（食品科学专业论文）红曲米中产凝乳酶菌株的筛选、鉴定及固态发酵条件的研究.pdf

i 知 ； 噜 at h e s i ss u b m i t t e df o r t h e a p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo f e n g i n e e r i n g s c r e e n i n gc h y m o s i n - m i c o o r g a n i s mi nm o n a s c u s ， i d e n t i f i c a t i o no ft h el i v i n ga n d o p t i m i z a t i o no fs o l i d s t a t e c a n d i d a t e ： s p e c i a l t y ： f e r m e n t a t i o nc o n di t i o n s g uz h e n l e i f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw a n g c h e n g z h o n g s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h t i n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 4 j _ 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义一i - _ 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名：闩期：垄皇鱼年乞l 月2 兰l 同 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名： 同期：2 立屋年之月二冱同 同期：2 受皮年鱼一月丝同 k ； 山东轻丁业学院硕f ：学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i 第l 章绪论l 1 1 研究背景1 1 1 1 凝乳酶1 1 1 2 凝乳酶的结构及其特性一l 1 1 3 凝乳酶的凝乳机理1 1 1 4 凝乳酶的分类研究。2 1 1 5 凝乳酶的应用研究一4 1 2 论文的研究内容及其意义6 1 2 1 本课题研究内容6 1 2 2 本课题的研究意义6 第2 章红曲米中产凝乳酶菌株的筛选与鉴定7 2 1 引言7 2 2 材料与方法7 2 2 1 材料与设备7 2 2 2 菌种的分离方法8 2 2 3 形态结构和培养特性观察9 2 2 4 菌株特性实验1 0 2 3 结果与讨论。1 0 2 3 1 筛选所得新菌株的凝乳性试验1 0 2 3 2 形态结构一1 0 2 3 3 培养特性1 2 2 4 小结1 4 第3 章固态发酵培养基及发酵条件的优化。1 5 目录 3 1 引占15 3 2 材料与方法15 3 2 1 材料15 3 2 2 菌株与培养基15 3 2 3 试剂15 3 2 4 仪器设备1 5 3 2 5 方法1 6 3 3 结果与讨论1 6 3 3 1 碳源对产酶的影响1 6 3 3 2 氮源对产酶的影响1 7 3 3 3 p h 对产酶的影响1 8 3 3 4 培养基含水量对产酶的影响1 9 3 3 5 会属离子对产酶的影响2 0 3 3 6 葡萄糖加入量对酶活的影响2 l 3 3 7 培养时间对产酶的影响2 2 3 3 8 培养温度对产酶的影响2 3 3 3 9 培养基成分的正交实验状况2 4 3 4 小结2 6 第4 章凝乳酶的分离纯化2 7 4 1 引言2 7 4 2 材料2 7 4 2 1 材料2 7 4 3 方法2 8 4 3 1s e p h a d e x g 一7 5 分子筛层析2 8 4 3 2 阴离子交换层析2 8 4 3 3 凝胶电泳2 9 4 4 结果与讨论3 0 4 4 1 凝乳酶的分离纯化3 0 4 4 2 凝胶电泳3l 4 5 小结3l 第5 章红曲凝乳酶在乳酪生产应用中的初步研究3 3 2 山东轻- r 业学院硕i j 学位论文 5 1 引言一3 3 5 2 材料3 3 5 2 1 材料3 3 5 2 2 菌株与培养基3 3 5 2 3 试剂3 3 5 2 4 仪器设备3 3 5 3 方法3 4 5 3 1 乳酪的制作方法3 4 5 3 2 食品物性仪乳酪品质的测定方法及其相关参数3 4 5 4 结果与讨论3 5 5 4 1 凝乳酶的添加量对乳酪品质的影响3 5 5 4 2 不同c a 2 + 浓度对乳酪品质和结构的影响3 6 5 4 3 不同乳酸菌发酵时i 日j 对乳酪品质和结构的影响3 7 5 4 4 不同加盐量对乳酪品质和结构的影响3 8 5 4 5 不同凝乳温度对乳酪品质和结构的影响3 9 5 4 6 证交试验分析4 0 5 4 7 凝乳酶对不同乳成乳酪的影响4 3 5 4 8 不同种凝乳酶对乳酪的影响4 5 5 4 9 红曲凝乳酶奶酪与市售奶酪的比较4 7 5 5 小结4 7 第6 章工作总结与展望4 9 1 1 工作总结4 9 1 2 展望4 9 参考文献5 l 致谢5 5 在学期间主要科研成果5 7 l 山东轻丁业学院硕i ? 