（食品科学专业论文）类金属硫蛋白的发酵生产及提取工艺的研究.pdf

摘要 摘要 金属硫蛋1 1 1 ( m e t a l l o t h i o n e i n ) ，简称m t ，是在动物、植物、微生物中广泛存在着的一 类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。本文以酵母菌经诱导培养所产生的c u m t 为研究对象。通过对数种不同酵母菌株进行筛选比较得到一个较优菌株，再进行诱变处理， 得到优势出发菌株n 1 。本论文对c u m t 的摇瓶发酵生产以及超声提取工艺作了初步的 研究，并对其清除羟自由基性质等作了探讨。 本论文根据热带假丝酵母c u 1 、酿酒酵母c u - 2 、c u 3 、c u 4 和啤酒酵母c u 5 菌株自 然产金属硫蛋白能力的分析，筛选得到较优菌株c u 3 ( 类金属硫蛋白产量以巯基活性计达 o 0 1 2 ) 。以c u - 3 菌株为诱变出发菌株，交替进行了两次紫外线( u v ) 和两次亚硝基胍( n t g ) 诱变，并对突变株进行筛选得到突变株n 、1 ，其产金属硫蛋白的能力( 以巯基活性表示) 达到0 0 4 1 左右，较出发菌株( 产c u m t 以巯基活性计为o 0 1 2 ) 提高了约3 4 2 倍，且具 有很好的遗传稳定性。 突变株n - 1 菌株生产c u - m t 的摇瓶发酵培养过程的研究中综合考察了活化培养时间、 诱导c u 试剂类型、浓度、诱导培养时间、温度、诱导培养基装液量、接种量以及摇床转 速8 个培养条件对菌株c u - m t 产量的影响。最终确定了n 一1 菌株摇瓶发酵培养的最佳条 件为：选择c u c h 为诱导c u - m t 试剂、浓度为1 0 m m o l l 、活化培养时间4 8 h 、诱导培养 温度3 0 c 、诱导培养时间4 8 h 、接种量l m u 5 0 m l 培养液、诱导培养基装液量为5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶、摇床转速1 4 0 r m i n 。按照以上培养条件安排实验，测得类金属硫蛋白产量( 以巯 基活性计) 为0 0 7 4 。 通过单因素实验以及正交实验设计对c u m t 的超声提取工艺条件进行了优化，综合 考虑了料液比、超声提取强度、超声提取时问、热变性时间等因素对提取效果的影响，最 后得到了c u - m t 超声提取的最优条件为：p h 8 6 i r i s h c i 缓冲液与干菌体之间的料液比 ( g ：m l ) 为l ：1 5 ，2 0 0 w 超声提取3 0 m i n 以及8 0 热变性6 m i n 。在此提取条件下，提取 得到的c u m t 以巯基活性计为0 0 8 5 。 此外，菌体蛋白经过超声提取，再将提取液适当浓缩后，流经s e p h a d e xg 5 0 凝胶过 滤柱以及d e a e 一纤维素阴离子交换柱进行两步分离纯化，得到c u m t 的三个亚型m t - i 、 m t - i i 、m t - i i i ，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 测得c u - m t 三个亚型的表观分 子量分别为9 0 0 0 d a 、9 0 0 0 d a 以及8 0 0 0 d a ；通过与抗坏血酸抗氧化能力的比较，证实c u m t 具有较强的清除羟自由基活性。 关键词：酵母菌；金属硫蛋白；诱变；超声提取；羟自由基 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t m e t a l l o t h i o n e i n ( m di sas p e c i a lc y s t e i n e b a s e dp r o t e i nt r a n s p o r t i n gm e t a l s ( s u c ha s c o p p e r , z i n c ) i na n i m a l s ，p l a n t s ，a n dm i c r o o r g a n i s m s i n t h i st h e s i s ，t h ep r o d u c t i o na n d a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fm tt r a n s p o r t i n gc o p p e r ( c u m t ) f r o my e a s t ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) w e r ei n v e s t i g a t e d ay e a s tm u t a n t ，n 1 ，w a ss c r e e n e df r o mm u t a t e ds t r a i n su s i n g a l t e r n a t i n g u vi r r a d i a t i o na n dn - m e t h y l e - n 、一n i t r o s o g u a