（食品科学专业论文）类菌胞素氨基酸（MAAs）Porphyra334的提取及其新功能研究.pdf

类菌胞素氨基酸( m a a s ) p o r p h y r a 一3 3 4 的提取 及其新功能研究 摘要 海苔，是亚洲百姓生活中比较常见的一种食品，也是日本传统饮 食中较有代表性的健康食品。日本人的长寿和健康与他们日常大量摄 取海藻类食品及其他海产品有着不可分割的关系，因此，从海苔中寻 找功能性成分也成为了诸多科学研究者的研究课题。 作为海苔的原料来源，条斑紫菜( p o r p h y r a y e z o e n s i s ) 所含的类 菌胞素氨基酸( m y c o s p o r i n e l i k ea m i n oa c i d s ，简称m a a s ) 是一类 功能性氨基酸，它是一大类以环己烯酮为基本骨架，与不同类型氨基 酸通过缩合作用所形成的水溶性物质，并广泛存在于多种水生生物 中。目前国内外对于该类氨基酸的研究多集中于其紫外防护功能上， 由于其吸收峰值在3 1 0 3 6 0 n m 之间，因此对紫外辐射具有较高的吸收 能力，被认为具有保护细胞、减少u v r 损伤的功能。但是，对于该类 氨基酸的其他功能仅有少量文献有所报道。 本论文以日本海域中常见藻类为主要目标，测定类菌胞素氨基酸 ( m a a s ) 的分布情况，着重对条斑紫菜中所含有的p o r p h y r r a - 3 3 4 进 行分析测定，并对其抗氧化、抗肿瘤细胞活性等新功能进行研究探索， 同时尝试探讨其在海苔等健康食品中的保健功能机理。旨在为今后将 该类功能性氨基酸开发成为天然、安全、有效的抗氧化产品、保健食 品或者相关药物提供基础理论依据。 通过研究我们主要得到以下结论： 首先，本文发现条斑紫菜( p o r p h y r a y e z o e n s i s ) 中含有较高浓度 的p o r p h y r a 3 3 4 ，并优化了提取p o r p h y r a 一3 3 4 的h p l c 条件： 色谱柱：分析柱c a p c e l lp a kc 1 8u g l2 0s 5 ( 4 6 m m i d 1 5 0 m ml e n g t h ) 柱温：4 0 流动相：0 1 醋酸水溶液 流速：0 7 m l m i n 测定波长：3 3 0 n m 进样量：2 0 9 1 分析时间：3 0 m i n 其次，我们发现条斑紫菜中提取的p o r p h y r a 3 3 4 对于a a p h 诱 导的亚油酸氧化反应以及单线态氧( 1 0 2 ) 诱导的亚油酸氧化反应具 有较显著的抑制作用。同时，0 【生育酚与p o r p h y r a 3 3 4 对由a a p h 诱 导的脂质氧化具有一定的协同抑制作用，在氧化反应开始1 0 m i n 时， 5 0 i ，t m 的p o r p h y r a 3 3 4 浓度条件下，添加与不添加o 0 2 9 m0 【一生育酚 的抑制作用差异可达4 0 。 最后，从条斑紫菜中提取的p o r p h y r a 一3 3 4 能够有效抑制b 1 6 4 a 5 鼠黑色素肿瘤细胞的生长，在p o r p h y r a - 3 3 4 添加量为1 0 0 1 a m 时，经 7 2 h 体外培养后，b 1 6 4 a 5 鼠黑色素肿瘤细胞的生存率与空白生存率 ( 8 6 7 ) 相比，降低至4 5 4 左右。同时，在p o r p h y r a 一3 3 4 添加量 为1 0 0 9 m 时，经7 2 h 体外培养后，正常人表皮角化细胞的生存率与 空白生存率( 9 8 1 ) 相比，降低至9 0 4 左右，可见p o r p h y r a 3 3 4 对于正常人表皮角化细胞k e r a t i n o c y t e 的细胞增殖没有明显抑制。上 述结论为p o r p h y r a 3 3 4 在临床应用方面提供了一定的理论依据，并揭 示了将其开发成预防黑色素肿瘤细胞相关保健食品、化妆品或药物的 可能性。 关键词：类菌胞素氨基酸( m aa s ) ，p o r p h y r a 3 3 4 ，提取，抗氧化剂， 抗细胞增殖 n o v e lf u n c t i o no fam y c o s p o r i n e l i k ea m i n oa c i d ， p o r p h y r a - 3 3 4 a b s 仃a c t n o r i ( p o r p h y r ay e z o e n s i s ) ，w i d e l yc o n s u m e di ne a s t e r na s i ai n c l u d i n g j a p a n ，c h i n aa n dk o r e a ，h a sl o n gb e e n b e l i e v e da sh e a l t h yf o o da n dv e r y s t a b l et oo x i d a t i v es t r e s sd u r i n gs t o r a g