学位论义 摘要 干酪营养丰富，味道鲜美，贮存期长且种类繁多，是世界食品中的重要组成部 分，素有“乳制品之王”之称。在干酪的加工处理过程中，凝乳酶应引起人们足够 的关注。世界上生产奶酪主要用小牛皱胃酶，致使每年宰杀小牛5 0 0 0 多万头，但 仍不能满足r 益增加的市场需求，凝乳酶有着广阔的开发前景。 本文从红曲米中分离筛选产凝乳酶的菌株，评估菌株的发酵和产凝乳酶的特 性，筛选出了适用于生产凝乳酶的菌株。经p d a 培养基培养，培养仞期为白色小 菌落，经过培养后，菌落开始老熟，表面的逐渐变化长出绒毛，菌落颜色丌始改 变，由白色逐渐为红色、紫色、深紫色、紫黑色，菌落凸起，中心下陷，菌落的 主要形状绒毯状，长时间培养菌落出现放射状的沟纹，边沿平滑整齐。扫描电镜 观察发现：细胞成椭球犁，表面有凹陷。 经实验发现：该菌株传代8 次后凝乳性依然稳定，最适生长温度为3 0 一 3 5 ，凝乳酶为该菌株的次级代谢产物，发酵过程中p h 值有较小幅度下降，然 后稳定在p h 6 5 左右。 同时，本文还得到了菌种固态发酵的最有条件：最佳碳源为糯米，最佳氮源 为豆粕，最佳发酵仞始p h 6 5 ，最佳发酵温度为3 0 。c ，最佳发酵时问为1 2 天。培 养基最佳配比为碳氮比为5 ：2 ，葡萄糖添加量为3 5 ，氯化钙添加量为1 5 ， 磷酸氢二钾添加量为2 o ，含水量为6 0 。在上述条件下，料酶液中凝乳酶的酶 活。i 叮以达至09 0 5 6 s u m l 。 取料酶液，经离心，低温浓缩，葡聚糖g - 7 5 分子筛层析和纤维素阴离子交换 层析，得到了纯度较高的凝乳酶。其中，葡聚糖分子筛层析分离中后两个峰为活 性峰，纤维素凝胶的离子交换层析中n a c i 浓度0 4 m o l l 的活峰中凝乳酶纯度较 高，得到的产品为电泳纯。 将红曲凝乳酶初步应用到奶酪的制作中，相同工艺条件下，红曲霉发酵液作 为凝乳酶相对于小牛皱胃酶作为凝乳酶对乳酪品质的影响，大约相差8 4 。 关键字：筛选；凝乳酶：固态发酵；分离纯化；初步应用 a b s t r a c t c h e e s e ，n u t r i t i o u sa n dd e l i c i o u s ，s t o r a g ea n daw i d er a n g eo fl o n gp e r i o d i sa n i m p o r t a n tp a r to ff o o di nt h ew o r l d ，k n o w na s ”k i n go f d a i r yp r o d u c t s ，”s a i d c h e e s ei n t h ep r o c e s s i n g , c h y m o s i ns h o u l da r o u s es u f f i c i e n ta t t e n t i o n c h e e s ep r o d u c e di n t h e w o r l di sm a i n l yu s e dc h y m o s i n ，r e s u l t i n gi na ns l a u g h t e ro fm o r et h a n5 0 0 0m i l l i o n c a l v e say e a r i ts t i l lc a nn o tm e e tt h em a r k e td e m a n d i ti s b r o a dd e v e l o p m e n to f c h y m o s i n i n d i s s e r t a t i o n ，o n e m i c r o o r g a n i s m ，p r o d u c i n gc h y m o s i nw a si s o l a t e d 舶m m o n a s c u s t h em i c r o o r g a n i s mi nt h ep d a c u l t u r em e d i u ms h o w ：s m a l lw h i t e c o l o n i e s i