n i d i n e ( n t g ) t r e a n n e n t ，a n dt h e c u m tp r o d u c t i v i t yi n c r e a s e dm o r et h a n3f o l db a s e do nt h ec o p p e ri o n b i n d i n ga c t i v i t yo f s u l f h y d r y l ( s n ) g r o u p s f u r t h e ro p t i m i z a t i o no ff e m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ( c u c l 2a s t h ei n d u c e r 、v i t l lac o n c e n t r a t i o no f1 0m m o l l ，a c t i v a t e df o r2d a y s ，a d d e dl m la c t i v a t e dc u l t u r ei n t o5 0 m l c u l t u r em e d i ai na2 5 0 m lf l a s ka n di n d u c e di nar o t a t es h a k e r ( 1 4 0 r m i n ) a t3 0 f o r2d a y s ) ， t h ep r o d u c t i o no f c u m ti n c r e a s e d6f o l d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fc u - m te x t r a c t i o n p u r i f i c a t i o nf r o my e a s tc u l t u r ea n di t s a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eu l t r a s o n i ct r e a t m e n to fy e a s t c u l t u r eu n d e rap o w e ro f2 0 0 wf o r3 0m i ni nar a t i oo f1 ：15f o rs a m p l et oe x t r a c t i o nb u f f e r i n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo f _ s hg r o u pt o0 0 8 5 ( 7f o l d ) a f t e rf u r t h e rd e n a t u r a l i z a t i o na t8 0 。cf o r 6 m i n a f t e rc u - m tw a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e du s i n gs e p h a d e xg 5 0g e lf i l t e rc o l u m na n d d e a e - c e l l u l o s ea n i o ne x c h a n g ec o l u m n ，t h r e es u b t y p e sw e r eo b t a i n e d ，w i t ham o l e c u l a rw e i g h t o f9 k d a , 9 k d s ，a n d8 k d a , r e s p e c t i v e l y , a n a l y z e db ys d s p a g eg e le l e c t r o p h o r e s i s c o m p a r e d 、v i lv c i tw a sf o u n dt h a ti t sa n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yi ne l i m i n a t i n go h 一w a sm o r ee f f e c t i v et h a n t b a to f v c k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；m e t a l o t h i o n e i n ；m u t a t i o n ；u l t r a s o n i ct r e a t m e n t ；o h 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 盔垒经日期：；年历月，户日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：垒至丝导师签名：氲2 塞 日期：5 年莎月勿日 第一章绪论 第一章绪论 1 0 引言 金属硫蛋i ! t ( m e t a l l o t h i o n e i n ，简称m t ) 化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐【”，是一类 低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白【2 l ，简称m t 。