eu n d e rt h ed r yc o n d i t i o n ，a n di ti s a l s ot h eh o t s p o to fr e s e a r c hi no r d e rt oc l a r i f yt h ep o s i t i v ef u n c t i o no fi t m y c o s p o r i n e l i k ea m i n oa c i d s ( m n a s ) ，w h i c ha r e d i s t r i b u t e dw i d e l y t h r o u g h o u tt h ef r e s h w a t e ra n dm a r i n eo r g a n i s m s ，h a v ec o m ei n t og r o w i n g c o n c e r n si nt e r m so ft h e i ru l t r a v i o l e t - a b s o r b i n gc a p a c i t y t h eb a s i c s t r u c t u r eo fm a a si sa na m i n oa c i do ra na m i n oa l c o h o l ，w h i c hi s c o m b i n e dt oac y c l o h e x e n o n eo rac y c l o h e x e n i m i n e t h ef a m i l yo f 1 v i m m si sc u r r e n t l yk n o w nt oc o n s i s to fa b o u t2 0s t r u c t u r a l l yr e l a t e d w a t e r - s o l u b l ec o m p o u n d si n c l u d i n gp o r p h y r a - 334 ，w h i c hh a sam a x i m u m a b s o r p t i o n a t3 3 4 n m m m m sa r ec o n s i d e r e do fu l t r a v i o l e t a b s o r b i n g f u n c t i o nw i t hm a x i m u ma b s o r p t i o nr a n g i n gf r o m310t o36 0 n m h o w e v e r , o n l yf e wp a p e r sh a v eb e e nr e p o r t e dt op r o v eo t h e rp o s i t i v ev a l u e ss u c ha s a n t i o x i d a t i o no ra n t i p r o l i f e r a t i o no fm a a s e s p e c i a l l yp o r p h y r a - 3 3 4 t h eo b j e c t i v eo ft h i sw o r ki st ov e r i f yt h ec o n t e n to fp o r p h y r a 一3 3 4i n s e v e r a l a l g a ei n c l u d i n gn o r i ( p o r p h y r ay e z o e n s b ) ，t h e ne v a l u a t e t h e a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so fp o r p h y r a 一3 3 4u n d e rv a r i o u so x i d a t i v es t r e s s e s f u r t h e r m o r e ，w ea l s oo b s e r v e dt h ea n t i - p r o l i f e r a t i o no fp o r p h y r a - 3 3 4 t o w a r d st h eb16 - 4 a 5c e l ll i n ec o m p a r e dw i t ht h ek e r a t i n o c y t ec e l ll i n e t h ep o r p h y r a 一33 4w a sd e t e c t e da tah i g h e s tc o n c e n t r a t i o ni nt h e o p t i m i z e dh p l c c o n d i t i o na sf o l l o w s ： c o l u m n ：c a p c e l lp a kc 1 8u g l 2 0s - 5 ( 4 6 m mi d 1 5 0 m m l e n g t h ) t e m p e r a t u r e ：4 0 。