（食品科学专业论文）益生菌LGG对酸奶品质及贮藏性能影响的研究.pdf

摘要 随着益生菌研究的深入进行，益生菌在食品、特别是乳制品中得到了广泛的应 用。在益生菌酸牛奶产品中，后酸化和异味是益生菌酸奶品质的主要问题，在冷链 不完善的我国显得尤为突出，严重影响了消费者对酸奶的接受性和酸奶的普及与发 展。本课题主要针对目前我国益生菌酸奶普遍存在的后酸化及风味问题，以添加 l g g 的酸奶为研究对象，系统地研究了益生菌l g g 对酸奶理化性能的影响，并确 定了引起l g g 酸奶后酸化和异味的主要因素，提出了防止l g g 酸奶发生后酸化的 控制措施。主要试验结果如下： 1 l g g 对酸奶理化性能影响的研究：l g g 为一株产l 一乳酸的益生菌，在2 0 1 5 天的储存期内，l g g 在酸奶中存活稳定；与不添加l g g 的酸奶相比，添加l g g 的 酸奶酸度显著增高( p 0 0 1 ) ，双乙酰和乙醛含量显著减少( p 0 0 5 ) ，丙酮酸含量显 著减少( p o 0 1 ) ，乳酸和乙酸含量显著增多( p o 0 1 ) ，乳清酸和柠檬酸含量基本无 变化，甲酸、丙酸、丁酸、尿酸和马尿酸未检出。 2 影响l g g 酸奶后酸化的因素：l g g 酸奶的后酸化受l g g 添加量、贮存温 度及发酵剂的产酸能力等因素的影响。l g g 添加量越多、储存温度越高、发酵剂产 酸能力越强，l g g 酸奶的后酸化越快，反之亦然。 3 控制l g g 酸奶后酸化的有效方法： ( 1 ) 热处理法：5 5 5 m i n 的热处理有效地钝化了l g g 在酸奶中的活性。2 0 储存条件下，与对照组( 添加不经过热处理的l g g 的酸奶) 相比，试验组( 添加经过 热处理后的l g g 的酸奶) 的酸度显著降低( p 0 0 1 ) ，有效地延迟了l g g 酸奶发生后 酸化的时间( 约6 天) ，双乙酰含量显著减少q o 0 1 ) ，乙醛含量显著增多 0 o i ) ， 乳酸和乙酸含量显著减少( p o 0 1 ) ，丙酮酸、乳清酸、柠檬酸含量基本相同，甲酸、 丙酸、丁酸、尿酸和马尿酸未检出，酸奶的后酸化和风味得到了改善。 ( 2 ) l g g 后添加法：l g g 在酸奶发酵结束后添加到酸奶中，2 0 储存条件下， 与对照组( l g g 和发酵剂同时添加的酸奶) 相比，有效地延迟了l g g 酸奶发生后酸 化和异味的时间( 约6 天) ，酸奶的品质得到了有效的控制。 关键词：益生菌l a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u sg g ；酸奶；后酸化 s t u d yo ne f f e c to fl g go n q u a l i t ya n ds t o r a g ep r o p e r t yo fy o g u r t a b s t r a c t p m b i o t i ca r eu s e dw i d e l yi nd a i r yp r o d u c t si nr e s e n ty e a r s ，e s p e c i a l l yi ny o g u r t p o s t a c i d i f i c a t i o na n do f f - f l a v o ro fy o g u r ta r et h em a i n l yp r o b l e mi na p p l i c a t i o n ，a n da r e m o r eo b v i o u si nc h i n a ，w h i c hh a sn oc o m p l e t e c o l dc h a i n t h i se x p e r i m e n t s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e do nt h en u t r i t i o nc h a r a c t e r i s t i ca n d m e t a b o l i s mo fl g gi ny o g u r t ， f a c t o r sr e s u l ti np o s t a c i d i f i c a t i o na n do f f - f l a v o r , a n dp u tf o r w a r ds o m em e t h o d st o c o n t r o li t l g g p r o d u c e dl 1 a c t i ca c i da n ds u r v i v a l e dw e l li ny o g u r td u r i n gt h es t o r a g e ( 2 0 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o l ( y o g u r tw i t h o u tl g g ) ，a c i d i t yo fy o g u r tw i t hl g g w a sh i g h e r ( p 0 0 1 ) ，c o n t e n to fd i a c e t y l ，a c e t a l d