经几十年的研究，发现m t 在动 物、植物、微生物中广泛存在，由于它的氨基酸组成及分子结构，决定了m t 在生命过程 中起着重要的生理作用。 1 1 金居硫蛋白的来源 自1 9 5 7 年m a r g o s h e s 和v a l l e e 首次报道从马肾中分离得到c d m t 以来【3 卅，现在几乎能从 所有的哺乳动物、鱼类、两栖类、无脊椎动物和某些植物及真核、原核微生物中分离得到， 但鸟类的m t 研究未见报道。1 9 6 0 年，k a g i 和v a l l e e 提纯了这类蛋白质，发现其中含有大量 半胱氨酸残基和金属【5 】。小麦的e c 蛋白是第一个被分离的植物金属硫蛋白嘲。1 9 7 7 年 c a s t e r l i n e 和b a r n e t t 茵- 次从大豆的根中分离出富含c d 2 + 的复合物，由于它在柱层析上的表观 分子量和其他性质与动物体内的m t 极为类似，故称之为类m t ( m t - l i k e ，简称m t l ) 。 用于金属诱导产生m t 的生物非常广泛。家兔因来源广、价廉、易饲养、m t 产率高 而常用于m t 制备的诱导，其中尤以青紫兰家兔因其耐受性强而广泛应用。小鼠也因来源 广、价廉常用来进行m t 的诱导。李令嫒等用两栖类动物大鲵为材料1 7 】，用c d 诱导m t 的合成以研究生物的分子进化相关理论。由于蚯蚓具有抗重金属及富集重金属的特性，同 时，蚯蚓具有蛋白质含量高、价格低、易饲养等持点，因而有学者用c d 诱导环节动物威 廉环毛蚓，这对寻找廉价m t 来源有重要意义。郭样学等用锌诱导蓝藻，分离出类金属硫 蛋白，为进一步研究m t 的结构和功能，尤其是有关它的分子进化方面的研究，提供了新 的途径；证实了藻类对金属污染环境适应的一种分子机制，即通过诱导产生类金属硫实现。 就目前而言，生产m t 主要还是以锌诱导家兔，从肝脏合成z n m t ，然后经提取、分 离纯化来制备z n m t 。但通过这种途径生产m t 对实验设备和条件要求较高，在常规实验 室难以开展此项研究，以致影响其广泛应用。 研究表明，金属离子的加入可诱导微生物产生应激反应，从而使菌体合成并积累类金 属硫蛋白。与动物肝脏提取法相比，通过微生物诱导途径生产m t 具有设备条件要求简单、 简便易行、过程可操作性大等优点。类金属硫蛋白是一种金属诱导的胞内蛋白，提取时首 先对细胞进行破壁处理，再用合适的溶剂来提取，就可以获得微生物类m t 。 1 2 金属硫蛋白的结构与性质研究 在1 9 8 5 年召开的第二届关于研究m t 及其他小分子金属结合蛋白的国际会议上提出 了对m t 的明确定义：低分子量( 通常少于1 0 ，0 0 0 d a ) 、高金属含量( 通常4 一1 2 个金属离子 分子) 、半胱氨酸含量高且缺乏芳香族氨基酸和组氨酸或含量极少【8 1 ，有丰富的c y s x c y s 序列结构( x 为除c y s 外其他氨基酸) 、金属巯基结构的特征光谱性质、金属巯基簇结构域。 m t 结构在生物进化中高度保守，在哺乳动物中存在4 种m t 异构体【9 l ，即m t 1 、 1 江南大学硕士学位论文 m t 一2 、m t 3 、m t 一4 ，其中m t 1 和m t 2 存在于所有器官中，而m t 一3 仅存在于脑组织 中，m t 4 仅发现在鳞状上皮组织中【1 0 】。m t 可以由重金属、化学药品、激素和应激( 饥饿、 疲劳、寒冷、高热、创伤、运动) 等多种因素诱导。m t 在体内的含量随体内生理功能( 或紊 乱程度) 的变化而增加j 。 一般来说，哺乳动物的m t 分子量为6 0 0 0 7 0 0 0 d a ，但去金属后，即硫蛋白( t h i o n d n ) 分子量为6 0 0 0 d a 左右，而真核微生物的m t 分子量范围较大，为2 0 0 0 1 0 0 0 0 d a ，如从 粗糙脉孢菌中分离出来的m t 分子量为2 5 0 0 d a 左右，酵母菌中分离得到的m t 分子量为 8 0 0 0 1 0 0 0 0 d a 。高等植物m t 的分子量1 0 0 0 0 1 3 8 0 0 d a 。m t 等电点p i 一般在p h 4 左右， 如哺乳类动物m t 的p i 在3 9 4 6 之间，已发现的水生生物m t 的p i 在3 5 6 0 之间。 m t 具有热稳定性，可耐受8 5 1 0 m i n 不破坏【l “。 1 2 1 一级结构 大多数m t 都是单链蛋白质结构，一般是由6 0 6 8 个氨基酸残基组成的多肽单链。 肽链氨基端有一个乙酰化的甲硫氨酸，分子内半胱氨酸的数目和位置及碱性氨基酸残基都 有一定的保守性，这是m t 保持其功能相似的物质基础。m t 分子中所含半胱氨酸的数目 及其相对位置如图1 1 所示【1 3 】。虽然m t 分子中含有大量巯基，但分子内、分子间均不存 在二硫键，在自然条件下，所有的s c y s 均与金属结合，这是m t 的重要性质【l “。 k a g i 等研究发现哺乳类m t 包含6 1 6 2 个氨基酸残基，2 0 个半胱氨酸【l ”。