（食品科学专业论文）益生菌发酵剂的研究.pdf

摘要 摘要 益生菌发酵剂对于益生荫发酵乳制品的开发与应用有重要意义，本文利用一株具有 降低胆固醇作用的益生菌d c f d 妇i 池cc 口s e ib d i i 制备发酵剂，研究该菌的生【毛发酵特 性，通过筛选增菌培养基、保护剂及预培养、热激来提高发酵剂存活率和活性。 通过对b d 1 i 的生长及发酵特性测定，确定：上d c f o 妇i f ，“cc 口s p 旭d i i 在复原脱脂乳 中1 0 h 凝乳，1 2 hp h 达到4 ，5 ，滴定酸度8 1 5 0 t ；蛋白分解活力在2 4 h 对应游离氨基酸浓度 达到2 9 4 7 u m l ；最适、最高、最低生长温度分别为3 8 、4 6 、1 2 ；药敏实验表明， b d j j 对四环素、氯霉素和红霉素高度敏感，而对青瓣素、氨苄青霉素中度敏感，对链 霉索氟哌酸和庆大霉素不敏感。通过气质联用分析该菌发酵乳所含挥发性风味物质酮类 物质与各类挥发性脂肪酸总含量分别达到3 5 9 1 和5 2 5 2 ，其中乙酸含量最高，占总挥 发性物质质量分数3 6 2 6 ，2 丁酮和2 ，3 丁二酮分别占1 4 1 8 、1 0 6 7 。在0 至7 d 内， b d 1 i 发酵乳酸度变化不大，1 4 d 时增加至0 9 6 ，有一定程度的后酸化现象；在p h 4 0 i ) b s 缓冲溶液4 贮存1 0 天时从6 3 5 1 0 7 c f u m l 下降为5 6 【1 0 6 c f u m l ；将酸奶菌与b d i i 混 合发酵，配合比例l ：1 ：3 、接种量3 、3 9 培养条件下6 h 开始凝乳，比b d i i 单菌发酵 缩短了4 h 。 m 交实验确定b d 1 1 的最佳增贿培养基组成：酶水解1 0 脱脂乳中加入0 5 葡萄 糖，1 5 胰蛋白胨、o 3 酵母浸膏、o 1 m 0 1 l p h 5 6n 8 2 h p 0 4 柠檬酸。此培养基中最大 菌数8 8 l ( ) ”c f l 】m l ，分别比m r s 及脱脂复原乳中提高1 3 5 倍和0 7 5 倍。由数学工具 o r 画n 6 0 ，得到干酪乳杆菌在优化培养基中分批培养的生长动力学模型：n ( t ) = 3 4 0 8 8 ( 1 + e 3 o “3 2 5 舢) 。计算值与实验值相对埃差基本在5 范围内。 i f 交优化得到最佳冻干保护剂绑合为：脱脂奶粉1 0 0 9 l - 】甘油3 0 m i | 1 麦芽糊 精l o o g l - 1 海藻糖2 0 0 9 l 。1l 谷氨酸钠1 0 9 l - 1 。用于l c 口5 e jb d i i 冷冻二f 燥，其 存活率达到8 2 2 ，4 4 1 0 “c f u 垃。冻干过程中，3 7 预培养6 0 m i n 后以4 0 预冻3 h ， 存活率达到了最高8 4 8 ，活菌数4 9 1 0 c f u 卫，凝乳时间为1 3 h 。应用特性实验表明， 冻干发酵剂比液体发酵剂产酸稍慢，2 4 h 后产酸量基本达到一致。在4 真空条件下保 藏贮存6 0 d 后，其相对存活率为5 9 6 含菌数达到2 9 1 0 ”c f u 屉。 对b d i i 不同温度下的抗热性进行测定，通过毛细管法确定其在1 0 灭菌脱脂乳介 质中，7 0 、7 2 、7 5 时的d 值分别为3 6 2 s 、2 6 5 s 和1 1 3 s 。研究不同热激条件对 诱导提高该菌株抗热性的影响，最佳热激条件为菌龄7 h 时进行5 0 ，4 5 m j n 热激，6 0 9 0 s 处理，存活率为o 1 4 6 ，较对照提高2 1 l 倍。喷雾干燥条件设定进风温度1 7 0 、出风温度7 0 ，以2 0 复原脱脂乳悬浮的培养物为对照，采用脱脂奶粉2 2g d l 1 、 甘油3 、海藻糖1 0 复配的抗热保护剂进行喷干时，活菌数从6 4 1 07 c f u 旭增加到 1 3 1 0 8 c f u g 。热激处理后的喷干发酵剂中活菌数从1 3 1 0 8 c f u g 增加到1 5 1 0 8 c f u g 提高了1 2 8 。 关键词：益生菌二f 酪乳杆菌生长发酵特性发酵剂 江南大学硕：i 二学位论文 a b s t r a c t p r o b i o t i cs t a r t e rc u l t u r ep l a y si m p o r t a n tr o l ei n d e v e l o p i n gp r o b i o t i cy o g h u r to r f e r i n e n t e dd a i r yp m d u c t s i i lt h i sp a p e r ，l 口c 幻6 口c f f m sc 口s “b d - 1 i ，t h ec h o l e s t e r o l r e d u c i n g p r o b i o t i c s t r a i n ，w a su s e dt o p r e p a r e d s t a r t e rc u l t u r e t h e