（食品科学专业论文）红曲霉产色素培养条件及其抑菌活性物质的研究.pdf

摘要 摘要 红曲霉是种丝状腐生真菌，在我国的利用己具有悠久的历史，早期主要用于红曲 米的生产。近些年来，人们发现红曲霉可产生降胆固醇、降血脂等生物活性物质，因此 再次受到人们的广泛关注，众多专家学者利用现代生物技术对其代谢产物进行了研究， 尝试开发多种新型保健食品和治疗药物，但是自从法国学者b l a n c 发现红曲中的抑菌活 性物质可能是桔霉素后，红曲保健品的研究以及我国红曲的出口都受到很大的影响。 本论文分离出一支红曲霉0 3 0 1 ( 暂定名) ，并初步确定其为红色红曲霉。通过实验 确定其最佳培养基组成为葡萄糖，5 0 9 l ；谷氨酸钠，5 e , l , z n s 0 4 7 1 - 1 2 0 ，o 5 9 几；m g s 0 4 ， 1 0 9 l ；k 2 h p 0 4 ，5 9 l ；k h 2 p 0 4 ，5 9 l , m n s 0 4 h ：o ，0 3 9 l ；水，1 0 0 0 m l 。培养条件 优化为：培养温度3 2 4 - 1 ，培养基起始p h 为6 0 ，培养时间为8 天。经工艺条件优化， 红曲霉红色素总色价达到9 9 1 2 u m l ，比初始条件提高1 2 3 ，黄色素总色价达到 9 7 0 2 i7 m i ，比初始条件提高1 6 5 。 用红曲霉0 3 0 1 、5 0 3 7 所产色素与桔霉素作抑菌实验，发现红曲色素对革兰氏阳性 菌具有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无抑制作用，且抑菌强度与色 素浓度成正相关性；桔霉素对细菌具有较强的抑制作用，对酵母菌抑制作用较弱，对霉 菌无抑制作用，抑菌性强弱与桔霉素浓度成正相关性。 薄板层析和h p l c 检测红曲霉0 3 0 1 所产色素中桔霉素含量均低于最小检出量，经 数据分析，所获得的红曲色素中桔霉素含量低于o 5 r , g g ，符合红曲色素产品中对桔霉素 含量的有关规定。对其色素成分进行分离并作抑菌实验，发现红曲色素中的抑菌物质存 在于橙色素提取液中，可能与橙色素有关。 红曲霉0 3 0 1 所产色素具有安全性高，色价相对较高并具有一定抑菌作用 的特点，可进一步研究开发成为既能抑菌又有着色功能的红曲防腐产品。 关键词：红曲霉，培养条件，红曲色素，桔霉素，检测方法，抑菌物质 a b s tr a c t t h em o n a s c u si saf i l a c e o u sh u m i ce p i p h y t e ，a n dt h ea p p l i c a t i o no fi th a sa l o n gh i s t o r yi nc h i n a t h em o n a s c u si sw i n d l yu s e di nt h em o n a s c u sr i s e i nt h e s e y e a r s ，b e c a u s em o n a s c u sc a np r o d u c ts u b s t a n c e o fd e b a s i n gc h o l e s t e r i na n d d e b a s i n gb l o o df a t ，m o n a s c u sb e g a nt ob ea b r o a da r r e s t e da t t e n t i o n ，a n du t i l i z i n g m o d e r nb i o s c i e n c e t e c h n o l o g y ，al o to fe x p e r t sa n d s c h o l a r sr e s e a r c h e di t s m e t a b o l i z a b l ep r o d u c t i o na n da t t e m p t e de m p o l d e r i n gm a n i f o l dn e w - s t y l eh e a l t h c a r ef o o d s t u f fa n dc u r i n gm e d i c a t i o n b u tg a l l os c h o l a rb l a n cd i s c o v e r e dt h a t a n t i b i o t i cs u b s t a n c eo fm o n a s e u sp o s s i b l yi s c i t r i n i n ，r e s e a r c ho fm o n a s c u sh e a l t h c a r ef o o d s t u f fa n dc h i n e s em o n a s c b se x p o r tw a sa f f e c t e dt oag r e a te x t e n t i nt h i sp a p e r ，am o n a s c u s ( t e m p o r a r yn a m i n g0 301 ) w a ss e p a r a t e da n dw a s i d e n t i f i e da sm o n a s c u