c m o b i l e sp h a s e ：o 1 a c e t i ca c i ds o l u t i o n f l o wr a t e ：0 7 m l m i n w a v e l e n g t h ：3 3 0 n m v o l u m eo fi n j e c t i o n ：2 0 1 a l t i m ef o ra n a l y s i s ：30 m i n t h er e s u l t so b t a i n e df r o mt h er e a c t i o ns y s t e m se v a l u a t i n ga n t i - o x i d a t i v e a c t i v i t i e sa g a i n s tl i n o l e i ca c i ds h o w e dt h a tp o r p h y r a 一334 w a s a b l et o s u p p r e s so x i d a t i o n si n d u c e db ya l k y lr a d i c a l s ( a _ a p h ) a n ds i n g l e to x y g e n ， a n ds y n e r g i s t i c a l l yw o r kw i t h 仅一t o c o p h e r 0 1 t h ea n t i - o x i d a t i o na c t i v i t i e s i s u pt o4 0 f o rt h el i n o l e i c a c i do x i d a t e db ya a p hw i t ho 0 2 9 m 0 【- t o c o p h e r o la n d5 0 9 mp o r p h y r a 一3 3 4 m e a n w h i l e ，p o r p h y r a - 3 3 4p u r i f i e df r o mn o r i ( p o r p h y r ay e z o e n s i s ) a l s o s h o w e dp o s i t i v e a n t i - - p r o l i f e r a t i o n a c t i v i t i e sf o rb16 - 4 a 5m e l a n o m a c a n c e rc e l l ，a n dh a dn ov i s i b l ee f f e c to nk e r a t i n o c y t ec e l ll i n e t h e v i a b i l i t yo fb 16 - 4 a 5c e l ll i n ew a ss u p p r e s s e dt o4 5 4 w h i l ec u l t u r e d w i t h10 0 t mp o r p h y r a - 3 3 4a f t e r7 2 hc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ( 8 6 7 、) m e a n w h i l e ，p o r p h y r a 一3 3 4d i dn o ts h o we f f e c t i v ea n t i o p r o l i f e r a t i o n t o n o r m a lk e r a t i n o c y t ec e l ll i n e ，w h i c hw a ss u p p r e s s e dt o9 0 4 b y10 0 t m p o r p h y r a - 3 3 4 a f t e r7 2 hc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ( 9 0 4 ) t h e c o n c l u s i o n sa b o v ee l u c i d a t e dt h ep o s s i b i l i t yo fp o r p h y r a 一3 3 4b ea p p l i e d t ot h ec l i n i c a sal o n gh i s t o r yo fc o n s u m p t i o no fm y c o s p o r i n e l i k ea m i n oa c i d s ( m a a s ) i n c l u d i n gp o r p h y r a - 3 3 4i na l g a ea sd a i l yf o o df o ra s i a np e o p l e ， p o r p h y r a 一3 3 4e x t r a c t e df r o ml a v e ri se x p e c t e dt ob ea p p l i e da sak i n do f a n t i o x i d a n t ，a n t i p r o l i f e r a t i o nf u n c t i o nf o o d ，f u n c t i o n a lc o s m e t i c sa n dt o b eu t i l i z e df o ro t h e rv a r i o u sp u r p o s e sa sag r a s ( g e n e r a l l yr e c o g n i z e d a ss a f e ) c o m p o n e n t k e y w o r d s ：m y c o s p o r i n e l i k ea m i n oa c i d s ( m a a s ) ，p o r p h y r a - 3 3 4 ，e x t r a c t i o n ， a n t i o x i d a n t ，a n t i p r o l i f e r a t i o n 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：词序 日期：a 2 l 础年f 月山日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 ， 不保密叼 学位论文作者签名：翻黔指导教师签每! 王麟 日期：0 叮9 8 年r 月如日日期：a 斛, l - 户j 斓 上海海洋大学硕士学位论文 引言 随着人民生活水平的提高和健康意识的增强，人们对于食物的摄取已不仅仅 是为了充饥果腹，而更关注其成分的功能和营养。由于人口老龄化和饮食西方化 的影响，诸如肥胖、高血压、动脉硬化等疾病患者正在逐年增加；而人们也意识 到了同常饮食生活对于维持健康的重要性。同时，在目前提高食品安全与质量的 背景下，并考虑到消费者对于人工合成添加剂的抵制，如何从食物中提取天然功 能性成分，继而开发成风味良好又具有保健功能的健康食品j 下成为食品行业研究 开发的热点。 与此同时，对于人类食物摄取来源也呈现出从陆地生物向海洋生物转移的趋 势。从海洋生物圈中寻找新型功能性成分，不仅是由于海洋生物资源的开发具有 巨大潜力，也是为了解明许多人们日常生活中摄入的健康海产品的功效机理，进 而从中提取有效成分用于功能性食品和药品的研究开发【i j 。 海苔，是亚洲百姓生活中比较常见的一种食品，也是日本传统饮食中较有代 表性的健康食品。日本民族的健康长寿与他们r 常大量摄取诸如海藻等海产品有 着密不可分的关系【2 】，由此，从海苔这类日常消费食品中寻找功能性成分也成为了 诸多科学研究者的研究课题。海苔不仅口味鲜美，而且高蛋白低脂肪，其所含有 的氨基酸、维生素、二十碳五烯酸( e p a ) 及无机物质等具有降低胆固醇、预防动 脉硬化、软化血管的功效【2 】，是一种老少皆宜，美味营养的食品。 作为海苔的原料来源，条斑紫菜( p o r p h y r a y e z o e n s i s ) ，日文名灭吵p 9 ， 在日本和我国长江以北均有大面积种植【9 】。该品种所含的类菌胞素氨基酸 ( m y c o s p o r i n e l i k ea m i n oa c i d s ，简称1 v i a a s ) 是一类功能性氨基酸。它是一大类 以环己烯酮为基本骨架，与不同类型氨基酸通过缩合作用所形成的水溶性物质， 并广泛存在于多种水生生物中【3 - 4 1 。目前国内外对于该类氨基酸的研究多集中在其 紫外防护功能上。由于其吸收峰值在3 1 0 3 6 0 r i m 之间，因此对紫外辐射具有较高的 吸收能力，被认为有保护细胞、减少u v r 损伤的功能1 3 j 。但是，对于该类氨基酸的 其他功能仅有少量文献有所报道。如d u n l a p 和y a m a m o t o 报道一种名为 m y c o s p o r i n e g l y c i n e 的m a a s 类氨基酸具有一定的抗氧化功能1 5 j ，而对条斑紫菜中 含量最高的一种名为p o r p h y r a - 3 3 4 的m a a s 类氨基酸，其所具有的抗氧化功能以 及抵制黑色素肿瘤细胞生长活性尚无报道；此外，国内对于类菌胞素氨基酸的相 关研究文献也非常少，并且仍集中于其抵御紫外线辐射的功能探讨1 6 - 7 j 。 本论文以日本海域中常见藻类为主要目标，测定类菌胞素氨基酸( m a a s ) 的 3 上海海洋大学硕士学位论文 分布情况，着重对条斑紫菜中所含有的p o r p h y r a - 3 3 4 进行分析测定，并对其抗氧 化、抗肿瘤细胞活性等新功能进行研究探索，并探讨其在海苔等健康食品中的保 健功能机理。旨在为今后将该类功能性氨基酸开发成为天然、安全、有效的抗氧 化产品、保健食品或者相关药物提供基础理论依据。 第一章海藻中的类菌胞素氨基酸( m a a 。) 第一节条斑紫菜简介 作为海洋植物中的一大家族，海藻在波澜壮阔的大海中茁壮生长，每天经历 阳光侵袭，海浪暗涌拍打，汲取着大海的养分。紫菜，是一种营养价值较高的海 洋藻类植物，作为人类食用及药用物质已有上千年历史，其保健作用更是受到人 们的认可。