e h y d ea n dp y r u v i ca c i dw e r el o w e r ( p o 0 5 o rp 0 0 1 ) ，l a c t i ca n da c e t i ca c i d sw e r eh i g h e r ( p o 0 1 ) ，o r o t i ea n dc i t r i c a c i d sw e r en o t c h a n g e d ，f o r m i c ，p r o p i o n i c ，b u t y r i c ，u r i ca n dh i p p u r i ca c i d sw e r en o td e t e c t e du n d e rt h e c o n d i t i o nu s e d p o s t a c i d i f i c a t i o no fy o g u r tw i t hl g gw a ss i g n i f i c a n ti n f l u e n c e db yi n o c u l a t i o n a m o u n to fl g g , s t o r a g et e m p e r a t u r ea n dt h es t a r t e ru s e d i n o c u l a t e dl g ga f t e rh e a tt r e a t m e n t ( 5 5 。c5 r a i n ) ，c o m p a r e dw i t hc o n t r o l ( y o g u r t w i t hl g gn o th e a tt r e a t e d ) ，a c i d i t yw a sl o w e r ( p 0 o1 ) ，c o n t e n to fd i a c e t y lw a sl o w e r ( p 0 0 1 ) ，a c e t a l d e h y d ew a sh i g h e r ( p o 0 1 ) ，l a c t i ca n da c e t i ca c i d s w e r el o w e rq 0 0 t ) ， p y r u v i c ，o r o t i c a n dc i t r i ca c i d sw e r en o tc h a n g e dd u r i n gt h es t o r a g e ( 2 0 ) ，t h e p o s t a c i d i f i c a t i o na n do f f - f l a v o ro fy o g u r tw e r ei m p r o v e de f f e c t i v e l y i n o c u l a t e dl g ga f t e rf e r m e n t e dd e l a y e dt h ep o s t a c i d i f i c a t i o na n do f f - f l a v o ro f y o g u r ta b o u t6d a y sc o m p a r e dw i t hc o n t r o l ( y o g u r ti n o c u l a t el g g b e f o r ef e r m e n t e d ) k e yw o r d s ：p r o b i o t i cl a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u sg g ：y o g u r t ；p o s t a c i d i f i c a t i o n d ir e c t e db y ：p r o f j i ny e ，p h d a ny i n g a p p i ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：c h e ns hixia n ( f o o ds c i e n c e ) ( f 0 0 ds c i e n e ea n de n g i n e e r i n gc o l l e g e 。i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 8 。c h i n a ) 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢町 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：篮堡! 基日期：塑生丘：! 笪 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，印：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：照丝叠 指导教师签名：雌 日 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 益生菌 1 1 1 益生菌的定义 随着科学研究的深入，人们对益生茵的认知也不断提高。