sr u b e r v a r at i e g h e me l e m e n t a r y a no p t i m u mm e d i u mw a s o b t a i n e d t h r o u g ht e s t s w eg o tt h eo p t i m u mm e d i u m ：g l u c o s e ，5 0 9 l ；m o n o s o d i u m g l u t a m a t e ，5 9 l ；z n s 0 4 7 1 - 1 2 0 ，0 5 b l ；m g s 0 4 ，1 0 9 l ；k 2 i - - 1 9 0 4 ，5 9 l ；k h 2 p 0 4 ，5 9 l , m n s 0 4 h 2 0 ， o 3 9 l ；w a t e r , 1 0 0 0 m l t h ec u l t u r ec o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h ec u l t u r et e m p e r a t u r ew a s 3 2 4 - 1 a n dt h ec u l t u r em e d i u mi n i t i a lp hw a s6 0 ，t h ec u l t u r et i m ew a s8d a y s t h r o u g h o p t i m i z i n gt e c h n i c sc o n d i t i o n ，m o n a s c u sr e dp i g m e n tc o l o rv a l u ew a s9 9 1 2 u m la n d m o n a s e u sy e l l o wp i g m e n tc o l o rv a l u ew a s9 7 0 2 u m l i t sw e s eh e i g h t e n e d1 2 3 a n d 1 6 5 t h a ni n i t i a t o 巧c o n d i t i o n s t h ep i g m e n t so f m o n a s c u s0 3 0 1a n dm o n a s c u s5 0 3 7a n dc i t r i n i nw e r eu s e dt o a n t i b i o t i c e x p e r i m e n t s w e f o u n dt h a tm o n a s c u s p i g m e n t s i n h i b i t e d b a c i l l u s s u b t i l i s ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n dh a d n oe f f e c to ne c o l i ，y e a s t sa n dm y c e t e s a n d a n t i b i o t i ce f f e c tw a si np r o p o r t i o nt op i g m e n t sc o n c e n t r a t i o n w ea l s of o u n dt h a t c i t r i n i nh a ds t r o n g e ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s tb a c i l l u ss u b t i l i s ，s t a p h y l o c o c c u s a u r e u sa n de c o l i ，h a dw e a k e ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t y a g a i n s ty e a s t s ，h a d n o a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s tm y c e t e s a n da n t i b i o t i ce f f e c tw a si np r o p o r t i o nt o c i t r i n i nc o n c e n t r a t i o n t l ca n dh p l cm e n s u r a t e dp i g m e n t so fm o n a s c u s0 3 0 1 r e s u l tw a st h a t c i t r i n i nc o n t e n tw a sa l ll e s st h a nt h el e a s tm e n s u r a t i n gr e s u l t t h r o u g ha n a l y z i n g ， c i t r i n i nc o n t e n to fm o n a s c u sp i g m e n t sw o u l db el e s st h a n0 5 i ，t g g ，a n dw o u l da c c o r d w i t hp r o v i s i o n so fm o n a s c u