b i o l o g i c a la n df e r m e n t a t i o n p r o p e r t i e sw a ss t u d i e d e n r i c h m e n tm e d j u ma n dp r o p e rp r o t e c t a n t sw e r ec h o o s e nw i t ht h e m e a n so f p r e i n c u b a t i o na n dh e a ts h o c kt oe n h a n c et h es u i v i a v a lr a t e sa n da c t i v i ty t h eb i o l o g i c a la n df 色r m e n t a t i o np r o p e n i e so f 上c n s p fb d 1 1w a ss t u d i e d r e s u l t s ：t h e f e r m e n t e dr s mw a sc o a g u l a t e da t1 0 h ，a t1 2 h ，p hw a s4 5a n dt i t r a t a b l ea c i d i t yw a s8 1 5 o t ；p m t e o l y t i ca c t i v i t yd e t e r i l l i n a t i o na st h ef r e e - a m i n oa c i dc o n c e m t r a t i o ni s1 3 5 m m l ；t h e o p t i m a lg m w t ht e m n p e r a t u r ei s3 8 ，a n di h em a x i m u m4 6 ，m j n i m u m1 2 a n t i b i t o t i c s e n s i t i v i t y t e s tf o u n dt h a tt h es t r a i ns h o w e d s i g n i f i c a n t l y s e n s i t i v et o 1 t r a c y c l i n e ，c h l o r a m p h e n i c o la n de r y t h m m y c i n ，m i d d l i n g l ys e n s i t i v et ob e n z y l p e n i c i l l i na n d a m p i c j l l i n u m ，b u tn os e n s i t i v i t yt os t r e p t o m y c i n 、n o r n x a c i na n dg e n t a m y c i n v 0 l a t ef i a v o r c o m p o n e n t sa n a l y s i so ff e m l e n t e ds k i mm i l kw i t hg a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y s h o w e dt h em a j o rc o m p o u n d sa r ek e t o n e 、v o l a t e f a t t ya c i d ，w h i c hp m p o n i o na r e 3 5 9 1 a n d5 2 5 2 t h ef i r s tl h r e ea r ea c e t i ca c i d ，2 b u t a n o n ea n d2 ，3 - b u t a n e d i o n ew i t h 3 6 2 6 ，1 4 1 8 ，1 0 6 7 ，r e s p e c t i v e l 弘t h ea c i d i t yo f f e 呻e n t e dm i l kc h a n g e di n d i s t i n c t i v e l y i n0t o7 d ，a n db e c a m e0 1 6 h i g h e ra t1 4 d ，s h o w ss o m e t h i n gp o s t - a c i d i f y w h e ns t o r e di n p h 4 0p b sb u f f e ra t4 f o r1 0d a y s ，t h ev i a b l ec e l l sc h a n g e d 仃o m6 3 5 1 0 7 c f u m l t o5 6 1 1 0 6 c f u m l - m i x e df e r i i l e n t a i o no fs t ，印 d c d c c “st 卉e ，研咖j u s a c t d 幻c “s 西u j 。