nt h ei n i t i a lp e r i o d ，a n dt h e nt h ec o l o n i e sb e g a nt oo l dg r o w t h ，f u z zg r o w i n g a tt h e s a m et i m e ，c o l o n yc o l o rb e g a nt o c h a n g eg r a d u a l l yf r o mw h i t et or e d ，p u r p l e d a r k p u r p l e ，p u r p l i s hb l a c k c o l o n i e sc o n v e x ，t h ec e n t e rs u b s i d e n c e ，t h em a i ns h a p eo f c a r p e t 。l i k ec o l o n i e s ，t i m et on u r t u r ec o l o n i e sa p p e a rr a d i a lg r o o v e s ，e d g e ss m o o t ha n d t i d ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ef o u n dt h a t ：c e l li n t ot h ee l l i p s o i dt y p e s u r f a c e d e p r e s s i o n t h ee x p e r i m e n tf o u n dt h a t ：t h es t r a i n s ，p a s s a g e de i g h t t i m e s ，r e m a i n e ds t a b l e t h e o p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r ei sb e t w e e n3 0 t o3 5 c h y m o s i ni st h es e c o n d a r y m e t a b o l i t e so fs t r a i n s t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sh a v eas m a l l e rd e c l i n ei np h ，a n dt h e n s t a b i l i z e da tp h 6 5o rs o m e a n w h i l e ，t h ep a p e ra l s or e c e i v e dac o n d i t i o n a ls t r a i no ft h em o s ts o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n ：t h eb e s tc a r b o ns o u r c ef o rt h er i c e ，t h eb e s tn i t r o g e ns o u r c ef o rs o 、，b e a n m e a l ，t h eb e s tf e r m e n t a t i o ni n i t i a lp hf o r6 5 ，o p t i m a lf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ef o r3 0 ，o p t i m u mf e r m e n t a t i o nt i m ef o r12d a y s t h eb e s tr a t i oo fc a r b o na n dn i t r o g e no f 5 ：2 ，g l u c o s ea d d i n ga m o u n to f3 5 ，c a l c i u mc h l o r i d e a d d i n ga m o u n to f1 5 d i p o t a s s i u mh y d r o g e np h o s p h a t ea d d i n ga m o u n to f2 0 ，w a t e rc o n t e n to f6 0 i nt h e a b o v e - m e n t i o n e dc o n d i t i o n s ，t h ec r u d ee n z y m el i q u i d - c l o t t i n ge n z y m ea c t i v i t yc a nb e a c h i e v