更短的肽 链在无脊椎动物和真菌中发现，如p r i n z 和w e s e r 发现酿酒酵母x 一2 1 8 0 - 1 a a 菌株中的 c u m t 含5 3 个残基，1 2 个半胱氨酸。最短的多肽链存在于粗糙脉孢菌m t 中，该m t 含 2 5 个残基，7 个半胱氨酸。而某些高等植物m t 是由两条或更多条长度不等的多肽链构成 的低聚物。在所有形式中，除了半胱氨酸含量占氨基酸总量的l 3 左右以外，还有一个最 显著的特征是c y s x c y s 三肽结构的重复出现，其中x 代表除半胱氨酸外的其他氨基酸。 图1 - l 哺乳动物m t 氨基酸顺序图 f i g 1 - 1a m i n oa c i ds e q u e n c eo f m a m m a l i a nm t 第一章绪论 1 2 2 空间结构和金属结合位点 用核磁共捌1 6 。7 】、x 射线等技术研究发现，虽然不同m t 中氨基酸顺序不同，但空间结 构却相似，即m t 整个分子呈哑铃形1 8 1 ，由旺和b 两个大小相近球形结构域组成【1 9 1 ，这两 个结构域通过第3 0 ，3 1 位的l y s 残基( 铰链区) 相连，m t 铰链区的存在使2 个结构域有较 大的柔性以及可变性，使m t 中的金属离子与溶液中的金属离子易于交换，从而为其调节 体内金属离子的代谢提供了结构基础【2 0 1 。m t 空间结构的简化模型如图1 2 所示【2 ”。 a 图i - 2m t 空间结构的简化模型示意图 f i g 1 2s i m p l i f i e dm o d e lo f m t _ sd i m e n s i o n a lc o n f i g u r a t i o n m t 三级结构中a 区含有的1 1 个c y s 残基结合4 个原子的z n 或c d ，或结合5 6 个 原子的c u ；b 区含有的9 个c y s 的残基结合3 个z n 或c d ，或结合5 6 个c u 。金属离子 与所有c y s 的巯基结厶【砼1 ，因此，天然的m t 分子不含二硫键，也没有自由的巯基存在， 在每个区中z n 和c d 都是v a - 价状态和4 个c y s 的巯基结合，形成 m 2 + ( c y s 。) 4 】2 。( m 2 + 表示 金属离子) 复合物而使得整个分子带负电，c u 则是以一价的形式结合。 但是并不是所有的m t 都具有a 、8 两个结构域。在低等动物如甲壳类的蟹中，m t 仅 具有2 个1 3 结构域，而n 结构域则出现于较高等的动物；果蝇是动物m t s 基因家族中唯一 与其他成员没有同源性的例子，只有一个结构域；迄今为止，发现真核微生物m t s 只含有 单一的金属结合的结构域 2 3 1 。 1 2 3 金属硫蛋白基因调控 对m t 的诱导作用发生在转录水平上【2 4 1 ，通过金属效应元件( m r e ) 进行调控，动物 体内存在一种或多种呈金属依赖性结合的金属效应元件转录因子( m e t a lr e s p o n s e e l e m e n t b i n d i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，m r t f ) ，可与诱导的金属如z n 结合后发生变构从而与 江南大学硕士学位论文 m r e 特定位点结合，m r t f 对效应基因进行调控，由此促使m t 基因转录，而且转录的速 率与细胞内z n 浓度呈正比【2 5 i 。除了z n 能诱导m t 外，人们最早从接触c d 的兔肝组织中 发现c d 可诱导m t 合成，此后在多处细胞中发现了这种诱导作用。c d 对m t 的诱导能力 很强，它通过激活金属效应元件结合蛋白( m r e - b p ) 和m t f - l ，并与m t 启动子上的m r e 结合，从而促进m t 转录。研究结果表明，2 0 9 m o l l 的c d 可使m r e b p 的活性提高2 倍： 0 8 8 0 0 l m a o l l 的c d c l 2 可使m t 基因调控元件结合的d n a 结合活性增加2 0 4 0 倍。 另外，c d 诱导机体产生m t 存在性别差异，经腹腔注射染毒，雌鼠仅需1 h 即出现肝m t 浓度升高，而雄鼠在3 4h 后才出现肝m t 浓度升高；c d 还可能通过诱导或抑制蛋白一蛋 白相互作用，从而直接或间接影响m t 基因的染色体空间结构而激活转录过程。研究表明， c u 在肝、肾中可诱导m t 基因转录和m r n a 水平升高，不过诱导能力较弱，只有在c u 的剂量较大时才诱导肝m t 合成，对肾m t 合成的诱导作用则很弱【2 6 j 。另外，目前对硒( s e ) 诱导m t 合成进行了研究，通过蛋白质芯片分析研究发现，有机s e 在一定剂量下能有效 诱导m t 的合成【27 l 。除金属的基因调控外，人和动物m t 基因的调控还受其他一些因素如 糖皮质激素、干扰素( m r ) 、白细胞介素一l0 l 1 ) 、各种应激( 包括禁食、高温、寒冷等) 及 氧化性物质如过氧化氢( h 2 0 2 ) 等的调节。表明m t 的基因调控是一个多因素和多环节的调 控过程。 