紫菜是我国主要海洋经济藻类之一，同时也是日本韩国等亚洲国家广 泛消费的海产品之一。其中，海苔的原料条斑紫菜( p o r p h y r a y e z o e n s i s ) ，在分 类上属于红藻门、红藻纲、红毛菜目、红毛菜科，外观呈紫红微带蓝色。其最显 著的特点是淡黄色精子囊群呈长条或长块状，混杂在深紫红色的果孢子囊区域中， 而成花条斑纹状，故而得名【8 】。条斑紫菜本种叶状体薄嫩，菜质甚佳，相比坛紫菜 ( p o r p h y r a y e z o e n s i s ) ，条斑紫菜更易于加工成薄片，具有更高的经济附加值。条斑 紫菜( p o r p h y r ay e z o e n s i s ) 主要分布于我国东海北部和黄、渤海沿岸以及日本列岛 和朝鲜半岛沿岸，是我国长江以北( 主要为江苏、山东等地) 、日本和韩国人工栽培 的主要品种一j 。 由条斑紫菜干燥加工制作而成的海苔味道鲜美，是一种典型的高蛋白、低脂肪 的天然海藻功能性食品，蛋白质含量高达3 6 31 ，具有防止动脉硬化作用的二十 4 上海海洋大学硕士学位论文 碳五烯酸( e p a ) 在条斑紫菜中大约占脂肪酸含量的半【l o l 。同时因为富含谷氨酸、 丙氨酸、甘氨酸和鸟苷酸等呈昧氨基酸，在中国是餐桌上的传统佳肴汤料，在日本 和韩国通常将其直接或者配合米饭食用，也常用于制作寿司。在日本的商店里能 经常看到焙烤海苔( 烧砉海苔) 、以及在加工过程中添加酱油、味淋等调味液制作 而成的调味海苔( 味付海苔) 等商品。 海苔不仅味道鲜美，食用方便，也具有非常高的营养价值。传统医学认为， 条斑紫菜味甘、咸，性寒，具有清凉泻热、利水消肿、软坚、补肾的功能，传统 用于治疗甲状腺肿、高血压、支气管炎、喉炎、水肿、麻疹等m j 。而现代医学则证 明，条斑紫菜富含海藻多糖、蛋白质、维生素和微量元素等多种保健成分，在降血 压降血脂、预防动脉硬化、增强免疫功能、抵抗衰老及预防营养缺乏症等方面具 有独特的功能瞵】。 第二节类胞菌素氨基酸( m a a s ) 简介 类菌胞素氨基酸( m y c o s p o r i n e l i k e a m i n oa c i d s ，简称m a a s ) 是一类功能性 氨基酸，它是一大类以环己烯酮为基本骨架，与不同类型氨基酸通过缩合作用所 形成的水溶性物质【3 - 4 】。如图1 1 所示的基本结构，由于共轭双键和不同侧链上活 性基团的存在，类菌胞素氨基酸在3 1 0 一3 6 0m 的紫外光区对u v a 和u v b 具有较强 的吸收能力，其前体为g a d u s o l 或d e o x y g a d u s o l ，分别在2 6 8 和2 9 4n t 1 处有最大吸收 峰，在生物体内主要是起到吸收紫外光辐射，保护生物体的功能。 翮。 掣国u 缃 图1 - 1 类菌胞素氨基酸及其前体g a d u s o l 的基本结构 f i g 1 一lm o l e c u l a rs t r u c t u r eo fm a a s a n di t sp r e c u r s o rg a d u s o l 上海海洋大学硕士学位论文 类菌胞素氨基酸在生物界分布广泛，最早i 主t l e a c h 从真菌中分离得到【1 1 1 。之后， 相继在蓝藻、浮游真核藻类( 微藻和大型藻) 、细菌、真菌，及其他水生生物中都 有发现。其中，浮游植物中类菌胞素氨基酸的研究多集中在海洋生物中，也有少 量淡水藻类含m a a s 的报道。根据t s u j i n o ，x i o n g ，k a r s t e n e ta 1 等相关报道【l 卜1 3 】， 类菌胞素氨基酸首先在红藻门中被发现，红藻门同时也是含m a a s 最高和密度最大 的藻类植物；褐藻不含或仅含痕量的m a a s ；绿藻门大部分属都含有m a a s ，但浓 度较小【4 】o 此外，高等植物和高等脊椎动物中没有发现m a a s 类氨基酸，这是因为 高等植物的紫外防御功能主要是由类黄酮来实现，而高等脊椎动物则靠黑色素类 物质来吸收紫外光辐射i 训。 类菌胞素氨基酸在生物体内的存在形式多样，主要种类有a s t e r i n a 3 3 0 、 m y c o s p o r i n e - g l y c i n e 、p o r p h y r a - 3 3 4 、s h i n o r i n e 、p a l y t h i n e 、p a l y t h i n o l 、p a l y t h e n e 等， 多根据其吸收峰值在3 1 0 3 6 0 n m 之间来命名( 图1 2 ) ，但目前尚无中文名。刘正文 等( 2 0 0 3 ) 曾报道微囊藻属( m i c r o c y s t i s ) 的铜绿微囊藻含有s h i n o r i n e 矛n p o r p h y r a 一3 3 4 这两种类菌胞素氨基酸【7 】。 6 上海海洋大学硕士学位论文 篡脒啊拳黜擞帼岬, , 一a 2 0 a西l 口狮。k z 釉矾k 。黝帼 稿t 一传毒均 k t 文蚰确 j 。敝 。