sp i g m e n t sp r o d u c t i o no ne i t r i n i nc o n t e n t t h ep i g m e n t c o m p o n e n t sw e r es e p a r a t e da n dw e r eu s e dt oa n t i b i o t i ce x p e r i m e n t sa n dw ef o u n dt h a t a n t i b i o t i cs u b s t a n c eo f m o n a s c u sp i g m e n tc o n s i s t e di nd i s t i l ll i q u i do fo r a n g ep i g m e n t a n dw a sl i k e l yt or e l a t ew i t ho r a n g ep i g m e n t t h ep i g m e n t so fm o n a s c u s0 301h a dl o w e rc i t r i n i nc o n t e n t ，c o l o rv a l u ew a s u p p e ra n d h a dac e r t a i ne x t e n ta n t i b i o t i cf u n c t i o n s oi tw a sa b l et oe m p o l d e ra na n t i b i o t i c a n dp a i n t e dm o n a s c u sa n t i s e p t i cp r o d u c t i o n k e y w o r d ：m o n a s o u s c ui t u r ec o n di tio n s ，i g o r l a s c u spig m e n t 。citrinin ， m e n s u r a tin gm e t h o d s 。a n tibio tics u b s t a n c e i 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：红些耋芒鱼塞蛰差釜住题墓地苴活性塑厦的婴究 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 炙) ，保密期至 如易年争月日为止。 学生签名：塑罡宣导师签名： 主! 二l 童 钞咕年争月，f 日 第一章文献综述 1 1 红曲概述 第一章文献综述 红曲古代称丹曲，是以红曲霉为主的一种独特的酒曲，它具有耐酸、耐高温的特性， 在工艺制造上也有独到之处，所以，本草纲目里评论它说：“此乃人窥造化之巧者也 和“盖奇药也 。所以，红曲的闻世，是我国制曲技术的重大成就，开创了世界上用微 生物发酵方法制造食用色素的新纪元，给我国和世界食品微生物发酵史写下了光辉的一 页。 在我国，红曲的生产主要分布在福建、浙江、台湾等省，其中以福建的古田红曲最 为著名。红瞌不仅被用于酿造黄酒，而且在腐乳、食醋、食用色素、中药等制造方面也 有广泛应用。近几年来，由于化学合成色素对人类的致癌作用引起了人们对微生物色素 开发的兴趣，特别是在红曲色素的研究与开发方面。如上海市工业微生物研究所、宁夏 轻工设计研究所、四川食品工业研究所、北京食品研究所、福建粮油科研所等，他们在 红曲色素的生产与应用研究方面都取得了成绩和经验。但红曲色素的耐光、耐热性较差， 容易退色成淡黄色，成本较高，这些方面还有待进一步深入研究。在医药方面，沈阳市 副食品厂用淀粉渣代替大米原料，用红曲霉制成红曲应用于酿酒，并从酒醅中提取粗制 红曲霉素，治疗慢性肠炎、痢疾等有特效；在白酒生产方面，在红曲酯化菌、强化大曲 等方面有新发现；在保健食品方面，已开发出了红曲醋以及醋饮料、红曲健身酒、红曲 清酒、红曲补酒等，向红曲保健食品系列化方向发剧。 1 2 红曲霉属的特征和主要种【1 捌 1 2 1 红曲霉属的特征 ( 1 ) 细胞结构 红曲霉菌丝有横隔，多核，分枝甚繁且无规律。细胞幼时含有颗粒，老后含有空泡 及油滴。在菌丝体中常出现联结现象，即两条菌丝接触在一处时，由一细胞生出突起， 与另一细胞接触处细胞壁消失，将二者互相沟通。 第一章文献综述 ( 2 ) 无性繁殖 红曲霉无性繁殖时，由菌丝生出分生孢子梗，在其顶部产生分生孢子，单生或以向 基式生出2 6 个成链。分生孢子大多为梨形，多核，萌发后又形成菌丝。 ( 3 ) 有性繁殖 红曲霉有性繁殖时在菌丝顶端或侧枝顶端首先形成一个单细胞多核的雄器，随后在 雄器下面的细胞处以单轴方式又生出个细胞，这个细胞就是原始的雌器，即产囊器的 前身。由于雌性器官的生长和发育，将雄器向下推压，使雄器与柄把呈一定角度。这时 雌性器官在顶部又生出一隔膜，分成两细胞，顶端的细胞为受精丝，另一细胞即产囊器。 当受精丝尖端与雄器接触后，接触点的细胞壁解体产生- d , 孔。雄器内的核和细胞质经 受精丝进入产囊器。此时只进行质配，而细胞核则成对排列，并不结合。在此同时，在 两性器管下面的细胞生出许多菌丝将其包围，形成初期的被子器。被子器内产囊器膨大， 并长出许多产囊丝，每个产囊丝形成许多双核细胞，核配于此时发生，经过核配的细胞 即为子囊母细胞。