1 2 4 一t 与金属结合的性质研究 对m t 研究，除对其结构进行研究外，与金属结合的性质研究也是非常重要的一个方 面。 1 m t 的金属解离 哺乳动物m t 的等电点在p n3 9 4 6 之间，在生理条件下( p i a7 0 7 4 ) ，金属硫蛋白 带负电荷。研究还表明，不同种属的m t ，其等电点可能有些差异。例如，马肾m t 在p h 7 5 9 5 之间，带2 个负电荷；而人、鼠、兔的m t - 2 ，在p h8 6 下，带有3 个负电荷。 m t 在天然状态下，所有的c y s 均与金属离子结合，不存在游离的c y s ，因此，a p o - m t ( 脱 金属硫蛋白) 必须在较低的p h 值条件下才能获得。对于m t 与金属结合的性质研究，主 要集中在稳定性方面进行研究，这包括热力学性质和动力学性质。 2 m t 与金属结合的热力学性质 m t 可以同多种金属离子在体内或体外结合，结合的稳定常数，通过用p h 滴定的实验 结果求出解离常数。用这种方法所计算出兔c d 7 m t 和z n 7 一m t 的解离常数分别为1 0 - 2 2 和 1 0 郴，由此可以获得其平均解离常数。实验证实，k c d 与k z n 分别为5 1 0 。7 和5 x 1 0 。3 。采 用同样的方法计算，人的k z 。为1 4 x 1 0 。1 3 。根据其热力学的稳定性，可计算m t 与许多金 属离子结合的稳定常数。研究证明，许多重金属可以诱导m t 进行生物合成。由体内分离 纯化得到的m t 通常含有c u 、z n 、h g 、c d 等金属元素。而在体外实验中，许多金属离子 包括z n 2 + 、c d 2 + 、a 9 2 + 、c u + 、a u + 、b i 3 + 、c 0 2 + 、f e 2 + 、h 9 2 + 、n i 2 + 、p b 2 + 、p t 2 + 和t c 4 + 等都 可以与m t 结合。根据其稳定常数可以知道，m t 对金属离子亲和力的大小顺序与典型的 4 第一章绪论 硫醇盐对金属离子的亲合顺序相一致口引，即f e 2 + c 0 2 + z n 2 + c u = a s h g ，而p b 和f e 几乎无作用。不 过，对m t 是否有重金属解毒作用还存在争议【3 。早在1 9 3 3 年，v a l l e e 就提出那些用来证明 m t 具有重金属解毒这一基本功能的证据并不完全可信。首先，m t 并不是对所有能诱导它 合成的金属都具有解毒作用，例如，虽然a g 、a u 、c o 和n i 都能诱导m t 的合成，但m t 并 不对这些金属有解毒作用；同时，w e b b 指出，虽然细胞内c d m t 具有保护作用，但在胞外， c d m t 具有比c d 2 + 本身的更大的肾细胞毒性。 1 3 2 消除自由基和抗脂质过氧化作用 m t 具有清除自由基、抑制脂质过氧化过程而保护细胞膜的突变、增强吞噬细胞的功 能来提高免疫力。t h o n a l l e y 等实验表明，m t 具有强大的消除自由基能力，是有效的细胞 保护剂。唐朝枢等研究表明用m t 能显著地减轻细胞缺氧，复氧的损伤，增强细胞存活率， 降低细胞c a 2 + 的积累，抑制膜脂质过氧化。林稚兰等对酵母类金属硫蛋白的抗氧化作用 进行了研究，发现酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) y b d l 0 1 菌株的类金属硫蛋白能清 除羟基自由基【3 5 】。m t 是一种有效的自由基捕获剂。它不仅能清除0 2 且对o h 。也有极强的 清除能力。其对o h 。的捕获能力比对0 2 。大( m t 捕获o h 。的能力是g s h 的1 0 0 倍，而捕获 0 2 。- 的能力是g s h 的2 5 倍) 【3 6 】；m t 对0 2 。的捕获能力却不及s o d ，但s o d 只能清除0 2 。不能 清除o h 。，这说明m t 在清除自由基方面比s o d 优越。m t 在清除0 2 和o h 时，可释放出微 量元素z n ，促使免疫功能和细胞代谢，从而提高其抗炎、自我保护修复和自我改善的能力 3 7 1 。m t 也对o h 。弓i 起的d n a 损伤具有一定保护作用1 3 ”。 m t 抗氧化作用机制的研究结果不太一致。t h o n a l l e y 等根据m t 与o h + 反应的速率较 高的事实认为【3 9 1 ，m t 主要是通过其分子中半胱氨酸残基上s h 和自由基的相互作用发生 抗氧化作用。另外一些学者则认为硫蛋白本身的受氧化过程不是抗氧化的主要机制，起主 要作用的可能是m t 被氧化后释放的金属离子【4 0 】。有学者还发现，m t 在氧化时也可将氢 原子供给附近被自由基作用过的部位，使这些部位恢复到未损状态j ，或在释放出原子的 金属离子后再和f e 等金属离子结合，使这些金属离子不易参与特定反应如f e n t o n 型反应 的形式，从而阻止h 2 0 2 向o h 的转变，抑制了脂质过氧化。 1 3 3 抗电离辐射作用 电击和辐射照射后，细胞和组织中的m t 含量增加且所产生的自由基可导致d n a 损 伤，并伴随m t 基因信号的放大，根据其照射类型、时间和部位的不同，所引起m t 增加 的类型和量也有所不同。