p 期哺哺帆 嘲呻呵啊a 铺群舶q 蝴i | 岫h a 国柳h 曩穆喇睫 - 鞘棚k t 。籼嘲# 蝴舯- 酾7 嘲 小f 辩舛 嘲酬。r - 侧嘲嘲、搀洲 嘲硼h - 坶翻婚q 擎谢啪囊1 1 4 。粥狮k 镕2 , 6 8 黼 唧 k _ z 删腧鲫 m 州p a 0 -m 朔锄嚷斜翻一b 善甜l # - 刚g 氛庸村咖 _ h 蕾s a o m i 童触l 謦3 l d 霸m f m a l p e i l 弦脯掰黼 图卜2 常见类菌胞素氨基酸的分子结构与最大吸收波长 f i g 1 - 2m o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dw a v e l e n g t h so fm a x i m u ma b s o r p t i o no f s e v e r a lm a a s 类菌胞素氨基酸的合成主要通过莽草酸途径来实现【4 】。真菌m a a s 含专有的含氧 络一碳酰基发色基团( o x o m a a s ) ，而水生生物及陆生蓝藻主要是亚氨基一碳酰基 结构( i m i n o m a a s ) ，因而真菌与水生生物和陆生蓝藻在m a a s 的合成上出现进化上 的分隔。如图1 - 3 所示，莽草酸途径的中间产物3 一脱氢醌( 3 - d e h y d r o q u i n a t e ，d h q ) 是真菌中普遍存在的m y c o s p o r i n e s 碳环结构的前体。真菌m y c o s p o r i n e s 和m a a s 的合 成是在d h q 形成g a d u s o l s 基础之上合成而得到的( f a v r e b o n v i ne ta 1 1 9 8 7 ) 。但d h q 怎样从莽草酸途径分支出来，形成环己烯酮，进而又怎样合成m a a s ，许多合成细 节目前尚不清楚。 7 上海海洋大学硕士学位论文 + = d a h p 日3 _ 脱氢醌日3 _ 脱氢莽草衷j 莽草素i - - 1 赤藓糖一4 磷酸d a h p s。h q s 8 。h q 。s 。u s k 莽草素一3 磷酸 日脱氧环己焖哪p o e p s p 亚氨基一类茵胞素氨基酸 暑氧醣基一类茵胞素氨基酸 图卜3 莽草酸途径及推测的m a a s 合成途径( 实线箭头表示莽草酸合成途径，虚线箭头表示推测 的m a a s 合成途径，催化各步骤的酶标示在箭头下或右) 其中，d a h e3 - d e o x y - d a r a b i n o h e p t u l s i n a t e - 7 - p h o s p h a t e ；d a h p s d a h pa - f f 成酶；d h q s 3 - 脱氢醌合成酶； d h q d 3 - 脱氢醌脱氢酶；s d 莽草素羟化酶；s k 莽草素激酶；e p s e5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e - 3 - p h o s p h a t e ； e p s p s e p s p 合成酶：c s 莽草酸合成酶 f i g 1 - 3t h es h i k i m a t ep a t h w a ya n d p u t a t i v em a a sb i o s y m h e s i s m a a s 在细胞中的合成和积累通常有3 种模式：( 1 ) m a a s 含量一直很高并且不 受光刺激的诱导，如红藻p o r p h y r au m b i l i c a l i s 和g r a c i l a r i a c o r n e a ：( 2 ) m a a s 含量低 但在光刺激下迅速诱导合成，如节球藻属n o d u l a r i ab a l t i c a 等；( 3 ) 不含m a a s 且不 能受光诱导产生，如大多数的褐藻。 目前，国内外对于m a a s 的研究多集中在其紫外防护功能上，众多研究证实 它不仅能有效地吸收紫外光辐射，还能将吸收的能量高效散发而不是传递给敏感 的生物分子，并且不会形成氧胁迫的活性氧分子l l4 1 。除了光保护功能之外，m a a s 对胚胎和幼虫发育，珊瑚漂白具有保护作用，并参与真菌中的繁殖调节和蓝藻中 的渗透调节【6 j 。 第三节条斑紫菜中的m a a s 类氨基酸：p o r p h y r a 一3 3 4 近年来，对于m a a s 类氨基酸的抗氧化功能开始有少量文献有所报道。目前 已经知道，m a a s 的前体g a d u s o l 和4 - d g 都具有强抗氧化活性。如d u n l a p 和 y a m a m o t o 报道名为m y c o s p o r i n e g l y c i n e 的m a a s 能够有效结合单线态氧( 1 0 2 ) ， 酮 一l；旆1；， ：；：k_c；吐 环 上海海洋大学硕十学位论文 因而具有一定的抗氧化功能【5 1 ；从条斑紫菜中提取得到的亚氨基一碳酰基氨基酸 ( i m i n o 4 _ a a s ) u s u j i r e n e 也被证明具有较强的抗氧化活性【i5 1 。