每个子囊细胞中的核经过三次分裂形成八个子囊孢子，这时被子器 已发育成熟，其中子囊消解，子囊孢子成堆地留在被子器内，好似其中只有一个子囊。被 子器外壳破裂后，散出子囊孢子，子囊孢子萌发后形成多核菌丝。 ( 4 ) 培养特征 培养红曲霉多用麦芽汁琼脂培养基。红曲霉在上述培养基上生长良好，菌丝初为白 色，老熟后变为淡红色、紫红色、赭红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。菌落的结构 有呈绒毡状者，有呈皮膜状者，呈皮膜状的菌落少褶皱或有辐射纹。红曲霉也可在p d a 培养基上生长，但呈现局限生长，而不像在麦芽汁琼脂培养基上那样蔓延的幅度大。一 些种在p d a 培养基上的菌落呈疮疤状。红曲霉都能形成红色素，常将色素分泌到培养基 中，故使培养物的背面着色。 1 2 2 红曲霉属的主要种 ( 1 ) 发白红曲霉 它在麦芽汁琼脂培养基上有自色气菌丝，成熟后培养基内和培养基表面的菌丝体为 皮膜状，呈淡红褐色。分生孢子球形或梨形，直径6 - - 9 1 a m ，不着色。被子器球形，直 径2 5 3 0 9 m 。子囊孢子椭圆形，3 i _ t m x 2 1 5 9 m ，不着色。 ( 2 ) 巴克红曲霉 在麦芽汁琼脂培养基上，菌落初呈白色，后变为深褐色、绒毡状。分生孢子梨形， 2 第一章文献综述 7 - 1 l p m 。被子器球形，直径2 5 , - - - , 3 5 1 a m ，外壳褐色。予囊孢子椭圆形，2 9 m x 3 9 i n ，淡 褐色。 ( 3 ) 烟灰色红曲霉 在麦芽汁琼脂培养基上，菌落初呈白色，渐变为灰黑色、毡状，背面红褐色。分生 孢子单生或成链，梨形或球形，直径4 5 1 1 o l a m ，或( 7 - - 1 2 ) g m x ( 6 - 9 ) g m 。被子器 褐色，球形，直径3 0 一- 5 0 9 m 。子囊孢子卵形，( 4 5 6 3 ) l a m x ( 3 5 - - 5 ) “m ，褐色。 ( 4 ) 紫红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上，初为粉色，后变为紫色或葡萄酱紫色，有褶皱及气菌 丝，背面紫红色。分生孢子成链，球形或梨形，直径6 - - 9 t m 。被子器球形，直径2 5 7 5 9 m ，橙红色。子囊孢子卵形或椭圆形( 5 - - - 6 5 ) l a m x ( 3 5 6 ) l a m ，淡红色。 ( 5 ) 红色红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上初为白色，后变为赭红色，呈毡状，气菌丝赭色，背面 红色。分生孢子梨形或球形，直径1 0 1 2 9 i n 。被子器球形，直径4 0 - - 5 4 1 a m ，红色。子 囊孢子卵形，( 7 - - - , 8 ) i t m x ( 4 5 ) p m ，无色。 ( 6 ) 锈色红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上形成厚的皮膜，初为白色，后变为鲑肉似的橙红色，上 面覆盖短的白色菌丝。分生孢子梨形或球形，直径6 - - - - 9 9 i n ，无色。被子器球形，直径 2 5 3 5 i i m 。子囊孢子椭圆形3 5 9 i n 2 5 1 a m ，不着色。 ( 7 ) 变红红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上形成皮膜状，有褶皱，白色，色素产生非常缓慢，3 0 天后才变为粉红色或桃红色。气菌丝稀少，分生孢子球形或梨形，直径6 - - 1 2 p m ，无色。 被子器球形，直径3 0 1 a m ( 2 5 1 l m 以下、3 6 1 a m 以上者极少) 。子囊孢子椭圆形，( 2 - 3 ) g m x ( 3 - 3 5 ) g m 。 ( 8 ) 毛霉状红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上产生白色气菌丝，底部菌丝体为淡红色，背面白红色。 分生孢子梨形或球形，1 5 - - , 1 8 9 m ，成链状。被子器球形，直径6 0 , - - , 7 0 1 m ，无色。子囊 孢子长圆形，5 i t m x8 1 a m ，无色。 1 3 红曲霉的代谢产物【3 7 】 1 3 1 初级代谢产物 3 第一章文献综述 ( 1 ) 酶 红曲霉能产生多种酶类，主要有洳淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糊精化酶、蛋白酶、果 胶酶、羧肽酶，不同种类菌株产酶的类型及产量会有差异。某些红曲霉菌株还能分泌直 接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的胞外酶。对己酸乙酯合成能力较强的红曲酯化菌进行 四级扩大培养得到了酯化率 t 8 5 的酯化酶制剂，用于白酒生产已取得较好的效果。 ( 2 ) 脂肪酸 1 9 8 9 年，日本学者的研究表明红曲霉培养物主要含有的脂肪酸是c 1 8 ：l ，c 1 8 ：2 ， c 1 6 ：0 ，c 1 8 ：0 ，c 1 6 ：l ，认为不同红曲霉菌株产生的脂肪酸成分有很高的相似性。国内 宋洪涛采用气相色谱进行分析，结果表明不饱和脂肪酸含量达6 4 7 7 ，多烯不饱和 脂肪酸含量达1 6 - 2 7 。