e d9 0 5 6 s u m l c r u d e e x t r a c t ， o b t a i n e d b yc e n t r i f u g a t i o n ，l o wt e m p e r a t u r e c o n c e n t r a t i o n s e p h a d e x g - 7 5m o l e c u l a r s i e v e c h r o m a t o g r a p h ya n dc e l l u l o s ea n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , h a sb e e nah i g hp u r i t yc h y m o s i n a m o n gt h e m ，s e p h a d e xg 7 5 m o l e c u l a rs i e v ec h r o m a t o g r a p h yi nt w op e a k so fa c t i v i t ya f t e rt h ep e a k ，c e l l u l o s e g e l i o n 。e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yi nt h en a c lc o n c e n t r a t i o no f0 4 m o l lp e a ki nt h e c h y m o s i no fl i v eh i g hp u r i t yp r o d u c to b t a i n e d e l e c t r o p h o r e s i sp u r ec h y m o s i nw i l l a b s t r a c t i n i t i a l l yb ea p p l i e dt ot h ep r o d u c t i o no fc h e e s e o nt h es a m ep r o c e s sc o n d i t i o n s ，m o n a s c u sf e r m e n t a t i o nb r o t h ，a sc o m p a r e d ，i s u s e dt ot h ec h e e s ea saq u a l i t yo fa b o u tad i f f e r e n c eo f8 4 t oc a l fc h y m o s i n k e y w o r d s ：s c r e e n i n g ；c h y m o s i n ；s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ； p r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o n u 山东轻t 业学院硕i ? 学位论义 第1 章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 凝乳酶 凝乳酶是乳酪，主产业的一种重要酶制剂，可以导致牛奶凝固。目前主要来源 为从未断奶的小牛胃中提取，随着乳酪生产逐年增加的刚性需要，凝乳酶的需求 量越来越大，据统计凝乳酶的产值占全世界酶制剂总量的1 5 左右。全球每年屠宰 小牛大约5 0 0 0 多力头，从而导致小牛的数量急剧下降。从生态学角度说，人与自 然和谐发展就是指人类在丌发利用资源时要有度、要有节制的丌发，因此，8 0 年 代以来欧美苏等发达困家对凝乳酶的研究从未停止过，目前用基因工程技术进行 凝乳酶的生产，取得了较好的经济效益和社会效益。我国对凝乳酶的研究起步较 晚，该酶现在主要靠进口。 1 1 2 凝乳酶的结构及其特性 小牛凝乳酶是存在于刚出生几天的小牛第四胃( 皱胃) 中的一种酸性水解酶。 这种凝乳酶原是有3 6 5 个氨基酸残基组成，在p h 葡萄糖 氯化钙 磷酸氮- 二钾 最佳配比a lb 3 c 1d 3 一一_ 第3 章同态发酵培养皋及发酵条件的优化 氯化钙添加量为1 5 ，磷酸氢二钾添加量为2 0 。 3 4 本章小结 综上所述最佳碳源为糯米，最佳氮源为豆粕，最佳发酵初始p h 6 5 ，最佳发 酵温度为3 0 c ，最佳发酵时间为1 2 天。培养基最佳配比为碳氮比为5 ：2 ，葡萄 糖添加量为3 5 ，氯化钙添加量为1 5 ，磷酸氢二钾添加量为2 o ，含水量为 6 0 ，在上述条件下，粗酶液中凝乳酶的酶活可以达到9 0 5 6 s u m l 。 