益生菌( p r o b i o t i c s ) ， 也有译为“益生素、原生菌”等，早在1 9 0 7 年m e t c h n i k o f f 提出的发酵乳制品有助于 健康长寿的理论中发展而来的。英文p r o b i o t i c s 一词源于希腊语，意思是“为了生 命”( f o rl i v e ) ，与a n t i b i o t i c s 相对立。而它的现代定义则最早在1 9 6 5 年被l i l l e y 和 s t i l l w e l l 阐述为“由一种微生物分泌的刺激其他微生物生长的物质或组织提取物”。 此后随着对益生菌的研究的深入，益生菌定义也屡次被修订。p a r k e r l 9 7 4 年将其表 述为“有助于肠道菌群平衡的微生物及其相关物质”。后来f u l l e r 将此定义修改为“能 通过改善肠道微生物平衡而对宿主产生有益影响的微生物活体制品”比1 。1 9 9 2 年， h a v e n a a r 等进一步扩展此定义为“单一或混合发酵的微生物，能通过改善内源微生 物的性质而对人或动物有益”。而最近的g u a r n e r 等提出的更精炼的定义为“当摄入 一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。1 。2 0 0 2 年，欧洲食品与饲料菌种协会 ( e f f c a ) 给出最新定义：益生菌是活的微生物，通过摄入充足的数量，对宿主产生 一种或多种特殊且经过论证的功能性健康益处一1 。 1 1 2 益生菌的种类及应用标准 目前用作益生菌的微生物均是来源于人或动物，人们研究和应用比较多的是乳 酸菌和双歧杆菌这些可以产生乳酸的肠道菌，因此益生菌制品也经常使用这两个属 的菌。日本和欧美用于酸奶及益生菌剂的乳酸菌种，主要是一些来自人体的乳酸菌 种和双歧杆菌，如：嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗氏乳杆菌、植物乳酸杆菌、酪 乳杆菌、詹氏乳酸杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌等等1 。此# i - - 孚l 酸肠球菌等亦使用之。2 0 0 1 年我国卫生部公布了可用于保健食品的益生菌菌种名 单：两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、保 加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌 1 ，2 0 0 4 年后又新 增了鼠李糖乳杆菌l g g 、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌b i - 0 7 和动物双歧杆菌胎1 2 。 作为好的益生菌株必须满足以下要求哺1 ： ( 1 ) 来源于健康人肠内，分类学上的地位非常明确，没有受过任何遗传工程的修 饰的天然菌株。 ( 2 ) 能抗胃酸及肠道消化液的作用，活着进入人体消化道的下部。 ( 3 ) 有粘附在肠管上皮及表面粘膜上的能力。 ( 4 ) 能在一定时间定殖在人体肠内并在停止饮用后能自然地从人体内消失。 ( 5 ) 能分泌产生有选择性地抗菌物质，但自身没有耐药性基因。 ( 6 ) 促进人体健康的生理功能被人体及临床实验严格验证过。 2 益生菌l g g 对酸奶品质及贮藏性能影响的研究 ( 7 ) 安全性被严格验证过。 ( 8 ) 适合商品生产，在商品生产流通过程种保持存活及稳定，风味能被一般消 费者接受。 目前常用于益生菌产品的菌株列于表1 中阳1 。 表1目前常用于益生菌产品的菌株 1 1 3 益生菌的生理功能n ( 1 ) 改善肠道功能 初生动物是无菌的，可作为研究益生菌调节肠道功能的模型。研究表明，将比 例为l ：l ：l 的植物乳杆菌、乳酸片球菌和粪链球菌冻干粉，饲喂给初生犊牛，扫描 电镜和透射电镜结果显示，益生菌可促使犊牛肠绒毛表面形成发达的环形或纵形的 皱褶，有助于小肠绒毛的发育，而且可以维持和加强犊牛十二指肠、空肠、回肠上 皮细胞细胞质中线粒体( 嵴多且密集) ，滑面内质网和粗面内质网等细胞器的数量和 结构1 。所以，益生菌可通过对肠道结构的直接调节作用改善肠道功能。肠道紊乱 会导致腹痛、腹泻，严重的甚至危及生命。根据m e r g e r 和c r o i t o r u 的研究，与肠道 固有微生物耐性降低有关的免疫系统功能的失调会导致慢性肠炎疾病，而这可以通 过益生菌得到改善n 副。n a n j i 等的研究表明，潜在的病变( 如慢性肾脏疾病) 和胃酸缺 乏将导致小肠细菌过度繁殖，从而造成有害微生物大量滋生。摄入不可消化的食物 ( 如具有乳糖不耐症者摄入乳糖) 会给肠内微生物生长提供发酵底物，有时会带来有 害影响n 盯。实验表明，益生菌摄入量达1 0 9 1 0 1 1 c 列天的水平，可起到降低某些肠道 疾病的发病率、持续时间和病情严重性的效果。 ( 2 ) 免疫功能 人体免疫功能会随着年龄的增长而降低，免疫系统的功能失调将带来健康问题， 如过敏和炎症反应。对益生菌的免疫效果研究表明，益生菌能通过激活巨噬细胞、 内蒙古农业大学硕士学位论文3 增强细胞活性和增加免疫球蛋白( 特别是) 的水平等来增强非特异性免疫和特异性免 疫应答。益生菌的活菌细胞、死细胞或是发酵产物都具有免疫调节功能。