经过活性测定认为它们可能有增强m o n a c 0 1 i n s 分解甘油三 酯，降低极低密度脂蛋白胆固醇的功能。1 9 9 2 年，德国学者发现m o n a s c u sp u r p u r e u s 能将短链脂肪酸转变为甲基酮，并对其代谢途径进行了初步探讨。在不饱和脂肪酸方面， 尚有待深入研究，以便对红曲的降脂作用能有较为全面的了解。 ( 3 ) 有机酸 日本有人在利用红曲霉突变株生产酒精饮料时对产生的有机酸进行了分析，发现突 变株与亲株产生的有机酸成分很相近。泰国研究者对收集到的4 0 株红曲霉菌株进行筛 选，发现 勿撇站淞a r g l l g o s c $ 1 sa h u9 0 8 7 菌株在含有1 0 葡萄糖、o 0 2 5 牛肉膏提取物 的培养基中培养，l 苹果酸产量达n 2 8 1 9 l ，随后又对菌株进行诱变处理，分离得到的 白化突变株最大产量可达4 8 7 e , l 。 1 3 2 次级代谢产物 ( 1 ) 红曲色素 红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的多种色素的混合物，它是由结构类似的 红、橙、黄三类不同色素组成的，包括红色的红斑素、红曲红素；橙色的红斑胺和红曲 红胺；黄色的红曲素和红曲黄素。 ( 2 ) 降血脂类物质 1 9 7 6 年，日本东京农工大学远藤章教授等对红曲进行研究，从红曲霉的红色红曲中 发现了强力的胆固醇合成阻碍剂莫纳可林k 、接着又从同一菌株分离出与莫纳可林k 构 造相似的其他活性物质，这些物质毒性都极低，有较强的降低胆固醇的作用，其特征为 对抗阻碍胆固醇合成系统中的限速酶h m g - c o a ( 3 羟基3 一甲基一戊二酸单酰c o 砧还原 4 第索文献综述 酶。莫纳可林k 不仅能降低多种动物( 兔子、狗等) 血中的胆固醇，而且对高胆固醇血症 患者也极有效，其最大特征是能对低密脂蛋白l d l ( l o wd e n s i t yl i p o p r c t c i u ) - - - 胆固醇具 有优先降低作用。l d l 是最能引起动脉硬化的物质。 ( 3 ) 降血压物质 红曲具有很强的降压作用，推测其有效成分为y 氨基丁酸( g a b a ) 及g l u c o s a m i n e ( 或红曲霉的其它细胞壁成分) 。研究发现红曲还可以用作血压升高剂，对血压有双重控 制作用。2 0 世纪9 0 年代，日本研制的“群势 红曲有很强的降压功能，因而获得高血压 改善剂的专利。日本还开发了用m a n k a 的提取物制备保健饮料用于治疗高血压的技术。 还可以根据红曲的降压功效来开发低盐食品，比如日本研制成功的低盐大豆酱油。日本 的研究者还发现用麸皮制备的红曲中除了含有m o n a c o l i nk 之外还含有g l u c o s a m i n e ( 5 m g g 干重) ，因此该麸皮红曲既有降脂功能又有降压功能。最近日本的研究又发现进 行厌氧处理可使y q 惦昭量提高1 0 倍以上。 ( 4 ) 降血糖物质 远藤章教授曾直接用红曲霉的培养物作饲料进行动物试验，发现试验兔子在进食饲 料后半小时内血糖降低了2 3 - 3 3 ，而在l 小时后血糖量仍比对照组下降了1 9 2 9 ，其有效成分尚待研究。 ( 4 ) 其他代谢产物 不少红曲霉菌株能产生麦角固醇。麦角固醇是v d 2 的前体，而且还是生产“考的 松”、黄体酮的原料，它还可与胆固醇竞争肠道中的吸收部位，从而减少外源性胆固醇 的吸收。也有人发现从传统家酿红酒的小曲中分离到的红曲霉菌株可以产生d p p h 自由 基的清除剂。2 0 世纪9 0 年代初期研究了红曲霉生产l 肉毒碱、核酸酶的技术。从红曲 霉中分离得到的单胺氧化酶抑制物可治疗某些精神疾病，而其产生的黄酮酚又是有潜在 防癌和抗癌作用的药物。之后又发现了三种植酸酶，可以用来提高食品的营养价值。红 曲霉在化妆品上的应用也大都见于日本。发现用酶水解发酵液后可提取一种细胞活化剂 用于防止皮肤粗糙、延缓衰老。将红曲霉产生的色素溶于乙醇再与丝心蛋白混合后形成 的红曲色素一丝心蛋白结合物可用作化妆品着色剂。 1 4 红曲霉的抑菌活性物质 我国自元代以来红曲就己用在鱼、肉制品的防腐保存上，现存的明代宋应星所撰写 的天工开物有如下的记载：世间鱼肉最朽腐物，而此物薄施涂抹，能固其质于炎 5 第一章文献综述 暑之中，经历旬月蛆蝇不敢近，色味不离初，盖奇药也。这段记述说明红曲有杀菌和 抑菌作用，可防止鱼肉因感染杂菌而发生变质，肯定了其中抑菌活性物质的存在。 1 4 1m o n a s c i d i na 【8 ，9 】 1 9 7 7 年香港中文大学的h i s c h u a n gw a n g 等人首次报道了经快中子及x 射线诱变的紫 红曲霉有抑菌作用，变异t 朱n 1 1 s 较g l 的抗菌活性高，主要抑制芽孢杆菌、链球菌、假 单胞杆菌的生长。1 9 8 1 年他们又首次分离出红曲中的一种抑菌因子，并命名为m o n a s c i d i n a ，继而建立了m o n a s c i d i na 的提取方法。 