山东轻t 业学院顾i ：学位论文 4 1 引言 第4 章凝乳酶的分离纯化 随着研究工作的不断深入，凝乳酶标准品的缺乏使得凝乳酶的研究工作受到 了严重影响，提纯成为重要技术难题之一，目前还没有既经济又有效的的分离纯 化方法，因此，利用现在分离技术来提高凝乳酶的纯度质量是目前研究的重点【5 6 1 。 本实验采用s e p h a d e xg 一7 5 ，纤维素凝胶对粗酶液进行分离纯化，用凝胶电泳 法定性检测分离酶的纯度。 4 2 材料 4 2 1 材料 4 2 1 1 菌株与培养基 菌种：红曲菌种 固态发酵培养基：糯米：豆粕= 5 ：2 ，葡萄糖添加量为3 5 ，氯化钙添加量 为1 5 ，磷酸氢二钾添加量为2 0 ，含水量为6 0 ，分装于5 0 0 m l 三角瓶中， 含水量为6 0 。 4 2 1 2 试剂 s e p h a d e xg 7 5 ，纤维素凝胶 d n s 试剂：酒石酸钾钠1 8 2 9 ，氢氧化钠2 0 8 ，苯酚5 9 ，水杨酸6 9 ，硫酸氢 钠5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，避光保存周后使用。 4 2 1 3 仪器设备 h d 9 7 1 核酸蛋白检测仪 b s z 1 0 0 自动部分收集器 x w t - s 小型台式记录仪 a c c u l a b 电子天平 t g l 一1 6 c 型高速离心机 h s 8 4 0 u 超净工作台 垂直板型电泳槽 x w t - s 小型台式记录仪 上海康华生化仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海自动化仪器三厂 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海安亭科学仪器厂 苏州净化设备有限公司 北京六一仪器厂 上海自动化仪器三厂 第4 章凝乳酶的分离纯化 层析柱、p e 手套、大号表面皿、5 0 或l o o g l 的微量注射器、直流稳压电源、 恒温水浴锅 4 3 方法 4 3 1s e p h a d e x g - 7 5 分子筛层析 s e p h a d e x g 7 5 凝胶的前处理称取适量的干凝胶，用浓度为0 0 2 m o l lp h 为 6 5 的磷酸盐缓冲液在1 0 0 惹溶胀2 小时或者室温f 溶胀2 4 小时。冷去后脱气。 装柱：选用2 5 x 3 0 0 m m 层析柱，垂直央于铁架台上。关闭层析柱出水口，然 后在搅拌状态下，将浆状的凝胶缓缓的注入柱内，使之自然沉降，打开柱出水口， 调节合适流速，使凝胶继续沉积。带沉积的胶面上升至距离柱子上口3 5 厘米时 关闭层析往出水口。 平衡：打丌核酸蛋白检测仪及记录仪电源丌关，将柱上端接口与储液瓶连接， 将柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连，f ：启柱出水口开关，调节流速 2 m l m i n ，用大约2 倍体积的p h 6 5 磷酸缓冲液平衡。流出液在蛋自检测仪上绘 出稳定的基线，即可上样。 上样：关闭柱子上下开关，用滴管小心吸出层析柱上层液体。打丌柱子出水 开关，使残余液体与胶面相切( 不要干胶) ，即可关闭出水 1 。吸取经浓缩的粗酶 液沿柱内壁加到凝胶表面( 切勿冲起凝胶颗粒) 。打丌出水口刀= 关，使样品进入凝 胶内，直到与胶面相切，立即用l m l 缓冲液冲洗柱壁，使其缓慢的进入凝胶内， 然后在胶面上端加入3 - 4 厘米高度的沈脱液。 沈脱：调节流速1 5 滴r a i n 开始洗脱，在检测仪上观察到开始出现j x l 湿进行 收集。 4 3 2 阴离子交换层析 羧甲基纤维素的前处理：称取1 0 9 羧甲基纤维素粉，置于2 5 0 m l 烧杯中，加 入l5 0 m l 浓度为o 5 m o l l 的氢氧化钠0 5 m o l l 的氯化钠溶液浸泡2 0 m i n 。然后 用布氏漏斗抽滤。蒸馏水冲洗至p h 8 0 左右，抽干。再移至2 5 0 m l 烧杯中，加入 1 5 0 m l 盐酸溶液浸泡2 0 m i n ，转移至布氏漏斗内，抽滤，蒸馏水冲洗至p h 6 0 左 右，最后转移到烧杯内，用1 5 0 r a l 浓度为0 0 2 m o l lp h 6 5 的磷酸盐缓冲液浸泡 约1 5 m i n ，经过真空干燥器脱气后就可以装柱。 装柱 装入柱内 就可加样 吸附 选用1 5 x 2 0 0 m m 层析柱，垂直央在铁架台上。将脱气后羧甲基纤维素 用同一缓冲液平衡，使流出液在核酸蛋白检测仪上绘出稳定的基线， 取经过经纯化的样品上样，待样品全部流入柱床后，用p h 6 5 的磷酸 山东轻下业学院硕i j 学位论文 盐缓冲液平衡，目的是吸取未被吸附的杂蛋白，直至基线稳定。 