g a 工j c “sa n d a c 0 6 a c “sc a s p jb d 1 is t u d vs h o w e do d t i m a lc o n d i t i o n sa r e1 ：1 ：3 w i t hi n o c u l u m3 ，i n c u b a t et e m p e r a t u r e3 9 t _ l l ec o g u l a t e dt i m ew a s6 h ，4 hl e s st h a ns i n g l e f e r i t l e n t a t i o n t h eo n h o g o n a l i t yt e s tu s e dt od e s i g nt h eo p t i m a le n r i c h m e n tm e d i u mo fb d i i t h e b e s tc o n s i s to fe n z y m eh y d r o l y s e d1 0 r s m ，0 5 g l u c o s e ，1 5 p e p t o n e ，0 3 y e a s te x t r a c t a n do 1 m o l l p h 5 6n a 2 h p 0 4 - c i t r i ca c i d t h ev i a b l ec o u n t si s8 8 1 0 9 c f u m 1 ，1 - 3 5a n d 0 7 5f 0 1 dh i g e rt h a n tf e r m e n t e di nm r sa n dl o r s m w i t hh e l po fo r i g i n6 0 ，k i n d so fk i n e t i cp a r a m e t e ra r ee s t i m a t e d ，a n dt h ek i n e t i c m o d e lo fb a t c hf c 珊e n t a t i o n 伊o w t ho fb d 一i sn ( t ) = 3 4 0 8 8 ( 1 + e 3 3 5 6 0 一o3 2 5 4 ) r e l a t i v e e r r o ro fm o d l ev a l u ea n dv a l u eo fe x p e r i m e n ti si nt h er a n g eo f5 t 1 l eb e s tc r y o p r o t e c t a n td e s i g h e dw i t ho r t h o g o n a l i t yt e s t ：n f mp o w d e r1 0 0 9 。l _ 1 m a l t o d e x t r i n1 0 0 9 l - 1 、l 广g l u t a m j n e l o g l - 1 、g l y c e m l3 0 m 1 l _ 1 、t r e h a l o s e2 0 0 9 l _ 1 t 1 l e s u r v i v a lr a t eo fl y p h i l y z a t j o ns t a n e ri s8 2 2 ，v i a b l ec o u n t s4 4 1 0 l u c f u 倌w j t hi t f o r o p t i m i z i n gl y p h i l y z a t j o np m c e s s ，t h es u s p e n d e dc u l t u r ep r e i n c u b a t e da t3 7 f o r6 0 m i n ，a n d f o r z e na t - 4 0 f o r3 h ，s u r v i v a lr a t ei s8 4 8 ，v i a b l ec o u n t s4 9 1 0 1 0 c f u 悖，t h ec o g u l a t i o nt i m e i s 1 3 h a p p l i c a t i o nt e s ts h o w e dt h el y p h i l y z a t i o ns t a n e rp r o d u c e da c i ds l o w l yt h a nl i q u j d i i a b s l 阳c l s t a n e r b u ri h ea c i d i t va l m o s ts a m ea f l e r2 4 h w h e ns i a r t e rp o w d e rs t o r e da t4 v a c u u m ，r c l a i i v es u j v a lr a t ea n dv i a b l ec o u n i sa r e5 9 6 a n d2 9 l o “c f u g ，r e s p e c t j v e l y h e a is t r e s sr e s i s t a n c ea n dr e s d o n s eo f “c f 0 6 c i ，“5c n s “b d 1 1w e r es t u d i