研究表明， 一些乳杆菌发酵制品可使肠中与结肠癌有关的p 葡萄苷酸酶、p 葡糖苷酶、甘氨胆 酸还原酶和硝基还原酶活性下降，可使丫干扰素和白细胞介素等非特异性免疫系统 激活物增加，可使淋巴细胞和细胞数量增加，对包括轮状病毒疫苗在内的各种激发 物的特异性免疫应答增强4 1 。某些过敏反应的发生是由于肠粘膜屏障功能的崩溃， 致使大量抗原侵袭所造成的。已有研究报道益生菌具有调节某些过敏反应的功效， 它是通过改善肠粘膜屏障功能的作用来实现的。有关特异治疗和食品过敏反应的研 究表明：通过恢复肠粘膜的透过性，调节区域免疫反应及应用能改变食品抗原的微 生物，免疫反应能被引导恢复至正常乳圳。 ( 3 ) 抗癌功能 m o o r e 等人报导了对肠道菌群与癌症间的关系所作调查结果，对不同地区，不 同饮食习惯、结肠息肉患者和肿瘤低发区，挑选出的8 7 名对象进行研究，从这些人 的粪便中分离出5 5 6 0 个菌株作统计学处理，结果显示，与结肠癌有正相关的菌种 是：长双岐杆菌，角双岐杆菌a n g u l a t u m ) ，普通拟杆菌和s t e r c o r i s ) ， 与结肠 癌有负相关的菌株是：乳杆菌，好气真杆菌n 。但也有不同结果。流行病学调查显 示癌症发病率的高低和膳食组分密切相关，而含益生菌的膳食己被证明具有明显降 低癌症发病率的功效。对益生菌的抗癌研究显示，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏 乳杆菌、保加利亚乳杆菌的菌体或用其做成的酸奶食用后可活化单球巨噬细胞的活 性，增强全身性免疫应答。干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、奶油链球菌及各种双歧杆菌 的菌体或酸奶上清液均具有相当强的抗肿瘤活性n 盯。根据a k a z a n 等人的研究，每 日三次使用1 0 1 0 c f u 的三c a s e i 干粉制品并持续一年，可以达到抑制表面膀胱癌的再 发生n 射。另外，有研究表明益生茵具有阻碍结肠和其他器官中发生的非基因型和基 因突变型的功能啦们。 ( 4 ) 降胆固醇功能 许多研究证明益生菌可以降低胆固醇，每天吃酸奶可使血清胆固醇降低。给试 验鼠喂饲罗氏乳杆菌每天1 0 4 个细胞，连续7 天，再给予高胆固醇饲料，与对照组 相比，其总胆固醇下降2 0 ，三甘油脂下降3 3 ，l d l h d l 降低1 7 。乳酸菌为 何能降低胆固醇，其机制尚无定论，有人认为乳酸菌可产生3 羟基3 甲基戊二酸 ( h m g ) 而抑制了胆固醇合成时所必需的羟基戊二酰辅酶a 还原酶活性之故。也有人 认为发酵乳中由乳清酸衍生的代谢产物可降低胆固醇浓度，或由于乳酸菌可将胆固 醇有效地同化或将其捕住使之不能进人血液心1 1 。 ( 5 ) 抗高血压功能 根据t a k a n o 初步研究表明，益生菌食品能在一定程度上控制血压。其抗高血压 效果在先天性高血压老鼠实验中得到证实瞄1 。k a n a g a w a 从啤酒酵母和瑞士乳杆菌发 4 益生菌l g g 对酸奶品质及贮藏性能影响的研究 酵乳中分离的三肽物质( v a l p r o p r o 和l i e p r o p r o ) 具有抑制血管紧张素转移酶活 性的作用。与其它机制不同的是这里起作用的是益生菌的发酵产物，而不是活的益 生菌n 刀。 ( 6 ) 其他功能 益生菌对人体的健康促进作用还包括促进泌尿系统健康、减弱放射性同位素的 作用、降低与酒精中毒性肝病相关的内毒素的作用等。 1 2 益生菌酸奶 1 2 1 益生菌在酸奶中的应用 乳酸菌产业在全球市场的增长率超过9 ，含有益生菌的食品基本以奶制品为 主，所用菌种主要为乳酸菌和双歧杆菌，产品类型主要是添加了益生菌的液态奶和 酸奶。国外发酵型乳酸菌奶饮品比较发达，日本、欧洲发酵乳酸菌奶饮料在乳制品 市场的比例已达到8 0 ，北美约为3 0 。2 0 0 3 年全球乳制品总产值就超过3 0 0 亿美 元，其中使用益生菌的乳制品超过5 0 亿美元。2 0 0 5 年全球范围内富含益生菌食品 的市场份额为1 0 0 亿欧元，乳制品所占比例最高，约7 4 5 ，其中，酸奶又占益生 菌乳制品的7 4 ；而益生菌类膳食补充剂的市场份额大约为4 亿欧元，这两个市场 都在以两位数的速度增长n 引。 表2 市场上主要使用的典型益生菌 我国的乳酸菌产业主要包括发酵型酸奶、乳酸菌饮料、益生菌、乳酸菌饲料、 发酵型泡菜、发酵型肉制品，医药保健品等产品。其中发酵型酸奶成为推动我国乳 内蒙古农业大学硕士学位论文5 酸菌产业发展的主导产品，而乳酸菌饮料市场近年来异军突起，发展潜力巨大。酸 牛奶产品由2 0 0 1 年的3 0 9 万t 增加到2 0 0 5 年的1 6 1 9 万t ，乳酸菌饮料产量由2 0 0 1 年的1 4 3 万t 增加到2 0 0 5 年的1 0 7 6 万t 。1 9 9 7 年以后，中国的酸奶企业从国外引 进直投式酸奶发酵剂。目前我国8 0 乳品加工企业，主要是大型企业采用的基本是 直投式酸奶发酵剂。活菌数一般为1 0 l o 1 0 1 2 c f u g 。 目前市场上较成功的直投式发酵剂可根据酸奶厂家对风味特征、口感、粘稠度、 风味、香型，酸奶类型等要求，提供不同类型的菌种配方供酸奶生产厂家灵活选择， 用来生产具有个性化的酸奶产品。