4 3 3 凝胶电泳 ( 1 ) 分离胶和浓缩胶的制备 按表4 1 所列的试剂用量配置分离胶 表4 1 不连续系统不同浓度凝胶配制用鼙表 t a b l e4 1s d sd i s c o n t i n u o u sg e ls y s t e mp r e p a r e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ns c a l e 分离胶浓缩胶缓冲液l o 1 0 h 2 0 抽1 0 总体 贮液 贮液 p h 9 8 s d st e m e d 气a p积 1 0 分离胶 6 6 7 m l5 m l0 2 m l2 m l 5 9 3 m l l o 0 2 m l2 0 m l m l n 3 浓缩胶3 m l0 1 m l2 m l3 5 5 m l0 1 m l1 0 m l 将所配制的凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面用细长头的滴管加至长、短玻 璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约l c m 。用滴管沿玻璃片内壁加一层 正丁醇( 用于隔绝空气，使胶面平整) 。约3 0 一_ 6 0 m i n 凝胶完全聚合，用滴管吸 去分离胶胶面的正丁醇层，用蒸馏水冲洗，再用无毛边的滤纸条吸去残留的水液。 按表4 1 配制浓缩胶，混匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到已聚合的分离 液上方，直至距短玻璃片上缘o 5 c m 处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内( 插入“梳子” 的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽) 。蒸馏水封到长 玻璃板边缘，约2 h 后凝胶聚合小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多 余的水分。 ( 2 ) 蛋白质样品的处理 标准蛋白质样品的处理 称标准蛋白质样品各l m g 左右，分别转移至带塞的小试管中，按1 0 1 5 9 l 溶液比例，向样品加入“样品溶解液”，溶解后轻轻盖上盖子( 不要盖紧，以免加 热时迸出) ，在1 0 0 沸水浴中保温2 - 3 m i n ，取出冷至室温。如处理好的样品暂 时不用，可放在2 0 。c 冰箱保存较长时问。使用前在1 0 0 。c 水中加热3 m i n 。 待测蛋白质样品的处理 固体样品的处理与标准蛋白质相同。如待测样品己在溶液中，可先配制“浓样 品溶解液”( 各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高l 倍) ，将待测液与“浓样品 溶解液”等体积混匀，然后同上加热。 ( 3 ) j j 日样 第4 章凝乳酶的分离纯化 将p h 8 3 的电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，应没过短玻璃片。用微量注射 器依次在各个样品凹槽内加样，一般加样体积为1 0 i r t l 。由于样品溶解液中含有密 度较大的甘油，所以样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。 ( 4 ) 电泳 接通电源丌始电泳，丌始电流要小，待样品全部进入后将电流调大。染料接 近下端时停止电泳。 ( 5 ) 后处理 将凝胶从电泳槽中剥出，放入固定液中，固定1 h ：染色，将凝胶放入染色液 中，染色2 h ：脱色，将凝胶放入脱色液中，脱色直到凝胶上有清晰地色带位置。 4 4 结果与讨论 4 4 1 凝乳酶的分离纯化 4 4 1 1 葡聚糖g 一7 5 分子筛层析 幽4 1 葡聚糖g 一7 5 分子筛层析分析幽 f i g u r e4 1d e x t r a ng 7 5g e lf i l t r a t i o na n a l y s i so ff i g u r e 由图4 1 可见，浓缩后的粗酶液样品经g 一7 5 分子筛层析分离后，得到的蛋 自峰形较多，测凝乳酶酶活，得到两个酶活峰，也就是后两个峰。 