e d s t a i i o n a r y p h a s ec e l i so f c 口s db d i ih a dd e c i m a ir e d u c t i o nt i m e s ( dv a i u e s ) i n r e c o n s i i t u t e ds k i m m j l ko f3 6 2 s ，2 6 5 sa n d1 1 3 sa t7 0 ，7 2a n d 7 5 ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a l h e a ts h o c kc o n d i t i o n sa r e7 hc u l t u r eo fl c 口s e jb d i ia d a d t e dt o5 0 f o r4 5 m i n v i a b i l i t v o f6 0 9 0 st r e a t m e n tw a s0 1 4 6 ，2 1 1t i m e f o l dh i g h e rl h a nt h ec o n t m l a sl h eo p e r a t i n g c o n d i t i o n so fs p r a y - d y i n gw e r ei n l e tt e m p e r a t u r e17 0 ，o u l e tt e m p e r a t u r e7 0 ，v i a b l e c o u n t sw a se n h e n c e df r o m6 4 1 0 c f u gt o 1 3 1 0 6 c f u 倌c o m p a r e dt h ep r o t e c i a n lc o n s i s t o f n f mp o w d e r2 2 0 9 l _ 1 、g l y c e r o l3 、i r e h a l o s e1 0 w i t hc o n t m l v i a b l ec o u n t so f h e a t s h o c kc u l t u r ew h i c hw a ss p r a y - dr i e da l s oe n h a n c e d1 2 8 i h a nc o n t r 0 1 k e yw o r d s ：p r o b i o t i c l a c t o b a c 川u sc a s e i b i o l o g i c a la n df e r m e n t a t i o np r o p e n i e ss t a r t e r c u l t u r e i i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 t 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 衅 导师签名： 日期：嘶年易月f 莎日 章绪论 第一章绪论 1 1 益生菌发酵乳简介 有关含益生菌的食品例如发酵奶的健康功效其历史纪录可追溯到几个世纪之前， 它们对人体的滋养和治疗作用甚至在圣经中也有提及【lj 。由于近年益生菌的研究f i 益深 入，益生菌也已经开始应用于酸奶的生产。酸乳作为一种细菌发酵型乳制品，逐渐山高 酸性向低酸性发展，人们普遍喜爱低酸、低脂、富含营养素，具有活性的酸乳。同时， 酸乳也改变了使用传统的乳酸菌( & r 印f o c d c “s ，! e r 叩 i m s 口n d 口c f d 妇c f ，m s 如z d r “e 女f f 船p6 “g 肠r i c “s ) 发酵而添加了益生菌，以提高其保健功能。使用这些益生菌生产的酸 奶进入消化道后，会抑制些腐败微生物的生长与定殖，发挥其特殊的生理作用。含有 益生菌的酸奶在世界各国较为流行，此类产品的消费量呈上升趋势。目前法国1 l 的酸 乳中添加了益生菌，占整个国家鲜奶销量的4 【3 j 。 益生菌( p r o b i o i i c ) 被定义【4 l 为含有足够数量活菌、组成明确的微生物制剂或产品， 能通过定婀作用改变宿主某一部位菌群组成、从而产生有利于宿主健康作用。益生菌的 保健作用主要体现在以下方而： 抑制肠道致病菌，调节肠道免疫功能；防治多种类型腹泻； 刺激肠道蠕动、防j e 便秘和胃肠胀气； 促进生 乏，控制感染与增加营养素的消化利用率； 促进钙、镁、铁、锌和维生索d 的吸收； 减轻乳糖不耐受症状； 降低高m 压，减低血中低密度脂蛋白胆固醇； 抗肿瘤作用； 提高对放射线的耐受性。 益生菌的代谢产物从简单的短链脂肪酸到一些人体必需，结构较复杂的有机酸如 叶酸、乳清酸等、这些化合物能使消化道的p h 降低，形成一种酸性环境，并且对宿主 一系列的生理过程进行调节。乳酸菌在肠腔内释放的各种酶可以对消化过程起协同作 用，并减缓部分肠道吸收不良的症状，如在亚洲人群中最为常见的乳糖不耐症等。细菌 素等抗菌物质的产生能提高益生菌在体内的抗菌作用，增加了其作为生物治疗方法的应 用潜力【2 3 】。