市场上主要使用的典型益生菌列于表2 中乜4 1 。 1 2 2 益生菌酸奶的质量问题 我国的益生菌发酵乳制品市场刚刚起步，随着我国消费者饮食习惯已经从精细 转变为健康绿色，代表着健康的益生菌制品将会全面占领市场。目前国内酸奶市场 上较为领先的品牌如伊利、蒙牛、光明、达能、味全等，每年都会根据市场需求， 推出部分新品来活跃市场。如伊利的l g g 酸牛奶、优品酪乳酸牛奶( a b 菌) ，蒙 牛的冠益乳酸牛奶和蒙牛酸酸乳( 富含l a b s 益生菌群) ，光明的健能a b l 0 0 、e + 益生菌酸牛奶，达能的碧悠b e 8 0 益生菌，味全的健百分( l c 0 1 活力c 菌) 、优酪 乳( 龙根b 菌) 等等。 酸奶作为一种细菌发酵型乳制品，逐渐由高酸性向低酸性发展，人们普遍喜爱 低酸、低脂、富含营养素，具有活性且风味良好的酸奶。通常在酸奶中加入的益生 菌主要包括：嗜酸乳杆菌和双歧杆菌n 引，但由于嗜酸乳杆菌产酸能力较强，双歧杆 菌代谢会产生醋酸等代谢产物瞳引，因此会使生产的酸奶出现后酸化及不良风味的问 题，酸奶的货架期缩短位7 1 ，限制了益生菌酸奶的普及。目前发达国家的益生菌酸奶 以果味型为主，而且在产品的终端销售中有完善的冷链保证，几乎不存在上述品质 问题，而在我国冷链不完善的情况下，益生菌酸奶后酸化和不良风味问题显得尤为 突出。所以我国对益生菌酸奶的开发要以益生菌的生物特性为基础，从影响酸奶品 质的主要因素出发，改善酸奶由于益生菌的添加而出现的后酸化、不良风味等品质 问题。 1 3 益生茵酸奶的研究现状 虽然目前益生菌酸奶在国内外都是乳制品专业制造商竞相开发的产品，成为一 些厂家的新卖点，但在选用优良的益生菌发酵剂的同时更要注意产品质量的控制， 除了保证其中有相当数量的活的益生菌之外，还要注重消费者非常关注的口感。后 酸化是酸奶品质的主要问题，严重影响了消费者对酸奶的接受性和酸奶的普及与发 展。 目前国内所采用的控制酸奶后酸化的方法主要有发酵后二次杀菌和高压处理方 6 益生菌l g g 对酸奶品质及贮藏性能影响的研究 法、调整保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例、改变细胞膜的通透性、添加细菌素 笠 寸。 发酵后二次杀菌和高压处理方法虽然解决了酸奶的后酸化问题，但得到的酸奶 因不含有活菌而达不到国际乳品联合会( i d f ) 对酸奶制品的要求( 发酵乳制品中需含 1 0 f u m l 活菌数) 。中华人民共和国行业标准乳酸菌饮料( 报批稿) 中规定乳酸菌 发酵制成的酸奶饮料中，乳酸菌的数量需为1 0 5 1 0 6 c f u m l ，这样才能达到乳酸菌 在人体内的生理学保健功能砼引；在酸奶发酵剂中，调整保加利亚乳杆菌和嗜热链球 菌的比例，增加球菌对杆菌的比例可使酸奶后发酵减弱。研究表明，球菌与杆菌之 间的比例为1 5 ：1 ，所生产的酸奶质量是最优的旺引；郭清泉( 2 0 0 1 ) 通过在酸奶中添 加牛胆盐明显抑制了酸奶的后酸化现象，但牛胆盐价格偏高，应用前景不乐观们： 在奶中添加n i s i n ，然后接种菌到乳中并直到凝固。n i s i n 抑制了乳酸菌的繁殖，并 降低了总菌数，延长了发酵时间，但只要选择合适的剂量和适当的添加方式，就既 可以使酸奶活菌数达到国家标准，又能抑制酸奶的后酸化，延长保质期，提高酸奶 的风味口，徐成勇、吴吴等人( 2 0 0 6 ) 通过改变嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的比 例和添加乳酸链球菌素来控制酸奶后酸化口列。 国外发达国家具有完善的冷链设施，对酸奶的后酸化问题是从乳酸菌细胞、基 因水平上进行研究的，并以获得在高温下产酸能力强，低温下产酸能力弱( 或根本不 产酸) 的菌株作发酵剂，丹麦汉森公司所产的发酵剂在冷藏条件下发酵乳糖产酸能力 很弱，但是在目前冷链还不完善的我国并不适用。 1 4 本课题研究的意义和主要内容 益生菌发酵糖类产生乳酸、乙酸等有机酸，能使消化道的p h 降低，形成一种 酸性环境，并且对宿主一系列的生理过程进行调节。乳酸菌在肠腔内释放的各种酶 可以对消化过程起协同作用，并减缓部分肠道吸收不良的症状，如在亚洲人群中最 为常见的乳糖不耐症等。细菌素等抗菌物质的产生能提高益生菌在体内的抗菌作用， 增加了其作为生物治疗方法的应用潜力p 3 一1 。此外，益生菌降低血清胆固醇水平和 血脂浓度以及抗高血压、抗肿瘤的作用成为近年来研究热点m 1 。有大量的动物实验 和临床试验对多种益生乳酸菌的功能进行验证，同时进行的还有其对免疫功能的调 节作用研究。一般认为益生菌的这些功能与其在发酵食品中产生的生物活性物质如 生物活性肤和胞外多糖等密切相关。 l g g ( a t c c 5 3 1 0 3 ) 是一株己申请专利的鼠李糖乳杆菌菌株( l a c t o b a c i l l u s r h a m n o s u s ) ，2 0 世纪8 0 代初由两位美国教授s h e r w o o dg o r b a c h 和b a r r yg o l d i n 从 健康人体肠道中分离出来，并以乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) 和两位美国教授姓名( g o r b a c h 和g 0 1 d i n ) 的第一个字母连接命名n 引。