紫外线照射4 h 后，m t - 1 和m t - 2m r n a 的合成最多，紫外线照 射后，可参与m t - m r n a 及其蛋白的诱导，x 射线照射后，大鼠肝、肾、胸腺的m t 含量 增加，全身接受x 一辐射，可诱导小鼠肝脏m t - m r n a 转录和蓄积。这表明m t 具有很强的 抗电离辐射作用，保护细胞损伤及修复损伤细胞的功能【4 2 】。用马来酰亚胺作为自旋标记红 6 第一章绪论 细胞膜来研究m t 的抗辐射作用，当引入射线作用于红细胞膜时，结果表明含有m t 的基 质红细胞膜比对照组受损伤程度要小得多，过氧化程度明显低，红细胞膜构象没有受到破 坏。研究表明：3 种不同的细胞株对紫外线辐射的实验证实，在y 射线照射前给d n a 水 溶液加入m t 可明显减轻辐射对d n a 的损伤。 1 3 4 参与激素和发育调节，增强机体应激反应 研究发现各种炎症因子及机体的应激状态，例如电击、寒冷、高温、过度疲劳、饥饿 等均可引起m t m r n a 转录的增加，同时伴有血浆中z n 浓度的下降；同时发现给动物注 射与应激有关的糖皮质激素、肾上腺索、干扰素、白细胞介素一i 均能使肝脏中m t 合成增 加；利用中药调整大鼠的应激反应实验结果证明，m t 确与应激反应有关，应激状态下m t 含量增加，给予中药缓解应激状态，m t 含量降低。 关于m t 与发育过程的调节有关，主要体现在发育过程中的m t 定位变化以及m t 含 量的变化上。1 9 8 9 年，n i s h i m u r a 等人报道了在胎鼠和新生鼠的肝细胞核中m t 含量高， 随后逐渐降低，两周后m t 则主要集中在胞质中：1 9 9 2 年h a i l e 等人报道了m t 在细胞核 与细胞质之间的转运还受到细胞周期的控制，在乳腺癌和结肠癌细胞中，都只能在s 期而 不是g l 期细胞核中检测到m t 的存在；m t 分子上并不存在核定位信号，近来的研究表明 m t 向核转移受细胞能量驱动，但具体的分子机制仍不明确。 在胚胎发育过程中，有几种组织的m t 基因表达增加，这提示m t 在胚胎生长发育及 分化中起着重要作用，这可能是由于参与这些过程的酶是需c u 或z n 的含金属酶，它们所 需的金属由m t 提供【4 3 】；c h e r i a n 等人研究就认为细胞核中的高m t 含量与转录因子对锌 的需求相关，核m t 可能起到保护细胞d n a 和防止细胞凋亡，也可能调控基因的表达】： 实验也发现，细胞内m t 水平的改变导致细胞对脑外信号反应的改变，表明m t 通过调节 细胞内自由锌的水平而影响基因表达，m t 与细胞核内定位的作用可能与金属在细胞周期 中与各种细胞核成分的相互作用有关。 1 4 金属硫蛋白的应用 1 4 1 在医学临床中的应用 许多基础研究及l 晦床医学研究表明，m t 与肿瘤、艾滋病、血管疾病、营养缺乏等有 密切关系。认为m t 作为治疗药物用于临床是非常有前途的生化产品。t s u t o m u 等用m t 注射给小鼠后，可抑制氯仿乙醇诱导的胃溃疡形成 4 5 l 。病理生理研究表明，m t 可用于临 床控制缺血后再灌注损伤。日本、美国、德国等已相继申请了有关m t 作为治疗药物的专 利。越来越多的研究及临床证实，m t 作为放射化学治疗的辅助成分是相当有效的，它具 有防止放射治疗的副作用，保护正常人体细胞的功能。 m t 的抗病机理可以从清除自由基的连锁反应，阻止过氧化脂质的形成，降低机体的 过氧化水平，加强吞噬细胞功能，促进细胞代谢，提高机体免疫能力，抗辐射和光敏损伤 7 江南大学硕士学位论文 等方面来解释。虽然癌症、衰老、心血管病的起因十分复杂，但在发病过程中有共同之处， 都发生生物化学反应，而生物化学反应的过程也是氧化还原的过程。事实上脂质过氧化水 平高是诱发衰老、癌症、心血管疾病的重要原因之一h 6 1 。 m t 作为药物开发，可作为片剂、散剂、胶囊剂、舌下剂等多种剂型，经口服或非1 3 服都可使用。可以预测，m t 在2 1 世纪作为药物会被大量使用。 1 4 2 在化妆品行业中的应用 m t 所具有的独特性质决定了它在美容护肤领域中具有广泛的开发前景。现在人们已 经知道s o d 系列美容护肤品，但m t 将有可能取代s o d 作为美容护肤品添加剂。因为 m t 比s o d 具有更多的优越性。对热稳定性好，这是作为美容护肤品必需具有的性质； m t 的分子量小，约6 k d ，极易为机体吸收，而s o d 分子量约3 2 k d ；m t 不仅能清除0 2 ， 且对o h 也有极强的清除功能，而s o d 只能清除0 2 。，不能清除o i l - ；m t 具有很强抗辐 射作用，修复损伤细胞的功能。这些都使其成为护肤美容的理想佳品。 1 4 3 在保健品行业中的应用 随着世界性人口老龄化，老年人越来越多，每个家庭越来越把敬老保健作为消费的主 旋律；同时，每对夫妻只生一个孩子，营养过剩和锌等微量元素奇缺，年轻的父母日夜盼 购生理调节剂。这一老一少对营养保健品的需求，使保健品行业发展里直线上升。据统计， “九五”期间每年医疗保健费用超过1 0 0 0 亿，接近全国财政总收入的l 5 左右；到2 0 1 0 年， 我国医疗保健总产值将达到8 0 0 0 亿元，将成为国民经济发展最快的高新技术主导产业。 