此外，益生菌降低血清胆固醇水平和血脂浓度以及抗高血压、抗肿瘤的作 用成为近年来研究热点有大量的动物实验和临床试验对多种益生乳酸菌的功能进行 验证，同时进行的还有其对免疫功能的调节作用研究。一般认为益生菌的这些功能与起 在发酵食品中产生的生物活性物质如生物活性肽和胞外多糖等密切相关。 i | 前用作益生菌的微生物均是来源于人或动物，人们研究和应用比较多的是乳杆 菌和双歧杆菌这些可以产生乳酸的肠道菌，因此益生菌制品也经常使用这两个属的菌， 其中使用乳杆菌中的肠道菌株生产产品可以追溯到2 0 世纪3 0 年代。目前常用于益生菌 产品的菌株列于表l - 1 中【。 1 江南大学顾j “学位论文 表1 1 目前用于益生菌制品的菌株 发酵乳( c u l t u r em i l k ) 是以乳与乳制品为原料经均质或不均质、杀菌或灭菌后， 加入特定的微生物发酵剂，保温发酵而制成的具有特殊风味的凝乳状产品( 1 9 9 2 年国 际乳业联合会( 1 d f ) ) 【6 】。由于发酵乳良好的风味组织、营养价值及独特的保健功效， 近二十年来，全世界发酵乳的消费量逐步提高。益生菌以发酵乳作为其主要食用形式， 乳制品也是益生菌的最重要的载体1 7j 。发酵乳作为益生菌的有效载体，主要有下列原因： 发酵食品特别是发酵乳制品本身就是有很好的健康功效。消费者己熟知发酵食品含 有活性微生物。益生菌可将发酵性能与健康功效结合。此外从技术原因上言，发酵乳 制品已优化其加工和储存条件，也为益生菌的存活创造了有利条件。 发酵乳在很大程度上取决于发酵剂的质量，因此，在发酵乳生产前必须根据发酵 乳的不同种类和生产条件的差异选定适宜菌种预先制备相应的发酵剂【“。传统的酸乳是 利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌( 统称为酸乳菌，y o g u nb a c t e r i a ) 发酵生产的，这类微 生物虽然具有一定的保健作用，但由于它们不是人体肠道内原始寄生菌，在消化道内高 酸度环境下难以存活，因此通常不包括在益生菌类内f 我国除外1 。通常加入的益生菌 主要包括：嗜酸乳杆菌和双歧杆菌【8 j ，但由于嗜酸乳杆菌产酸能力较强，双歧杆菌代谢 会产生醋酸等代谢产物，因此会使生产的酸奶具有某些特殊的味道，所以在应用益生菌 生产酸奶制品时对产品口味会有所影响，其次还应该保持制品中存在较高的活菌数以保 证益生菌进入消化道后发挥其生理作用。对益生菌酸乳的开发要以益生菌的生物特性为 基础，根据其产生保健作用的机理，选择优良菌株，控制发酵过程的d h 值，温度，容 氧量，营养基质等参数入手| 9 j 不断提高工艺水平。 1 2 发酵乳制品发酵剂概况 目前益生酸奶在国内外都是乳制品专业制造商竞相开发的产品，成为一些厂家的新 卖点，但是要注意选用优良的益生菌发酵剂，只有选择有一定实验研究基础的发酵剂， 才能生产出具有益生作用的产品。发酵剂是制造干酪、奶油及发酵乳制品所用的特定的 微生物培养材料【1 0 】，发酵剂的加入目的是：通过乳酸菌的乳酸发酵使牛乳中部分乳糖转 化成乳酸，乳p h 降低，产生凝固，防止杂菌生长，延长贮存期；促使发酵乳产生良好 2 粥节埔论 风味物质，如挥发性物质丁二酮、乙醚等；具有一定的降解脂肪和蛋白质作用，提高乳 的消化吸收；通过丙酸菌的丙酸发酵产生丙酸、乙酸、二氧化碳嗣水，使一些发酵乳产 生特有的风味和组织状态；通过酵母菌的酒精发酵生成酒精和二氧化碳，抑制有害菌生 长并赋予产r w ，独特的风味，可用于生产乳酒。制造发酵剂的原始培养物称为发酵剂菌种。 酸奶应用的微生物主要是乳酸市1 ：菌和乳链球菌，其中保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和二 二 酪乳杆菌发育最好，发酵时形成大量的乳酸，使乳的酸度升高。下表是酸奶发酵剂常用 的乳酸菌的种类及其特性。 表1 2 发酵剂常用菌种及其特性 约3 0 2 5 3 0 j 二酮乳酸链球约3 0 滔 嗜热链球菌 4 0 4 5 蚀柠檬明串珠菌2 0 2 5 乳 瑞十乳杆菌 4 0 4 5 酸 扦 乳酸乳十1 ：菌 4 0 一4 5 困 保加利弧乳杆菌4 0 一4 3 嗜酸乳杆菌3 5 3 7 二f 酪乳杆菌3 5 4 0 烈歧柑菌 酵 乳酒假丝酵母 儡 脆壁酵母 0 8 一1 0 0 8 0 8+ o 8 1 o 一 少许 + 2 5 3 0 l 5 2 o 1 8 2 0 1 8 2 o 一 1 5 2 o 一 乙醇、 c 0 2 乙醇、 c 0 2 人t 酪乳、酸奶油、 干酪 人，i ：酪乳、酸奶油、 干酪 人：i 。酪乳、酸奶油、 干酪 酸奶 干酪、酸奶油 酸奶、开非尔 酸奶、开非尔 酸奶、乳酸菌饮料 嗜酸乳杆菌乳 液体发酵乳、干酪乳 杆菌发酵乳 双歧杆菌发酵乳 开非尔、马乳酒 在风靡世界的日本益生菌产品y a k u l t 的产品包装说明上，生产商把上c 口5 西s h i r o t a 发酵剂描述为：在消化道菌群中天然存在的有益菌，并提供一些科学知识支持它的作用 一肠道菌群的平衡对维持健康非常重要：消化道中良好的菌群能因为不良饮食习惯、 压力、服用抗生素和年龄的增长而减少；y a k u i l 产品中的大量有益菌能帮助维持肠道菌 群的有益平衡和内脏的自然运动节律；每天服用y a k u l c 可以促使人建立更加健康和平衡 的生物规律。