但是，条斑紫菜等红 藻中含量较高的1 v i a a s 物质：p o r p h y r a - 3 3 4 ( 图1 - 4 ) ，其所具有的抗氧化功能未见 相关报道。p o r p h y r a - 3 3 4 的最大紫外吸收波长为3 3 4 n m ，分子量为3 4 6 。根据最新 研究报道，日本学者柘植圭介、渡迈弥生( 2 0 0 6 ) 等人成功从条斑紫菜通过加压 热水抽提得到的水溶性小分子提纯物质具有抑制人白血病细胞株h l 6 0 的细胞增 殖活性【1 6 1 ，但对于仅含p o r p h y r a - 3 3 4 的提纯物质的抗氧化和抗细胞增殖活性尚无 相关报道。 h a c h o h 0 0c h 0 n h l l c o 。h 二 图卜4p o r p h y r a - 3 3 4 分子结构( 入m a x 23 3 4 n m ，m w = 3 4 6 ) f i g 1 4c h e m i c a ls t r u c t u r eo f p o r p h y r a - 3 3 4 ( 入m a x 23 3 4 n m m w = 3 4 6 ) 综合上述研究成果，本研究将以日本海域中常见藻类为主要目标，首先从中 测定p o r p h ，r r a - 3 3 4 等类菌胞素氨基酸( m a a s ) 的分布情况，其次着重对条斑紫菜 ( p o r p h y r ay e z o e n s i s ) 中的p o r p h y r a 3 3 4 进行抗氧化功能方面的研究。此外，对于 p o r p h y r y 3 3 4 抑制黑色素肿瘤细胞生长也将展开相关研究，并试图探讨其在海苔等 健康食品中的保健功能机理。 9 上海海洋人学硕士学位论文 第二章1 3 种海藻中的类菌胞素氨基酸( m 从s ) 测定 第一节材料与方法 1 1 试验材料及试剂 如表2 1 ，所有海藻原料均由白子株式会社( t o k y o ，j a p a n ) 提供，均为日本人 日常生活中经常食用或常见的藻类。于2 0 0 6 年1 月至2 0 0 7 年1 月采集于日本长崎有 明海等海域。海藻样品洗净去除泥沙后放入密封袋，于一8 0 进行保存。 表2 - 1 用于测定p o r p h y r a - 3 3 4 的海藻名称 t a b 2 1a l g a ef o rd e t e c t i n gp o r p h y r a - 3 3 4a n do t h e rm a a s 藻类门 中文名日文名拉丁名 红藻真江篱 方：f f ，1 ) g r a c i l a r i aa s i a t i c a 太平洋红翎菜 专l jy s o l i e r i ap a c i f i c a 条斑紫菜 天廿匕u p o r p h y r ay e z o e n s i s 绿藻海葡萄 少ep 戈夕 c a u l e r p al e n t i l l i f e r a 刺松藻 专1 1 , c o d i u m f r a g i l e 浒苔d ，昵， 灭7 右，l l e n t e r o m o r p h ap r o l i f e r 日本石莼 弋歹l ，少廿 u l v a j a p o n i c a 石莼o h n o r i 于 7 ，才廿 u l v ao h n o r i 浒苔 才二7 方71 ) e n t e r o m o r p h ap r o l i f e r a 褐藻幅叶藻k u r o m e n ，、1 p e t a l o n i ak u r o m e 鹅掌菜 夕口j e c k l o n i ak u r o m e 海带 了j 二歹 l a m m a r m j a p o n i c a 裙带菜 匕口j u n d a r i au n d a r i o i d e s 2 5 含水甲醇，三氯甲烷溶液，1 醋酸溶液均d d n a c a l a it e s q u e ( k y o t o ，j a p a n ) 株式会社购入，为高效液相色谱用特级溶液。 l o 上海海洋人学硕士学位论文 1 2 试验仪器 高效液相色谱h p l c ( l c 1 0 a dv p ，岛津株式会社) u v - v i s 检出器( s p d 1 0 a v p ，岛津株式会社) 高效液相色谱h p l c p d a ( l c 6 a dv p ，岛津株式会社) p d a 二极管阵列检测器( s p d m 2 0 a ，岛津株式会社) 真空冷冻干燥机( e y e l af d 5 n ) 紫外分光光度计( u v i s2 4 0 0 p c ，岛津株式会社) 冷冻库( r e v c o 超低温槽，朝日l i f es c i e n c e 株式会社) 高速离心机( t o m yg r x - - 2 2 0 ) 恒温加热器( d r yt h e r m ou n i td y u 2 c ，t a i t e c ) 电子天平( a u x 3 2 0 ，岛津株式会社) v o r t e x 混匀器( v o r t e xg e n i e 2 ，s c i e n t i f i ci n d u s t r i e s ) 1 3 试验方法 1 3 1 样品预处理 原料从冷冻库取出后用电子天平每种称量1 0 9 左右，用滤网洗涤并清除泥沙 杂质，装入密实袋，通过液氮瞬时冷冻的方法将样品粉碎，并转移至一8 0 冷冻 库冻结保存3 h ，取出后用榔头轻敲至细小碎片。 