近期，人们逐步认识到，抗衰老保健行业使高科技产品更上一层楼。由于m t 可广泛添加 到奶粉、麦乳精、饮料和各种食品中，可制成男女老少皆宜，价廉物美的口服液、饮料和 食品，将成为遍及城乡每个家庭，敬老爱幼的热门畅销产品，仅以口服液为例，在国内市 场上要比化妆品市场更为广阔。 这里值得一提的是，m t 的更大潜力是有待开发的医药产品，更可喜的是最近国内外 的临床研究证实：m t 对糖尿病、老年痴呆症、尿毒症、脑血栓、高血压、动脉硬化等病 症有非常好的疗效，特别是可进入人的皮肤细胞发挥作用。进一步实验证实，m t 将给开 发新药带来世界性新变革，创造出一片极其广阔的市场。 1 4 4 在对重金属中毒的检测与环境监测中的应用 国外已有测定职业接触c d 者尿中c d m t 的报道，认为m t 浓度与体内金属浓度有较 好的相关性，用检测m t 来取代检测血和尿中金属可反映人体中毒程度更为合适。而且由 于人和环境的密切关系，重金属污染区中居民体内的金属含量必定异常，因此可用于对环 境进行监测【4 7 1 。 1 5 立题背景和意义 8 第一章绪论 目前，对于抗氧化活性物质的研究与开发日益受到世界各国科学界的关注。基于抗氧 化活性物质的重要生理功能和作用，其需求及应用日趋普遍。寻求一种更加高效、更加安 全的抗氧化活性成分，越来越成为众多科研工作者的迫切要求。其中，开发纯天然强效抗 氧化活性物质是当前以及将来的一个主要发展趋势。金属硫蛋白作为一种天然强抗氧化活 性成分，因其所具有的重要生理作用与功能，世界各国科研工作者对m t 的研究日趋广泛， 尤其近年来因金属硫蛋白的应用前景不断拓宽，研究态势也愈显高涨。一些世界著名杂志 也专门开辟了m t 专栏，而且迄今为止在1 9 7 8 、1 9 8 5 、1 9 9 2 、1 9 9 6 、2 0 0 5 年分别召开了 五届关于金属硫蛋白的国际会议，第五届m t 会议于2 0 0 5 年在北京召开，这足以证明人 们对m t 的重视程度，同时m t 的理论和应用研究也在各个研究领域显示了广阔的应用前 景和理论价值。目前，对m t 已涉及农业、医药、生物化学、分子生物学、环境科学、卫 生毒理学、食品科学、营养学、保健科学和方法学等领域，除了对m t 的来源、功能性质、 提取纯化工艺等进行深入研究外，对于其在某些特殊行业( 如医药、化妆品行业、食品行 业等) 的应用研究工作也占据了很大的比重。由此可见，随着m t 研究工作的步步深入， 我们对其各个方面的认识必将日益深入，其在社会生活各个领域的应用也必将得到很大的 拓展。然而，仍旧存在很多的不足和缺陷，这在很大程度上限制了金属硫蛋白研究的深度 及其应用的范围。 现在金属硫蛋白的主要提取方法还是动物肝脏提取，对实验设备和条件要求较高，在 常规实验室难以开展此项研究，且资源消耗巨大，以致影响其广泛应用。而通过微生物发 酵生产，则在一定程度上克服了上述不足。首先，微生物来源广泛且培养周期一般较短， 可在较短时间内通过诱导生产大量富含类金属硫蛋白的菌体；其次，微生物发酵过程易于 控制，可以通过控制发酵过程的条件参数进而调控类金属硫蛋白的生产过程与规模；再次， 发酵所需设备简单，条件易于满足，通过设置生产规模的大小可以在实验室条件或者工业 条件下进行类金属硫蛋白的生产和提取。 长期以来，为了解决金属硫蛋白微生物发酵、提取、纯化以及分析检测过程中存在的 各种问题，国内外工作者对此作了非常多的研究。但大多工作都还只是集中在对不同微生 物来源的m t s 的具体性质的研究探讨，如林稚兰等报道的异常汉逊酵母b d l 0 2 金属硫蛋白 的性质鉴定，n a i kn 、y a m a g a t as 有关酿酒酵母i f 0 0 4 4 r c u 类m t s 的相关报道等。而对于如 何通过改良微生物发酵过程相关因素以增加m t s 的产量则研究较少，直至2 0 0 5 年才有科研 机构尝试利用诱变方法处理出发菌株，但也只是着重考证了突变株所产金属硫蛋白生物学 性质的保持，并没有对其产量的增加情况作具体的分析。 本研究通过对众多不同类型菌株的筛选研究发现，相比较其他种类微生物菌株而言， 在同等发酵条件下酵母菌可能富集较多产量及质量较好的金属硫蛋白。在此基础上，本文 将针对实验室一般情况下采用的几种酵母菌，对它们进行进一步的筛选和分析，然后再对 较优菌株进行诱变处理以期得到产量较高且高度稳定的突变株，这必将在一定程度上克服 产量的问题，有助于对金属硫蛋白开展更为深入的研究。 此外，本文还将对金属硫蛋白的微生物发酵生产以及后期的提取纯化过程作一定研 9 江南大学硕士学位论文 究，对其中所涉及的工艺条件参数进行调整与优化，期望能达到工业化发酵生产金属硫蛋 白的生产要求。 1 6 论文主要研究内容 本论文的研究工作主要分为以下四部分： 1 筛选产类金属硫蛋白的菌株；对筛选得到的较优菌株进行物理、化学诱变，提 高产量，并进行遗传稳定性研究； 2 对突变株的摇瓶发酵培养条件进行优化，寻求最佳培养条件； 3 对类金属硫蛋白的超声波提取工艺条件进行优化，寻求最佳提取条件参数； 4 初步探讨类金属硫蛋白的相关结构特点及其抗氧化特性研究。 1 0 第二章类金属硫蛋白产生菌的诱变育种 第二章类金属硫蛋白产生菌的诱变育种 2 0 引言 从自然界分离所得到的原始酵母菌株用于类金属硫蛋白的诱导生产时，无论从产量还 是质量上考虑均不乐观。