因此，作为益生菌发酵乳制品的源头，益生性发酵乳发酵剂的研制和开发 显得尤为重要。下表是目前美国市场常见的益生酸奶制品及其使用的发酵剂p ，5 】。 3 5 5 晰 。 叭 4 4 4 彗 凿 味 求 n 链 叫 酸 脂 乳 乳 乳酸球菌 0 0 o o 2 2 2 2 - 7 o o o o o 弘 药 药 江南大学烦：l 学位论文 表1 3 美国市场常见的益生酸奶制品及其使用的发酵剂 1 2 1 益生菌选择及应用于加工发酵乳制品的标准 在发酵乳制作中，发酵剂菌种选择对产品有很大的影响，筛选和分离具有优良特性 的菌株，如抗噬菌体菌株，产香、产粘和产酸特性良好以及具有健康特性菌株的选育等， 仍然是目前重要的研究课题。最早用于益生菌的乳酸菌是乳杆菌，对治疗腹泻有一定的 作用，主要包括用乳杆菌发酵的酸乳，其标准是1 4 j ： ( 1 ) 人类来源； ( 2 ) 具有抗胃酸和胆汁酸盐能力； ( 3 ) 对人肠细胞具有吸附性，并能通过人体消化道定植； ( 4 ) 产生抗菌物质； ( 5 ) 对致癌及致病菌有拮抗力； ( 6 ) 具有安全性； ( 7 ) 临床证实对健康有效。 益生菌稳定及加工特性包括【1 2 l ： ( i ) 保持活性能力稳定； ( 2 ) 产品具有良好的组织质地和风味； ( 3 ) 贮藏期间维持酸度基本稳定； ( 4 ) 加工及贮藏期间定植特性的保持； ( 5 ) 发酵产品中优良贮藏稳定性； ( 6 ) 冷冻干燥或其他干燥方法处理后具有稳定性； ( 7 ) 正确的菌株鉴定； ( 8 ) 有效剂量的实验数据。 4 翌二里竺堡 12 2 新型发酵剂的研究概况 所谓新型发酵剂是相对于传统发酵剂直接应用于生产的一次性发酵剂。此类发酵 剂不仅可以直接用于生产发酵乳品，也可以作为食品添加剂使用或直接食用i ”i 。发酵剂 按其使用的形态，可分为传统的液体发酵剂和经低温干燥、喷雾干燥或冷冻二f 二燥制成的 粉术发酵剂等；随发酵剂使用菌种数量的不同，又可分为单一和混合型发酵剂。由于益 生菌是一类生理性能不完全一致的多种细菌的组合，在生产上很难有一种适合于各种益 生菌发酵的种子培养基，所以为了获得理想的产品性能，应该将各种细菌单独培养，在 生产时按照比例加入原料中混匀发酵。但是这样做比较麻烦，困外有将所需的各种细菌 培养浓缩，制成一次性发酵剂，这既有利于方便生产又有利于产品质量的稳定【l2 ”j 。传 统的商业发酵剂所含菌量少( 1 07 1 0 8 个m 1 ) ，用于生产前需经过母发酵剂、中| 1 1 j 发酵 剂、生产发酵剂的扩大繁殖才能用于生产乳制品，这既繁杂又技术上不易控制( 因无菌 条件要求高) 。新型发酵剂克服了传统发酸剂的不足，可直接用于发酵乳制品的生产的 同时，还具有以下优点1 5 】：节省菌种车间；减少投资和空问；简化了工艺过程； 避免了技术原因造成的质量不稳定，有利于发酵乳产品的生产标准化；提高发酵乳 产品质量，保障了消费者的利益和健康；为家庭自制发酵乳制品提供简捷条件。 1 2 2 1 新型发酵剂的分类 新型发酵剂的研究始于十九世纪末至二十世纪初。但真正商品化则经历了一个比较 长的时间，大约在本世纪五、六十年代以后，刁真正用于大规模工业化生产。目前，丹 麦的汉森公司的乳品发酵剂的研究水平处于国际领先地位，并于l9 8 8 年生产出超浓缩直 接使用的酸乳发酵剂，其菌数达1 0 “个g 。美、日等国的新型发酵剂的技术也处于较先 进水平之列【”】。我国内蒙、黑龙江等地从八十年代开始，相继建立了发酵剂研究中心， 为生产厂家提供各种菌剂的浓缩菌剂或干剂。其中东北农业大学骆承痒教授及其研究生 在这方面开展的工作较早，现已开发出酸奶粉及各种商品化发酵剂【1 7 j 。但从全国来看， 还刚刚起步，有许多工作要跟上。 新型发酵剂按形态可大致分为干制发酵剂，浓缩发酵剂和冻藏发酵剂三种。分述如 下： 1 干制发酵剂是指经真空低温干燥法，冷冻真空干燥法和喷雾二f 燥法制得呈干粉状 或颗粒状的发酵剂。 ( 1 ) 真空低温干燥法。该法制作发酵剂尽管制备工艺简单、经济，但其制品呈颗粒状， 分散性能差菌的存活率也不高。 ( 2 ) 冷冻干燥法。该法是常用的一种方法，制备的发酵剂菌株存活率高、活力强，尤其 加入一定的冻干保存剂后，其效果更好。但是该法制备周期长，每次制备量太少， 很难满足大规模工业化生产需要。该法成本高，不经济。 ( 3 ) 喷雾干澡法。该法制备的发酵剂有成本低，效率高，产量大的特点，但菌株存活率 偏低。如东北农业大学骆承痒导师的研究生研制的经喷雾二f 燥法生产的酸奶粉，其 活菌数1 0 6 - 一1 0 8 c f u g ，直接应用于酸奶生产上，代替原先的发酵剂，以2 _ _ 4 w w 江南大学坝：i j 学位论文 量添加，所生产的酸奶只是酸度略低，组织状态与普通酸奶接近【1 8 1 。 2 浓缩发酵剂 浓缩发酵剂的研究，直到1 9 6 3 年刁进人商品化实用阶段，其含菌量一般为1 0 9 l o ”c f u m 1 。