1 4 2a n k a i a o t o n e 【1 0 l 1 9 9 1 年，h i r o s h i n o z a k i 等舭a n k a 的发酵培养液中分离得到一种抑菌活性物质，并 将其命名为a n k a l a c t o n e ，这种红曲霉的代谢产物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有抑制作 用，经鉴定为a , p 不饱和，y - 内脂衍生物。1 9 9 6 年捷克斯洛伐克也同样分离出了这种物质。 a n k a l a c t o n e 的结构式如图所示： 1 4 3 红曲色素【1 1 1 6 1 o 图1 1a n k a l a e t o n e 结构式 f i g l - 1a n k a l a e t o n ec o n f i g u r a t i o nf o r m u l a 红曲色素由红色素、黄色素和紫色素三种基本色素组成。最近郭东川等人又发现了 两种新色素，它们的分子式为c 2 5h 3 1 0 5 n 和c 2 3 h 2 7 0 s n 。华南理工大学童群义等人使用自 制的红曲色素粉末配成0 ，5 9 m l 的红曲色素水溶液进行抑菌实验，结果证实红曲色素对 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，对大肠杆菌、灰色链霉菌抑菌作 用较弱，而对啤酒酵母、霉菌等无抑制作用。中国食品发酵工业研究所王柏琴等人研究 表明，红曲色素溶液能抑止肉毒梭状芽孢杆菌生长，对发酵菌株的生长和产酸均无显著 6 第一章文献综述 影响，因此将其应用于发酵香肠生产，替代亚硝酸盐是切实可行的。 1 4 4 橙色素分离液1 1 7 , 1 8 1 9 9 5 年，m a r t i n k o v a 等人报道红曲霉的抑菌作用是由橙色素引起的。天津轻工业学 院宫慧梅等人将分离获得的六种红曲样品色素分别进行抑菌实验，实验结果表明红衄色 素的三种分离液，对细菌的抑制能力较强，对阴性菌的大肠杆菌也有一定的抑制作用， 对酵母菌和霉菌无抑菌性，而其中起主要抑菌作用的成分为橙色素分离液，黄色素与红 色素分离液无抑菌活性。橙色素结构式如下图： o 1 4 5 几丁质酶【1 9 1 c h 3 o 图1 2 橙色素结构式 f i g l - 2o r a n g ep g m o mc o n f i g u r a t i o nf o r m u l a c h 3 2 0 0 1 年，台湾的w a n g s l 在虾蟹壳粉末制成的培养基中，从m p u r p u r e u s c c r c 3 1 4 9 9 的细胞外产生出一种有抗菌作用的几丁质酶，并得到纯化和鉴定。该几丁 质酶分子量约为8 1 0 0 0 道尔顿，等电点为5 4 ，最适p h 为7 ，最适温度为4 0 c 、稳定 的p h 为6 8 。该酶可被f e 2 + 强烈抑制，可抑制细菌和真菌。 1 5 红曲霉产桔霉素的发现及其性质 1 5 1 红曲霉产桔霉紊的发现【2 0 1 1 9 9 3 年，法国学者b l a n c 等分别用不同的固体和液体的培养基培养红曲霉，将培养 物经t l c 硅胶板分离，发现分离出的已报道的抑菌活性物质m o n a s c i d i na 与桔霉素在薄层 层析板上具有相同的r f 值，在波长3 5 0 n m 的紫外灯下均发淡黄色荧光，且同样具有抑菌 第一奄文献综述 性，而分离出的另外两种物质无抑菌性。同时， 外吸收光谱等对m o n a s c i d i na 进行了结构分析， 1 5 2 桔霉素的产生菌【2 l 】 b l a n c 等人还通过核磁共振、质谱、紫 证实m o n a s c i d i na 就是桔霉素。 桔霉素是由真菌产生的次级代谢产物。自然界中许多青霉和曲霉菌株能产生桔霉 素，产桔霉素的特征菌是桔青霉( p e n c i l l i u mc i t r i n i u m ) ，用查氏葡萄糖培养液3 0 l 接种 桔青霉，培养两周后可提取桔霉素4 5 6 0 9 ，产量高达1 5 0 0 - 2 0 0 0 m g l 。 1 5 3 桔霉素的物理化学特性【2 2 1 桔霉素纯品为黄色晶体，熔点1 7 8 - - 一1 7 9 。c ，难溶于水，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙脂、 乙醇等有机溶剂，分子量为2 5 0 ，分子式为c 1 3 h 1 4 0 5 ，结构式如图所示： o c h 3 o h o h 图1 3 桔霉素结构式 f i 9 1 3e i t r i n i nc o n f i g u r a t i o nf o r m u l a 1 5 4 桔霉素的毒性和抑菌性【2 2 2 7 】 桔霉素是一种真菌毒素，具有肾毒性，且怀疑是人类某些地方病的潜在致病剂。最 近的研究表明桔霉素对肾脏的结构和功熊极为不利。桔霉素可在线粒体内聚集且干扰电 子传递系统，导致d n a 合成受到抑止，并进一步使r n a 和蛋白质合成受到抑止，肝糖原 下降，胆固醇和甘油三酸脂合成受阻。桔霉素还可以诱发突变。m a r t i n 等报道，桔霉素 在大肠杆菌d n a 完整性方面会导致单峰和双峰的形成，并且诱发大肠杆菌细胞d n a 修 复合成。另外，在大肠杆菌突变试验中，逐渐增加的碱基对也被发现。p f e i f f e r 等发现桔 霉素抑止聚合酶并且导致v 7 9 细胞染色体中的c r e s t 阳性微核的突变。