1 3 2 干燥粉的制备 将粉碎后的样品加入已洗净烘干的5 0 0 m l 圆底烧瓶中，于真空冷冻干燥机中 分别进行真空干燥，时间约为1 2 1 4 h ，直至完全干燥。 回收干燥样品，经研钵研碎至微细粉末状，转移至密实袋后，计算得率，并 于一2 0 冷冻保存，直至使用。 样品干燥粉得率( ) = 干燥后重量( g ) 原料质量( g ) 1 0 0 通过试验完成后计算，大部分海藻经预处理后得到的干燥粉末的重量在3 0 9 4 0 9 之间，即得率为3 0 , - - 4 0 。 上海海洋大学硕士学位论文 1 3 3 高效液相色谱用样品的前处理 首先将预备进入高效液相色谱分析的样品进行前处理，参考f i g u e r o af le t c 的试验方法【l7 1 ，并在此基础上进行适当优化。准确称量各种海藻粉末干燥品0 1 9 ， 溶解于5 m ! 的2 5 ( 2 5 7 5 ，v ) 含水甲醇溶液中，经恒温加热4 5 2 h 后，混合液 经高速离心( 2 5 0 0 r p m ，4 c ，1 5 m i n ) 后过滤。再加入8 m l 含水三氯甲烷( 2 5 7 5 ，v v ) ， 经高速离心( 2 5 0 0 r p m ，4 c ，1 0 1 5 m i n ) 后得到除去了脂质和色素的透明上清。将 该上清通入氮气蒸发全部溶剂，最后加入0 5 m l 的超纯水，溶解完全后，作为高效 液相色谱样品备用。 1 3 4高效液相色谱条件 根据c a r r e t oj i 的试验方法 1 8 】，采用流动相梯度洗脱( e l u e n ta ： 0 2 t f a + a m m o n i u m h y d r o x i d e ，p h 4 3 ； e l u e n t b ：0 2 t f a +a m m o n i u m h y d r o x i d e ，p h 2 2 0 ：m e t h a n o l ：a c e t o n i t r i l e = 8 0 ：1 0 ：1 0 ，v ：v ：v ) 对样品进行高效液相色谱 h p l c p d a 分析，但是分离效果并不理想。本次试验通过实际操作经验比较， 多次优化后确定以下高效液相色谱分析条件： 色谱柱：分析柱c a p c e l lp a kc 1 8u g l 2 0s 5 ( 4 6 m mi d 1 5 0 r a ml e n g t h ) 柱温：4 0 流动相：o 1 醋酸水溶液 流速：o 7 m l m i n 测定波长：3 3 0 n m 进样量：2 0 9 t 1 分析时间：3 0 m i n 第二节 13 种海藻中p o r p h y r a 一3 3 4 的分布情况 p o r p h y r a 一3 3 4 标品由白子株式会社提供( t o k y o ，j a p a n ) ，并根据p o r p h y r a - 3 3 4 在3 3 4 n m 左右处有最大吸收峰这一性质，根据1 3 4 的h p l c 色谱条件，标品在进 样时间2 0 1 m i n 左右出现单一吸收峰，再将各海藻样品的h p l c p d a 色谱图与 1 2 上海海洋人学硕士学位论文 p o r p h y r a 3 3 4 标品图谱( 图2 1 ) 进行对照，以确定各海藻样品中是否含有 p o r p h y r a - 3 3 4 。 图2 1p o r p h y r a - 3 3 4 标准样品h p l c 色谱图 f i g 2 1c h r o m a t o g r a mo fp o r p h y r a - 3 3 4s t a n d a r ds a m p l e 2 1 几种红藻中的p o r p h y r a - 3 3 4 分布情况 2 1 1 条斑紫菜中p o r p h y r a - 3 3 4 的分布 在装备了二极管阵列检测器( p d a ) 的高效液相色谱( h p l c ) 3 2 ，根据1 3 4 的 h p l c 色谱条件，采用c 1 8 分析柱( c a p c e l lp a kc 1 8u g l 2 0s 5 ，4 6 m m i d x l 5 0 m ml e n g t h ) ，p d a 波长范围2 0 0 - 6 0 0 n m ，使得条斑紫菜抽提液获得了良好 的分离。 加m邮鲫加叩柏寻m 0 上海海洋大学硕士学位论文 图2 - 2 条斑紫菜( p o r p h y r ay e z o e