当时筛选菌种的标准是必须来自健康人体肠 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 道、黏附于上皮细胞、能够定殖于人体肠道、能够产生抑菌物质、具有良好的生长 特性等。1 9 8 7 年，芬兰维利奥公司获得了l g g 的全球唯一授权。目前，全球3 0 多 个国家和地区已有l g g 产品生产和销售。 目前，l g g 的研究文献是所有益生菌中最多的，其安全性和功能性均有大量的 科学实验所证实。大量的科学实验表明，l g g 具有以下功能： ( 1 ) 平衡肠道菌群，改善肠道功能 细胞培养实验表明：l g g 能够减少鼠伤寒沙门氏菌对细胞的侵入。动物实验表 明：l g g 可以保护肠道免受有害菌的入侵。与对照组相比，摄入l g g 的老鼠的肠 道中沙门氏菌的数量明显少得多。而且，被沙门氏菌感染的老鼠摄入l g g 后，可 以活更长的时间。 ( 2 ) 预防和治疗腹泻 o b e r h e l m a n 等对营养不良的儿童腹泻进行了1 5 个月的研究，发现l g g 对于腺 病毒引起的腹泻具有明显预防效果口引。l g g 对1 8 2 9 个月的孩了腹泻的预防是十分 有效的，而且，它主要对非母乳喂养的孩了腹泻的预防更为有效。研究发现l g g 对儿童因抗生素治疗引起的腹泻腹痛有明显的治疗效果，且l g g 无任何副作用。 o k s a n e n 等在土耳其对一些旅行者进行的研究发现，若一天日服两次l g g 产品， 对旅行者腹泻的治疗是十分有效的m 。h i l t o n 等对美国去亚洲、东非、南美等地的 旅行者腹泻发病情况进行了研究，发现每天日服一粒l g g 胶囊可预防旅行腹泻的 发生，且发现l g g 对以前从未发生旅行腹泻者更为有效h 。 l g g 和l a c t o p h i l u s 粉、酸奶发酵剂进行治疗腹泻效果的比较，发现只有l g g 对腹泻的加速恢复有作用，因为l a c t o p h i l u s 也含有鼠李糖乳杆菌菌株，所以相同种 的不同菌株在功能上也会有很大的差别。 ( 3 ) 提高机体免疫力 临床实验证明：l g g 可以增强i g a 对食物抗原的抵抗力。一些消炎药能够引起 胃肠道黏膜的渗透性增加甚至出血，而l g g 可以帮助胃黏膜的渗透性保持正常。 m a j a m a a 等人研究了因牛乳过敏而发生湿疹的儿童，当他们摄入不含牛乳的l g g 产品后，患者症状和程度大大减轻了幻。 l g g 可以增加非特异性免疫反应，明显地降低因过敏而产生的炎症。一方面， l g g 可以增加免疫防御能力，促进免疫反应，另一方面，l g g 还可以减少过敏反 应中的过度活性免疫反应。 ( 4 ) 保护胃黏膜 当发生肠炎或微生物菌群平衡被打破的时候，胃黏膜的渗透性就会增加，大的 抗原分子和肠道微生物就可以穿过黏膜进入系统。当实验动物摄入l g g 后，黏膜 的成熟过程就变得正常了，抗原的渗透也得到很好的控制。上述实验结果与免疫球 蛋白a ( i g a ) 有很大关系。 8 益生菌l g g 对酸奶品质及贮藏性能影响的研究 ( 5 ) 降低水解酶的活性，减少毒素 结肠中的微生物菌群与结肠癌的发病率有很大关系。肠道微生物的水解酶类可 以将食物中的致癌物质前体转化为致癌物。l g g 发酵奶则可以降低这些结肠中水解 酶( d 葡糖苷酸酶、甘氨胆酸水解酶、硝基降解酶、胰蛋白酶等) 的活性以及尿中 有毒的p 甲酚的分泌。 此外，研究者还发现l g g 可以结合一些细菌毒素，如黄曲霉毒素和葡萄球菌 毒素等。 ( 6 ) 预防龋齿 早期的研究主要集中在胃肠道方面，但最近的一些研究表明，l g g 对龋齿也具 有一定的作用。m e u r m a n 教授等人研究了l g g 对儿童龋齿的预防作用阳1 。实验对 象为4 5 1 名1 6 岁的儿童，实验期为7 个月。结果发现，l g g 对龋齿的发生具有一 定的预防作用。龋齿的产生主要与一些细菌产酸有关，而l g g 能够抑制这些细菌 的生长，从而对牙齿产生保护作用。 本课题主要针对目前我国益生菌酸奶普遍存在的后酸化及风味问题，以添加 l g g 的酸奶为研究对象，对发酵结束以及储藏过程中酸奶的酸度、l g g 活菌数、 风味物质、有机酸等指标进行跟踪监控，通过对实验条件的优化，使l g g 酸奶的 品质得到进一步的提高，为酸奶的生产和研究提供试验数据和理论依据。具体研究 内容如下： ( 1 ) 益生菌l g g 对酸奶理化性能影响的研究 ( 2 ) 引起l g g 酸奶后酸化主要因素的确定 ( 3 ) 防止l g g 酸奶后酸化控制措施的研究 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 试验菌株 发酵剂g 0 1 8 ：嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 和保加利亚乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 混合菌种，由丹麦丹尼斯克( d a n i s c o ) 公司提供。 