我国对浓缩发酵剂的研究起步较晚，1 9 9 1 年高松柏等人向乳酸菌培养液中 添加缓冲盐，再经离心分离和真空干燥制得浓缩发酵剂，含菌量达l o ”个m i 。梁勇等在 查问大量文献的基础上，将浓缩发酵剂的制备分为四种方法【1 。 ( 1 ) 物理法。即通过将常规法制得的发酵剂进行离心分离，使菌体得到浓缩的方法。 离心有两种：一种为普通离心机离心，另一种为超速离心机离心，其中超速离心分离的 效果好一些。 ( 2 ) 化学中和法。在乳酸菌的生长过程中，自动向培养液中滴加n a 0 h 或n h 。0 h ，将产 生的乳酸中和掉，会促进乳酸菌的生长。用该法制得浓缩发酵剂，当菌体浓度达 l o c f u m l 时，中和反应将不起作用。 ( 3 ) 缓冲盐法。该法原理是用缓冲盐控制乳酸产生时所造成的p h 值降低，该缓冲盐 类的配方一般不公开。t i n e k e h 利用高浓度的蛋白和磷酸盐来达到缓冲效果。 ( 4 ) 渗析法。这种方法是利用膜技术，选择适宜的膜孑l 径来浓缩菌体。原理是向培 养液中不断添加新的营养液，乳酸菌代谢产物通过膜除去，从而促使乳酸菌繁殖。用此 法达到的菌体浓度比上述三种方法都要高，一般大于1 0 “c f u m l 。 3 冻藏发酵剂 冻藏发酵剂的应用始于7 0 年代初，是将发酵剂菌种繁殖于制备培养基中，在稳定生 长后期，实行冻存，冻藏于一2 0 或4 0 ，甚至保存于液氮( 一1 9 6 ) 的条件下，这样可 获得较理想的菌存活率和活力。其中液氮冻藏效果最好。但在应用中需要特殊的冷藏车 来进行运输，费用较高，对发酵剂中心的依赖性太强。吕加平等在一2 0 与一4 0 条件下 对浓缩后的发酵剂进行冻存，结果发现，3 个月后，一2 0 冻藏菌数为8 7 1 0 9 c f u 屈， 而一4 0 冻藏的菌数为4 4 l o ”c f u g ，差异并不显著，但对更低温度下的情况则没有进 行相应的研究。 1 2 2 2 国内外新型发酵剂的研究进展 据报道，自1 9 世纪末2 0 世纪初，西方乳业科学家就开始研制浓缩发酵剂，酸奶发 酵剂现已在乳业发达国家实现商业化生产，并涌现出一批知名发酵剂制造商，例如：丹 麦h a n s e n 公司、澳大利业c s i r o 研究所、荷兰n i z o 研究所等，它们生产的发酵剂性能优 良，种类多样，已销往世界各地的乳品企业。直投式酸奶发酵剂的制备技术包括以下五 个方面：菌株的选育、增殖培养基筛选、发酵过程控制、菌体的富集浓缩、菌体的制备 方式等。对于酸乳发酵剂的研究i2 0 1 ，目前国内主要是从增殖培养基筛选、浓缩方法选择 和冷冻干燥工艺等方面进行试验性工作，对优良菌株的选育以及发酵过程的控制等深入 研究的较少，难于从根本上来提高发酵剂的质量和产量。 1 3 立题意义 有关乳酸菌优良特性的不断发现促进了发酵剂种类的开发，使其工业价值和经济 6 效益成倍增值、如丌发使用酸敏感性的保加利业乳杆菌发酵剂可生产风味柔和的酸乳， 并延长产晶的保质期：开发代谢胞外多糖饵p s ) 发酵剂赋予产品良好的质构及黏度，从 而降低乳固体含量并减少稳定剂用量。为了健康的目的，开发的“益生型”发酵剂( 主 要为嗜酸乳杆菌、二f 酪乳杆菌和双歧杆菌等) 已4 + 为消费者接受、很明显，未来的发酵 乳生产可能会要求提供具有明确特性的生产发酵剂降1 2 l 。 最近l o 年中，商业浓缩型乳酸菌发酵剂已获得广泛应用，特别是直投式发酵剂已 在乳品和奶酪行二业中已占有优势、从根本上避免了产品自然发酵周期长、质量波动大和 食用安全性及卫生性难于保障的缺陷，促进了产品及生产过程的标准化。然而同前乳品 发酵剂在国内还尚未形成专业化、规模化的：叫k 生产体系，尤其是直投式发酵剂存在质 量良莠不齐、生命力相对较短等缺点，而剥于各种益生菌发酵剂的研究更是处于实验室 探索阶段。随着益生菌筛选： 作的不断发展，拥有我国自主知识产权的益生菌越来越多， 尤其是对降血压、降胆固醇作用等菌株的筛选，为功能。肚乳制品的开发打开了全新的局 而。为更好的应用这些菌株丌发益生菌制剂和乳制t 满足市场和消费者的需求，生产符 合我国国情的、性能稳定的标准化益生菌发酵剂已势在必行。 1 4 研究内容 本文依据新型浓缩乳酸菌发酵剂的基本制作工艺，从菌株生理、发酵特性测试、 增菌培养基筛选及冷冻干燥、喷雾二r 燥等关键技术入手，以发酵剂的各项标准对一株已 经证实具有凋节1 1 i | 脂功能的干酪乳杆菌a c t o 拍c j 吣c a s p jb d 一1 i 包括产酸、后酸化、 挥发性风味物质成分等各项特性分析，并与常用的酸奶发酵菌株配合研究其乳发酵性 质，确定二f 酪乳杆菌发酵剂高浓度培养的增菌培养基配方及粉末发酵剂制备： 艺中的相 关参数指标，分别采用预培养和热激处理对提高冷冻干燥和喷雾干燥制备发酵剂过程中 菌株的存活率进行探索。