 胞周质间和胞外的氧化环境易形成= 硫键，从而形成有活性的可溶蛋自而非包涵体；蛋白纯化更 为有乖j ；蛋自转移刘胞外减轻宿主负担，n 希j 于宿主的生长。 其中p i n t i i 系统是以p b r 3 2 2 为基础秘建驰，它带有大殛抒麓孛最强的寤动予之一，即娜 ( 脂蛋白基因) 启动子t 在启动子的下游装有l a e u v - 5 的崩动予及其操纵基因，并且抱l a c 腿遏 7 申霸农业太学硕士论文第一章文献综述 予的基因( 1 a c1 ) 也克隧在这个质粒上，这样，目的蘑因的表运就成为可调节的了。在转泵控钢 爝序的下游再装上八二 合成的赢效翻译起始j 螟序( s d 序列及a t g ) 。作为分泌克隆袭这载体中 关键的编码信号肽的顺序，是取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因：o m p a ( 外膜蛋白基因) 。在 信号歇编码颓序下游綮接着的是l 段人工台成的多克隆位点片段，为了使不同密码子阅读框絮的 髫的基因片段都在克隆位点上靼信号膝密码予阕读挺豢正确衔接，分g 台成适胡子所有3 种密 码子阅读框架的多克隆能点片段。使用这三种多克隆位点片段的载体分别称之为：p i n o m p a l ， p i n o m - p a 2 和p i n o m p a 3 。 1 3 。1 3 融合蠢白表达 融合蛋自是指爱白质的n 末端由原核d n a 序列或者蕊他d n a 侉列编码，c 端由真核d n a 的完整序列编码，褥裂的蛋自由一条短齄原核多煞或具有其镳功能的多敖和真核蛋囟质结合蔼 成。通过表达融合鬣白这种方式，可以增加外源蛋白稳定性，通常表达的产物是以小分子肽的方 式存在；而莱些单独表达时呈现包涵体形式的缀自，在融台蛋白表达时大部分蛋白会珏可溶的形 式积累，保持了叠昭蛋囱豹天然活惶。此终融会蛋爨静突激统点是可以遂避识剿融合蛋囱黪配体 进行亲和层析，纯化相对容易。一些公司提供了高效的融仑蛋白的表遮载体系统，比如： ( 1 ) 组氨酸( h i s ) 融合系统 组氰酸融合表达系统通常是将6 个组氨酸的核营酸置于待表达基因的n 端，袋者c 端，或 者插入到信号肽及发达的基因之间，表达产物一般有6 个融合妁h i s 作为标签，可以逶过n 离 予螯合楗( n i 柱) 进行快速亲和纯化。常用的有p e t 系列表达载体等。 ( 2 ) 谷胱营款娼一巯基转移酶( g l u t a t h i o n e s t r a n s f e r a s e ，g s t ) 系统 g s t 是昝赋营肽s 臻基转移酶基因，外澡基因秘g s t 基因融台，其间插入蛋白酶切蹙点， 产生的融合蛋白可以用档胱苷肽a g a r o s e 亲和纯化，之后用凝血酶直接切除g s t 从而获得目的蛋 白。亦有一垫载体跌葡萄球菌a 蛋白的z 功能区二聚体蛋白作配体的融合蛋白，可以通过1 2 g 亲鹅拄进行一次性纯化等。常用鲍栽体寿p g e x 系列载体等。毽大多数g s t 融合摄自不够稳定， 易隧蛋白水解酶的降解；有的产物为不溶性蛋白，减j 衄酶的切割效率不高。 p g e x 系统是p h a r m a c i a 公司的融合嚣自表达载体系统。这个系统有3 种载体p g e x 1 t ， p g e x - 2 t 帮p g e x - 3 x 和1 静耀于缒他表达蛋魏的亲翱屡柝奔囊g l u t a t h i o n es e p h a r o s e 4 b 。载体 的组成成分基本上与其它表达裁体相似，禽有感动子( t a e ) 及l a c 操纵基因，s d 序列、l a cl 阻 遏蚤白基因等。这类载体与其它表达载体不同之外是s d 序列下游就是谷胱苷肽疏基转移酶基因， 嚣亮隆的外灞莲函剃与谷魏营黢巯鏊转移翡基离相连。当避行基鞠表达时，表达产物为谷胱替脓 疏基转移酶和目的基因产物的融合体。这个载体系统具有如下优点： ( 1 ) 可诱导高效表达； ( 2 ) 载镩内含有l a ci 阻遁蛋自基因； ( 3 ) 表达的融念蛋尚质纯他方便； ( 4 ) 使用凝血酶( t h r o m b i n ) 和x a 因子( f a c t o r x a ) 就可从表达的融合蹑白中切下所需要的 蛋白质和多菔； ( 5 ) 用e c o rl 从x g t l l 载俸中分离的基因可壹接插入p g e x - i x t 审， 此外，还肖双标签表达蛋白，载体上同时有g s t 秘h i s 标签，更便于检测和纯化。 8 串国农螗大学1 餮士论文 第一章文献综述 !i，i，一 i i i 本实验采用g s t 系统进行t 肪馥脱氢酶的琢核表这。 1 3 2 酿酒酵母和华券酵母表谜系统 1 3 2 1 酵母表达系统 目前，高等微生物已经成为生产动物瑕白的常规方法。但由于动物基因的启动子和其他一些 表达信号在低等的真核生穆中并不能狠好钓、寓效的表达，西戥需要一些真核表达系镜。其中酿 酒酵母是迄今了躺摄全砥的真拨生物，是第一个用于袭达外源基因的真核表达系统。其中，慰脂 肪酸脱氯酶进行的功能研究中，皆用酿酒酵母作为宿主( m i c h i n a k ae t 以2 0 03 ) 。这主要由于该 系统在实验系统研究方面存在许多优势： ( 1 ) 酵母是真棱生物，毒性 b 细莹小，它可以使菜些蛋白痿糖基纯面更加稳定； ( 2 ) 酵母是一种单细胞生物能在简啦的培养基上生长，能够通过改变其物理或化学环境完全 控制其生长。鞠酵母i n v s c i 就是u r a 3 突变的结果为尿嘧啶缺硝型，可作为选择标识， 方馁筛选转化予； ( 3 ) 酵母是在医药和食品1 ：业中安全的一种生物体，在酿溉酵母袭达体系中离效表达的蛋白 更易为入们所接受。 1 3 2 2 巴新得华赤酵母表达系统 巴斯得率赤酵母表达系统是上世纪8 0 年代初期麓展起来的种新型的外源蛋白表达系统， 它既具窍原核表达系统操作爨易、易于堆棼、生长速度快、表达篮离、成本低等伉点，还具有