发酵剂y o m i x 8 6 3 ：嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 和保加利亚乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 混合菌种，由丹麦丹尼斯克( d a n i s c o ) 公司提供。 发酵剂y o f l e xg 0 6 1 ：嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 7 ( f l 保加利亚乳杆 菌( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 混合菌种，由科汉森( c h rh a n s e n ) 公司提供。 发酵剂y f l 8 1 2 ：嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 和保加利亚乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 混合菌种，由科汉森( c h rh a n s e n ) 公司提供。 l g g ：鼠李糖乳杆菌l r h a m n o s u sg g ，由芬兰维里奥( v a l i o ) 公司提供。 n c f m ：嗜酸乳杆菌，由丹麦丹尼斯克( d a n i s c o ) 公司提供。 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 b b 1 2 ：双歧杆菌，由科汉森( c h rh a n s e n ) 公司提供。 a b y ( g 0 2 5 ) ：嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌种，由科汉森( c h rh a n s e n ) 公 司提供。 2 1 2 培养基 检测培养基：m r s 琼脂培养基添加0 0 5 e d l 万古霉素，1 1 5 灭菌1 5 m i n 。 2 1 3 试验用药品及仪器设备 2 1 3 1 药品 标准酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、乳清酸、柠檬酸、尿酸、马尿酸、 丙酮酸( s i g m a 公司) ： 双乙酰( 标准品，s i g m a 公司) 、乙醛( 标准品，s i g m a 公司) ； l 乳酸测定试剂盒( r b i o p h a r m 公司) ； 无水甲醇( 色谱纯) ，磷酸、磷酸二氢钠( 优级纯) ： 邻苯二胺、盐酸、碘、亚硫酸氢钠、碳酸氢钠、淀粉、三氯乙酸、氢氧化钠( 分 析纯) 。 2 1 3 2 仪器设备 j j t - 9 0 0 型洁净工作台； l r h 2 5 0 i i 型微电脑控制生化培养箱； m s 2 型迷你振荡器； o l y m p u sc x 3 l 型生物显微镜； a g 0 2 5 型厌氧罐； 岛津l c 一1 0 a 液相色谱仪系统； s i g m a3 k 3 0 型冷冻离心机； 7 5 6 p c 型紫外分光光度计； m i l l i q 型超纯水器： g f l 型超低温冰柜； h v e 5 0 型全自动高压灭菌锅； m e t r o h m7 8 5d m pt i t r i n o 型电位滴定仪： a b l 0 4 型电子天平； c 1 0 p 2 1 型循环水浴锅； k q 7 0 0 v d v 型双频数控超声波清洗器： m z 2 0 7 0 m g z 微波炉等。 1 0 益生菌l 6 g 对酸奶品质及贮藏性能影响的研究 2 2 试验方法 2 2 1活菌数的检测 酸奶中l g g 的检测方法：称取1 0 9 含有l g g 的酸奶样品，用含有l g l 蛋白胨 的生理盐水梯度稀释，吸取合适稀释度的溶液l m l 于无菌培养皿中，倒入5 0 c 左 右的灭菌检测培养基，立即混匀，待凝固后倒置，3 7 c 厌氧培养3 6 7 2 h ，观察菌落 生长情况并计数m 1 。 2 2 2 滴定酸度( ot ) 的测定 按照g b t 5 4 1 3 1 9 9 7 ，称取5 9 酸奶放入1 5 0 m l 三角瓶中，加入4 0 m l 冷却煮 沸水，再加入5 滴5 9 l 的酚酞酒精溶液，小心摇匀，用o 1 0 0 0 m o l l 的n a o h 标准 溶液滴定至微红色，在3 0 s 内不消失为宜，同时做空白试验。 酸度( o t ) = ( n v o ) x m x l o o ( o 1 0 0 0 m ) 。 一样品消耗n a o h 的体积，m l ； 一空白消耗n a o h 的体积，m l ； 删a o h 标准溶液的准确摩尔浓度，m o l l ； m m 酸奶样品的准确质量，g 。 2 2 3 双乙酰的测定 双乙酰和邻苯二胺反应生成2 ，3 一二甲基并吡嗪，生成物盐酸盐在3 3 5 n m 波 长下有最大吸收值，可对双乙酰进行定量测定“叼。 2 2 3 1 建立双乙酰浓度标准曲线 ( 1 ) 双乙酰标准溶液：用微量进样器吸取2 0 9 l 双乙酰标准品，溶于蒸馏水中， 并定容至5 0 0 m l 。 ( 2 ) 分别取0 0 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 m l 的标准溶液于6 个1 0 m l 容量瓶 中，并用蒸馏水补足1 0 m l 。取1 0m l 上述双乙酰标准溶液加入1 0 m l l 6 的三氯乙 酸溶液，混匀，这样双乙酰标准溶液的浓度分别为0 0 、4 0 、8 0 、1 2 0 、1 6 0 、2 0 0 l a g m l 。 ( 3 ) 取两支试管，分别加入不同浓度的双乙酰标准溶液1 0 m l ，并向其中一支 管中加入o 5m l l 的邻苯二胺溶液，另一支不加作为空白，摇匀后置于黑暗处放置 3 0 m i n 。 ( 4 ) 反应完全后分别加入4 0 m o l l 盐酸溶液2 0m l 和2 5m l 终止反应，混匀 后以不加邻苯二胺的溶液为参比，在3 3 5 n m 下用石英比色杯测定吸光度值。 ( 5 ) 以双乙酰浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 内蒙古农业大学硕士学位论文 趔 舍 o1 0 双乙酰标样浓度( p g m l ) 图i双乙酰浓度标准曲线 5 0 2 2 3 2 酸奶样品中双乙酰浓度的测定 酸奶3 0 9 ，加3 0 m l l 6 1 拘- - 乙酸溶液，混匀，静置1 0 m i n ，4 c 下离心 ( 1 0 0 0 0 9 ) l o m i n 离心2 遍，以灭菌乳作为空白。重复上述过程的3 、4 步，然后查双 乙酰的标准曲线可求得待测样品中双乙酰的浓度( p 曲。 2 2 4 乙醛的测定 乙醛在酸性条件下与亚硫酸氢钠发生加成反应生成乙醛亚硫酸氢钠，其剩余的 亚硫酸氢钠被碘氧化。在碱性条件下，乙醛亚硫酸氢钠与碘定量反应，根据当量关 系计算乙醛含量m 1 。 反应式如下： 酸性条件下： c h 3 c h o + n a h s 0 3 = c h 3 c h o h s 0 3 n a ，n a h s 0 3 + 1 2 + h 2 0 = 2 h i + n a h s 0 4 碱性条件下： c h 3 c h o h s 0 3 n a + 1 2 + h 2 0 _ c h 3 c h o + n a h s 0 4 + 2 h i 精确量取2 0 0 m l1 的n a h s 0 3 溶液于2 5 0m l 具塞三角瓶中，加入处理后( 同 双乙酰处理方法) 酸奶样1 0 m l ，摇匀，在室温下放置- d , 时后，加入l m l l 淀粉溶 液，用o 1 0 0 0 m o l l 的碘标准溶液滴至接近终点，再用o 0 1 0 0 m o l l 碘标准溶液滴定 至终点( 淡蓝紫色，3 0 s 内不褪色) ，不计数。再加2 0 m ll m o l l 的n a h c 0 3 ，振荡混 匀至溶液蓝色消失，用0 o l o o m o l l 碘标准溶液滴定至终点，记录消耗的标准碘液 的体积，同时做空白试验。 计算公式：乙醛含量( p g ) = ( 乃v z ) x c x o 0 2 2 x 1 0 6 1 0 乃一样品滴定消耗1 2 标准溶液的体积m l ： 如一空白滴定消耗1 2 标准溶液的体积m l ； 12 益生菌l g g 对酸奶品质及贮藏性能影响的研究 c l l 2 1 2 标准溶液的浓度m o l l ； o 0 2 2 一乙醛化学反应基本单位g ； 1 旺乙醛样品称样量m l 。 2 2 5 有机酸的测定 实验采用岛津l c i o a 液相色谱系统自动进样分析。 色谱柱：a q c 18 ，5 肛m ，4 6 m m x 2 5 0 m m 。 色谱条件：流动相为体积比为3 ：9 7 的甲醇与p h 为2 0 0 的磷酸磷酸二氢钠缓 冲液( 浓度为l o m m o l l ) ，流速0 5 m l m i n ，吸收波长2 1 0 n m ，柱温3 5 。c ，进样量 l oj - t l 。 2 2 5 1 有机酸标准曲线的制作 以7 个不同质量浓度的有机酸混合标准液各进样l o i _ t l 测定峰面积( a ) ，绘制峰 面积( a ) 对质量浓度( c ) 的标准曲线，结果如表3 所示。由表3 可以看出，在所在的 进样量范围内，线性关系理想。有机酸标准品进行h p l c 分析后的色谱图如附图1 所示。 表3 有机酸标准曲线线性范围 注：a 为面积；c 为质量浓度( p 咖l ) 2 2 5 2 酸奶中有机酸的测定 样品前处理：准确称取0 5 0 0 0 9 酸奶样品置于1 0 m l 容量瓶，加8 m l 浓度为 0 0 1 m o u l 的硫酸溶液振荡3 0 s 后定容，4 c 下离，t , ( 3 5 0 0 9 ) 1 0 m i n ，取清液经0 4 5 1 a m 膜过滤进样分析h 刀。酸奶样品采用与有机酸标准溶液相同的色谱条件进行h p l c 分 析，通过查各有机酸标准曲线计算浓度。酸奶样品的有机酸色谱图如附图2 所示。 2 2 6l 一乳酸的测定 采用l 哥l 酸测定试剂盒( r b i o p h a r m 公司) 测定。 内蒙古农业大学硕士学位论文 2 2 7 数据统计与分析 数据分析采用s a s 进行数据处理。 2 3 酸奶的制作工艺 全脂鲜牛乳_ 预热( 6 5 7 0 ) 一加6 蔗糖一混合均匀一杀 菌( 9 0