具体研究内容如下： ( 1 ) 益生菌幽c 幻如c j ，sc a s 口jb i ) 一i i 的生长、发酵特性的研究 ( 2 )如c f o 加c j ，船c a s e jb d l i 的i ) h 内控型增菌培养基设计及分批发酵生长动力 学研究 ( 3 )a p f 口妇o j f 占口jb d i i 冻二f _ 粉末发酵剂的制备及应用研究 ( 4 ) 利用热激处理提高幻c f o 铂c j ，“sc a s p jb i ) 一i i 的抗热性及在喷二f 发酵剂制备 中的应用 江南大学颇：i 一学位论文 第二章益生菌a c 亡d 6 a c ，船c a s e ? 即一i i 生长发酵特性测定 2 1 引言 发酵菌种及发酵剂是制造酸奶、干酪等所用的特定的微生物的培养物。此培养物一 般为液体或固体粉末。工业生产中，发酵剂指用于生产的单一或多种微生物的混合培养 物。发酵剂所用菌种一般是嗜热链球菌和保加利亚如杆菌的混合菌种，但根据需要，也 可复配以嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、乳酸链球菌、干酪乳杆菌等，或者直接使用单一菌种。 但最终选择的标准主要是菌种的耐热性、最适发酵温度、产酸能力、产黏能力、产香能 力、后酸化情况、发酵周期、菌种间的共生能力、最终所需求的发酵乳的特性等来确定 【3 + 1 1 1 。 益生性或益生作用是指某种微生物制剂或发酵制品通过调节宿主黏膜与系统免疫 功能以及改善肠道营养与菌群平衡对宿主所产生的有益的生理作用。尽管部分乳杆菌不 能以活菌状态达到肠道，并在那里定殖，但其细胞壁成分仍可以发挥抗瘤变和免疫调节 作用。至今为止，乳杆菌仍然是应用最广泛的益生菌【4 】。目前常用作益生菌的乳杆菌有 l d e l b r h e c k i i s h b s p - b u t g n r t c u s 、l b n c t d o p h t l h s ，l b c n s e t 、l b f e r m e n t h m 、l b r e u t e r i 、 l b r 沁m n o s u s 、l b p i n t r h m 、l b 1 d c t i s 、l b g n s s e r i 、l b j o h n s o 哦i 等。硝匝甩于发酵裁桷 菌株必须对其各项生物技术特征进行全面了解，所以本章对益生菌l 口c 向妇c l 抛sc 口s “ b d i i 生长及发酵特性进行测定。 2 2 材料和方法 2 2 1 实验菌株 干酪乳杆菌上口c 幻妇c f 池sc 口s e fb d i i 由光明乳业股份有限公司技术中心提供 嗜热链球菌s 打印 d c d c c 坩拍8 埘咖j u s 本实验室保藏菌株，分离自法国罗地亚 公司直投发酵剂 保加利亚乳杆菌a c 0 6 a c j “s6 “咖，j c 坩本实验室保藏菌株，分离自法国罗地 亚公司直投发酵剂 2 2 2 原料与试剂 脱脂乳粉上海光明乳业有限公司 葡萄糖中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 蛋白胨中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 牛肉浸膏中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 无水乙酸钠中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 第二章益生苗工d c 幻6 c i ，m “w e fb d i i 生氏发酵特陛的研究 吐湍一8 0 氢氧化钠 氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氨钾 磷酸二氢钠 氯化钾 琼脂 酚酞 药敏纸片 三氯乙酸 甲醇 邻苯二甲醛 2 2 3 培养基 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中困医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 无锡l t 丰试剂厂 上海三爱思试剂有限公司 上海伊华医学科技有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 2 2 3 1m r s 【2 l 】。 2 2 3 21 0 的脱脂乳培养基( r s m ) ： 将1 0 9 脱脂乳粉溶于9 0 9 去离子水中，于1 1 5 1 0 m i n 条件下灭菌，灭菌后置于3 7 下 培养三天，确认无菌后使用。 2 2 4 主要仪器 恒温水浴锅 冷冻离心机 7 5 2 紫外光栅分光光度计 电子天平 微型旋涡混合仪 超净工作台 恒温培养箱 移液枪 高压蒸汽灭菌锅 p h 计 g c 血订s 液相色谱质谱联用仪 2 2 5 实验方法 2 2 5 1p h 测定 德国t l u l e d 0 公司 德国h e t7 r i c h 公司 上海第三分析仪器厂 m 盯t l e r t o l ，e d o 公司 上海沪诬分析仪器厂 苏州安泰空气技术有限公司 上海跃进医疗器械厂 e p p e r d o r f 公司 上海华线医用核子仪器有限公司 m e t e rt o l e d o 公司 美国f i n n