桔霉素以口服方 式喂给小鼠，会造成小鼠的骨髓细胞中染色体断裂、空缺等畸变现象，也会导致肾细胞 8 第一章文献综述 肿瘤的出现。同时，桔霉素可使稳定表达人类c y p 3 a 4 基因的基因工程细胞发生突变。 1 5 5 红曲霉中桔霉素的合成途径【2 8 】 自法国学者b l a n c 等人发现m o n a s c i d i na 和桔霉素是同一种物质以后，红曲霉中桔霉 素的合成途径就成为人们探讨的主要问题。最近的研究表明，桔霉素与红曲色素的合成 开始在同一途径上，如图所示，先由一个乙酰辅酶a 和3 个丙二酰辅酶a 合成丁酮和辅酶， 复合物经甲基化，在丙二酰辅酶a 的参与下合成戊酮，然后分开，一条途径合成己酮， 最后产生红曲色素；另一条途径最后产生桔霉素。所以桔霉素常伴随在红曲色素中产生。 这也解释了色价高的菌种，桔霉素含量也高的原因。 j r 酮聚合酶 丙删鳅t 。$ i 产醋酗 c 。彩心s h 配黼0 卜卜 上 、i 1 。6 解决桔霉素问题的途径 自从发现红曲霉产桔霉素后，美、日、欧各国制定了针对我国红曲出口的新标准， 严格限制红曲中桔霉素的含量，而我国红曲中桔霉素含量很难达到控制标准，桔霉素问 题已成为限制我国红曲出口的瓶颈问题。解决桔霉素问题，可以从以下几个方面考虑： 9 第一章文献综述 1 6 1 筛选不产或少产桔霉素的优良菌种2 1 】 红曲霉产桔霉素是普遍现象，但不同菌株产桔霉素的能力差别较大，因此可以筛选 出色价高，而桔霉素含量低的优良菌种。无锡轻工大学许赣荣等筛选出的z k - o a 菌株生 产红曲米，色价高于 1 0 0 0 u g ，桔霉素质量分数低于5 m g k g 。杭州商学院王雅芬等通过诱 变处理筛选出红曲霉h s 一9 1 2 5 ，桔霉素质量分数低于1 叫蚝，而色价高达3 5 0 0 u g 以上。 1 6 2 培养基与发酵工艺条件优化，减少桔霉素的生成 3 2 , 3 3 1 桔霉素的生成与培养基的成分密切相关。酵母膏营养丰富，含有多种有利于微生物 分泌代谢产物的因子，有利于桔霉素的分泌，因此在红曲霉的培养基中应尽量避免加入 酵母膏。在氮源中，精氨酸和丙氨酸可强化桔霉素的生成，而缬氨酸、组氨酸、色氨酸、 亮氨酸可消除桔霉素的生成。在红曲霉液体深层培养中，供氧量对桔霉素的生成具有很 大的影响。高通气量和搅拌速度都可加速桔霉素的生成，因此在满足供氧需求的情况下， 减少通气量和搅拌速度。 另外，最新研究报道：脂肪酸和甲基酮会影响红曲中桔霉素的生成，尤其是2 三十 碳酮，能强烈抑制桔霉素的生成，同时并不影响色素的形成，解析其原因可能有二，其 一可能性是抑制了桔霉素形成的支路反应；其二是由于脂肪酸的加入增加了过氧化物的 活性，从而使桔霉素改变结构，转化为无毒物质。 1 7 立题意义 列入我国食品添加剂使用卫生标准范围的防腐剂有苯甲酸、苯甲酸钠、山 梨酸等2 9 个品种，年产量约5 0 0 0 多吨，除乳链球菌肽属天然防腐剂( 年产4 吨) 外，其余均为化学合成品。因此，开发天然防腐剂一一红曲防腐剂具有重 要意义，但目前国内外对红曲的应用只是停留在生产色素及其保健食品上，红曲防腐 剂的研究尚未有生产报道。同时，红曲的防腐作用虽有报道，但其抑制微生物的种类， 提取方法和防腐效率国内外研究甚少。因此分离优良红曲霉菌株，并通过对红曲霉 发酵液中活性物质抑菌作用的研究，确定最佳的工艺条件，从而开发具有抑菌 和着色双重功效的红曲防腐产品，符合天然食品添加剂替代合成食品添加剂的 发展方向，具有很好的市场前景。 1 0 第一章文献综述 1 8 本论文的主要研究内容 本论文意在进行高色价、低桔霉素产量的红曲霉菌株的分离，红曲霉产色素液 体深层发酵工艺条件优化，红曲色素抑菌特性，桔霉素检测方法等方面的研究。 在红曲霉菌株的分离方面，分离并确定红曲霉菌株并对其产色素条件作 研究，检测其产桔霉素能力，确定其研究和开发前景。 在液体深层发酵工艺条件优化研究中主要是确定最佳碳源、氮源、金属离子添加量 以及温度、p h 、培养时间等对红曲霉产色素能力的影响，使其达到最大产色素能力。 在红曲色素抑菌特性方面，主要研究红曲霉胞外发酵液和胞内浸提液对大肠杆菌， 金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌，黑曲霉和米曲霉等的抑菌性，并与桔霉素抑 菌性进行比较，分析红曲色素与桔霉素抑菌性方面的差异。 桔霉素检测方法主要是通过薄板层析和液相色谱结合的方法，定性和定量的 确定红曲霉发酵液中桔霉素的含量，从而可以检测分离出的红曲霉所产色素的 桔霉素含量，确定其安全性。 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 2 1 实验材料与方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 实验菌种 红曲霉5 0 3 7 ( c i c c 编号) 红曲霉0 3 0 1 2 1 1 2 实验试剂 名称 葡萄糖 谷氨酸钠 硫酸锌 磷酸二氢钾 磷酸氢二钾 硫酸镁 硫酸锰 蔗糖 琼脂 硝酸钠 硫酸铁 乙酸乙酯 苯 氯仿 丙酮 可溶性淀粉 无水乙醇 纯度 分析纯 9 9 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 购于中国工业微生物保藏中心 微生物教研室分离保藏 1 2 生产厂家 成都化学试剂厂 