山东轻t = 业学院硕l j 学位论文 4 4 1 2 阴离子交换层析 图4 2 纤维素阴离子交换层析分析图 f i g u r e4 2f i g u r ec e l l u l o s ea n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y 用d e a e 纤维素5 2 进一步纯化，以p h 7 2 的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，以 含0 1 m o l l 、0 2 m o l l 、o 3 m o l l 、0 4 m o l l 及0 5 m o l ln a c l 浓度的缓冲液进 行梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的 凝乳酶。 4 4 2 凝胶电泳 将经分离纯化的高纯度的凝乳酶进行凝胶电泳分析，n a c i 浓度0 4 m o l l 的 活峰中凝乳酶纯度较高。 4 5 本章小结 经葡聚糖g 7 5 分子筛层析和纤维素凝胶的离子交换层析，得到了纯度较高 的凝乳酶。其中，葡聚糖分子筛层析分离中后两个峰为活性峰，纤维素凝胶的离 子交换层析中n a c i 浓度0 4 m o l l 的活峰中凝乳酶纯度较高，得到的产品为电泳 纯。 r 山东轻下业学院硕i j 学位论文 第5 章红曲凝乳酶在乳酪生产应用中的初步研究 5 1 引言 红曲凝乳酶作为一种新产品，实际的奶酪生产过程中能否应用，产品的口味、 感官、硬度、黏着度等物性参数能否达到标准，对以后的研究有着荤要的意义【5 7 】。 本实验对红曲凝乳酶在奶酪中的应用进行了初步研究。 5 2 材料 5 2 1 材料 马铃薯、葡萄糖、完达山无抗脱脂乳粉、完达山无抗全脂乳粉、无水氯化钙 粉术、蒸馏水、食盐、硼砂、临苯二甲酸氢钾等 硼砂缓冲液：准确称取1 0 5 下恒重的硼砂0 9 5 3 4 9 ，加少量蒸馏水溶解，加 蒸馏水定容至2 5 0 m l 。 小牛皱胃酶：内蒙古新宏生物科技有限公司 5 2 2 菌株 乳酸菌菌种：冷冻乳酸菌粉末经l ：5 的脱脂乳3 7 c 活化1 2 h ，用脱脂乳再次 扩培。 红曲菌种：本实验室保藏。 5 2 3 试剂 临苯二甲酸氢钾缓冲液：准确称取1 0 5 c 下恒重的临苯二甲酸氧钾2 5 5 2 9 9 ， 加少量蒸馏水溶解，加蒸馏水定容至2 5 0 m l 。 5 2 4 仪器设备 z h w y 一2 1i c 型摇床 上海福玛实验设备有限公司 h s 一8 4 0 p 型水平层流单人净化工作台苏州净化设备有限公司 电热恒温水浴锅北京市长凤仪器仪表公司 y p 3 0 0 1 n 型电子天平上海精密科学仪器有限公司 a c c u l a b 型电子天平s a r t o r i u sg r o u p p b l o 型p h 计 s a r t o r i u sg r o u p k q - a 1 0 0 0 d e 型数控超声波清洗器必能信超声( 上海) 有限公司 电热鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司 第5 章红f l i 凝乳酶住乳酪生产心用中的初步研究 g h x 9 0 8 0 8 1 型隔水式恒温培养箱 冰箱 食品物性测试仪 上海福玛实验设备有限公司 伊莱克斯 s t a b l em i c r os t r f e m s 5 3 方法 5 3 1 乳酪的制作方法 用马铃薯、葡萄糖和水做成p d a 培养基，将菌种接种到p d a 培养基中，置 于3 0 的摇床内生长7 天，经4 0 0 0 r m i n 离心所得的上清液即为本实验所用发酵 液。 单因素实验：测定不同因素对乳酪品质和结构的影响。 正交试验：确定最佳工艺条件。 对比试验：确定不伺乳原料和不通种类凝乳酶对乳酪品质和结构的影响。 工艺流程 乳粉还原_ 测定p h _ 巴氏灭菌_ 冷却一接种乳酸菌_ 乳酸菌发酵一测定 p h _ 添加凝乳酶_ 保温静置使其凝乳_ 切块_ 升温_ 排除乳清_ 凝块称重_ 加 盐一压榨一成熟_ 物性测试、感官品评 操作要点 乳粉还原：乳粉还原为液态奶不要有末溶解的粉末。 测定p h ：测定前要先校准p h 计。 接种乳酸菌：无菌操作，防止杂菌污染。 升温：温度升高到4 2 ，防止温度太高使酪蛋白变性。 物性测试：保证测定的奶酪块大小、厚度、形状均统一。 5 3 2 食品物性仪乳酪品质的测定方法及其相关参数 选取探头：本实验用的是p 5 0 探头。 连接电脑与物性仪，打丌丌关，打开物性测定程序，选择“p 5 0 t p a ”分析。 