如果单纯依赖自然界存在的微生物菌群进行自然选育，由于自然 突变率低，突变幅度小，获得高产菌的几率非常小。利用诱发突变处理是最为可靠的微生 物菌种选育方法，具有方便、经济且高效的特点。微生物的诱变是以人工的方法使遗传物 质结构改变，从而破坏细胞的自控体系，引起细胞物质代谢障碍并产生所期望得到的物质。 目前实验室所采用的诱变剂大致分为物理以及化学诱变剂两类。物理诱变剂有非电离 辐射类的紫外线、激光以及能引起电离辐射的x 射线、1 r 射线和快中子等：化学诱变剂主 要包括烷化剂以及碱基类似物等。其中，烷化剂最常用且高效的有亚硝基胍( n t g ) 等， 可与巯基、氨基和羧基等直接反应，因而更易引起基因突变。 对微生物菌株进行诱变处理过程中，一般情况下如果仅仅采用一种诱变方法( 物理诱 变或化学诱变) ，诱变效果往往不十分理想。因而在选择诱变处理方式时，我们可以采用 不同诱变方法进行交替处理，具体实验过程中也即选择不同类型的诱变剂对实验菌株进行 交替诱变处理。通过采用不同诱变方法交替处理，可以动摇多种基因的稳定性，造成各种 基因功能重新调整从而提高突变率，产生更多的突变类型。 目前酵母菌被广泛应用于实验室真菌类金属硫蛋白的生产与性质研究。本实验通过对 产c u m t 的各种实验室常用酵母菌株进行比较筛选得到一株较优的菌株，然后对其进行 交替诱变处理，以期得到具备一定稳定性的c u - m t 高产突变菌株，并希望对工业化生产 提供技术支持。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 热带假丝酵母c u - 1 、酿酒酵母c u 2 、酿酒酵母c u 3 、酿酒酵母c u - 4 、啤酒酵母c u - 5 ： 由江南大学生物工程学院提供。 2 1 2 试剂及材料 k 2 h p 0 4 ( 分析纯) k h 2 p 0 4 ( 分析纯) 亚硝基胍( 生化试剂) 葡萄糖( 食用级) 蛋白胨( 生化试剂) 酵母膏( 生化试剂) 琼脂( 生化试剂) 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 瑞士f l u k a 公司进口分装 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 江南大学硕士学位论文 牛血清白蛋白( 生化试剂) 三( 羟甲基) 氨基甲烷( 生化试剂) 氯仿 醋酸钠 醋酸 氯化铜 2 ，2 二硫代联毗啶( 生化试剂) 考马斯亮蓝g 2 5 0 ( 生化试剂) s e p h a d e xg 一5 0 ( s u p e r f i n e ) d e a e 纤维素 2 1 3 主要仪器及设备 1 5 w 紫外灯 杀菌锅 隔水式电热恒温培养箱 h y g i i 型回转式恒温调速摇瓶柜 台式离心机 数显恒温水浴锅 j y 9 8 h i 超声波细胞粉碎机 7 2 2 光栅分光光度计 t u 一1 9 0 0 双光束紫外可见分光光度计 无菌操作台 p h 计 电子天平 2 1 4 培养基 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 a l f aa e s a r 公司 上海化学试剂公司 上海s i g m a 公司 上海s i g m a 公司 吴县照明灯厂 上海医用核子仪器厂 上海跃进医疗器械厂 上海欣蕊自动化设备有限公司 上海安亭科学仪器厂 金坛荣华仪器制造有限公司 宁波科生仪器厂 上海第三分析仪器厂 北京普析通用仪器有限公司 苏州净化设备厂 梅特勒托利多仪器上海有限公司 梅特勒托利多仪器上海有限公司 活化培养基( g l ：蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，酵母膏1 0 ，自然p h 值【4 8 1 ； 诱导培养基( g l ) ：蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，酵母膏1 0 ，c u 盐，自然p h 值； 斜面及分离培养基( g l ) ：蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，酵母膏1 0 ，琼脂条2 0 ，自然p h 值。 2 1 5 u v 诱变 1 取新鲜的斜面，加入6 m lo 1 m o v m lp h 6 0 的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振 荡试管，将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，由此制得单孢子悬液； 2 取2 4 m l 制备的菌液加到直径9 c m 培养皿中，放入一无菌磁力搅拌子，然后置 第二章类金属硫蛋白产生菌的诱变育种 磁力搅拌器上，1 5 w 紫外灯下3 0 c m 处照射一定时间。在正式照射前，先开启紫外灯1 0 m i n ， 让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射。操作均在红灯下进行； 3 取稀释1 0 1 0 6 倍的未照射的制备菌液和照射