沈阳红梅味精股份有限公司 沈阳市新城化工厂 沈阳市试剂一厂 沈阳市试剂五厂 天津开发区海晶精细化工厂 大连市华中试剂厂 北京化工厂 福建泉州市泉港化工厂出品 天津市科密欧化学试剂开发中心 北京化学试剂三厂 公主岭市化学试剂厂 沈阳市试剂五厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市广成化学试剂有限公司 浙江湖州食品化工联合公司 大连市华中试剂厂 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 甘油 果胶 棉子糖 松三糖 纤维二糖 海藻糖 阿拉伯糖 d 木糖 正丁醇 尿素 酵母膏 蛋白胨 酪蛋白 硫酸铵 l 一赖氨酸 丙氨酸 d l - 色氨酸 甘氨酸 d l - 天门东氨酸 谷氨酰胺 半胱氨酸 酒石酸铵 2 1 1 3 实验仪器与设备 煤电两用手提式消毒器 电热恒温培养箱 电热鼓风烘箱 架盘药物天平 i j z q - c 空气浴振荡器 t g l - 1 6 g 台式离心机 7 2 2 s 分光光度计 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 层析纯 层析纯 层析纯 层析纯 层析纯 分析纯 分析纯 大连无机化工厂 上海试剂二厂 中国预防医学科学院劳卫所 上海试剂二厂 中国预防医学科学院劳卫所 浙江永嘉精细化工厂 上海试n - - 厂 上海试剂二厂 丹东市集贤化学试剂厂 沈阳试剂一厂 沈阳试剂一厂 中国预防医学科学院劳卫所 上海试n - - 厂 沈阳试剂一厂 上海试剂二厂 上海试剂二厂 上海试剂二厂 上海试n - - 厂 上海康达氨基酸厂 上海化学试剂采购供应站试剂厂 中国科学院上海生物化学研究所 北京化工厂 开封大河机电厂 沈阳市第四十五中学电器厂 国营沈阳医疗器械厂 上海医疗器械八厂 哈尔滨市东明医疗仪器厂 上海安亭科学仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 1 3 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 电光分析天平上海天平仪器厂 恒温水浴锅巩义市英裕予华仪器厂 电子调温万用电炉 龙口市先科仪器公司 生物显微镜上海光明仪器厂 2 1 1 4 培养基 3 4 , 3 5 1 ( 1 ) 麦芽汁培养基 5 波美度的麦芽汁( p h 约6 4 ) 加入1 5 琼脂。 ( 2 ) 马铃薯蔗糖培养基 马铃薯，2 0 0 9 ；蔗糖，2 0 9 ；琼脂，1 5 9 ；水，1 0 0 0 m l 。 制法：马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液加糖和琼 脂，熔化后，补足水分至1 0 0 0 m l 。 ( 3 ) c y a 培养基 n a n 0 3 ，3 9 l ；k 2 i - i p 0 4 ，1 9 l ；k c l ，0 5 9 l , m g s 0 4 7 h 2 0 ，o 5 9 l _ ；f e s 0 4 。7 1 - 1 2 0 ， 0 0 1 9 l ；酵母膏，5 e , l ；琼脂，1 5 9 l ；蔗糖，3 0 9 l ；水，1 0 0 0 m l 。 ( 4 ) 查氏培养基 n a n 0 3 ，2 9 ；k c l ，o 5 9 ；k 2 i - i p 0 4 ，l g ：m g s 0 4 ，0 5 9 ；f e s 0 4 ，0 0 1 9 ；蔗糖，3 0 9 ： 琼脂，1 5 - - 2 0 9 ；水，1 0 0 0 m l 。 ( 5 ) 大米培养基 大米，1 0 0 9 ；葡萄糖，2 0 9 ；琼脂，2 0 9 ；水，1 0 0 0 m l a 制法：大米加水煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液加糖和琼脂，溶化后，补足水 分至1 0 0 0 m l 。 ( 6 ) m s g 固体培养基 葡萄糖，5 0 9 l ；谷氨酸钠，5 9 l ；z n s 0 4 7 i - 1 2 0 ，o 5 9 l ；m g s 0 4 ，0 s g l ；k 2 h p 0 4 ， 5 9 l ：k h 2 p 0 4 ，5 9 l ；m n s 0 4 h 2 0 ，0 3 9 l ：f e s 0 4 。7 i - 1 2 0 ，0 0 1 9 l ：琼脂，1 5 - - 2 0 9 ： 水，1 0 0 0 m l ：p r i ，6 5 。 ( 7 ) m s g 液体发酵培养基 葡萄糖，5 0 9 l ；谷氨酸钠，5 e , l ；z n s 0 4 7 i - 1 2 0 ，0 s g l ；m g s 0 4 ，0 s g l ；k 2 h p 0 4 ， 5 9 l ；k h 2 p 0 4 ，5 9 l ；m n s 0 4 n 2 0 ，0 3 9 1 , ；f e s 0 4 7 h 2 0 ，0 0 1 9 l ：水，1 0 0 0 m l ；p h ， 65 。 1 4 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 红曲霉培养方法 将红曲霉接种于麦芽汁培养基斜面上，3 0 条件下恒温培养7 天，产生的大量孢子 可供液体培养接种