安装探头，校i f 探头高度：r e t u r nd i s t a n c e ( m m ) ：3 0 r e t u r ns p e e d ( m m s e c ) ：10 c o n t a c tf o r c e ( g ) ：l 设置运行参数：p r e t e s ts p e e d ：2 0 0 m r n s e c t e s ts p e e d ：5 0 0 m m s e c p o s t - t e s ts p e e d ：5 0 0 m r n s e c s t r a i n ：4 0 0 0 t i m e ：5 0 0 s e c t r i g g e rf o r c e ：5 0 9 3 4 山东轻t 业学院硕f j 学位论义 a d v a n c e do p t i o n s ：o n 将奶酪切成2 0 c m * 1 5 c m ，厚度为0 5 c m 的方块，置于物性仪相应位置进 行测试。 运行程序，取得数据。 分析数据。 5 4 结果与讨论 5 4 1 凝乳酶的添加量对乳酪品质的影响 分别称取五份2 0 9 脱脂乳粉，均溶于2 0 0 m l 0 0 1 m o l l 的c a c l 2 溶液中，配 制成1 0 的奶液，放置l h 使其稳定，分别测定p h 值： 8 0 保温3 0 m i n ( 低温长时问杀菌法l t l t ) ，进行巴氏杀菌，然后冷却 到3 0 一3 2 ； 添加发酵剂( 保加利哑乳杆菌和嗜酸乳杆菌的复合菌种) l o m l ，发酵 2 0 m i n ，分别测定p h 值； 添加相同活力的凝乳酶发酵液，分别为6m l ，8m l ，l o m l ，1 2m l ，1 4 m l ，3 5 水浴保温静置使奶凝固； 当奶完全凝固后，用刀切割成l c m 3 的凝块，缓慢搅拌1 5 m i n ，防止粘连； 水浴加热3 m i n 左右，温度上升至4 2 为止； 排除乳清； 将凝块收集称重，添加凝块重量2 5 的食盐，搅拌均匀； 装入干酪模中，在o 1 m p a 压力下压榨1 2 h ； 放入1 2 恒温发酵箱成熟； 最后，测定奶酪的物性参数，结果如表5 1 表5 1 凝乳酶添加量对咀嚼度的影响 t a b l e5 1i n f l u e n c eo fc h y m o s i no nt h ec h e w i n e s s 凝乳酶发酵液添加置( m l )咀嚼度 6 8 1 0 1 2 1 4 5 1 8 3 5 8 8 6 7 3 8 l 7 2 9 8 6 4 2 1 第5 章红曲凝乳酶n ：乳酪生产心用中的初步研究 b1 01 2 凝乳酶添加j ； ( m l ) 图5 1 凝乳酶添加餐对咀嚼度的影响 f i g u r e5 1i n f l u e n c eo f e h y m o s i no nt h ec h e w i n e s s 咀嚼度是衡量奶酪品质的重要参数之一，咀嚼度越高奶酪的品质就越好，出 图5 1 可知，随着凝乳酶添加量的增加，咀嚼度先迅速上升后缓慢下降，原因是 发酵液当中的蛋白分解酶增多。因此，凝乳酶发酵液的最适添加量为1 0 m l ，即 酶活力1 0 0 8 s u 的发酵液。 5 4 2 不同c a 2 + 浓度对乳酪品质和结构的影响 分别称取五份2 0 9 脱脂乳粉，溶于2 0 0 m l c a c l 2 溶液( 浓度分别为o m o l l ， 0 0 0 1 m o l l ，0 0 0 2 5 m o l l ，o 0 0 5 m o l l ，0 0 1 m o l l ) 中，配制成1 0 的奶液，并 放置l h 使其稳定，分别测定p h 值； 8 0 保温3 0 m i n ( 低温长时问杀菌法l t l t ) ，进行巴氏杀菌，然后冷却 到3 0 3 2 ： 添加发酵剂( 保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的复合菌种) l o l l ，发酵 2 0 r a i n ，分别测定p h 值； 其他条件不变，测定奶酪的物性参数，结果如表5 2 表5 2 钙离子浓度对硬度的影响 t a b l e5 2l n f l u e n c eo fc a 2 + o nt h eh a r d n e s s 钙离子浓度( m o l l ) 硬度( g ) 0 0 0 0 0 1 0 0 0 2 5 0 0 0 5 0 o l 7 3 7 5 7 6 3 5 7 9 8 l 7 9 9 4 8 0 1 7 8 7 6 5 4 3 2 ， o 型譬鲁 山东轻丁业学院彤! l j 学位论文 8 2 8 7 8 气 二7 6 善 7 4 7 2 7 0 0 0 l0 0 0 2 5 0 0 0 50 0 i 钙离r 浓立( m o y l ) 图5 2 钙离子浓度对硬度的影响 f i g u r e5 2i n f l u e n c eo fc a 2 + o nt h eh a r d n e s s 理论上，钙离子的浓度越高，奶酪的硬度也应越大，实际从图5 2 可知，当 钙离子浓度小于o 0 0 2 5 m o l l 时，随着钙离子浓度的增大，奶酪硬度